DE60100199T3 - Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Mischungen aus Isomaltulose und Trehalulose - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Mischungen aus Isomaltulose und Trehalulose Download PDF

Info

Publication number
DE60100199T3
DE60100199T3 DE60100199T DE60100199T DE60100199T3 DE 60100199 T3 DE60100199 T3 DE 60100199T3 DE 60100199 T DE60100199 T DE 60100199T DE 60100199 T DE60100199 T DE 60100199T DE 60100199 T3 DE60100199 T3 DE 60100199T3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
isomaltulose
trehalulose
fructose
glucose
syrup
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60100199T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60100199T2 (de
DE60100199D1 (de
Inventor
Ronny Leontina Marcel Vercauteren
Van Sau Nguyen
An Amanda Jules Heylen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cerestar Holding BV
Original Assignee
Cerestar Holding BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9891462&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE60100199(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cerestar Holding BV filed Critical Cerestar Holding BV
Application granted granted Critical
Publication of DE60100199D1 publication Critical patent/DE60100199D1/de
Publication of DE60100199T2 publication Critical patent/DE60100199T2/de
Publication of DE60100199T3 publication Critical patent/DE60100199T3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum enzymatischen Umwandeln eines Gemisches, umfassend Isomaltulose und Trehalulose, in einen Sirup, der mindestens 10% Gewicht/Gewicht Glucose und Fructose enthält. Das Enzym oder die Kombination von Enzymen wird in Chargen oder in immobilisierter Form angewendet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Isomaltulose oder 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-fructofuranose wird aus Sucrose durch die Wirkung eines in Bakterienstämmen, wie Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici und Serratia plymuthica, vorliegenden Enzyms synthetisiert.
  • Die Saccharoseglucosylmutase (auch genannt Isomaltulosesynthase, Sucrosemutase oder Sucroseisomerase (E.C. 5.4.99.11)), die in diesen Mikroorganismen vorliegt, ist für die Umlagerung der glycosidischen α1 → β2-Bindung in Sucrose zu einer α1 → 6-Bindung in Isomaltulose verantwortlich. Isomaltulose ist das kinetisch gebildete Produkt. Jedoch wird auch eine Menge des thermodynamisch stabileren Produkts Trehalulose gebildet.
  • Trehalulose ist 1-α-Glucopyranosyl-fructose und enthält eine α1 → 1-Bindung zwischen den Glucopyranosyl- und den Fructopyranosyleinheiten.
  • Gemische, die Glucosylfructosen, wie Isomaltulose und Trehalulose, enthalten, werden beispielsweise während des Herstellungsverfahrens von Isomalt (hydrierte Isomaltulose), d.h. das quasi-äquimolare Gemisch von 6-O-α-D-Glucopyranosyl- D-sorbit (1,6 GPS) und 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-mannit (1,1 GPM) erhalten. Isomalt wird gegenwärtig als ein kalorienarmes Süßungsmittel verwendet und ist für seine Nicht-Kariogenizität und bessere Stabilität verglichen mit Sucrose bekannt.
  • EP 0 625 578 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von hydrierter Isomaltulose. In einem ersten Verfahrensschritt wird Saccharose (d.h. Sucrose) enzymatisch in ein Saccharidgemisch, das "isomerisierte Saccharose" genannt wird und Trehalulose und Isomaltulose enthält, umgewandelt. In einem zweiten Schritt wird die "isomerisierte Saccharose" von nicht-isomerisierter verbleibender Saccharose durch enzymatische und/oder H+-katalysierte Hydrolyse befreit. In einem weiteren Schritt wird die "isomerisierte Saccharose" katalytisch hydriert, wobei in dem Fall vorzugsweise entweder vor oder nach der katalytischen Hydrierung das erhaltene Gemisch chromatographischer Trennung unterzogen wird.
  • H. Schiweck beschreibt in Alimenta 19, (1980), S. 5-16, eine Reinigung des "isomerisierte Saccharose" enthaltenden Sirups durch die Kristallisation der Isomaltulosefraktion aus übergesättigten wässerigen Lösungen. Die Mutterlauge enthält noch Isomaltulose, Isomaltose, Trehalulose, Glucose, Fructose und eine geringe Menge restlicher Saccharose. Das Vorliegen von restlicher Isomaltulose und Trehalulose, wobei beide Disaccharide darstellen, die schwierig zu hydrolysieren und schwierig zu fermentieren sind, in der Mutterlauge, erschwert stark ihre Verwendung als ein alternatives Fermentationssubstrat für die Herstellung von Nahrungsmitteln und Pharmazeutika, wie Antibiotika.
  • Ein Weg, dieses Problem zu umgehen, ist, die verbleibende Isomaltulose und Trehalulose in einem Sirup, der die fermentierbaren Monosaccharide Glucose und Fructose enthält, umzuwandeln und den so erhaltenen Sirup direkt für Anwendungen in Nahrung, Futter und Fermentation zu verwenden.
