DE2443895A1

DE2443895A1 - Verfahren zur herstellung einer immobilisierten dextroseisomerase

Info

Publication number: DE2443895A1
Application number: DE19742443895
Authority: DE
Inventors: Shiro Hasegawa; Masaki Tamura; Soichiro Ushiro; Masako Watanabe
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1973-09-13
Filing date: 1974-09-13
Publication date: 1975-04-10
Also published as: IT1021385B; DE2443895C3; FR2243954B1; AU7326374A; NL7412170A; ES429986A1; DE2443895B2; GB1482122A; ES449466A1; AR213387A1; FR2243954A1; AU467493B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Dextroseisomerase sowie ein Verfahren zur Isomerisierung von Dextrose. Die immobilisierte Dextroseisomerase kann in einer Säule verwendet werden, was eine wirksame und bequeme Methode zur Isomerisierung in industriellem Maßstabe bedeutet.

Dextroseisomerase ist der allgemeine Name für Enzyme, welche Dextrose"in Lävulose und umgekehrt umwandeln. Bisher konnte Dextroseisomerase hauptsächlich zur Herstellung von Lävulose aus Dextrose eingesetzt werden.

Derzeit wird das Enzym in Japan zur Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose enthaltendem Sirup in industriellem Maßstabe eingesetzt. Diese Reaktion wird in der Weise durchgefährt, daß eine Dextroselösung in Kontakt mit dem Enzym

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bei Temperaturen zwischen 60 und 7O⁰C während einer Zeitspanne von ungefähr 48 Stunden gehalten wird. Der Nachteil des chargenweise durchgeführten Systems besteht jedoch darin, daß der Verwendungswirkungsgrad des Enzyms gering ist. Ein anderer Nachteil ist darin zu sehen, daß das Produkt auf kostspielige Weise raffiniert werden muß, da es während der Reaktion verfärbt wird, die bei hohen Temperaturen während einer langen Zeitspanne durchgeführt wird. Da die Vermutung bestand, daß dieses Problem dadurch gelöst werden kann, daß die Dextroseisomerase immobilisiert wird, hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierter Dextroseisomerase zu schaffen.

In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Methoden zur Immobilisierung von Enzymen entwickelt. Diese Methoden lassen sich grob in die folgenden Gruppen einteilen: (1) Enzymprotein wird mit wasserunlöslichen Trägern chemisch oder elektrisch durch Absorption oder eine kovalente Bindung vereinigt. (2) Enzymprotein wird mit einer Verbindung mit mehr als 2 funktioneilen Gruppen vernetzt. (3) Enzymprotein wird in einem

Gelgitter oder in einer semipermeablen Membran festgehalten. (4) Intrazellulare Enzyme werden in Zellen durch eine physikalische oder chemische Behandlung fixiert.

Was die Immobilisierung von Dextroseisomerase betrifft, so ist die Methode, gemäß welcher das Enzym an DEAE-Cellulose (ÜS-PS 3 7 08 397) oder DEAE-Sephadex, (N. Tsumura und M. Ishikawa, Journal of Food Science and Technology, Vol. 14, Nr. 12539 (1967)) adsorbiert wird, sowie die Methode, gemäß welcher das Enzym kovalent mit Aminoalkylglas (Diazomethode) vereinigt wird (G. W. Strandberg und K. L. Smiley, Biotechn. and Bioeng., Vol. XIV, 509 (1972)) der Gruppe (1) zuzuordnen. Das Verfahren der Vernetzung des Enzyms mit Glutaraldehyd gehört zu der Gruppe (2). Das Verfahren der Begrenzung des Enzyms in dem Polyacrylamidgel (G. W. Strandberg und K. L. Smiley, Appl. Microbial., 2λ_, 588 .(1971)) gehört zu der Grup-

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pe (3), während die Methode der Fixierung des Enzyms innerhalb von Zellen durch Behandeln der Zellen mit Glutaraldehyd (japanische Patentanmeldung S47-45546) zu der Gruppe (4) zu zählen ist.

Eine immobilisierte Glucoseisomerase, die nach den Methoden der Gruppen (2), (3) und (4) hergestellt wird, besitzt jedoch schlechte hydraulische Eigenschaften bei einem Einbringen in großen Säulen. Bisher war es schwierig, eine konstante Fließgeschwindigkeit während einer langen Zeitspanne aufrechtzuerhalten. Andererseits sind DEAE-ZelIuIose sowie Aminoalkylglas teuer bei einem Einsatz zur Durchführung einer kontinuierlichen Isomerisation von Dextrose in industriellem Maßstabe.

Da Ionenaustauscherharze weniger kostspielig sind und in Säulen eingesetzt werden können, wurde versucht, unter ihrer Verwendung Dextroseisomerase zu immobilisieren. Das Verfahren, bei dem Enzyme an Ionenaustauscherharzen adsorbiert sind, gehört zu der Gruppe (1). Es wurde versucht, Glucoamylase an Amberlite CG-50 zu adsorbieren (vgl. K. Miyamoto, T. Fujii, und J.Y. Miura, Ferment. Tech. 4_9 Nr. 6, 565 (1971)). Ferner wurde versucht, Aminoacylase mit Amberlite IR-45 oder Diaion SA-11A zu immobilisieren (vgl. T. Tosa, T. Mori, N. Fuse und I. Chibata, Enzymologia, 31, 214 (1966)).

Diese Methoden haben jedoch keinen Eingang in die Großtechnik gefunden, da die Ionenaustauscherharze ein geringes Adsorptionsvermögen für Enzyme pro Mengeneinheit besitzen, und zwar im Vergleich zu einer Ionenaustauscherzellulose (wie beispielsweise CM-Zellulose und DEAE-Zellulose). Der Versuch, das vorstehend erwähnte Amberlite CG-50, das IR-45 oder das Diaion SA-11A auf Dextroseisomerase anzuwenden, gelang nicht in zufriedenstellender Weise, da die Adsorption der Enzyme, wie nachfolgend näher gezeigt wird, sehr gering ist.

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Nachfolgend werden die erfindungsgeraäß verwendeten Begriffe näher erläutert.

Unter dem Begriff "D.E." soll die Abkürzung für "Dextroseäquivalent" verstanden werden. Diese Begriffe lassen sich austauschbar dazu verwenden, den reduzierenden Zuckergehalt eines Materials, berechnet als Dextrose und ausgedrückt als Prozentsatz Gesamtfeststoffe, anzugeben.

Unter dem Begriff "Stärkehydrolysat" soll ein Sirup oder Trockenprodukt verstanden werden, das durch die Hydrolyse von Stärke erzeugt wird. Ein derartiges Produkt kann durch eine saure oder enzymatische Hydrolyse hergestellt werden. Ein bevorzugter Typ eines Stärkehydrolysats, das zur Durchführung der erfindungsgemäßen Isomerisierung verwendet wird, wird durch eine Säureverdünnung oder Enzymverdünnung bis zu einem D.E. von 10 oder weniger und anschließende enzymatische Verzuckerung bis zu einem D.E. von ungefähr 95 und vorzugsweise mehr 97,5 hergestellt.

Stärkehydrolysate mit mittlerem D.E. werden normalerweise als "Glucose" bezeichnet, und zwar unabhängig davon, ob das Stärkehydrolysat in Form eines Sirups oder in Form von Feststoffen vorliegt. Der Begriff "Dextrose" ist gewöhnlich für das raffinierte kristalline Monosaccharid reserviert, das aus einem Stärkehydrolysat mit hohem D.E. gewonnen wird, oder für D-Glucose als Bestandteil von Stärkehydrolysaten. Erfindungsgemäß soll der Begriff "Dextrose" dieses Monosaccharide in jeder Form, und zwar in Lösung oder in trockenem Zustand, als Bestandteil eines Stärkehydrolysatsirups, von Sirupfeststöffen oder in raffinierter kristalliner Form umfassen.

Die Begriffe "Fructose" und "Lävulose" werden im allgemeinen untereinander austauschbar dazu verwendet, das Isomere von Dextrose zu bezeichnen-, welches süßer als Dextrose ist.Dieses

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Isomere befindet sich in Honig sowie in Invertzucker, und zwar zusammen mit Dextrose, und ist infolge seiner Süßigkeit wertvoll. Der Begriff "Lävulose" wird im vorliegenden Falle dazu verwendet, dieses Monosaccharid zu definieren.

Das Enzym, welches Dextrose zu Lävulose isomerisiert, besitzt einige Namen. Es wird in der US-PS 2 950 228 als Xyloseisomerase bezeichnet, da es Xylose zu.Xylulose isomerisiert. Diese Aktivität wird zusätzlich zu seinem Vermögen festgestellt, Dextrose zu Lävulose zu isomerisieren. Ferner wurde das Enzym als Dextroseisomerase und Glucoseisomerase bezeichnet. Die Begriffe "Dextroseisomerase" oder, kürzer, "Isomerase" werden erfindungsgemäß verwendet.

