DE2443895B2 - Immobilisierte Dextroseisomerase-Zubereitung, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung für die Isomerisierung von Dextrose - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine immobilisierte Dextroseisomerase-Zubereitung in Form von Einzelteilchen, wobei das Enzym an die Oberfläche eines stark basischen Anionenaustauscherharzes adsorbiert ist, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung in einer Säule für die wirksame und bequeme Isomerisierung von Dextrose in großtechnischem Maßstäbe.

Dextroseisomerase ist der gebräuchliche Name für ein Enzym, das Dextrose in Lävulose und Lävulose in Dextrose umwandeln kann. Dextroseisomerase wird bisher hauptsächlich für die Herstellung von Lävulose aus Dextrose angewendet.

Derzeit wird das Enzym in Japan für die Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose enthaltendem Sirup in großtechnischem Maßstabe eingesetzt. Diese Reaktion wird in der Weise durchgeführt, daß eine Dextroselösung bei Temperaturen zwischen 60 und 70⁰C etwa 48 Stunden lang in Kontakt mit dem Enzym gehalten wird. Der Nachteil dieses ansatzweise durchgeführten (diskontinuierlichen) Verfahrens besteht darin, daß der Ausnutzungswirkungsgrad des verwendeten Enzyms gering ist. Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß das dabei erhaltene Produkt auf kostspielige Weise gereinigt werden muß, da es sich während der Umsetzung, die bei verhältnismäßig hohen Temperaturen über einen langen Zeitraum hinweg durchgeführt wird, verfärbt.

Man hat nun versucht, diese Probleme dadurch zu lösen, daß man die Dextroseisomerase durch Adsorption an einem Substrat immobilisiert. In den letzten

Jahren wurden verschiedene Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen, speziell von Dextroseisomerase, entwickelt Diese Verfahren lassen sich groß in zwei Gruppen einteilen:

(1) in solche, bei denen das Enzymprotein chemisch über eine kovalente Bindung oder elektrisch durch Adsorption an einen wasserunlöslichen Träger gebunden wird,

(2) solche, bei denen das Enzymprotein mit einer Verbindung mit mehr als zwei funktioneilen Gruppen vernetzt wird,

denen das Enzymprotein in einem in einer semipermeablen Membran

(3) solche, bei
Gelgitter oder
fixiert wird und

(4) solche, bei

denen intrazelluläre Enzyme durch physikalische oder chemische Behandlung in Zellen fixiert werden.

Aus der US-Patentschrift 37 08 379 und aus »Journal of Food Science and Technology« Band 14, Nr. 12, 539 (1967), sind Verfahren zur Immobilisierung von Dextroseisomerase bekannt, bei denen das Enzym an DEAE-Cellulose bzw. an einem DEAE-Ionenaustauscherharz adsorbiert wird. Aus »Biotechn. and Bioeng.« Band XIV, 509 (1972), ist ein Verfahren bekannt, bei dem das Enzym kovalent mit Aminoalkylglas (Diazoverfahren) verbunden wird. Alle diese Verfahren sind der o. g. Gruppe (1) zuzuordnen. Ein Verfahren der Gruppe (2) ist die Vernetzung des Enzyms mit Glutaraldehyd während ein Beispiel für ein Verfahren der Gruppe (3) die Fixierung des Enzyms in einem Polyacrylamidgel [vgl. »Appl. Microbiol.« 21,588 (1971)] ist. Ein Verfahren der Gruppe (4) ist die Fixierung des Enzyms innerhalb von Zellen durch Behandlung der Zellen mit Glularaldehyd (vgl. japanische Patentanmeldung S 47-45 546).

Eine immobilisierte Glukoseisomerase, die nach einem der Verfahren der o.g. Gruppen (2), (3), (4) hergestellt worden ist, hat jedoch beim Einbringen in große Säulen schlechte hydraulische Eigenschaften. Es ist schwierig, in diesen eine konstante Fließgeschwindigkeit über einen längeren Zeitraum hinweg aufrechtzuerhalten. Andererseits sind DEAE-Cellulose und Aminoalkylglas für die Verwendung zur Durchführung einer kontinuierlichen Isomerisierung von Dextrose in großtechnischen Maßstabe zu teuer. Da Ionenaustauscherharze weniger kostspielig sind und in Säulen eingesetzt werden können, hat man versucht, Dextroseisomerase an lonenaustauscherharzen zu immobilisieren. Derartige Verfahren, die zu solchen der o.g. Gruppe (1) gehören, sind beispielsweise aus »Ferment Tech.« 49, Nr. 6, 565 (1971), »Enzymologie« 31, 214 (1966), und aus der deutschen Offenlegeschrift 20 61 371 bekannt. Diese Verfahren haben jedoch keinen Eingang in die Großtechnik gefunden, da sich nur verhältnismäßig geringe Mengen an Enzym (Dextroisomerase) an den bisher verwendeten lonenaustauscherharzen adsorbieren lassen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, Mittel und Wege zu finden, um die Dextroisomerase auf wirksamere Weise als bisher zu immobilisieren.