  • H+-Katalyse oder enzymatische Hydrolyse von glycosidischen Bindungen wird erleichtert, wenn es eine große Energiefreisetzung während der Hydrolyse der entsprechenden Bin dung gibt. Jedoch solche Energiefreisetzung ist für α-1-6- und α-1-1-Bindungen fast vernachlässigbar, wodurch die enzymatische Hydrolyse von Isomaltulose und Trehalulose folglich sehr schwierig sein wird.
  • R. Weidenhageen beschreibt in Zeitschrift für die Zuckerindustrie, LXXXII (1957), S. 533, dass Isomaltulose enzymatisch mit α-Glucosidase aus Brauhefe hydrolysiert werden kann, jedoch mit niedrigerer Geschwindigkeit als die Hydrolyse von Maltose. Nichts wird über die Hydrolyse von Trehalulose berichtet.
  • S. Sugawara beschreibt in Journal Facul. Agr. Hokkaido, Band 52 Teil 3, (1962), S. 257-321, Untersuchungen über die Art des Auftretens von α-Glucosidase-Aktivitäten in dem Pilz Aspergillus Oryzae. Er berichtete über die sehr langsame Hydrolyse von Isomaltulose durch eine α-Glucosidase aus Aspergillus oryzae.
  • G. Siebert et a1. beschreibt in Zeitschrift für Ernährungswissenschaft 25, (1986), S. 242-247, die sehr langsame Hydrolyse von Isomaltulose und Trehalulose durch α-Glucosidase aus Hefe. Bei einem ähnlichen Reaktionsbeginn, bei dem Maltose zu einem Ausmaß von 100 hydrolysiert wird, wird Trehalulose zu einem Ausmaß von 6% hydrolysiert und Isomaltulose wird zu einem Ausmaß von nur 3% hydrolysiert.
  • Dieses angewendete Verfahren hat somit tatsächlich verschiedene Nachteile. Die Hydrolyse von glycosidischen α-1-6- oder α-1-1-Bindungen, wie in Isomaltulose und Trehalulose, ist sehr niedrig, nämlich 3% bzw. 6%, wohingegen die Hydrolyse bei einem Temperatur- und pH-Optimum durchgeführt werden muss, bei dem mikrobielles Wachstum stimuliert wird, was zu einem erhöhten Risiko von mikrobieller Verunreinigung des hydrolysierten Sirups führt.
  • Folglich gibt es einen deutlichen Bedarf für ein industriell brauchbares Verfahren, das aus einer einfachen enzymatischen Hydrolyse zum Hydrolysieren von glycosidischen 1-6- und α-1-1-Bindungen zu einem wertvollen Glucose, Fructose enthaltenden Sirup besteht, der direkt in Lebensmitteln, Futter und Fermentation angewendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit.
  • Kurzdarstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum enzymatischen Hydrolysieren eines Substrats, wobei das Verfahren die nachstehenden Schritte umfasst:
    • a) Nehmen eines Substrats, umfassend ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose, umfassend mindestens 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose,
    • b) Inkontaktbringen des Substrats mit einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase aus Eubacteria, Archaeobacteria oder Pilz,
    • c) Kontakthalten zum Hydrolysieren des Substrats, um einen Sirup, enthaltend mehr als 10% Gew./Gew., vorzugsweise mehr als 25% Gew./Gew., bevorzugter mehr als 40% Gew./Gew., stärker bevorzugt mehr als 60% Gew./Gew., am stärksten bevorzugt mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose, zu erhalten, und
    • d) gegebenenfalls Auf konzentrieren des Sirups. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, wo
    bei ein Sirup, enthaltend Fructose und Glucose, chromatographisch in eine Fructose und Glucose enthaltende Fraktion und einen Isomaltulose und Trehalulose umfassenden Nebenstrom gereinigt wird und wobei der Nebenstrom in Schritt b) zurückgeführt wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, wobei Gemische von Isomaltulose und Trehalulose, die zwischen 15% bis 70% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und 5% bis 30% Gewicht/Gewicht Trehalulose umfassen, hydrolysiert werden.
  • Weiterhin offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum enzymatischen Hydrolysieren eines Gemisches, das aus der Trockensubstanz der aus der Kristallisation von Isomaltulose erhaltenen Mutterlauge besteht.