Es wurden verschiedene im Handel erhältliche Harze auf ihre Fähigkeit untersucht, Dextroseisomerase zu adsorbieren. Dabei wurde gefunden, daß makroretikulare oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze sowie makroretikulare oder poröse schwachbasische Anionenaustauscherharze bezüglich des Adsorptionsvermögens herausragen. Ferner wird eine darauf immobilisierte Dextrose nur geringfügig eluiert und bleibt während einer andauernden Isomerisierungsreaktion stabil, wenn die Substratlösung auf pH-Werte in der Gegend von 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.

Es wurde ferner gefunden, daß bei einer Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose, die in der Weise durchgeführt wird, daß kontinuierlich eine Dextrose enthaltende Lösung, deren pH zuvor vorzugsweise auf etwa 8,0 eingestellt worden ist, durch eine Säule fließen gelassen wird, die mit einer immobilisierten Isomerase gepackt ist, welche dadurch hergestellt worden ist, dass eine Dextroseisomeraselösung mit entweder MR oder einem porösen stark basischen Anionenaustauscherharz und anschließende Adsorption des Enzyms hergestellt worden ist, bei einem Abfallen der Aktivität des immobilisierten

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Enzyms und folglich bei einem Abfallen der Isomerisierungsgeschwindigkeit, es möglich ist, das Enzym dadurch zu reaktivieren, daß Isomerase dem Vorrat der Dextrose enthaltenen Lösung zugesetzt wird, ohne daß dabei die Isomerisierungsreaktion unterbunden wird, wobei ferner die kontinuierliche Isomerisierung ohne Unterbrechung durchgeführt werden kann.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur -kontinuierlichen Isomerisierung, welche gekennzeichnet ist durch die Wiederholung der Prozedur der erneuten Enzymzufuhr in einem gegebenen Reaktor unter eingestellten Isomerisierungsbedingungen, wie sie für eine kontinuierliche Arbeitsweise bei einem gewünschten Umsatz- und Isomerisierungsgrad erforderlich ist. Im Verlaufe der kontinuierlichen Isomerisierung von Dextrose · zu Lävulose durch Durchschicken einer Dextroselösung, die vorzugsweise auf einen pH-Wert in der Gegend von 8,0 eingestellt worden ist, durch eine Säule, die mit immobilisierter Dextroseisomerase gepackt ist, welche in der Weise hergestellt worden ist, daß die Isomerase an MR-artigen oder porösen Anionenaustauschermaterialien adsorbiert worden ist, wird frische Dextroseisomerase der Dextrose enthaltenden Lösung zugesetzt, die durch die Säule geschickt wird, wenn die Aktivität des immobilisierten Enzyms bis auf ein bestimmtes Ausmaß abgefallen ist. Mit dem auf diese Weise reaktivierten immobilisierten Enzym wird die Dextrose enthaltende Vorratslösung (ohne Isomerase) anschließend durch die Säule geschickt.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich zur Herstellung von immobilisierten Enzymzubereitungen aus allen Typen von Dextroseisomerase anwenden, einschließlich solcher Zubereitungen, in denen das Enzym eine überwiegende oder schnellere katalytische Wirkung auf eine Isomerisierung ausübt, die von der Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose verschieden ist. Das Isomeraseenzym kann auf eine große Anzahl von verschiedenen Mikrobenquellen zurückgehen.

Erfindungsgemäß geeignete Dextroseisomerase kann beispielsweise in den Zellen von Strahlenpilzen (beispielsweise

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Streptomyces albus) oder Bakterien (beispielsweise Lactobacillus brevis), die als Dextroseisomerase erzeugende Mikroorganismen bekannt sind, entstehen. Sie wird in den verschiedenen Formen der rohen Isomerase eingesetzt, die aus den Zellen der erzeugenden Mikroorganismen extrahiert werden, und zwar durch Autolyse oder durch ÜberSchallbehandlung, worauf sich eine Abtrennung von den Zellresten anschließt. Sie kann ferner als teilweise gereinigte Isomerase eingesetzt werden, die durch Entfernung von Nukleinsäure erhalten wird, welche in der rohen Isomerease mit Protamin vorliegt, oder als kristalline Isomerase, die durch Kristallisation aus teilweise gereinigter Isomerase erhalten wird, die weiter durch eine Fraktionierung mit Ammoniumsulfat gereinigt worden ist.

Jedes Enzym scheint seine besonderen Eigenschaften zu besitzen, beispielsweise hinsichtlich des optimalen pH-Wertes, der optimalen Temperatur, der erforderlichen Metallionen, der Michaelis-Konstante sowie des Mechanismus, der Lävulosebildung, wobei alle diese Eigenschaften von einem Enzym zu dem anderen etwas verschieden zu sein scheinen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch zur Herstellung von immobilisierten Isomeraseenzymzubereitungen aus allen bekannten Mikrobenquellen und insbesondere aus allen Streptomyces-Spezies sowie -Stämmen sowie allen Bacillus-Spezies und -Stämmen, die Dextroseisomer as eenzymzubereitungen erzeugen.

Bevorzugte Mikroorganismen zur Erzeugung einer geeigneten Isomerase, die zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden kann, sind die Glieder des Streptomyces genus. Besonders bevorzugte Spezies dieses genus sind S. venezuelae und S. olivochromogenes. Kulturen bevorzugter Stämme dieser Organismen sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C. hinterlegt und deren permanenter Mikroorganismensammlung zugefügt worden. Sie haben die folgenden Bezeichnungen erhalten: S. venezuelae ATCC 21 113 und S. olivochromogenes ATCC 21 114.

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Die bevorzugtesten Mikroorganismen sind Mutantenstämme von Streptomyces olivochromogenes, insbesondere S. olivochromogenes ATCC Nr. 21713, 21714, 21715 sowie ihrer Äquivalente. Diese Mikroorganismen bilden erhebliche Mengen an Isomerase, wenn sie in Nährmedien gezüchtet werden, die frei von Xylose, von Xylose-lieferndenMaterialien sowie frei von zugesetztem Cobalt sind.

Eine Einheit der Enzymaktivität wird als das Ausmaß der Enzymaktivität definiert, welches 1 Mikromol Lävulose in 1 Minute unter den nachfolgend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen bildet. Zur Herstellung eines Enzyms zur Untersuchung ist es zuerst notwendig, es in eine lösliche Form zu überführen. Eine geeignete Methode, dies zu bewerkstelligen, besteht in einer Schallbehandlung.

Die Zellen aus einem bekannten Volumen einer Kulturbrühe werden erneut in einen 0,05 molaren Phosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Die Suspension wird dann unter Verwendung eines Branson Sonifier Modells 185-1 (20 kHertz) einer Schallbehandlung solang unterzogen, bis die Mikrobenzellen derselben in ausreichendem Maße aufgebrochen sind, so daß das Isomeraseenzym im wesentlichen vollständig freigesetzt ist. Hält man das Probenröhrchen in einem Eisbad während der Schallbehandlung, dann wird ein überhitzen sowie eine Enzyminaktivierung vermieden. Die erhaltene Enzymzubereitung ist eine Lösung von solubilisierter Isomerase.

Die Testmethode sieht die Durchführung einer spektrofotometrischen Bestimmung der Ketose vor, welche aus einer Dextroselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugt worden ist. Eine Ausgangslösung wird in der folgenden Weise hergestellt:

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— y ~

Komponenten Menge

0,1 m MgSO₄ -7H₂O 1 ml

0,01 m CoCl₀'6H₉O 1 ml

1 m Phosphatpuffer, pH 7,5 0,5 ml

wasserfreie D-Glucose · 1,44 g destilliertes Wasser, zur Einstellung eines Gesamtvolumens von 7,5 ml

Die zu untersuchende Enzymzubereitung wird zuerst soweit verdünnt, daß sie 1 bis 6 Isomeraseeinheiten pro ml enthält.

Eine enzymatische Isomerisierung wird in der Weise durchgeführt, daß 1 ml der Enzymzubereitung zu 3 ml der Ausgangslösung zugesetzt wird, worauf eine Inkubation während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 60 ⁰C durchgeführt wird. Nach Beendigung der Inkubationsperiode wird ein 1 ml-Aliquot entnommen und in einem 9 ml-Volumen einer 0,5 η Perchlorsäure abgeschreckt. Das abgeschreckte Aliquot wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zu Vergleichszwecken wird eine D-Glucose-Blindprobe verwendet, wobei 1 ml Wasser anstelle von 1 ml der Enzymzubereitung in Lösungsform zu Beginn der Inkubationsperiode verwendet wird.

Die Ketose wird dann nach der Cystein/Schwefelsäure-Methode bestimmt. Zur Durchführung dieser Untersuchung wird eine Isomeraseeinheit als das Ausmaß der Enzymaktivität defin'iniert, das erforderlich ist, um 1 Mikromol Lävulose pro Minute unter den beschriebenen Isomerisierungsbedingungen zu erzeugen.