Es wurde nun gefunden, daß man diese Aufgabe dadurch lösen kann, daß man das Enzym an der Oberfläche eines stark basischen, porösen Anionenaustauscherharzes mit speziellen lonenaustauschergruppen adsorbiert.

Gegenstand der Erfindung ist eine immobilisierte Dextroseisomerase-Zubereitung in Form von Einzelteilchen, wobei das Enzym an die Oberfläche eines stark basischen Anionemiustauscherharzes adsorbiert ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Austauscherharz ein

poröses Anionenaustauscherharz mit der Gruppierung
-N(CH₃J₃X' oder N(CHj)₂X

C₂H₄OH
als Ionenaustauschergruppe eingesetzt worden ist

Bei dem erfindungsgemäß verwendeten porösen Anionenaustauscherharz handelt es sich vorzugsweise um ein makroretikulares Harz oder ein solches, das sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren innerhalb der Polymermatrix auszeichnet

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend angegebenen immobilisierten Extroseisomerase-Zubereitung, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß die Dextroisomerase an dem porösen, stark basischen Anionenaustauscherharz in der Weise adsorbiert wird, daß eine Dextroseisomerase enthaltende Lösung mit dem in Form von Einzelteilchen vorliegenden porösen Anionenaustauscherharz in Kontakt gebracht wird.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Dextroseisomerase-Zubereitung für die Isomerisierung von Dextrose.

Auf diese Weise ist es möglich, eine kontinuierliche Isomerisierung der Dextrose unter maximaler Ausnutzung des Enzyms (Dextroisomerase) in einem großtechnischen Maßstabe durchzuführen. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf alle Typen von Dextroseisomerase anwenden einschließlich solcher Zubereitungen, in denen das Enzym eine überwiegende oder schnellere katalytische Wirkung auf eine Isomerisierung ausübt, die von der Isomerisierung von Dextrose zu LävLiose verschieden ist.

Die an einem makroretikularen oder porösen, stark basischen Anionenaustauscherharz durch Adsorption immobilisierte Dextroseisomerase läßt sich kaum daraus eluieren und bleibt während einer längeren Isomerisierungsreaktion stabil, wenn die .Substratlösung auf pH-Werte innerhalb des Bereiches von 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.

In der Praxis wird die Isomerisierung von Dextrose zu Lävulose in der Weise durchgeführt, daß eine Dextrose enthaltende Lösung, deren pH-Wert vorher auf etwa 8,0 eingestellt worden ist, kontinuierlich durch eine Säule fließen gelassen wird, die mit einer immobilisierten Dextroseisomerase gefüllt ist. Sobald die Aktivität der immobilisierten Dextroseisomerase und damit die Isomerisierungsgeschwindigkeit abfällt, kann das Enzyme dadurch regeneriert, d. h. reaktiviert, werden, daß man der Dextrose enthaltenden Lösung Dextroseisomerase zusetzt. Dadurch wird vermieden, daß die Isomerisierungsreaktion unterbrochen wird, was für die kontinuierliche Isomerisierung im Rahmen eines großtechnischen Verfahrens sehr bedeutsam ist.

Das hier als Dextroseisomerase bezeichnete Enzym, das die Fähigkeit hat, Dextrose zu Lävulose zu isomerisieren, ist unter verschiedenen Bezeichnungen bekannt. Dieses Enzym wird in der US-Patentschrift 29 50 228 als Xyloseisomerase bezeichnet, da es Xylose zu Xylulose isomerisiert. Außerdem wird es als Glukoseisomerase bezeichnet. Nachfolgend wird stets der Ausdruck »Dextroseisomerase« oder »Isomerase« dafür verwendet.

Unter dem hier verwendeten Begriff »D. E.« ist die Abkürzung für »Dextroseäquivalent« zu verstehen. Mit diesem Begriff läßt sich der Gehalt eines Materials an reduzierendem Zucker, berechnet als Dextrose und ausgedrückt als Prozents:.'!/ der Gesamtfeststoffe, angeben.