  • Der erhaltene Glucose, Fructose enthaltende Sirup umfasst weniger als 30% Gewicht/Gewicht restliche Isomaltulose und Trehalulose, vorzugsweise weniger als 20% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose, bevorzugter weniger als 10% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Substrat mit einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase in Kontakt gebracht wird und bei pH unter 6,5, vorzugsweise unter 6, bevorzugter unter 5 und bei einer Temperatur höher als 30°C, vorzugsweise höher als 40°C, bevorzugter höher als 50°C in einen Fructose und Glucose enthaltenden Sirup umgewandelt wird.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die α-Glucosidase von Pilzen erhalten wird, vorzugsweise aus den Gattungen Aspergillus, Penicillum, Candida, Monilia, Phoma und Alternaria, bevorzugter von den Arten Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus awamori.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, worin die α-Glucosidase, aus Eubacteria erhalten wird, vorzugsweise aus den Gattungen Enterobacter, Escherichia, Actinomyces, Bacillus, Klebsiella und Arthrobacter, bevorzugter von den Arten Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Bacillus thermoamyloliquefaciens.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass das Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende Enzym α-Glucosidase aus Archaeobacteria, vorzugsweise der Gattungen Thermococcus, Thermoproteus, Pyrodictium und Halobacteria, erhalten wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, worin das Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende Enzym in immobilisierter Form, vorzugsweise immobilisiert auf einem Träger, bevorzugter immobilisiert auf einem wiederverwendbaren Träger, verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, wobei die α-Glucosidase auf einem Anionenaustauschharz immobilisiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren, wobei α-Glucosidase auf einem Anionenaustauschharz immobilisiert ist und der Glucose und Fructose enthaltende Sirup mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose und weniger als 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose umfasst und dass diese Werte mit einer Fliessgeschwindigkeit von bis zu 5 Bettvolumen pro Stunde und für einen Zeitraum von mindestens 60 Tagen erreicht werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei der Glucose und Fructose enthaltende Sirup weiter gereinigt wird, d.h. mit chromatographischen Mitteln oder durch Filtration behandelt wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase aus Eubacteria, Archaeobacteria oder Pilz, mit diesen Aktivitäten zum Hydrolysieren eines Substrats enthaltend ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose umfassend mindestens 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose in einen Sirup, enthaltend mehr als 10% Gew./Gew., vorzugsweise mehr als 25% Gew./Gew., bevorzugter mehr als 40% Gew./Gew., stärker bevorzugt mehr als 60% Gew./Gew., am stärksten bevorzugt mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose.
  • Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum enzymatischen Hydrolysieren eines Substrats, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die nachstehenden Schritte umfasst:
    • a) Nehmen eines Substrats, umfassend ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose, umfassend mindestens 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose,
    • b) Inkontaktbringen des Substrats mit einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase aus Eubacteria, Archaeobacteria oder Pilz,
    • c) Kontakthalten zum Hydrolysieren des Substrats, um einen Sirup, enthaltend mehr als 10% Gew./Gew., vorzugsweise mehr als 25% Gew./Gew., bevorzugter mehr als 40% Gew./Gew., stärker bevorzugt mehr als 60% Gew./Gew., am stärksten bevorzugt mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose, zu erhalten,
    • d) gegebenenfalls Auf konzentrieren des Sirups.
  • Die enzymatische Hydrolyse wird durch ein spezielles Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierendes Enzym bewirkt. Das Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende Enzym kann jedes Enzym sein, das in der Lage ist, die glycosidischen α-1-1- und α-1-6-Bindungen zu hydrolysieren, und deren Verwendung führt zu einem industriellen Verfahren.
  • Der Glucose und Fructose enthaltende Sirup wird derart auf konzentriert, dass die mikrobielle Verunreinigung vermieden wird. Insbesondere wird der Sirup zu einer Trockensubstanz von mehr als 20% Gewicht/Gewicht, vorzugsweise zu einer Trockensubstanz von mehr als 30% Gewicht/Gewicht, bevorzugter mehr als 40% Gewicht/Gewicht, auf konzentriert.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt c) und Schritt d) oder nach Schritt d) der Sirup chromatographisch in eine Fructose und Glucose enthaltende Fraktion getrennt wird und ein Nebenstrom der Isomaltulose und Trehalulose umfasst, und der Nebenstrom zu Schritt b) zurückgeführt werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, wobei Gemische von Isomaltulose und Trehalulose, die zwischen 15% bis 70% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und 5% bis 30% Gewicht/Gewicht Trehalulose umfassen, hydrolysiert werden.