Die makroretikularen oder porösen stark basischen Anionenaustauscherharze sowie die makroretikularen oder porösen schwach basischen Anionenaustauscherharze, die erfindungsgemäß eingesetzt werden _t werden nachfolgend beschrieben.

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Unter porösen Ionenaustauscherharze!! sind solche Ionenaustauscherharze zu verstehen, die viele Poren besitzen» Derartige Ionenaustauscherharze sind im allgemeinen für eine Adsorption geeignet. Makroretikulare Ionenaustauscherharze werden im allgemeinen als MR-Typ bezeichnet und besitzen relativ große Poren. Unter stark basischen Änionenaustauscherharzen sollen Harze rait der Gruppierung -ISj-(CHt) ^X als lonenaustauschergruppe verstanden werden. Diese Harze unterscheiden sich von denjenigen mit der Gruppierung

-E- (CH,)-X ^x C₂H₄OH

als Ionenaustauschergruppe.

Amberlite IRA-904 sowie IRÄ-938 (Rohm & Haas Co„^ USA) sind im Handel als MR-artige stark basische Anionenaustauscherharze sowie Diaion Pä-308 und PA-304 (Mitsubishi Chemical Co., Japan) als poröse stark basische Ionenaustauscherharze erhältlich< > Mittlerweile ist Ämberlite IRA-93 (Rohm & Haas Co., USA) im Handel als MR-artiges schwach basisches i.iiionenaustauscherharz bekannt, während Diaion WA-30 (Mitsubishi Chemical Co., Japan) als poröses schwach basisches Anionenaustauschsrharz zur Verfügung steht.

Die Harz- oder Polymerteilchen werden am zweckmäßigsten in Form von Körnern oder Kügelchen eingesetzt und liegen weiterhin gewöhnlich in einer Größe zwischen 16 und. IGO mesh (US Standard Siebreihe) bezüglich ihrer Teilchengröße und insbesondere in Form von Kügelchen mit 20 bis 50 mesh vor=. Aus Zweckmäßigkeitsgründen werden die Kügelchen in eine Säule eingebracht.

Makroretikulare Harze bezeichnen sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes aus "extrazellulären" Mikrcokanälen oder Poren innerhalb der Polymerraafcrix aus..Wenn auch diese Mikrokanäle sehr klein sind, so sind sie dennoch groß im Vergleich zu den Poren von üblichen homogenen vernetzten'Zellen. Makroretikulare Harze, die für eine erflnctangsgemäße Verwendung geeignet sind,

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können spezifische Oberflächen von bis zu 2000 m²/g oder darüber besitzen.

Die Oberfläche sowie die Porosität (oft als ml/ml oder ccra/ccm angegeben) sowie andere physikalische Eigenschaften von makroretikularen Harzen können unter Anwendung anerkannter Methoden gemessen werden, beispielsweise sei auf die Seiten 152 - 167 von "Oxidation-Reduction Polymers", Harold G. Cassidy et al., Interscience Pub. N.Y., N.Y., 1965 hingewiesen.

Um die hohe Porosität sowie die großen spezifischen Oberflächen zu erzeugen, die im Falle der erfindungsgemäßen Harze erforderlich sind, können die Suspensionspolymerisationsmethoden der GB-PS 932 126 angewendet werden.

Nachfolgend werden die Methoden erläutert, mit deren Hilfe die Dextroseisomerase an diesen Anionenaustauscherharzen adsorbiert wird. Die Isomerase wird in Form von Lösungen verwendet, und zwar von 0,01 bis 0,1 m tris-HCl- oder Phosphatpufferlösungen, von Salzlösungen, wie beispielsweise (NH^)₃SO₄-MgCl₂- oder KNO₃-Lösungen, wobei alle Lösungen auf einen pH-Wert von 6 bis 9 (vorzugsweise 7 bis 8) eingestellt sind. Man kann auch einfach Lösungen in Wasser oder in Dextrose verwenden, wobei alle Lösungen Konzentrationen zwischen 3 und 50 Einheiten/ml aufweisen.

Das Ionenaustauscherharz wird in eine Säule mit der entsprechenden Größe eingefüllt, und dann durch Durchschicken der gleichen Lösung, wie sie zum Auflösen der Isomerase verwendet worden ist, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit zwischen 1 und 3 SV während einer Zeitspanne von 5 bis 10 Stunden equilibriert ("SV" ist eine Abkürzung für Substratgeschwindigkeit und betrifft die Fließgeschwindigkeit in Bettvolumina pro Stunde. 1 Bettvolumen ist das Substratvolumen pro Stunde, das dem Säulenvolumen äquivalent ist, welches von dem Harz in der Säule eingenommen wird). Ionenaustauschergruppen, wie beispielsweise Chlorid, Sulfat, Bisulfat, Nitrat,

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Carbonat, Bicarbonat, Borat oder Phosphat, ergeben bessere. Ergebnisse bezüglich der Adsorption von Dextroseisomerase als die OH-artigen Gruppen. Dann wird eine solche Menge der Dextroseisomeraselösung, die 10 bis 100 Einheiten (vorzugsweise 50 Einheiten) des Enzyms pro g des Harzes (feucht) entspricht, durch die Harzsäule mit einer Fließgeschwindigkeit zwischen 1 und 3 SV geschickt. Nachdem die gesamte Enzymlösung durch die Säule passiert ist, wird Wasser durch die Säule geleitet, um nicht-adsorbierte Isomerase wegzuwaschen.

Anschließend wird das Harz aus der Säule genommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht.

Als Ergebnis einer Reihe von Versuchen wurde festgestellt, daß die erizymisch-chernischen Eigenschaften, wie beispielsweise optimaler pH-Wert und Wärmewiderstandsfähigkeit, von Dextroseisomerase, die an einem Ionenaustauscherharz immobilisiert worden ist, praktisch ähnlich den Eigenschaften der ursprünglichen löslichen Dextroseisomerase sind. Ferner zeigt diese immobilisierte Isomerase keinen Abfall der Enzymaktivität nach einer Zeitspanne von 3 Monaten, wenn d'iese Isomerase bei Temperaturen unterhalb 10⁰C an dunklen Stellen aufbewahrt worden ist. Natürlich kann die auf diese Weise hergestellte immobilisierte Dextroseisomerase unmittelbar für eine Isomerisierung verwendet werden, ohne daß dabei ein Waschen mit Wasser erforderlich ist, und zwar durch Durchleiten einer Dextroselösung durch eine Säule, die mit dieser Isomerase gepackt ist, wobei die nachfolgend beschriebenen Bedingungen eingehalten werden.

Nachfolgend wird eine Untersuchung beschrieben, um zu zeigen, daß MR-artige oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze sowie MR-artige oder poröse schwach basische Anionenaustauscherharze bezüglich ihres Vermögens, Dextroseisomerase zu immobilisieren, gegenüber anderen lonenaustauscherharzen besonders hervorstechen.

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3 g Portionen von jeweils einigen im Handel erhältichen Ionenaustauscherharzen (Amberlite, Diaion) (feucht) werden jeweils in verschiedene Säulen eingefüllt. Nachdem die Harze gründlich mit einer 0,05 m tris-HCl-Pufferlösung equilibriert worden sind, wird eine Lösung von 250 Einheiten an kristalliner Dextroseisomerase in der gleichen Pufferlösung durch jede der Säulen mit einer Pließgeschwindigkeit von SV3 geschickt.

Nachdem die ganze Isomeraselösung durchgelaufen ist, wird jede der Harzsäulen mit Wasser gewaschen. Dann werden die Harze aus den jeweiligen Säulen entnommen und auf ihre enzymatische Aktivität untersucht. Die Ergebhisse gehen aus der Tabelle II hervor.

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Tabelle II

Klassifizierung Grundtyp Ionenaustauscher- Bezeichnung des Wirksamer

gruppe Harzes pH-Bereich

Menge des adsorbierten Enzyms (Einheit/g des feuchten Harzes)

	stark saures Katio- Gel	porös	-SO-M	Diaion SK-1B	0-14	0
	nenaustauscherharz
	" porös	MR	Il	PK-204	0-14	0
			Amberlite IR-118		0
	MR	Il	Amberlite IR-124	0-14	0
en	schwach saures Katio-
ο CD	' nenaustauscherharz porös	-COCM	Diaion WK-10	5-14	0
OO	MR	Il	Amberlite CG-50	4-14	0
_>.	stark basisches An- Gel	-N-(CH₃) ₃X	Diaion SA-11A	0-14	0,4
cn	ionenaustauscher	Il	Amberlite IRA-400	0-14	0
	harz porös	I!	Diaion PA-304	0-14	10
Im/ OO		i:	PA-308	0 -1*	19
σ>	MR		Amberlite IRA-900	0-14	6
CD		-N-(OL)-X	IRA-904	0-14	24
	stark basisches An- Gel	\ J Z	IRA-938	0-14	21
	ionenaustauscher	C₂H₄OH
	harz		Diaion SA-21A	0-14	0,4
	Austauscherharz	Il	Amberlite IRA-410	0-14	0,1
		Diaion PA-404	0-14	2
	It	Amberlite IRA-411	0-14 -	0,3
	IRA-911	0-14	2

mittelbasisches Anionenaustauscherharz

Gel

schwach basisches Gel Anionenaustauscher-

harz porös

MR

-N(R),

-NH(R)

Amberlite IRA-68 0-9

Diaion WA-11
Amberlite IR-45

Diaion WA-30
Amberlite IRA-93

0,2

0 -	9	0,8
0 -	9	1
		9
		17

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, zeigen die Kationenaustauscherharze kein Adsorptionsvermögen. Demgegenüber ragen MR-artige oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze sowie MR-artige oder poröse schwach basische Anionenaustauscherharze bezüglich ihres Vermögens, Dextroseisomerase zu adsorbieren, deutlich heraus.