Unter dem hier verwendeten Ausdruck »Stärkehydrolysat« ist ein Sirup oder Trockenprodukt zu verstehen, das bei der Hydrolyse von Stärke hergestellt wird. Ein solches Produkt kann durch saure oder enzymatische Hydrolyse hergestellt werden. Ein bevorzugter Typ eines solchen Stärkehydrolysat», das zur Durchführung der erfindungsgemäßen Isomerisierung verwendet wird, wird durch Säureverdünnung oder

ίο Enzymverdünnung bis zu einem D. E von 10 oder weniger und anschließender ertzymatischer Verzuckerung bis zu einem D. E von 95, vorzugsweise von mehr als 97,5, hergestellt
Stärkehydrolysate mit einem mittleren D. E. werden

π normalerweise als »Glukose« bezeichnet, unabhängig davon, ob das Stärkehydrolysat in Form eines Sirups od<jr in Form von Feststoffen vorliegt Der Begriff »Dextrose« ist in der Regel für das raffinierte !kristalline Monosaccharid reserviert das aus einem Stärkehydrolysat mit hohem D. E. gewonnen wird, oder er steht für D-Glukose als Bestandteil von Stärkehydrolysate^ Der hier verwendete Ausdruck »Dextrose« steht für dieses Monosaccharid in jeder Form, und zwar in Lösung oder in trockenem Zustand, als Bestandteil eines Stärkehy-

_>> drolysats, von Sirupfeststoffen oder in raffinierter kristalliner Form.

Die Begi iffe »Fructose« und »Lävulose« stehen beide für das gleiche Isomere von Dextrose, das süßer als Dextrose ist. Dieses Isomere findet sich in Honig s( wie

to Invertzucker, und zwar zusammen mit Dextrose, und es ist wegen seiner Süßheit wertvoll. Unter dem hier verwendeten Ausdruck »Lävulose« ist nachstehend dieses Monosaccharid zu verstehen.

Die erfindungsgemäß verwendeten porösen oder

Ci makroretikularen, stark basischen Ionenaustauscherharze sind im Handel erhältlich.

Bei den nachfolgend angegebenen Harzen A, B und C handelt es sich um makroretikulare, stark basische Anionenaustauscherharze (vom MR-Typ), bei den

κι nachfolgend erwähnten Harzen D, E und F handelt es sich um poröse, stark basische Anionenaustauscherharze.

Bei den nachfolgend erwähnten Harzen G und H handelt es sich um makroretikulare bzw. poröse.

π schwach basische Anionenaustauscherharze.

Die L-rfindungsgeinäß verwendeten Harz- oder Polymerteilchen werden am zweckmäßigsten in Form von Körnchen oder Kügelchen eingesetzt, deren Größe innerhalb des Bereiches 1,2 bis 0,15 mm, vorzugsweise

,1) 0,84 bis (UO mm, liegt.

Das erfindungsgemäß verwendete Enzym Dextroisomerase kann aus den verschiedensten Mikroorganismen gewonnen werden. Eine erfindungsgemäß geeignete Dextroiüomerase kann beispielsweise in den Zellen von

r> Strahlenpilzen (z. B. Streptomyces albus) oder Bakterien (beispielsweise Lactobacillus brevis), die als Dextroseisomerase erzeugende Mikroorganismen bekannt sind, entstehen. Sie wird in den verschiedenen Formen der rohen Isomerase eingesetzt, die aus den

W) Zellen der erzeugenden Mikroorganismen extrahiert werden, und zwar durch Autolyse oder durch Ultraschallbeihandlung, woran sich eine Trennung von den Zellresten anschließt. Sie kann ferner als teilweise ge> einigte Isomerase eingesetzt werden, die durch

h'> Entfernung von Nukleinsäure erhalten wird, die in der rohen Isomerase zusammen mit Protaminen oder als kristalline Isomerase, die durch Kristallisation aus teilweise gereinigter Isomerase erhalten wird, die weiter

durch eine Fraktionierung mit Ammoniumsulfat gereinigt worden ist, vorliegt.

Jedes Enzym scheint seine besonderen Eigenschaften zu besitzen, beispielsweise hinsichtlich des optimalen pH-Wertes, der optimalen Temperatur, der erforderlichen Metallionen, der Michaelis-Konstante sowie des Mechanismus der Lävuiosebildung, wobei alle diese Eigenschaften von einem Enzym zu dem anderen etwas verschieden zu sein scheinen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch zur Herstellung von immobilisierten Isomeraseenzymzubereitungen aus allen bekannten Mikrobenquellen und insbesondere aus allen Streptomyces-Spezies und -Stämmen sowie allen Bacillus-Spezies und -Stämmen, die Dexlroseisomeraseenzym bilden.

