KR100444370B1 - 나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 에프원의 제조방법 - Google Patents

나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 에프원의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 F1의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 진세노사이드 F1의 제조방법은, 인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을 용매에 용해시킨 다음, 아스퍼질러스 나이저 또는 페니실리움속 미생물에서 분리한 나린지나제 효소와 반응시켜 진세노사이드 F1을 생성하고, 이온교환수지 또는 수포화 부탄올로 용출 후 농축한 다음, 컬럼크로마토그래피로 분리하여 진세노사이드 F1을 고수율로 제조한다.
본 발명에 의해, 인삼추출물에서 트리올계 사포닌을 고순도로 정제하는 과정을 생략할 수 있고, 단시간내에 대량으로 고수율의 진세노사이드 F1을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 에프원의 제조방법{THE MANUFACTURING METHOD FOR GINSENOSIDE F1 WITH NARINGINASE}
본 발명은 나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 F1의 제조방법에 관한 것이다.
인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체는, 다마란계의 트리테르페노이드인 프로토파낙사다이올, 또는 프로토파낙사트리올에 글루코스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물로서, 현재까지 고려인삼에서 약 34 종의 유도체들이 밝혀져 있다.
또한, 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합위치에 따라 약리효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있으며, 인삼 중 함량이 많고 분리하기가 용이한 주요 사포닌의 약리효능에 대해서는 많은 연구가 수행되었으나, 미량 사포닌의 약리효능에 관한 연구는 극히 적은 편이다.
미량 사포닌인 진세노사이드 F1은 고려인삼의 잎에 0.4 %, 일본의 히로시마 지역 재배인삼의 잎에 0.01 % 함유하고 있는 것으로 보고되었고, 인삼의 뿌리에서의 검출 보고는 알려지지 않았으며, 인삼을 섭취할 경우 장내 세균에 의한 대사산물로서 생성되는 것으로 보고되어 있다.
진세노사이드 F1(20-0-β-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)은 아래 화학식 1 로 표기되는 화합물이다.
한편, 효소 나린지나제(Naringinase)는 감귤류의 쓴맛인 나린진(Naringenin- 7-glucorhamnoside)의 람노스와 글루코스의 α-1,2 결합을 가수분해하여 쓴맛이 없는 풀닌(Naringenin-7-glucoside)을 생성하는 효소로서, 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger) 등에서 추출하여 사용한다.
종래 진세노사이드 F1의 제조방법으로는, 진세노사이드 Rg1표준품 100 ㎎ 을 랫드에 경구투여 후 대장 내용물중의 대사산물을 추출하여 TLC 방법으로 진세노사이드 F1과 Rh1이 거의 동량 검출됨이 보고된 바 있다.
또한, 진세노사이드 Rg1표준품 300 ㎎ 을 효소 헤스페리디나제 100 ㎎ 과 반응시켜 반응액으로부터 진세노사이드 F1153 ㎎ 을 분리 제조한 바 있다(Chem. Pharm. Bull. 31(10), 3691, T. Odani 등, 1983년).
그러나, 이와 같은 방법들은, 진세노사이드 F1의 생성 수율이 낮을 뿐만 아니라, 여러 단계의 분리, 정제 과정을 거쳐야 하는 복잡하고 어려운 점이 있다.
한국특허출원 10-1991-016456(신물질 20(R)-진세노사이드 Rh2)에는, 홍삼에만 함유되어 있는 미량 사포닌인 진세노사이드 Rh1이나 Rh2를 제조하는 방법으로 산 가수분해법이 공지되어 있으나, 산 가수분해법은 진세노사이드의 아글리콘 C20위치의 배당체 결합을 분해하기 때문에 프로토파낙사트리올의 C20위치에 글루코스가 1분자 결합된 형태인 진세노사이드 F1을 제조하기는 어렵다.
한국특허출원 10-1996-046168(20(에스)-진세노사이드 알에이치1 및 20(에스) -프로토파낙사트라이올의 제조방법)은, 본 발명의 출원인이 선출원 한 것으로, 인삼 사포닌 중 트리올계 사포닌 인 Re와 Rg1을 구조전환 시켜 진세노사이드 Rh1을 고수율로 얻을 수 있는 방법이 공개되어 있으나, 이 방법으로는 진세노사이드의 아글리콘 C20위치의 배당체 결합을 분해하기 때문에 프로토파낙사트리올의 C20위치에 글루코스가 1분자 결합된 형태인 진세노사이드 F1을 제조하기는 어렵다.
본 발명의 목적은, 인삼에 다량 함유되어 있는 주요 트리올계 사포닌인 진세노사이드 Re, Rg1및 이들의 혼합물, 또는 트리올계 사포닌 함량이 높은 인삼 추출물을 나린지나제 효소를 이용하여 진세노사이드 F1을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명의 진세노사이드 F1의 제조공정도.