Nachfolgend wird die Bestimmung der Enzymstabilität beschrieben.

3 g von jeweils verschiedenen Arten einer immobilisierten Dextroseisomerase werden hergestellt, wobei die Isomerase an Amberlite IRA-904, IRA-938, IRA-93, IRA-911, Diaion PA-308, WA-30 bzw. PA-404 adsorbiert ist. Jedes Harz wird dann in eine andere Säule eingefüllt.

Dann wird die Stabilität einer jeden der immobilisierten Enzymproben in der Weise untersucht, daß eine 60 %ige Glucoselösung durch die Säulen unter den nachfolgend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen geschickt wird. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der Fig. 1 hervor, in welcher die vertikale Achse den Prozentsatz der Lävulose in der festen Substanz der Zuckerlösung, die aus jedem Volumen herausgekommen ist, und die horizontale Achse die Betriebszeit der Säule repräsentiert. In dieser Figur bedeutet "a" die Isomerisierungsreaktion, welche unter Einsatz der immobilisierten Isomerase durchgeführt wird, die unter Einsatz von Amberlite IRA-904 hergestellt worden ist, "b" bedeutet die Isomerisierungsreaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Verwendung von IRA-93 hergestellt worden ist, "c" bedeutet die Isomerisierungsreaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Verwendung von Amberlite IRA-938 hergestellt worden ist, "d" bedeutet die Isomerisierungsreaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Einsatz von Diaion PA-308 hergestellt worden ist, "e" ist die Reaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt wird, das unter Verwendung von Diaion WA-30 hergestellt worden ist, während

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"f" die Reaktion ist, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Verwendung von Amberlite IRA-911 sowie Diaion PA-404 hergestellt worden ist.

Im Falle "a" bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52 % während der ersten 12 Tage stehen, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 26 % nach 17 Tagen ab.Im Falle "b" bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52 % während der ersten 11 Tage, fällt jedoch auf die'Halfte oder auf 26 % nach 16 Tagen ab. Im Falle von "c" bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52 % während der ersten 10 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder 26 % nach 15 Tagen ab. Im Falle von "d" bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52 % während der ersten 6 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 2 6 % nach 10 Tagen ab. Im Falle von "e" bleibt der Lävulosegehalt bei 52 % während der ersten 3 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 26 % nach 6 Tagen ab. Im Falle von "f" nimmt der Lävulosegehalt in dem Ablauf innerhalb von 1 Tag auf 26 % ab.

Die Zeitspanne, während welcher der Prozentsatz der Lävulose auf die Hälfte des Anfangswertes absinkt, wird als die Halbwertszeit der immobilisierten Isomerase bezeichnet. Aus Fig. geht hervor, daß die immobilisierte Isomerase, die unter Einsatz von Amberlite IRA-904 und IRA-938 hergestellt worden ist, wobei es sich bei diesen Materialien um MR-artige stark basische Anionenaustauscherharze handelt, sowie unter Verwendung von IRA-93 erzeugt worden ist, das ein MR-artiges schwach basisches Anionenaustauscherharz ist, sich deutlich bezüglich der Stabilität abhebt und Halbwertszeiten von 17 Tagen, 15 Tagen bzw. 16 Tagen zeigt. Von den porösen Harzen sind Diaion PA-308, ein stark basisches Anionenaustauscherharz sowie Diaion WA-30, ein schwach basisches Anionenaustauscherharz, etwas weniger günstig bezüglich der erhaltenen Ergebnisse. Die Dextroseisomerase zeigt eine Halbwertszeit von 10 Tagen, wenn sie mit Diaion PA-308 immobilisiert wird, sowie von 6 Tagen, wenn sie unter Einsatz von Diaion WA-30 immobilisiert wird.

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COPV

Obwohl sie den gleichem MR- und Porentyp entsprechen, besitzen Amberlite IRA-911 und Diaion PA-404, bei denen es sich um stark basische Harze handelt, ein sehr geringes Vermögen, Dextroseisomerase zu adsorbieren. Die erhaltene immobilisierte Isomerase besitzt eine Halbwertszeit von nur 1 Tag. Andere gelartige Harze adsorbieren nur sehr wenig Isomerase, wobei die Halbwertszeit der erhaltenen immobilisierten Isomerase kürzer als 1 Tag ist. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß MR-artige -oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze, sowie MR-artige oder poröse schwach basische Anionenaustauscherharze bezüglich der Immobilisierung von Dextroseisomerase deutlich herausragen.

Nachfolgend wird eine Methode zur Isomerisierung von Dextrose unter Einsatz einer immobilisierten Isomerase, die erfindungsgemäß erhalten worden ist, erläutert.

Beispiele für Dextrose, die eingesetzt werden kann, sind folgende: kristalline Dextrose (Dextrosegehalt: oberhalb 99 %), pulverisierte Dextrose (etwa 90 %), Glucosesirup (40 bis 90 %) sowie Hydrol (50 bis 60 %) .

Diese Dextrosearten werden jeweils in einer Konzentration zwischen 30 und 70 % (vorzugsweise etwa 60 %) aufgelöst und mit . 0,001 - 0,01 m MgCl₂ vermischt. Dann wird die erhaltene Zuckerlösung auf pH-Werte von etwa 7_r0 bis 8,5 (vorzugsweise 7,5 bis 8,0) unter Einsatz von NaOH oder KOH eingestellt. In diesem Falle spielt das MgCl₂ die Rolle eines Aktivators der Isomerase. In der Zwischenzeit wird immobilisierte Isomerase, die auf MR-artigen oder porösen stark basischen Anionenaustauscherharzen oder auf MR-artigen oder porösen schwach basischen Anionenaustauscherharzen erzeugt worden ist, in einer Säule eingefüllt. Die Säule wird auf Temperaturen zwischen 60 und 70⁰C gehalten, während die Lösung mit Fließgeschwindigkeiten zwischen SV1 uridCSV5 · (gewöhnlich SV1 bis 2) durchgeschickt wird.

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Die Lävulosekonzentration des Ablaufs wird in der Weise bestimmt, daß die optische Drehung der Lösung mit einem Polarimeter oder nach der Cystein/H-SO.-Carbazol-Methode gemessen wird. Im Falle der Isomerisierung von Dextrose mit immobilisierter Isomerase, die erfindungsgemäß erhalten worden ist, ist es sehr wichtig, die Dextroselösung auf einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,5 einzustellen, da die Stabilität des immobilisierten Enzyms als Ergebnis erhöht wird.

Zu Demonstrationszwecken werden 10g Amberlite IRA-904, wobei es sich um ein MR-artiges stark basisches Anionenaustauscherharz handelt, in jeweils fünf verschiedene Säulen einfüllt. Jede Säule wird mit einer 0,05 m tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), die 0,01 m MGCl₂ enthält, equilibriert. Nach der Equilibrierung wird eine Lösung von 1000 Einheiten an kristalliner Isomerase in der gleichen Pufferlösung durch jede Säule geschickt, Dann v/erden fünf getrennte 60 %-ige Dextroselösungen, die jeweils 0,01 m MgCIj enthalten und auf verschiedene pH-Werte· von 6,0, 7,0, 7,5, 8,0 und 9,0 eingestellt sind, durch die jeweiligen Säulen bei 70⁰C sowie mit einer Fließgeschwindigkeit von SV1 hindurchgeschickt.

Nach diesem Isomerisierungsverfahren wird die Halbwertszeit der immobilisierten Isomerase für jede dieser verschiedenen pH-Werte gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der Fig. 2 hervor, wo die pH-Werte auf der horizontalen Achse und die Halbwertszeiten auf der vertikalen Achse aufgetragen sind. Wie aus der Figur ersichtlich ist, ist es zweckmäßig, den pH-Wert der zu isomerisierenden Lösung bei etwa 7,0 bis 8,5 zu halten, um die immobilisierte Isomerase während der Isomerisierungsreaktions stabil zu halten.