Bevorzugte Mikroorganismen zur Erzeugung einer geeigneten Isomerase, die zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden kann, sind die Vertreter des Genus Streptomaces. Besonders bevorzugte Spezies dieses Genus sind S. venezuelae und S. olivochromogenes. Kulturen bevorzuger Stämme dieser Organismen sind bei American Type Culture Collection, Washington, D. C, USA, hinterlegt und deren permanenter Mikroorganismensammlung zugefügt worden. Sie haben die folgenden Bezeichnungen erhalten: S. venezuelae ATCC 21 113 und S. olivochromogenes ATCC 21 114.

Die am meisten bevorzugten Mikroorganismen sind Mutantenstämme von Streptomyces olivochromogenes insbesondere S. olivochromogenes ATCC Nr. 21 713, 21 714, 21 715 sowie ihrer Äquivalente. Diese Mikroorganismen bilden erhebliche Mengen an Isomerase, wenn sie in Nährmedien gezüchtet werden, die frei von Xylose, von Xylose-Iiefernden Materialien und frei von zugesetztem Kobalt sind.

Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Enzymaktivität definiert, die 1 Mikromol Lävulose innerhalb von 1 Minuten unter den nachfolgend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen bildet. Zur Herstellung eines Enzyms zur Untersuchung ist es zuerst notwendig, es in eine lösliche Form zu überführen. Eine geeignete Methode, dies zu bewerkstelligen, besteht in einer Ultraschallbehandlung.

Die Zellen aus einem bekannten Volumen einer Kulturbrühe werden erneut in einem 0,05molaren Phosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Die Suspension wird dann unter Verwendung eines handelsüblichen Ultraschallbehandlungsgerätes (20 kHz) so lange einer Schallbehandlung unterzogen, bis die Mikrobenzellen in ausreichendem Maße aufgebrochen sind, so daß das Isomeraseenzym im wesentlichen vollständig freigesetzt ist. Hält man das Probenröhrchen in einem Eisbad während der Ultraschallbehandlung, dann wird ein Überhitzen und eine Enzyminaktivierung vermieden. Die erhaltene Enzymzubereitung ist eine Lösung von solubilisierter Isomerase.

Das Prüfverfahren sieht die Durchführung einer spektrophotometrischen Bestimmung der Ketose vor. die aus einer Dextroselösung unter standardisierten Bedingungen erzeugt worden ist. Eine Ausgangslösung wird in der folgenden Weise hergestellt:

Komponenten

Menge

Die zu untersuchende Enzymzubereitung wird zuerst soweit verdünnt, daß sie 1 bis 6 Isomeraseeinheiten pro ml enthält.

Eine enzymatische Isomerisierung wird in der Weise durchgeführt, daß 1 ml der Enzymzubereitung zu 3 ml der Ausgangslösung zugegeben wird, worauf eine Inkubation während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 60°C durchgeführt wird. Nach Beendigung der Inkubalionsperiode wird ein 1 ml-Aliquot entnommen und in einem 9-ml-Volumen einer 0,5 n-Perchlorsäure abgeschreckt. Das abgeschreckte Aliquot wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zu Vergleichszwecken wird eine D-Glucose-Blindprobe verwendet, wobei 1 ml Wasser anstelle von 1 ml der Enzymzubereilung in Lösungsform zu Beginn der Inkubationsperiode verwendet wird.

Die Ketose wird dann nach der Cystein/Schwefelsäure-Methode bestimmt. Zur Durchführung dieser Untersuchung wird eine Isomeraseeinheit als die Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Lävulose pro Minute unter den beschriebenen Isomerisierungsbedingungen zu bilden.

Unter porösen !onenaustauscherharzen sind solche Ionenaustauscherharze zu verstehen, die viele Poren besitzen. Derartige Ionenaustauscherharze sind im allgemeinen für eine Adsorption geeignet. Makroretikulare Ionenaustauscherharze werden allgemein als solche vom MR-Typ bezeichnet und besitzen relativ große Poren. Unter stark basischen Anionenaustauscherharzcn sollen Harze mit der Gruppierung

0,1 m MgSO₄ - 7 H₂O
0.01 m CoCI₂ ■ 6 H₂O
1 m Phosphalpuffer, pH 7.5
wasserfreie D-GIucose
destilliertes Wasser

1 ml
1 ml
0,5 ml
1,44 g
ad 7.5 ml

als lonenaustauschergruppe verstanden werden. Diese Harze unterscheiden sich von denjenigen mit der Gruppierung

C₂H₄OH

als lonenaustauschergruppe.