  • Diese Gemische können die Trockensubstanz der restlichen Mutterlauge sein, die durch Kristallisation der Isomaltulosefraktion aus übergesättigten wässerigen Lösungen des "isomerisierte Saccharose" enthaltenden Sirups erhalten werden. Solche Mutterlauge kann noch zwischen 15% und 70% Gewicht/Gewicht Isomaltulose, zwischen 0-10% Gewicht/Gewicht Isomaltose, zwischen 5% und 30% Gewicht/Gewicht Trehalulose, zwischen 2% und 15% Gewicht/Gewicht Glucose, zwischen 2% und 15% Gewicht/Gewicht Fructose und zwischen 0% und 5% Gewicht/Gewicht restliche Saccharose enthalten, während andere Oligosaccharide ebenfalls vorliegen könnten. In einem typischen Beispiel umfasst die Trockensubstanz solcher Mutterlauge 53% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und 17,5% Gewicht/Gewicht Trehalulose. Diese relativ hohen Mengen Isomaltulose und Trehalulose, die in der Mutterlauge vorliegen, machen es schwierig, sie als ein alternatives Fermentationssubstrat für die Herstellung von Nahrungsmitteln oder Pharmazeutika, wie Antibiotika, zu verwenden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein enzymatisches Verfahren zum Umwandeln dieses Produktstroms ohne direkten Wert in einen wertvollen Glucose-Fructose-Sirup bereit, welcher direkt in Nahrung, Futter und Fermentation angewendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende Enzym bei bevorzugten Temperatur- und pH-Wert-Reaktionsbedingungen arbeitsfähig ist und wo mikrobielle Verunreinigung vermieden wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Substrat mit einem Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden Enzym mit diesen Aktivitäten in Kontakt gebracht wird und in einen Fructose und Glucose enthaltenden Sirup bei einem pH-Wert unter 6,5, vorzugsweise unter 6, bevorzugter unter 5, und bei einer Temperatur höher als 30°C, vorzugsweise höher als 40°C, bevorzugter höher als 50°C umgewandelt wird.
  • Diese α-Glucosidasen (Transglucosidasen) können bei einem Temperatur- und pH-Wert-Optimum angewendet werden, wobei mikrobielle Verunreinigung quasi ausgeschlossen ist. Beispielsweise hat α-Glucosidase aus Aspergillus oryzae ein pH- Optimum von rund pH 4,2-4,6 und ein Temperaturoptimum von etwa 55°C. Jedoch bis jetzt ergeben die angewendeten Reaktionsbedingungen für die Hydrolyse durch diese Enzyme aus bakteriellem oder pilzlichem Ursprung eine viel zu langsame Hydrolyse zur Gewinnung eines industriell sinnvollen Verfahrens. Und die beschriebenen Reaktionen wenden nur reine Substrate an.
  • Aus Pilzen, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, Penicillum, Candida, Monilia, Phoma und Alternaria, bevorzugter von den Arten Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus awamori erhaltene α-Glucosidase kann in einem industriell sinnvollen Verfahren angewendet werden. Weiterhin kann aus Eubacteria, vorzugsweise aus der Gattung Enterobacter, Escherichia, Actinomyces, Bacillus, Klebsiella und Arthrobacter, bevorzugter aus den Arten Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Bacillus thermoamyloliquefaciens erhaltene α-Glucosidase ebenfalls angewendet werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die α-Glucosidase aus Archaeobacteria, vorzugsweise aus der Gattung Thermococcus, Thermoproteus, Pyrodictium und Halobacteria, erhalten wird.
  • Die enzymatische Hydrolyse von Gemischen, die Isomaltulose und Trehalulose umfassen, ergeben Sirupe, die mehr als 10% Gewicht/Gewicht, vorzugsweise mehr als 25% Gewicht/Gewicht, bevorzugter mehr als 40% Gewicht/Gewicht Glucose und Fructose umfassen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wendet ein Enzym an, das nicht weiter gereinigt werden müssen und die als kommerzielle Grundlage angewendet werden können und wobei Gemische von Isomaltulose und Trehalulose mit einer hohen Trockensubstanz (d.h. mindestens 20% Gewicht/Gewicht) angewendet werden. Die Hydrolyse ergibt Sirupe, die auch bevorzugter mehr als 60% Gewicht/Gewicht, bevorzugter mehr als 80% Gewicht/Gewicht Glucose und Fructose enthalten, d.h. ein wesentlicher Hydrolysegrad wird erhalten.
  • Weiterhin umfasst der Fructose und Glucose enthaltende Sirup weniger als 30% Gewicht/Gewicht restliche Isomaltulose und Trehalulose, vorzugsweise weniger als 20% Ge wicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose, bevorzugter weniger als 10% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose.
  • Die industrielle Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch Anwenden von Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierendem Enzym in immobilisierter Form verbessert. Das Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende Enzym kann in immobilisierter Form verfügbar sein, wie vernetzte Enzymkristalle. Das Enzym kann auf einem Träger immobilisiert sein, bevorzugter immobilisiert auf einem wiederverwendbaren Träger. Für den vorliegenden Zweck wiederverwendbar bedeutet, dass der Träger von Enzym oder enzymatischer Aktivität in einer derartigen Weise befreit werden kann, dass das Trägermaterial intakt bleibt. Der Träger kann entweder kontinuierlich oder unterbrechend wieder aufgefrischt werden. Das Trägermaterial kann dann mit Enzym erneut beladen und wiederverwendet werden. Das Trägermaterial kann mit Enzym erneut beladen und wiederverwendet werden. Das Reinigen des Trägers kann beispielsweise durch Waschen mit saurer oder basischer Lösung ausgeführt werden. Dies kann in Charge oder in der Säule ausgeführt werden. Es kann vorteilhafterweise ein Salz zugesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Protein abbauenden Enzymen. Ein noch weiteres Mittel würde Erhitzen des Materials sein.