Wird eine kontinuierliche Isomerisierung von Dextrose gemäß vorliegender Erfindung unter Verwendung von immobilisierter Isomerase auf Amberlite IRA-904, IRA-938 oder IRA-93 durchgeführt, dann beträgt die Isomerasemenge, die zur Erzeugung von 1 g Lävulose erforderlich ist, ungefähr 0,15 Einheiten.

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.Wird eine immobilisierte Isomerase auf Diaion PA-3 08 oder WA-30 verwendet, dann beträgt dieser Wert ungefähr 0,3 bis 0,4 Einheiten. Andererseits erfordert ein in üblicher Weise chargenweise durchgeführtes Isomerisierungsverfahren ungefähr 1 Einheit Isomerase zur Erzeugung von 1 g Lävulose. Daher kann die Menge an Dextroseisomerase durch das erfindungsgemäß durchgeführte kontinuierliche Isomerisierungsverfahren beträchtlich reduziert werden. Ferner ist die erhaltene isomerisierte Zuckerlösung praktisch farblos. Sie kann in zufriedenstellender Weise durch Entsalzen mit Ionenaustauscherharzen raffiniert werden. Dabei entfällt die mühsame Entfärbung mit Aktivkohle, die normalerweise bei der Durchführung eines chargenweise ausgeführten Isomerisierungsverfahrens erforderlich ist.

Im Falle einer Isomerisierung von Dextrose mit einer Isomerase, die auf einem stark basischen makroretikularen Anionenaustau-" scherharz gemäß vorliegender Erfindung immobilisiert worden ist, ist es vorteilhaft, die Dextroselösung auf einen pH-Wert von etwa 8,0 einzustellen, da die Stabilität des immobilisierten Enzyms als Folge erhöht wird.

Zu Demonstrationszwecken werden 10g Amberlite IRA-904, ein MR-artiges stark basisches Anionenaustauscherharz, in jeweils einige Säulen eingefüllt. Jede Säule wird mit einer 0,05 m tris-HCL-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), die 0,01 m MgCl₂ enthält, equilibriert. Nach der Equilibrierung wird eine Lösung von 1000 Einheiten einer kristallinen Isomerase in der gleichen Pufferlösung durch jede Säule geschickt. Dann werden getrennte 60 %ige Dextroselösungen, die jeweils 0,01 m MgCl₂ enthalten und auf verschiedene pH-Werte von 6,0, 7,0, 8,0 bzw. 9,0 eingestellt sind, durch die Säulen bei 60 bis 70⁰C sowie unter einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr SV 1 geschickt.

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Nach diesem Isomerisierungsverfahren wird der Lävulosegehalt des Ablaufes aus jeder Säule gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus Fig. 3 hervor, wo die vertikale Achse den Lävulosegehalt wiedergibt, während auf der horizontalen Achse die Betriebszeit einer jeden Säule in Tagen angegeben ist.

In Fig. 3 wird durch "a" die Linie wiedergegeben, auf welcher der Lävulosegehalt des Ablaufs der Säule aufgetragen ist, die bei einem pH-Wert von 8 betrieben wird, "b" identifiziert die pH 7 Säule, "c" die pH 6 Säule und "d" die pH 9 Säule. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, ist es zweckmäßig, den pH-Wert der Dextroselösung, die isomerisiert werden soll, auf etwa 7,0 bis 8,5 zu halten, um die immobilisierte Isomerase » während der Isomerisierungsreaktion stabil zu halten, wobei die immobilisierte Isomerase am stabilsten bei einem pH-Wert von ungefähr 8 ist.

Wird die kontinuierliche Isomerisierungsreaktion bei einem pH-Wert von ungefähr 8 durchgeführt, dann wird die Gleichgewichtsgeschwindigkeit der Isomerisierung (52 % Lävulose) während einer Zeitspanne von 15 Tagen aufrechterhalten. Danach nimmt jedoch die Geschwindigkeit allmählich ab und fällt auf die Hälfte des anfänglichen Werts (26 %) in 22 Tagen ab. Die Zeit, innerhalb welcher die Isomerisierungsgeschwindigkeit einer immobilisierten Isomerase auf die Hälfte des anfänglichen Wertes absinkt, wird als "Halbwertszeit" bezeichnet.

Wie nachfolgend näher erläutert werden wird, übt die Reinheit der Dextroseisomerase, die für die Immobilisierung verwendet wird, nur eine geringe Wirkung auf die Stabilität der erhaltenen immobilisierten Isomerase während der Isomerisierungsreaktion aus.

Einige Säulen werden mit jeweils 12 g Amberlite IRA-904 (feucht), einem MR-artigen stark basischen Anionenaustauscherharz, be-

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schickt. Nachdem das Harz gründlich mit einer 0,01 m sung (pH 7,5) equilibriert worden ist, werden die Säulen jeweils wie folgt beschickt: mit einer Lösung von 1000 Einheiten einer rohen Isomerase (extrahiert aus Zellen durch Autolyse), mit einer teilweise gereinigten Glucoseisomerase (abgetrennt von Nucleinsäure durch Protaminbehandlung) sowie kristalliner Isomerase, in der gleichen Lösung. Dann wird eine Glucoselösung, die 0,01 m MgCL· (pH 8,0) enthält, durch die Säule bei einer Temperatur von 70⁰C sowie mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 geschickt. Die immobilisierten Enzyme, die aus diesen Arten von Dextroseisomerase hergestellt worden sind, besitzen Halbwertszeiten von etwa jeweils 17 Tagen, so daß keine Wirkung ersichtlich ist, welche auf die Reinheit der Ausgangsisomerase zurückzuführen ist. Wird eine immobilisierte Isomerase industriell hergestellt, dann ist es daher vorteilhaft, rohe Glucoseisomerase einzusetzen.

Wird Glucose kontinuierlich nach den vorstehend beschriebenen Methoden isomerisiert, dann enthält die Zuckerlösung, die aus den Harzsäulen austritt, Lävulose, die anfänglich für 52 % der festen Substanz beiträgt, wie aus Fig. 3 hervorgeht. Dieser Lävulosegehalt wird während einer Zeitspanne von 10 bis 15 Tagen aufrechterhalten. -Das Isomerisierungsausmaß (52 %) ist der Gleichgewichtswert, der dann erreicht wird, wenn die Isomerisierung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt wird. Danach fällt jedoch der Wert auf die Hälfte des Anfangswertes oder auf 26 % in 17 bis 22 Tagen ab.

Nachfolgend wird die Methode der Reaktivierung der Säulen, deren Isomerisierungsaktivität herabzufallen begonnen hat, erläutert.

Zuerst wird eine Dextroseisomerase in der gleichen Glucoselösung, die für die Isomerisierung eingesetzt worden ist, aufgelöst. Dann wird eine bestimmte Menge der erhaltenen Enzymlösung, die 10 bis 15 Einheiten (vorzugsweise 25 bis 50 Ein-

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heiten) Isomerase pro g des feuchten Harzes enthält, durch die Säulen mit der gleichen Fließgeschwindigkeit geschickt, die derjenigen der Glucoselösung entspricht, die zum Isomerisieren durchgeschickt worden ist. Beim Durchlaufen durch die Säule wird mehr Enzym adsorbiert, wobei gleichzeitig die Glucose isomerisiert wird.

Auf diese Weise gewinnen die Harzsäulen wieder ihr ursprüngliches Isomerisierungsausmaß (52 %) zurück. Darüber hinaus zeigt die immobilisierte Isomerase, die reaktiviert worden ist, die gleiche "Halbwertszeit" wie die ursprüngliche (17 bis Tage). Wird diese Methode wiederholt, dann ist es möglich, die Isomerisierung ohne ein erneutes Füllen der Säulen durchzuführen, so lange die Ionenaustauscherharze arbeiten. Ferner kann der Lävulosegehalt in dem Ablauf aus den Harzsäulen konstant bei einem gegebenen Isomerisierungsausmaß von bis zu ungefähr 52 % (den normalen Gleichgewichtswert) in der folgenden Weise gehalten werden. Stellt man fest, daß das Isomerisierungsausmaß abfällt, wie sich durch Messen mit einem Polarimeter_termitteln läßt, dann wird die Harzsäule sofort in der vorstehend geschilderten Weise reaktiviert oder es wird wahlweise die Fließgeschwindigkeit allmählich reduziert, um das Isomerisierungsausmaß konstant zu halten, worauf die Säule erneut zu einem geeigneten Zeitpunkt aktiviert wird.

Ein günstiges Merkmal dieser Methode der kontinuierlichen Isomerisierung besteht darin, daß der erhaltene isomerisierte Sirup praktisch farblos ist. Es ist nur ein Entsalzen mit Ionenaustauscherharzen zur Durchführung einer Raffiniation nötig. Keine Entfärbung mit Aktivkohle vor dem Verkauf ist erforderlich.