Makroretikulare Harze zeichnen sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes aus »extrazellularen« Mikrokanälen oder Poren innerhalb der Polymermatrix aus. Wenn auch diese Mikrokanäle sehr klein sind, so sind sie dennoch groß im Vergleich zu den Poren von üblichen homogenen vernetzten Zellen. Makroretikulare Harze, die für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, können spezifische Oberflächen von bis zu 2000 mVg oder mehr besitzen.

Die Oberfläche, die Porosität (oft in ml/ml oder cmVcm³ angegeben) und andere physikalische Eigenschaften von makrorctikularen Harzen können unter Anwendung anerkann'er Methoden gemessen werden (vergleiche z. B. »Oxidation-Reduction Polymers«, Harold G. C a s s i d y et aU Interscience Pub. N. Y., N. Y., 1965, S. 152-167).

Um die hohe Porosität sowie die großen spezifischen Oberflächen zu erzeugen, die im Falle der erfindungsgemäß verwendeten Harze erforderlich sind, können die Suspensionspolymerisationsmethoden der GB-PS 9 32 126 angewendet werden.

Nachfolgend werden die Methoden erläutert, mit deren Hilfe die Dextroseisomerase an diesen Anionenaustauscherharzen adsorbiert wird. Die Isomerase wird in Form von Lösungen verwendet, und zwar in Form von 0,01 bis 0,1 m tris-HCl- oder Phosphatpufferlösungcn. von Salzlösungen, wie beispielsweise

MgCb- oder KNOj-Lösungen, wobei alle Lösungen auf einen pH-Wert von 6 bis 9 (vorzugsweise 7 bis 8) eingestellt sind. Man kann auch einfach Lösungen in Wasser oder in Dextrose verwenden, wobei alle Lösungen Konzentrationen zwischen 3 und 50 Einheiten/ml aufweisen.

Das lonenausiauscherharz wird in eine Säule mit der entsprechenden Größe eingefüllt, und dann durch Durchschicken der gleichen Lösung, wie sie zum Auflösen der Isomerase verwendet worden ist, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit zwischen 1 und 3 SV während einer Zeitspanne von 5 bis 10 Stunden äquilibriert (»SV« ist eine Abkürzung für »Substratgeschwindigkeit« und betrifft die Fließgeschwindigkeit in Bettvolumina pro Stunde. 1 Bettvolumen ist das Subsiraivolumcn pro Stunde, das dem Säuienvolumc-n äquivalent ist, das von dem Harz in der Säule eingenommen wird), lonenaustauschergruppen, wie Chlorid, Sulfat, Bisulfat, Nitrat, Carbonat, Bicarbonal, Borat oder Phosphat, ergeben bessere Ergebnisse bezüglich der Adsorption von Dextroseisomerase als OH-Gruppcn. Dann wird eine Menge der Dextroseisomeraselösung, die 10 bis 100 Einheiten (vorzugsweise 50 Einheiten) des Enzyms pro g des Harzes (feucht) entspricht, durch die Harzsäule mit einer Fließgeschwindigkeit zwischen 1 und 3 SV geschickt. Nachdem die gesamte Enzymlösung durch die Säule gelaufen ist, wird Wasser durch die Säule geleitet, um nichtadsorbierte Isomerase auszuwaschen. Anschließend wird das Harz aus der Säule entnommen und auf seine lsomeraseaktivität untersucht.

Als Ergebnis einer Reihe von Versuchen wurde festgestellt, daß die enzymisch-chemischen Eigenschaften, wie z.B. optimaler pH-Wert und Wärmewiderstandsfähigkeit, von Dextroseisomerase, die an einem lonenaustauscherharz immobilisiert worden ist, praktisch ähnlich den Eigenschaften der ursprünglichen löslichen Dextroseisomerase sind. Ferner zeigt diese ) immobilisierte Isomerase keinen Abfall der Enzymaktivität nach einer Zeitspanne von 3 Monaten, wenn sie bei Temperaturen unterhalb 10⁰C an dunklen Stellen aufbewahrt worden ist. Natürlich kann die auf diese Weise hergestellte immobilisierte Dextroseisomerase

κι auch sofort für eine Isomerisierung verwendet werden, ohne daß dabei ein Waschen mit Wasser erforderlich ist, und zwar durch Durchleiten einer Dextroselösung durch eine Säule, die mit dieser Isomerase gefüllt ist, wobei die nachfolgend beschriebenen Bedingungen eingehalten

ι^r) werden.