본 발명은 나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 F1의 제조방법에 관한 것이다.
본 출원의 발명자들은, 진세노사이드 F1은 화학식 1로 나타낸 바와 같이, 프로토파낙사트리올 사포게닌의 C20위치에 글루코스 한 분자가 결합된 화합물로, 진세노사이드 Re 또는 Rg1성분의 C20위치에 결합된 글루코스 한 분자를 제외한 나머지 C6위치의 배당체 결합을 모두 절단할 경우 진세노사이드 F1으로 전환된다는 점에 착안하여 연구 실험을 거듭하였다.
각종 미생물에서 분리한 효소를 사용하여 다각적인 실험을 실시한 결과, 아스퍼질러스 나이저 또는 페니실리움속 미생물에서 분리한 나린지나제 효소를 진세노사이드 Re, Rg1또는 이들의 혼합물과 반응시켰을 때, 제조수율 80 % 이상의 고수율로 진세노사이드 F1을 생성하는 것을 발견하고, 수 차례의 실험을 거쳐 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 나린지나제 효소 사용을 공통으로 하고, 분리방법에 따라 3 가지 방법으로 되어 있다.
본 발명의 방법 1의 구성은, 인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을, 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 여기에 아스퍼질러스 나이저 또는 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 효소를 첨가하여 가온상태의 수욕조 상에서 교반하면서 반응시키는 단계와, 반응액을 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와, 전기의 반응액을 이온교환수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하는 단계와, 반응생성물은 에탄올로 용출한 후 농축하고, 컬럼크로마토그래피하여 진세노사이드 F1을 수득하는 단계로 구성된다.
본 발명의 방법 2의 구성은, 인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 아스퍼질러스 나이저 또는 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 효소를 첨가하여가온상태의 수욕조 상에서 교반하면서 반응시키는 단계와, 반응액을 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와, 반응생성물은 수포화 부탄올과 혼합하여 진세노사이드 F1이 용출 된 상층부의 부탄올층을 수득하여, 농축시킨 것을 컬럼크로마토그래피로 분리하여 진세노사이드 F1을 수득하는 단계로 구성된다.
본 발명의 방법 3의 구성은, 인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 아스퍼질러스 나이저 또는 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 효소를 첨가하여 가온상태의 수욕조 상에서 교반하면서 반응시키는 단계와, 반응액을 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와, 전기의 반응액을 이온교환수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하는 단계와, 반응생성물은 에탄올로 용출 후 농축하여, 농축액을 제조한 다음, 분말상태가 될 때까지 재농축하여 진세노사이드 F1고함유물을 수득하는 단계로 구성된다.
본 발명에 의한 진세노사이드 F1의 제조방법을 도 1을 참조하여 자세히 설명하면 다음과 같다.
< 방법 1의 공정 >
제 1 공정 트리올계 사포닌 용해
인삼의 트리올계 사포닌인 진세노사이드 Re, Rg1및 이들의 혼합물 또는 이들의 함유비율이 높은 인삼 추출물을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시킨다.
여기에 사용되는 인삼의 트리올계 사포닌은, 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말리야인삼 또는 베트남인삼에서 추출 분리하여 얻은 것을 사용한다.
수성용매로는 물, 초산, 인산, 시트레이트, 시트레이트-인산의 완충용액 중에서 선택된 것으로, pH 3 ∼ 7, 특히 pH 4 ∼ 6 범위의 완충용액이 바람직하다.
전술한 수성용매는 단독으로 사용할 수도 있으나, 다른 수성용매 및 유기용매와 혼합하여 사용할 수도 있는데, 혼합하여 사용하는 유기용매는 물과 혼합되면서, 효소의 활성을 저하시키지 않는 것이어야 한다.
바람직한 유기용매로는 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸 설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등이 있으며, 유기용매의 사용량은 사용한 기질을 기준으로 2 ∼ 30 % 농도가 되도록 한다.
제 2 공정 효소 반응
트리올계 사포닌 용해액에 미생물 아스퍼질러스 나이저 또는 페니실리움속에서 분리한 나린지나제를 가하고, 20 ∼ 50 ℃ 수욕조 상에서 1 ∼ 72 시간 동안 교반하여, 효소 반응을 시킨다.
반응온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도조건이어야 하며, 수성용매만을 사용하는 경우는 50 ℃ 이하가 바람직하고, 수성용매와 유기용매의 혼합액을 사용하는 경우는 40 ℃ 이하가 바람직하다.
반응시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나 1 ~ 72 시간, 바람직하게는 24 ∼ 48 시간이 적정하다.
제 3 공정 효소 반응 종료
박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면, 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화 시켜 진세노사이드 F1이 주로 함유된 반응액을 수득한다.