Wie nachfolgend gezeigt werden wird, ist die immobilisierte Dextroseisomerase, die in der Weise hergestellt worden ist, daß sie an einem MR-artigen oder porösen stark basischen Anionenaustauscherharz adsorbiert ist,^% der Isomerase überlegen, die

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unter Einsatz anderer Ionenaustauscherharze hergestellt worden ist, und zwar im Hinblick auf die Fähigkeit einer Reaktivierung.

Wie vorstehend beschrieben worden ist, ragen Amberlite IRA-904, ein MR-artiges stark basisches Anionenaustauscherharz, Amberlite IRA-93, ein MR-artiges schwach basisches Anionenaustauscherharz sowie Diaion WA-30, ein poröses schwach basisches Anionenaustauscherharz, bezüglich ihres Vermögens, Isomerase zu adsorbieren, besonders heraus.

10 g eines jeden dieser Harze (feucht) werden in 3 verschiedene Säulen eingefüllt. Nachdem die Harze gründlich mit einer 0,01 m MgCl2-Lösung (pH 7,5) equilibriert worden sind, wird eine Lösung von teilweise gereinigter Isomerase (1000 Einheiten) in der gleichen Lösung durch jede der Säulen geschickt. Dann wird Glucose, die 0,01 m MgCl₂ (pH 8,0) enthält, bei 70⁰C durch jede Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt.

Das Isomerisierungsausmaß der jeweiligen Isomerasezubereitungen, die unter Verwendung von verschiedenen Ionenaustauscherharzen hergestellt worden sind (die Prozentsätze an Lävulose in der festen Substanz in den Abläufen, die aus den verschiedenen Säulen austreten) wird mit einem Polarimeter gemessen.

Alle Enzymzubereitungen zeigen zunächst einen Lävulosewert von 52 % in dem Ablauf. Im Verlaufe der Zeit nimmt jedoch der Wert allmählich ab. Nachdem er auf 26 % (die Hälfte des Anfangswertes) gefallen ist, wird eine Lösung von 250 Einheiten an Isomerase in einer Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ (pH 8,0) enthält, durch die Säule geschickt. Die Isomerisierungsreaktion wird dann in der Weise fortgesetzt, daß mit dem Durchschicken der ursprünglichen Glucoselösung durch'die Säule fortgefahren wird.

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- art -

Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der Fig. 4 hervor. In der Fig. zeigt (1) die Ergebnisse für Amberlite IRA-904, (2) für Amberlite IRA-93, und (3) für Diaion WA-30.

Dextroseisomerase, die mit Amberlite IRA-904 immobilisiert worden ist, gewinnt seinen anfänglichen Isomerisxerungsgrad (52 %) nach der Reaktivierung zurück. Ferner besitzt sie nach der Aktivierung die gleiche Halbwertszeit wie am Anfang.

Im Falle einer immobilisierten Isomerase, die mit Amberlite IRA-93 und Diaion WA-3 0 hergestellt worden ist, ist andererseits eine vollständige Regenerierung des Anfangsgrades der Isomerisierung nicht möglich. Die Aktivität nach der Reaktivierung steigt nur etwas an, wie aus Fig. 4 hervorgeht, wenn diese schwach basischen Anionenaustauscherharze als Träger verwendet werden.

Die folgenden spezifischen Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Teil- und Prozentangaben beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

Beispiel 1 Isomerisierung mit einem Enzym, das auf Amberlite IRA-904

immobilisiert worden ist.

100 g eines feuchten Amberlite IRA-904, ein MR-artiges stark basisches Anionenaustauscherharz (Bettvolumen: 150 ml) werden in eine Säule (3 x 30 cm) eingefüllt und mit 0,05 m tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) equilibriert. Dann werden 400 ml einer Lösung einer teilweise gereinigten Dextroseisomerase (die 10000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Nachdem die ganze Isomerase· lösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 2000 ml Wasser durch die Säule geschickt, um etwa noch vorhandene nicht adsorbierte Isomerase wegzuwaschen. Dann wird das Ionenaustau-

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scherhärz aus der Säule genommen und auf seine Glucoseisomeraseaktivität untersucht. Als Ergebnis stellt man fest, daß pro g des Harzes (feucht) eine Aktivität von 28 Einheiten entfällt.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (feucht) (Bettvolumen: 75 ml) werden in eine Säule (25 χ 20 cm) eingefüllt. Diese Säule wird bei einer Temperatur von 7O⁰C gehalten. Eine 60 %ige Glucoselösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52 % der festen Substanz. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 15 Tagen gehalten. 20 Tage später ist jedoch das Ausmaß der Isomerisierung auf 26 %, die Hälfte des anfänglichen Wertes, abgefallen.

Beispiel 2

Isomerisierung mit einem Enzym, das auf Diaion PA-3 08 immobilisiert worden ist.

100 g eines feuchten Diaion PA-308, eines porösen stark basischen Anionenaustauscherharzes (Bettvolumen: 150 ml) werden in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit einer 0,01 m MgCl--Lösung, die auf einen pH-Wert von 8 eingestellt worden ist, equilibriert. Dann werden 400 ml einer teilweise gereinigten Isomerase in der gleichen Lösung (die 10000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 2000 ml Wasser durch die Säule geleitet, um noch vorhandene nicht adsorbierte Isomerase wegzuwaschen. Anschließend wird das Ionenaustauscherharz aus der Säule entnommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht. Man stellt fest, daß jedes g des Harzes (feucht) eine Aktivität von 20 Einheiten besitzt.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (feucht) (Bettvolumen: 75 ml) werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt. Die Säu-

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le wird auf einer Temperatur von 7O⁰C gehalten. Eine 60 %ige Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgeschwxndigkeit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52 % der festen Substanz. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 6 Tagen gehalten und fällt dann in 10 Tagen auf 26 %, die Hafte des Anfangswertes, ab.

Beispiel 3

Isomerisierung mit einem Enzym, das auf Amberlite IRA-93 immobilisiert worden ist.

100 g eines feuchten Amberlite IRA-93, eines MR-artigen schwach basischen Anionenaustauscherharzes (Bettvolumen: 164 ml) wird in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit einer 0,01 m MgCl₂-Lösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, equilibriert. Dann werden 400 ml einer Lösung einer teilweise gereinigten Isomerase in der gleichen Lösung (die 10000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 2000 ml Wasser durch die Säule geleitet, um etwa noch vorhandene nicht adsorbierte Isomerase wegzuwaschen. Anschließend wird das Harz aus der Säule herausgenommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht. Jedes g des Harzes (feucht) besitzt eine Aktivität von 17 Einheiten.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (feucht) (Bettvolumen: 82 ml) werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) gepackt. Die Säule wird auf einerTemperatur von 70⁰C gehalten. Eine 60 %-ige Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52 % der festen Substanz. Dieser Wert wird

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während einer Zeitspanne von 10 Tagen gehalten und nimmt dann in 15 Tagen auf 26 %, die Hälfte des Anfangswertes, ab.

Beispiel 4 Isomerisierung mit einem Enzym, das auf Amberlite IRA-904

immobilisiert worden ist.

100 g eines feuchten Amberlite IRA-904, eines MR-artigen stark basischen Anionenaustauscherharzes (Bettvolumen 150 ml) werden in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit einer 60 %-igen Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₉ enthält und auf ei-

^Δ -ι

nen pH-Wert von 8,0 eingestellt ist, equilibriert.

Dann werden 2500 ml einer Lösung einer rohen Isomerase in der gleichen Glucoselösung (die 10000 Glucoseisomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 4000 ml Wasser durch die Säule geschickt, um etwa noch vorhandene nicht adsorbierte Glucoseisomerase wegzuwaschen. Dann wird das Harz aus der Säule entnommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht. Jedes g des Harzes (feucht) zeigt eine Aktivität von 15 Einheiten.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (Bettvolumen: 75 ml) werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt, Die Säule wird auf einer Temperatur von 70⁰C gehalten. Eine 60 %-ige Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52 % der festen Substanz. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 13 Tagen gehalten und fällt dann in 18 Tagen auf 26 %, die Hälfte des Anfangswertes, ab.

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Beispiel 5 Demonstration mit 60 %-iger Dextrosekonzentration

50 g einer immobilisierten Isomerase werden hergestellt, wobei die Isomerase an Amberlite IRA-904 Harz nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise adsorbiert wird. Die an dem Harz gebundene Isomerase wird in eine 2,5 χ 20 cm Säule (Bettvolumen: 75 ml) eingefüllt. Dann wird eine 60 %-ige Glucoselösung mit einem pH-Wert von 8,0, die 0,01 m MgCl₂ enthält, durch die Säule bei 60 ⁰C geschickt, wobei der Ablauf gesammelt wird. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52 %. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 10 Tagen gehalten und fällt dann allmählich auf 26 % in 40 Tagen ab. _s

Beispiel 6

Kontinuierliche Isomerisierung mit dem auf Amberlite IRA-904 immobilisierten Enzym

50 g eines feuchten Amberlite IRA-904, eines MR-artigen stark basischen Anionenaustauscherharzes, werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt. Das Harz wird mit einer 0,01 m MgCl₂-Lösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt ist, äquilibriert. 3000 ml einer Lösung einer rohen Dextroseisomerase in der gleichen Lösung (die 5000 Isomeraseeinheiten enthält) wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule gelaufen ist, wird eine 60 %-ige Dextroselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 bei 70⁰C geschickt.