Nachfolgend wird eine Untersuchung beschrieben, um zu zeigen, daß MR-artige oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze bezüglich ihres Vermögens, Dextroseisomerase zu immobilisieren, gegenüber anderen Ionenaustauscherharzen besonders hervorstechen.

3-g-Portionen von jeweils einigen im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharzen (feucht) werden jeweils in verschiedene Säulen eingefüllt. Nachdem die Harze gründlich mit einer 0,05 tris-HCI-Pufferlösung

2") äquilibriert worden sind, wird eine Lösung von 250 Einheiten an kristalliner Dextroseisomerase in der gleichen Pufferlösung durch jede der Säulen mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt.

Nachdem die ganze Isomeraselösung durchgelaufen

κι ist, wird jede der Harzsäulen mit Wasser gewaschen. Dann werden die Harze aus den jeweiligen Säulen entnommen und auf ihre enzymatische Aktivität untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Tabelle

Klassili/icruni:

Stark saures Kalioncnaustauscherharz

Stark saures Kationcnauslauscherharz

Stark saures Kationenaustauscherharz

Schwach saures Kaüonenaustauscherharz

Schwach saures Kationenaustauscherharz

Stark basisches Anionenauslauscherharz (erfindungsgemäß)

Stark basisches Anionenaustauscherharz (erfindungsgemäß)

Stark basisches Anionenaustauscherharz (erfindungsgemäß)

Stark basisches Anioncnaustauscherharz (erfindungsgemäß)
Auslauschcrharz

(jriindlvp	loncnauslauschergnippc	Wirksamer pH Bereich	Menge des atisor bierlen Hnrvms (Einhcit/g des feuchten Harzes)
Gel	— SO3M	0—14	0
porös	-SO3M	0—14	0
MR	-SO3M	0—14	0
porös	-COOM	5—14	0
MR	-COOM	4—14	0
Gel	-N-(CH3J3X — N —(CH3)3X	0—14 0—14	0,4 0
porös	-N-(CH3J3X -N-(CH3J3X	0—14 0—14	10 19
MR	-N-(CH3J3X — N-(CH3J3X	0—14 0—14	6 24
Gel	-N-(CH3J2X CH. ΩΜ	0—14 0—14 0—14	21 0,4 0.1

Fortsetzung

Kliissili/icruni!

(irundl)p

Stark basisches Anionenaustauscher- porös

harz (erfindungsgemäß)

Austauscherharz

Stark basisches Anionenaustauscher- MR
harz (erfindungsgemäß)
Austauscherharz

Mittelbasisches Anionenauslauscher- Gel

onciiiiuslaiisL'hcr^ruppc	Wirksamer pi I-Bereich	Menge des iidsni bierleii !.n/jms Ibinhcii/j! des leuchten Hur/es)
— r C	0—14 0—14	2 0,3
•J -(CH3J2X .'2H4OH	0—14	2
-N-(CHj)2X
C2H4OH	0—')	0,2
— N(R)2

Wie aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht, zeigen >» die Kationenaustauscherharze kein Adsorptionsvermögen. Demgegenüber ragen MR-artige oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze bezüglich ihres Vermögens, Dextroseisomerase zu adsorbieren, deutlich heraus, »ι

Nachfolgend wird die Bestimmung der Enzymstabilität beschrieben.

3 g von jeweils verschiedenen Arten einer immobilisierten Dextroseisomerase werden hergestellt, wobei die Isomerase an den lonenaustauscherharzen A-D jo und F-H adsorbiert ist. |edes Harz wird dann in eine andere Säule eingefüllt.

Dann wird die Stabilität einer jeden der immobilisierten Enzymproben in der Weise untersucht, daß eine 60%ige Glucoselösung durch die Säulen unter den r> nachfolgend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen geschickt wird. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der F i g. 1 hervor, in welcher die vertikale Achse den Prozentsatz der Lävulose in der festen Substanz der Zuckerlösung, die aus jedem Volumen herausgenom- -to men ist, und die horizontale Achse die Betriebszeit der Säule angeben. In dieser Figur bedeutet »a« die Isomerisierungsreaktion, welche unter Einsatz der immobilisierten Isomerase durchgeführt wird, die unter Verwendung des Harzes A hergestellt worden ist, »b« r> bedeutet die Isomerisierungsreaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Verwendung des Harzes G hergestellt worden ist, »c« bedeutet die Isomerisierungsreaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt χι worden ist, das unter Verwendung des Harzes B hergestellt worden ist, »d« bedeutet die Isomerisierungsreaktion, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Einsatz des Harzes D hergestellt worden ist, »e« ist die Reaktion, v. die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt wird, das unter Verwendung des Harzes H hergestellt worden ist, während »f« die Reaktion ist, die unter Einsatz des immobilisierten Enzyms durchgeführt worden ist, das unter Verwendung des Harzes C sowie bo des Harzes F hergestellt worden ist