  • Vorzugsweise ist der Träger in dem Sinne inert, dass er nicht durch die Umwandlung des Substrats in den Fructose und Glucose enthaltenden Sirup beeinflusst wird.
  • Weiterhin wird der Träger vorzugsweise als porös und im Wesentlichen nicht verpressbar beschrieben. Der Begriff "porös" soll bedeuten, dass der feste Träger eine Vielzahl von Hohlräumen und Poren umfasst, die eine große Oberfläche bereitstellen. Ein Beispiel zur Verwendung eines porösen Materials ist ein magnetisch stabilisierter Wirbelschicht-Enzymreaktor. Der Begriff "im Wesentlichen nicht verdichtbar" soll bedeuten, dass sich der feste Träger bei dem Druck, der während des Umwandlungsverfahrens vorherrschen könnte, zu keinem nennenswerten Ausmaß verformt.
  • Vorzugsweise werden Materialien verwendet, die Anionenaustauschgruppen aufweisen. Solche Materialien können auf der Basis von Cellulose vorliegen. Andere bevorzugtere Träger sind auf Polyacrylat oder Polystyrol-basierende Träger mit schwach basischen Gruppen. Schwach basische Anionenaustauscher sind Materialien, die primäre und/oder sekundäre oder tertiäre Aminogruppen aufweisen. Sie dissoziieren und haben Austauschfähigkeit in saure Lösungen. Die Materialien mit tertiären Aminogruppen haben eher basische Eigenschaften und sie werden auch mittelbasische Anionenaustauscher genannt. Vorzugsweise werden auf Phenolformaldehyd basierende Träger verwendet, wie kommerziell erhältliches DuoliteTM A 568 (Rohm und Haas).
  • Auch die Behandlung mit einem Vernetzungsmittel, wie Glutardialdehyd, kann zum Stabilisieren der immobilisierten Enzyme durchgeführt werden.
  • Das eine immobilisierte α-Glucosidase umfassende Verfahren wird durch Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung gezeigt. Das Enzym wird auf einem Anionenaustauschharz, beispielsweise makroporösem, schwachem Anionenaustauscher, immobilisiert.
  • Beim Hindurchgelangen des ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose umfassenden Substrats durch eine mit immobilisiertem α-Glucosidase-Konjugat gefüllte Säule enthält der Fructose-Glucose-Sirup mehr als 80% Gewicht/Gewicht Glucose und Fructose und weniger als 30% Gewicht/Gewicht restliche Isomaltulose und Trehalulose, vorzugsweise weniger als 20% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose, bevorzugter weniger als 10% Isomaltulose und Trehalulose. Diese Werte werden mit einer Fließgeschwindigkeit von bis zu 5 Bettvolumen pro Stunde, vorzugsweise bis zu 2 Bettvolumen pro Stunde und für einen Zeitraum von mindestens 60 Tagen erreicht.
  • Beim Hindurchgelangen einer Substratlösung von 20% (Gewicht/Gewicht) bei einem pH-Wert von 4,5 durch eine mit immobilisiertem α-Glucosidase-Konjugat (immobilisiert auf einem Anionenaustauscherharz, wie DuoliteTM A 568) gefüllten Säule verbleibt das Enzymsystem für mindestens 62 Tage stabil durch Anwenden einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 Bettvolumen pro Stunde und mindestens 85% Gewicht/Gewicht Fructose und Glucose wird erhalten.
  • Beim Anwenden von Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierendem Enzym in immobilisierter Form, wie vernetzten Enzymkristallen, kann der Fructose und Glucose enthaltende Sirup durch Anwenden von Fließgeschwindigkeiten auch höher als 5 Bettvolumen pro Stunde erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, wobei das Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose mindestens 30% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose umfasst.
  • Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch zwischen 15% und 70% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und 5% bis 30% Gewicht/Gewicht Trehalulose umfasst und der Hydrolysegrad ausreichend hoch ist zum Gewinnen eines Glucose, Fructose enthaltenden Sirups, der weniger als 30% Isomaltulose und Trehalulose, vorzugsweise weniger als 20% Gewicht/Gewicht restliche Isomaltulose und Trehalulose, bevorzugter weniger als 10% Gewicht/Gewicht Isomaltulose und Trehalulose umfasst.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der erhaltene Glucose-Fructose-Sirup weiter gereinigt werden, d.h. zum Gewinnen eines Sirups mit einem höheren Gehalt an Fructose und Glucose mit chromatographischen Mitteln oder durch Filtration behandelt werden. Eine chromatographische Trennung von hydrolysierter Isomaltulose-Mutterlauge liegt in Beispiel 3 vor. Simulierte Wanderbett-Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Ionenaustauscherharzes in der Na+-Form wird angewendet, und ein etwa 57% Fructose und 42,8 enthaltender Sirup wird erhalten, d.h. 99,8 Monosaccharid-Reinheit. Der erhaltene Nebenproduktstrom des Raffinats, das Fructose und Glucose, Isomaltulose, Trehalulose, Isomaltose und restliche Oligosaccharide mit höherem Molekulargewicht enthält, wird einem zweiten hydrolysierenden Schritt durch α-Glucosidase unterzogen und somit wird die Gesamtgewinnung von Glucose und Fructose weiter erhöht.
  • Die Zusammensetzung des Isomaltulose und Trehalulose umfassenden Gemisches und des Glucose-Fructose-Sirups wurde durch Anwenden von HPLC (Dionex Ionenchromatograph, ausgestattet mit amperometrischem Detektor und Carbopac-Säule) bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden Enzyms oder eine Kombination von Enzymen mit diesen Aktivitäten zum Hydrolysieren eines Substrats umfassend ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose umfassend mindestens 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose in einen mehr als 10% Gewicht/Gewicht, vorzugsweise mehr als 25% Gewicht/Gewicht, bevorzugter mehr als 40% Gewicht/Gewicht, auch bevorzugter mehr als 60% Gewicht/Ge-wicht Glucose und Fructose, besonders bevorzugt mehr als 80% Gewicht/Gewicht Glucose und Fructose enthaltenden Sirup.
  • Die vorliegende Erfindung ergibt ein industriell brauchbares Verfahren mit wesentlichen Vorteilen:
    • • Durch Hydrolysieren der Trockensubstanz der aus der Kristallisation von Isomaltulose erhaltenen Mutterlauge wird die vorliegende Erfindung zu der industriellen Lebensfähigkeit des industriellen Herstellungsverfahrens von Isomalt aufgestuft. Die vorliegende Erfindung wandelt einen Nebenproduktstrom ohne Wert in einen Glucose-Fructose-Sirup um, der direkt in Nahrung, Futter oder Fermentation angewendet werden kann.
    • • Die Hydrolyse wird an Gemischen von Isomaltulose und Trehalulose ausgeführt.
    • • Die Gemische werden mit hoher Trockensubstanz, d.h. mindestens 20% Gewicht/Gewicht, angewendet.
    • • Die Reaktionsbedingungen bezüglich des pH- und Temperaturoptimums sind derart, dass die Hydrolyse von mikrobieller Verunreinigung vermieden wird.
    • • Der Hydrolysegrad ist ausreichend hoch, um Sirupe, die mehr als 10% Gewicht/Gewicht, 25% Gewicht/Gewicht oder 40% Gewicht/Gewicht Glucose und Fructose enthalten, zu erhalten.
    • • Der Hydrolysegrad in Gegenwart von immobilisiertem Enzym bleibt für mindestens 60 Tage konstant und ergibt einen Sirup mit einer konstanten Zusammensetzung.
    • • Industriell brauchbares Verfahren.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1 – Dosierung von α-Glucosidase
  • Chargeninkubationen wurden mit dem α-Glucosidase-Enzym aus Amano (Transglucosidase L "Amano" – EC 3.2.1.20 – 300000 Amano-Einheiten pro ml Produkt) durchgeführt.
  • Das angewendete Substrat hatte die nachstehende Zusammensetzung:
    Figure 00140001
  • Die Hydrolyseversuche wurden bei 30% d.s., pH 5 und 60°C für 24, 48 und 72 Stunden durchgeführt.
  • Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00150001
  • Beispiel 2 – Hydrolyse mit immobilisierter α-Glucosidase
  • 1. Immobilisierung
  • Die Transglucosidase-L Amano (0,6 g Transglucosidase-Lösung für 1 ml Enzymträger) wurde auf DuoliteTM A 568 (ein makroporöser, schwacher Anionenaustauscher) immobilisiert. Das Konjugat wurde 6 Stunden gerührt und 0,08 ml Glutaraldehyd (25%)/g Konjugat wurden zugegeben. Das Rühren wurde 24 Stunden fortgesetzt. Das so erhaltene Konjugat wurde mit 4 Bettvolumina entmineralisiertem Wasser gewaschen.