제 4 공정 당류와 효소 제거
반응액을 이온교환수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후, 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거한다.
제 5 공정 에탄올에 용출
당류와 효소를 제거한 반응액을 에탄올에 용출한다.
제 6 공정 농축
에탄올 용출액을 농축시켜 농축액을 얻는다.
제 7 공정 컬럼크로마토그래피
농축액을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 진세노사이드 F1을 수득한다.
< 방법 2의 공정 >
방법 1의 제 1 공정 내지 제 3 공정을 동일하게 수행한다.
제 4 공정 수포화 부탄올과 혼합
제 3 공정에서 수득한 반응액을 수포화 부탄올과 혼합하여 진세노사이드 F1을 용출시킨다.
제 5 공정 부탄올층 수득
상부의 부탄올층과 하부의 물층으로 나누어져 있는 용액에서, 당류와 효소가 있는 물층은 버리고, 진세노사이드 F1이 용출 된 부탄올층을 수득한다.
이하 방법 1의 제 6 공정 농축과 제 7 공정 컬럼크로마토그래피 공정을 수행하여 진세노사이드 F1을 수득한다.
< 방법 3의 공정>
방법 1의 제 1 공정 내지 제 6 공정을 동일하게 수행한다.
제 7 공정 재농축
제 6 공정에서 수득한 농축액을 분말상태가 될 때까지 재농축하여 진세노사이드 F1고함유물을 수득한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 자세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 진세노사이드 Re를 사용한 진세노사이드 F1의 제조(방법 1)
진세노사이드 Re 1 g 을 0.1 M 초산 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50 ㎖ 로 정용하였다.
여기에 아스퍼질러스 나이저에서 분리한 나린지나제 3 g 을 첨가하여 37 ℃ 수욕조 상에서 교반하면서 48 시간 반응시켰다.
박층크로마토그래피에 의해 기질이 완전히 소실된 것으로 확인되어, 열수 중에서 10 분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하였다.
컬럼 흡착물을 에탄올로 용출시킨 다음, 농축시켰다.
농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 = 10 : 1)로 분리하여 진세노사이드 F1343 ㎎ 을 수득하였다.
<실시예 2> 진세노사이드 Rg1을 사용한 진세노사이드 F1의 제조(방법 1)
진세노사이드 Rg11 g을 인산-시트레이트 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 전체를 50 ㎖ 로 정용하였다.
여기에 아스퍼질러스 나이저에서 분리한 나린지나제 4 g 을 첨가하여 40 ℃ 수욕조 상에서 교반하면서 72 시간 반응시켰다.
반응액을 열수 중에서 10 분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
반응액을 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 증류수로 세척하고 에탄올로 용출시킨 다음 농축하였다.
농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 = 87 : 13) 로 분리하여, 진세노사이드 F1394 ㎎ 을 수득하였다.
<실시예 3> 진세노사이드 Rg1을 사용한 진세노사이드 F1의 제조(방법 2)
진세노사이드 Rg11 g 을 인산-시트레이트 완충용액(pH 5.5)에 용해시켜 전체를 50 ㎖ 로 정용하였다.
여기에 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 4 g 을 첨가하여 40 ℃ 수욕조 상에서 교반하면서 72 시간 반응시켰다.
반응액을 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
반응액에 수포화 부탄올 50 ㎖ 를 혼합하여 추출하였다.
상층부의 부탄올층을 수득한 다음, 농축시켰다.
농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 : 물 = 70 : 30 : 5)와 역상 C18컬럼 크로마토그래피(85 % 메탄올)로 분리하여 진세노사이드 F1378 ㎎ 을 수득하였다.
<실시예 4> 진세노사이드 Rg1를 사용한 진세노사이드 F1의 제조(방법 2)
진세노사이드 Rg11 g 을 인산 완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 50 ㎖ 로 정용하였다.
페니실리움속에서 분리한 나린지나제 3 g 을 첨가하여 40 ℃ 수욕조 상에서 교반하면서 72시간 반응시켰다.
반응액을 열수 중에서 10 분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
반응액에 수포화 부탄올 50 ㎖ 를 혼합하여 추출하였다.
상층부의 부탄올층을 수득한 다음, 감압농축하였다.
농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 = 10 : 1)와 역상 C18컬럼 크로마토그래피(82 % 메탄올)로 분리하여 진세노사이드 F1410 ㎎ 을 수득하였다.
<실시예 5> 진세노사이드 Re, Rg1혼합물을 사용한 진세노사이드 F1의 제조(방법 2)
진세노사이드 Re, Rg1혼합물 1 g 을 시트레이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50 ㎖ 로 정용하였다.
아스퍼질러스 나이저에서 분리한 나린지나제 3 g 을 첨가하여 50 ℃ 수욕조 상에서 교반하면서 72 시간 반응시켰다.