Im Falle »a« bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52% während der ersten 12 Tage stehen, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 26% nach 17 Tagen ab. Im Falle »b« bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52% während der ersten 11 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 26% nach 16 Tagen ab. Im Falle von »c« bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52% während der ersten 10 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder 26% nach 15 Tagen ab. Im Falle von »d« bleibt der Lävulosegehalt in dem Ablauf bei 52% während der ersten 6 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 26% nach 10 Tagen ab. Im Falle von »e« bleibt der Lävulosegehalt bei 52% während der ersten 3 Tage, fällt jedoch auf die Hälfte oder auf 26% nach 6 Tagen ab. Im Falle von »f« nimmt der Lävulosegehalt in dem Ablauf innerhalb von 1 Tag auf 26% ab.

Die Zeitspanne, während welcher der Prozentsatz der Lävulose auf die Hälfte des Anfangswertes absinkt, wird als die Halbwertszeit der immobilisierten Isomerase bezeichnet. Aus Fig. 2 geht hervor, daß die immobilisierte Isomerase, die unter Einsatz der Harze A und B hergestellt worden ist, wobei es sich bei diesen Materialien um MR-artige stark basische Anionenaustauscherharze handelt, sowie unter Verwendung des Harzes G erzeugt worden ist, das ein MR-artiges schwach basisches Anionenaustauscherharz ist, sich deutlich bezüglich der Stabilität abhebt und Halbwertszeiten von 17 Tagen, 15 Tagen bzw. 16 Tagen zeigt. Von den porösen Harzen sind die Harze D, ein stark basisches Anionenaustauscherharz, und H, ein schwach basisches Anionenaustauscherharz, etwas weniger günstig bezüglich der erhaltenen Ergebnisse. Die Dextroseisomerase zeigt eine Halbwertszeit von 10 Tagen, wenn sie mit dem Harz D immobilisiert wird, sowie von 6 Tagen, wenn sie unter Einsatz des Harzes H immobilisiert wird.

Obwohl sie dem gleichen MR- und Porentyp entsprechen, besitzen die Harze C und F, bei denen es sich um stark basische Harze handelt, ein sehr geringes Vermögen, Dextroseisomerase zu adsorbieren. Die erhaltene immobilisierte Isomerase besitzt eine Halbwertszeit von nur 1 Tag. Andere gelartige Harze adsorbieren nur sehr wenig Isomerase, wobei die Halbwertszeit der erhaltenen immobilisierten Isomerase kurzer als 1 Tag ist Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß MR-artige oder poröse stark basische Anionenaustauscherharze bezüglich der Immobilisierung von Dextroseisomerase deutlich herausragen.

Nachfolgend wird eine Methode zur Isomerisierung von Dextrose unter Einsatz einer immobilisierten Isomerase, die erfindungsgemäß erhalten worden ist erläutert

Beispiele für Dextrose, die eingesetzt werden kann, sind folgende: kristalline Dextrose (Dextrosegehalt: oberhalb 99%), pulverisierte Dextrose (etwa 90%), G lucosesirup (40 bis 90%) sowie Hydrol (50 bis 60%).

Diese Dextrosearten werden jeweils in einer Konzentration zwischen 30 und 70% (vorzugsweise etwa 60%) aufgelöst und mit 0,001 —0,01 m MgCl₂ vermischt. Dann wird die erhaltene Zuckerlösung auf pH-Werte von etwa 7,0 bis 8,5 (vorzugsweise 7,5 bis 8,0) unter Einsatz von NaOH oder KOH eingestellt. In diesem Falle spielt das MgCI₂ die Rolle eines Aktivators der Isomerase. In der Zwischenzeit wird immobilisierte Isomerase, die auf MR-artigen oder porösen stark basischen Anionenaustauscherharzen oder auf MR-artigen oder porösen schwach basischen Anionenaustauscherharzen erzeugt worden ist, in eine Säule eingefüllt. Die Säule wird bei Temperaturen zwischen 60 und 70⁰C gehalten, während die Lösung mit Fließgeschwindigkeiten zwischen SV 1 und SV 5 (gewöhnlich SV 1 bis 2)durchgeschickt wird.