  • 2. Hydrolyse
  • Substrat mit der nachstehenden Zusammensetzung wurde verwendet:
    Figure 00160001
  • Die Substratlösung von 20% (Gewicht/Gewicht) bei einem pH-Wert von 4,5 wurde durch eine mit dem immobilisierten Transglucosidase-Konjugat gefüllte Säule geleitet. Die Temperatur der Säule wurde bei 50°C gehalten und die Fließgeschwindigkeit wurde bei 0,3 Bettvolumen pro Stunde konstant gehalten. Die erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00170001
  • Beispiel 3 – Chromatographische Trennung
  • Ein Glucose-Fructose-Sirup mit der nachstehenden Zusammensetzung wurde zur chromatgraphischen Trennung angewendet:
  • Figure 00170002
  • Dieser Sirup wurde durch simulierte Wanderbett-Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Ionenaus tauschers in der Na+-Form in eine Produktfraktion und einen Nebenstrom (Raffinat) fraktioniert. Die erhaltene Produktfraktion hatte die nachstehende Zusammensetzung: 99,8 Monosaccharide (Gewicht/Gewicht), wovon 57% Gewicht/Gewicht Fructose und 42,8 Gewicht/Gewicht Glucose waren.
  • Der restliche Nebenstrom (Raffinat) hatte die nachstehende Zusammensetzung:
    Figure 00180001
  • Das Raffinat wurde durch ein immobilisiertes Transglucosidase-Konjugat bei 40°C und bei 30% d.s. (siehe Beispiel 2 für eine Beschreibung des Transglucosidase-Konjugats) geleitet und wurde in einen stark Fructose/Glucose haltigen Sirup mit der nachstehenden Zusammensetzung umgewandelt:
    Figure 00180002

Claims (14)

  1. Verfahren zum enzymatischen Hydrolysieren eines Substrats, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die nachstehenden Schritte umfasst: a) Nehmen eines Substrats, umfassend ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose, umfassend mindestens 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose, b) Inkontaktbringen des Substrats mit einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase aus Eubacteria, Archaeobacteria oder Pilz, c) Kontakthalten zum Hydrolysieren des Substrats, um einen Sirup, enthaltend mehr als 10% Gew./Gew., vorzugsweise mehr als 25% Gew./Gew., bevorzugter mehr als 40% Gew./Gew., stärker bevorzugt mehr als 60% Gew./Gew., am stärksten bevorzugt mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose, zu erhalten, d) gegebenenfalls Auf konzentrieren des Sirups.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt c) und Schritt d) oder nach Schritt d) der Sirup chromatographisch in eine Fructose und Glucose enthaltende Fraktion und einen Isomaltulose und Trehalulose umfassenden Nebenstrom gereinigt wird und wobei der Nebenstrom in Schritt b) zurückgeführt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch mindestens 15 bis 70% Gew./Gew. Isomaltulose und 5 bis 30% Gew./Gew. Trehalulose umfasst.
  4. Verfahren nach einem von Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch die Trockensubstanz der aus der Kristallisation von Isomaltulose erhaltenen Mutterlauge ist.
  5. Verfahren nach einem von Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Glucose und Fructose enthaltende Sirup weniger als 30% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose, vorzugsweise weniger als 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose, bevorzugter weniger als 10% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose, umfasst.
  6. Verfahren nach einem von Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mit einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase in Kontakt gebracht wird und dieser Kontakt erhalten wird bei pH unter 6,5, vorzugsweise unter 6, bevorzugter unter 5 und bei einer Temperatur höher als 30°C, vorzugsweise höher als 40°C, bevorzugter höher als 50°C, um einen in einen Fructose und Glucose enthaltenden Sirup zu erhalten.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende α-Glucosidase, erhalten wird von Pilzen, vorzugsweise aus den Gattungen Aspergillus, Penicillum, Candida, Monilia, Phoma und Alternaria, bevorzugter von den Arten Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus awamori.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende α-Glucosidase erhalten wird von Eubacteria, vorzugsweise von den Gattungen Enterobacter, Escherichia, Actinomyces, Bacillus, Klebsiella und Arthrobacter, bevorzugter von den Arten Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Bacillus thermoamyloliquefaciens.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende α-Glucosidase erhalten wird von Archaeobacteria, vorzugsweise der Gattungen Thermococcus, Thermoproteus, Pyrodictium und Halobacteria.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierende α-Glucosidase in immobilisierter Form, vorzugsweise immobilisiert auf einem Träger, bevorzugter immobilisiert auf einem wiederverwendbaren Träger, verwendet wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Anionenaustauschharz ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Glucose und Fructose enthaltende Sirup mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose und weniger als 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose umfasst und dass diese Werte mit einer Fliessgeschwindigkeit von bis zu 5 Bettvolumen pro Stunde und für einen Zeitraum von mindestens 60 Tagen erreicht werden.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Glucose und Fructose enthaltende Sirup weiter gereinigt wird, d.h. mit chromatographischen Mitteln oder durch Filtration behandelt wird.