Die Isomerisierungsgeschwindigkeit wird mit einem Polarimeter gemessen und als Prozentsatz Lävulose der festen Substanz in dem Ablauf aus der Säule angegeben. Der Grad bleibt bei 52 %

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(Gleichgewichtswert) während der ersten 12 Tage. Danach vermindert er sich jedoch allmählich und fällt auf 26- ⁰C am 17. Tag

Zu diesem Zeitpunkt werden 1500 ml einer Lösung von Isomerase in einer 60 %igen Dextroselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist (entsprechend 2500 Isomeraseeinheiten) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Dann wird die Isomerisierungsreaktion in der Weise fortgesetzt, daß die gleiche Dextroselösung (ohne Isomerase) durch die Säule unter den gleichen Bedingungen geschickt wird, wie sie zur Durchführung der Isomerisierungsreaktion eingehalten worden sind.

Als Ergebnis dieser Arbeitsweise gewinnt die Harzsäule wieder ihren ursprünglichen Isomerisierungsgrad von 52 % zurück und behält diesen Wert während einer Zeitspanne von weiteren 12 Tagen bei. In den darauf folgenden 5 Tagen fällt jedoch der Isomerisierungsgrad auf 26 % ab. Zu diesem Zeitpunkt wird die Harzsäule erneut in der gleichen Weise reaktiviert. Sie erlangt wieder vollständig ihre Anfangsaktivität zurück.

Beispiel 7

Kontinuierliche Isomerisation mit auf Diaion PA-308 immobilisiertem Enzym

50 g eines feuchten Diaion PA-308, eines porösen stark basischen Anionenaustauscherharzes, werden in eine Säule (2,5 χ 2,0 cm) eingefüllt. Nachdem das Harz mit einer 0,01 m MgCl₂" Lösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, e'quilibriert worden ist, werden 200 ml einer Lösung einer teilweise gereinigten Dextroseisomerase in der gleichen Lösung (die 5000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV1 geschickt.

Dann wird eine 60 %-ige Dextröselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, durch die

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Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt, wobei die Säule auf einer Temperatur von 70⁰C gehalten wird. Der Isomerisierungsgrad wird kontinuierlich unter Einsatz eines Polarimeter s gemessen. Er bleibt bei 52 % während der ersten 3 Tage
bestehen und beginnt dann allmählich abzufallen. Zu diesem
Zeitpunkt wird die Fließgeschwindigkeit der Dextroselösung
herabgesetzt, so daß der Isomerisierungsgrad auf 52 % gehalten werden kann. Diese Methode wird durch die Herabsetzung der Fließgeschwindigkeit der Dextroselösung um SV 0,25 pro Tag ermöglicht,

10 Tage nach dem Zeitpunkt, bei welchem die Verminderung der
Fließgeschwindigkeit begonnen wurde (nachdem die Fließgeschwindigkeit auf SV 0,5 abgefallen war), werden 100 ml einer
Lösung von Isomerase in einer 60 %-igen Dextroselösung, die
0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist (entsprechend 2500 Glucoseisomeraseeinheiten) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 0,5 geschickt. Danach wird die Isomerisierungsreaktion durch Durchlaufenlassen der Dextroselösung (ohne Isomerase) durch die Säule mit der
anfänglichen Fließgeschwindigkeit, und zwar SV 3, fortgesetzt. Wiederholt man diese Arbeitsweise, dann ist es möglich, die
Isomerisierung mit einem Isomerisierungsgrad von 52 % fortzusetzen, so lange das Ionenaustauscherharz funktioniert. Es ist unnötig, die Säule während dieser Zeitspanne erneut zu füllen.

Beispiel 8

Kontinuierliche Isomerisierung mit auf Amberlite IRA-904 immobilisiertem Enzym

50 g eines feuchten Amberlite IRA-904-Harzes, ein MR-artiges
stark basisches Anionenaustauscherharz, wird in eine 2,5 χ
20 cm Säule (Bettvolumen: 75 ml) eingefüllt. Das Harz wird mit einer 0,01 m MgCl₂-Lösung (pH 8,0) equilibriert, worauf 200 ml einer Isomeraselösung, die 5000 Isomeraseeinheiten enthält,
durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von .= _SY 1 geschickt wird.

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Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule gelaufen ist, wird eine 60 %ige Dextroselösung (pH 8,0), die 0,01 m MgCl₂ enthält, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 2,5 bei 60⁰C geschickt. Der Isomerisierungsgrad des Ablaufs wird kontinuierlich unter Einsatz eines Polarimeters gemessen. Der Isomerisierungsgrad wird zuerst zu 45 % ermittelt und dann konstant (45 % ) durch Herabsetzung der Fließgeschwindigkeit der Dextroselösung um SV 0,04 pro Tag gehalten. Nachdem die Fließgeschwindigkeit auf SV 0,5 nach 50 Tagen abgefallen ist, werden 5000 Isomeraseeinheiten, gelöst in 200 ml der Dextroselösung, durch die Säule bei SV 0,5 geschickt, um das Harz zu reaktivieren.

Dann wird die Isomerisierungsreaktion in der Weise fortgesetzt, daß die Dextroselösung (ohne Isomerase) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 2,3 geschickt wird. Dabei wird ein Isomerisierungsgrad von 45 % erzielt. Die Fließgeschwindigkeit wird in der gleichen Weise, wie vorstehend geschildert worden ist, vermindert» Wiederholt man diese Arbeitsweise, dann ist es möglich, die Isomerisierung bei einem Grad von 45 % fortzusetzen, so lange das Harz funktioniert.

Erfindungsgemäß immobilisierte Enzymzubereitungen können im allgemeinen zur Isomerisierung von Dextrose bei einem pH zwischen ungefähr 6 und ungefähr 9 sowie bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20 und ungefähr 80⁰C verwendet werden. Bevorzugtere Bereiche liegen bei pH-Werten von 7,0 bis 8,5, insbesondere beträgt der pH-Wert 8,0, während vorzugsweise die Temperatur zwischen 60 und 70⁰C schwankt. Die zu isomerisierende Dextroselösung kann jede verarbeitbare Konzentration aufweisen. Für praktische Zwecke stellt eine 40 %ige Zuckerkonzentration in einem Glucosesirup die obere Grenze der praktischen Verarbeitbarkeit dar. Das Verfahren läßt sich jedoch bei jeder Konzentration, bei welcher ein Kontakt erfolgt, durchführen, und zwar unabhängig davon, ob eine chargenweise oder kontinuierliche Arbeitsweise

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durchgeführt wird.

Die zur Durchführung der Erfindung eingesetzten Harze liegen in Form von Einzelteilchen vor, damit gute hydraulische Eigenschaften in dem Isomerisierungsreaktionsgefäß ermöglicht werden. Die Harzteilchen zeichnen sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren innerhalb der Polymermatrix eines jeden Teilchens aus, so daß eine große Oberfläche für eine Adsorption und einen Kontakt zur Verfügung steht.

Wenn auch die immobilisierten Enzymzubereitungen hauptsächlich im Zusammenhang mit einer Verwendung in Säulen beschrieben worden sind, so eignen sie sich dennoch auch für die Durchführung von Isomerisierungen in beliebigen Formen, bei deren Durchführung sie in einfacher Weise in Kontakt mit der Dextrosevorratsflüssigkeit gebracht werden können. Es können daher Säulen, Filterpressen oder irgendwelche anderen Kontaktvorrichtungen oder -systeme verwendet werden.

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Claims

- 33 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Dextroseisomerase, dadurch gekennzeichnet, daß Dextroseisomerase an einem makroretikularen oder porösen stark basischen oder schwachbasischen Anionenaustauscherharz in der Weise adsorbiert wird, daß eine Lösung, die Dextroseisomerase enthält, in Kontakt mit dem Ionenaustauscherharz gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Enzyms in Kontakt mit einem in Form von Einzelteilchen vorliegenden Harzes gebracht wird, das sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren innerhalb der Polymermatrix zur Schaffung einer adsorptiven Oberfläche auszeichnet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Enzyms in Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz in Form von Einzelteilchen gebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Anionaustauscherharz aus einem stark basischen Anionenaustauscherharz oder aus einem schwach basischen Anionenaustauscherharz besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das in Form von Einzelteilchen vorliegende Harz porös ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

eine Lösung des Enzyms in Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz in Form von Einzelteilchen, das porös ist, gebracht wird, wobei das Harz durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren in der Polymermatrix seiner Teilchen, die eine große Oberfläche schaffen, charakterisiert ist.