반응액을 열수 중에서 10 분간 가열하여 반응을 종료시켰다.
반응액에 수포화 부탄올 50 ㎖ 를 혼합하여 추출하였다.
상층부의 부탄올층을 수득한 다음, 농축하였다.
농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 = 10 : 1) 로 분리하여, 진세노사이드 F1325 mg 을 수득하였다.
<실시예 6> 트리올계 사포닌이 함유된 인삼근을 사용한 진세노사이드 F1의 제조(방법 2)
트리올계 사포닌이 주로 함유된 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획 1 g 을 인산 완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 50 ㎖ 로 정용하였다.
여기에 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 4 g 을 첨가하여 42 ℃ 의 수욕조 상에서 교반하면서 48 시간 반응시켰다.
반응액은 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시켰다.
반응액에 수포화 부탄올 50 ㎖ 를 혼합하여 추출하였다.
상층부의 부탄올층을 수득한 다음, 감압농축하였다.
농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 : 메탄올 = 9 : 1)와 역상 C18컬럼 크로마토그래피(85 % 메탄올)로 분리하여 진세노사이드 F1245 ㎎ 을 수득하였다.
<실시예 7> 진세노사이드 Re를 사용한 진세노사이드 F1고함유물의 제조(방법 3)
진세노사이드 Re 1 g 을 0.1 M 초산 완충용액(pH 4.0)에 용해시켜 전체를 50㎖ 로 정용하였다.
여기에 아스퍼질러스 나이저에서 분리한 나린지나제 3 g 을 첨가하여 37 ℃ 수욕조 상에서 교반하면서 48 시간 반응시켰다.
박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실된 것을 확인하고 열수 중에서 10분간 가열하여 효소반응을 종료시켰다.
반응액을 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하였다.
수지컬럼 흡착물을 에탄올로 용출 후 농축시켰다.
농축액을 분말 상태가 될 때까지 재농축하여, 진세노사이드 F1이 80 % 이상 함유된 진세노사이드 F1고함유물을 수득하였다.
본 발명에 의해, 반응원료인 트리올계 사포닌을 고순도의 순품으로 분리하는 과정을 거치지 않고도, 단시간내에 대량으로 고수율의 진세노사이드 F1을 제조하는 방법이 제공된다.

Claims (8)

  1. 진세노사이드 F1의 제조방법에 있어서,
    인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을,
    수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 나린지나제 효소를 첨가하여, 가온 상태의 수욕조 상에서 교반하면서 효소반응 시키는 단계와,
    반응액을 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와,
    반응액을 이온교환수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 다음, 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고, 반응 생성물은 에탄올로 용출하는 단계와,
    용출물을 농축시키는 단계와,
    농축액을 컬럼크로마토그래피하여 진세노사이드 F1을 수득하는 단계로 구성된,
    진세노사이드 F1의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 인삼은 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말리야인삼, 베트남인삼 중에서 선택된 하나인 것이 특징인, 진세노사이드 F1의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 트리올계 사포닌은 진세노사이드 Re, 또는 진세노사이드 Rg1인것이 특징인, 진세노사이드 F1의 제조방법.
  4. 제 1 항 있어서, 효소반응시 온도는 20 ∼ 50 ℃ 임을 특징으로 하는, 진세노사이드 F1의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 수성용매는 물, 초산, 인산, 시트레이트, 시트레이트-인산의 완충용액 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 F1의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 유기용매는 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸 설폭사이드, 저급 알콜 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 F1의 제조방법.
  7. 진세노사이드 F1의 제조방법에 있어서,
    인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을,
    수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 나린지나제 효소를 첨가하여, 가온 상태의 수욕조 상에서 교반하면서 효소반응 시키는 단계와,
    반응액을 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와,
    반응액과 수포화 부탄올을 혼합하고, 진세노사이드 F1이 용출된 상층부의 부탄올층을 수득하는 단계와,
    수득물을 농축시키는 단계와,
    농축액을 컬럼크로마토그래피하여 진세노사이드 F1을 수득하는 단계로 구성된,
    진세노사이드 F1의 제조방법.
  8. 진세노사이드 F1의 제조방법에 있어서,
    인삼에서 추출한 트리올계 사포닌 또는 트리올계 사포닌의 혼합물을,
    수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 나린지나제 효소를 첨가하여, 가온 상태의 수욕조 상에서 교반하면서 효소반응 시키는 단계와,
    반응액을 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시키는 단계와,
    반응액을 이온교환수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 다음, 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고,반응 생성물은 에탄올로 용출한 후 농축시키는 단계와
    농축액을 분말 상태가 될 때까지 재농축하여 진세노사이드 F1고함유물을 수득하는 단계로 구성된,
    진세노사이드 F1의 제조방법.
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