  14. Verwendung einer Isomaltulose und Trehalulose hydrolysierenden α-Glucosidase aus Eubacteria, Archaeobacteria oder Pilz zum Hydrolysieren eines Substrats umfassend ein Gemisch von Isomaltulose und Trehalulose umfassend mindestens 20% Gew./Gew. Isomaltulose und Trehalulose, in einen Sirup, enthaltend mehr als 10% Gew./Gew., vorzugsweise mehr als 25% Gew./Gew., bevorzugter mehr als 40% Gew./Gew., stärker bevorzugt mehr als 60% Gew./Gew., am stärksten bevorzugt mehr als 80% Gew./Gew. Glucose und Fructose.
DE60100199T 2000-05-13 2001-05-14 Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Mischungen aus Isomaltulose und Trehalulose Expired - Lifetime DE60100199T3 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0011468 2000-05-13
GBGB0011468.6A GB0011468D0 (en) 2000-05-13 2000-05-13 Method for enzymatically hydrolysing mixtures of isomaltulose and trehalulose

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE60100199D1 DE60100199D1 (de) 2003-05-28
DE60100199T2 DE60100199T2 (de) 2003-10-23
DE60100199T3 true DE60100199T3 (de) 2007-09-20

Family

ID=9891462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60100199T Expired - Lifetime DE60100199T3 (de) 2000-05-13 2001-05-14 Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Mischungen aus Isomaltulose und Trehalulose

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1153930B2 (de)
AT (1) ATE238322T1 (de)
DE (1) DE60100199T3 (de)
GB (1) GB0011468D0 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101964958B1 (ko) * 2018-04-20 2019-04-02 (주)네오크레마 결정 석출이 억제되고 혈당 상승 억제능을 갖는 팔라티노스 시럽
JP7316035B2 (ja) * 2018-11-15 2023-07-27 Ｄｍ三井製糖株式会社 眠気抑制剤及び眠気抑制用飲食品

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3241788A1 (de) * 1982-11-11 1984-05-17 Süddeutsche Zucker AG, 6800 Mannheim Verfahren zur herstellung von 1-0-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose und verwendung als suessungsmittel
EP0794259B1 (de) * 1996-03-04 2004-10-06 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Herstellung einer Trehalulose enthaltende Polysaccharidzusammensetzung.

Also Published As

Publication number Publication date
DE60100199T2 (de) 2003-10-23
ATE238322T1 (de) 2003-05-15
EP1153930A1 (de) 2001-11-14
GB0011468D0 (en) 2000-06-28
EP1153930B1 (de) 2003-04-23
EP1153930B2 (de) 2007-03-28
DE60100199D1 (de) 2003-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69821047T2 (de) Verfahren zur Herstellung von isomalto-oligosaccharid-reichen Sirupen
DE69825382T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Siurps mit hohem Gehalt an Maltose
CA1246556A (en) Production of fructose syrup
US5141859A (en) Manufacturing method of high purity maltose and its reduced product
KR20000052608A (ko) 말토우즈-풍부 시럽의 제조방법
JPS592695A (ja) 固定化細菌細胞の使用によるイソマルツロ−ス（６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド−Ｄ−フルクト−ス）の製造方法
CA2529508C (en) Process for preparing maltitol enriched products
DE3117211A1 (de) Verfahren zur herstellung von fructose-polymeren und fructosereichen sirupen
JPH11137288A (ja) マンノースの製造方法
DE3323617C2 (de)
DE60100199T3 (de) Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Mischungen aus Isomaltulose und Trehalulose
JP3075609B2 (ja) セロオリゴ糖の製造方法
KR100508724B1 (ko) 트레할로오스및당알코올의제조방법
DE1567323B2 (de) Verfahren zur Herstellung von Fructose durch enzymatische Umwandlung von Glucose
US3969538A (en) Recovery of enzymes with ion exchangers
DE2855392C2 (de)
JP3513197B2 (ja) 高純度マルチトールの製造方法
CN107287263A (zh) 一种高纯度麦芽糖联产β‑极限糊精的制备方法
EP1027452B1 (de) Verfahren zur herstellung von isomelezitose und isomelezitose-haltigen süssungsmitteln
JPH0331294A (ja) 新規なオリゴ糖及びその製造方法
DE2443895A1 (de) Verfahren zur herstellung einer immobilisierten dextroseisomerase
JPH0242997A (ja) 粉末マルトース及び粉末マルチトールの製造法
JPS61219345A (ja) 分岐オリゴ糖を多量に含むシラップの製造方法
GB2048887A (en) Saccharification of starch hydrolyzates using glucoamylase immobilized on porous alumina
JPH03188093A (ja) 新規な糖類及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8366 Restricted maintained after opposition proceedings