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7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Harz ein raakroretikulares Anionenaustauscherharz ist.

8. Immobilisierte Dextroseisomerasezuberextung, gekennzeichnet durch eine Dextroseisomerase, die auf der Oberfläche eines Anionenaustauscherharzes adsorbiert ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionenaustauscherharz in Form von Einzelteilchen vorliegt und porös ist.

10. Zubereitung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Harz aus einem stark basischen oder aus einem schwach basischen Anionenaustauscherharz besteht.

11. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Dextroseisomerase auf der Oberfläche eines in Form von Einzelteilchen vorliegenden Anionenaustauscherharzes adsorbiert ist, das sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren, die eine adsorptive Oberfläche gestatten, in der Polymermatrix der Teilchen auszeichnet.

12. Verfahren zur Herstellung eines Lävulose enthaltenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Dextrose enthaltende Lösung mit einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung aus Dextroseisomerase, die auf einem Anionenaustauscherharz immobilisiert ist, in Kontakt gebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Anionenaustauscherharz in Form von Einzelteichen vorliegt und stark porös ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung, die Dextrose enthält, in Kontakt mit einer immobili-

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sierten Dextroseisomerasezubereitung gebracht wird, wobei die Dextroseisomerase auf einem in Form von Einzelteilchen vorliegenden Harz immobilisiert ist, das sich durch ein Netzwerk von Poren, die eine adsorptive Oberfläche schaffen, in der Polymermatrix der Teilchen auszeichnet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete, in Form von Einzelteilchen vorliegende Harz aus einem stark basischen oder schwach basischen Anionenaustauscherharz besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Anionenaustauscherharz ein makroretikulares Anionenaustauscherharz ist.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung, die Dextrose enthält, mit einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung bei. einem pH-Wert zwischen 7,0 und ungefähr 8,5 inkubiert wird, wobei die Zubereitung aus einer Dextroseisomerase gebildet wird, die auf der Oberfläche eines stark porösen und in Form von Einzelteilchen vorliegenden Anionenaustauscherharzes immobilisiert ist, das aus einem stark basischen oder schwach basischen Anionenaustauscherharz besteht.

18. Verfahren nach Anspruch 12 zur kontinuierlichen Herstellung eines Lävulose enthaltenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bett aus einer Vielzahl von Teilchen aus einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung geschaffen wird, wobei die Dextroseisomerase auf Teilchen aus einem porösen Anionenaustauscherharz immobilisiert ist, das aus einem stark basischen oder schwach basischen Anionenaustauscherharz besteht, eine Lösung, welche Dextrose enthält, durch das Bett geschickt wird, und ein Lävulose enthaltendes Produkt gewonnen wird.

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19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwichen ungefähr 7,5 und ungefähr 8 gehalten wird, eine Konzentration an Dextrose in der Dextrose enthaltenden Lösung von ungefähr 30 bis ungefähr 70 Gewichtsprozent eingehalten wird und die Temperatur zwischen ungefähr 60 und ungefähr 70 ⁰C einreguliert wird.

20. Verfahren zur Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose, dadurch gekennzeichnet, daß eine Dextroselösung, die auf einen pH-Wert von ungefähr 7,0 bis 8,5 eingestellt worden ist, kontinuierlich in Kontakt mit einer immobilisierten Dextroseisomerase gebracht wird', die in der Weise hergestellt wird, daß eine Dextroseisomeraselosung in Kontakt mit einem makroretikularen oder porösen stark basischen oder schwach basischen Anionenaustauscherharz gebracht wird.

21. Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung, die Dextrose enthält, bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 7,0 und ungefähr 8,5 durch ein Bett aus einer immobilisierten Dextroseisomerase geschickt wird, das in der Weise hergestellt wird, daß eine Lösung aus Dextroseisomerase in Kontakt mit einem porösen oder makroretikularen stark basischen Anionenaustauscherharz gebracht wird, eine Lävulose enthaltende Lösung von dem Bett abgezogen wird, bis eine Abnahme der Enzymaktivität auftritt, dann frische Dextroseisomerase durch das Bett geschickt wird, damit diese immobilisiert wird, weiterhin die Lösung, die Dextrose enthält, durch das reaktivierte Bett geleitet wird, und eine zusätzliche Lävulose enthaltende Lösung gewonnen wird.

22. Verfahren zur Herstellung eines Lävulose enthaltenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Dextrose enthaltende Lösung in Kontakt mit einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung gebracht wird, die aus Dextroseisomerase besteht, die auf einem- Anionenaustauscherharz immobilisiert ist,

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ein Lävulose enthaltendes Produkt abgetrennt wird, und zusätzliche frische Dextroseisomerase in Kontakt mit dem Harz zur Erhöhung der Aktivität der Zubereitung gebracht wird.

23. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Anionenaustauscherharz in Form von Einzelteilchen vorliegt und stark porös ist.

24. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das in Form von Einzelteilchen vorliegende Harz ein stark basisches Anionenaustauscherharz ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Anionenaustauscherharz ein makroretikulares Harz ist.

26. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung eines Lävulose enthaltenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Dextrose enthaltende Lösung in Kontakt mit einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung gebracht wird, wobei die Dextroseisomerase auf einem in Form von Einzelteilchen vorliegenden Harz immobilisiert ist, das sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren, die eine adsorptive Oberfläche schaffen,

in der Polymermatrix seiner Teilchen auszeichnet, ein Lävulose enthaltendes Produkt, das bei der Kontaktierung anfällt, . gewonnen wird, und frische Dextroseisomerase in Kontakt mit dem in Form von Einzelteilchen vorliegenden Harz gebracht wird, um die Aktivität der Zubereitung zu erhöhen.

27. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die frische Dextroseisomerase in Kontakt mit dem in Form von
Einzelteilchen vorliegenden Harz gebracht wird, während sie in die Lösung eingemischt ist, die Dextrose enthält, und in Kontakt mit der Zubereitung gebracht wird.

28. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die frische,Dextroseisomerase in Kontakt mit der Zubereitung

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nach einer Verminderung der Aktivität der ursprünglichen Zubereitung gebracht wird.

29. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das in Form von Einzelteilchen vorliegende eingesetzte Harz ein stark basisches Anionenaustauscherharz ist.

30. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das in Form von Einzelteilchen vorliegende Harz ein makroretikulares stark basisches Anionenaustauscherharz ist.

31. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung eines Lävulose enthaltenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung, die Dextrose enthält, durch ein Bett aus einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung gebracht wird, wobei die Dextroseisomerase auf einem in Form von Einzelteilchen vorliegenden Harz immobilisiert ist, das sich durch das Vorliegen eines Netzwerks von Poren, die eine adsorptive Oberfläche darstellen, in der Polymermatrix seiner Teilchen auszeichnet, kontinuierlich ein Lävulose enthaltendes Produkt aus dem Bett abgezogen wird, bis eine Verminderung der Enzymaktivität auftritt, frische Dextroseisomerase durch das Bett in Kontakt mit dem in Form von Einzelteilchen vorliegenden Harz zur Erhöhung der Aktivität der Zubereitung geschickt wird, kontinuierlich die Lösung, die Dextrose enthält, durch das Bett mit seiner erhöhten Aktivität geleitet wird, und kontinuierlich zusätzliche Lävulose enthaltende Lösung aus dem Bett abgezogen wird.

32. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Harz ein makroretikulares stark basisches Anionenaustauscherharz ist.

33. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die frische Dextroseisomerase in Kontakt mit dem Harz gebracht

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wird, während es in die Lösung eingemischt ist, die Dextrose enthält und in Kontakt mit der Zubereitung gebracht wird.

34. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung eines Lävulose enthaltenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß kontinuierlich eine Lösung, die Dextrose enthält, bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 7,0 und ungefähr 8,5 durch ein Bett aus einer immobilisierten Dextroseisomerasezubereitung geschickt wird, wobei die Dextroseisomerase auf einem in Form von Einzelteilchen vorliegenden stark basischen Anionenaustauscherharz immobilisiert ist, welches sich durch ein Netzwerk von Poren, die eine adsorptive Oberfläche darstellen, in der Polymermatrix auszeichnet, kontinuierlich aus dem Bett ein Lävulose enthaltendes Produkt so lange abgezogen wird, bis eine Aktivitätsverminderung der ursprünglichen Zubereitung erfolgt, frische Dextroseisomerase dem Beschickungsstrom der Dextrose enthaltenden Lösung zugesetzt wird und die .dabei erhaltene Mischung durch das Bett in Kontakt mit der Zubereitung zur Erhöhung der Aktivität der Zubereitung ohne Unterbrechung der Isomerisierung geschickt wird und kontinuierlich anschließend ein weiteres Lävulose enthaltendes Produkte aus dem Bett abgezogen wird.

35. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert ungefähr 8 beträgt.

36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte in Form von Einzelteilchen vorliegende Harz ein makroretikulares stark basisches Anionenaustauscherharz ist.

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