Die Lävulosekonzentration des Ablaufs wird in der Weise bestimmt, daß die optische Drehung der Lösung mit einem Polarimeter oder nach der Cystein/H₂SO4-Carbazol-Methode gemessen wird. Im Falle der Isomerisierung von Dextrose mit immobilisierter Isomerase, die erfindungsgemäß erhalten worden ist, ist es sehr wichtig, die Dextroselösung auf einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,5 einzustellen, da die Stabilität des immobilisierten Enzyms dadurch erhöht wird.

Zu Demonstrationszwecken werden 10 g Harz A, wobei es sich um ein MR-artiges, stark basisches Anionenaustauscherharz handelt, in jeweils fünf verschiedene Säulen eingefüllt. Jede Säule wird mit einer 0,05 m tris-HCI-Pufferlösung(pH 7,5), die 0,01 m MgCl₂ enthält, äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wird eine Lösung von 1000 Einheiten an kristalliner Isomerase in der gleichen Pufferlösung durch jede Säule geschickt. Dann werden fünf getrennte 60%ige Dextroselösungen, die jeweils 0,01 m MgCI₂ enthalten und auf verschiedene pH-Werte von 6,0, 7,0, 7,5, 8,0 und 9,0 eingestellt sind, durch die jeweiligen Säulen bei 70⁰C sowie mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 hindurchgeschickt.

Nach diesem Isomerisierungsverfahren wird die Halbwertszeit der immobilisierten Isomerase für jede dieser verschiedenen pH-Werte gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der F i g. 2 hervor, wo die pH-Werte auf der horizontalen Achse und die Halbwertszeiten auf der vertikalen Achse aufgetragen sind. Wie aus der Figur ersichtlich ist, ist es zweckmäßig, den pH Wert der zu isomerisierenden Lösung bei etwa 7,0 bis 8,5 zu halten, um die immobilisierte Isomerase während der Isomerisierungsreaktion stabil zu halten.

Wird eine kontinuierliche Isomerisierung von Dextrose gemäß vorliegender Erfindung unter Verwendung von immobilisierter Isomerase auf dem Harz A oder B durchgeführt, dann beträgt die Isomerasemenge, die zur Erzeugung von 1 g Lävulose erforderlich ist, ungefähr 0,15 Einheiten.

Wird eine immobilisierte Isomerase auf dem Harz D verwendet, dann beträgt dieser Wert ingefähr 0,3 bis 0,4 Einheiten. Andererseits erfordert ein in üblicher Weise chargenweise durchgeführtes Isomerisierungsverfahren ungefähr 1 Einheit Isomerase zur Erzeugung von 1 g Lävulose. Daher kann die Menge an Dextroseisomerase durch das erfindungsgemäß durchgeführte kontinuierliche Isomerisierungsverfahren beträchtlich reduziert werden. Ferner ist die erhaltene isomerisierte Zuckerlösung praktisch farblos. Sie kann in zufriedenstellender Weise durch Entsalzen mit lonenaustauscherharzen raffiniert werden. Dabei entfällt die mühsame Entfärbung mit Aktivkohle, die normalerweise bei der Durchführung eines chargenweise ausgeführten Isomerisierungsverfahrens erforderlich ist.

Im Falle einer Isomerisierung von Dextrose mit einer Isomerase, die erfindungsgemäß auf einem stark basischen, makroretikularen Anionenaustauscherharz immobilisiert worden ist, ist es vorteilhaft, die Dextroselösung auf einen pH-Wert von etwa 8,0 einzustellen, da die Stabilität des immobilisierten Enzyms dadurch erhöht wird.

Zu Demonstrationszwecken werden 10 g Harz A, ein MR-artiges stark basisches Anionenaustauscherharz, in jeweils einige Säulen eingefüllt. Jede Säule wird mit einer 0,05 m tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), die 0,01 m MgCl₂ enthält, äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wird eine Lösung von 1000 Einheiten einer kristallinen Isomerase in der gleichen Pufferlösung durch jede Säule geschickt. Dann werden getrennte 60%ige Dextroselösungen, die jeweils 0,01 rn MgCI₂ enthalten und auf verschiedene pH-Werte von 6,0, 7.0, 8,0 bzw. 9,0 eingestellt sind, durch die Säulen bei 60 bis 70°C sowie bei einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr SV 1 geschickt.

Nach diesem Isomerisierungsverfahren wird der Lävulosegehalt des Ablaufs aus jeder Säule gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus F i g. 3 hervor, in der die vertikale Achse den Lävulosegehalt wiedergibt, während auf der horizontalen Achse die Betriebszeit einer jeden Säule in Tagen angegeben ist.

In Fig. 3 wird durch »a«die Linie wiedergegeben, auf welcher der Lävulosegehalt des Ablaufs der Säule aufgetragen ist, die bei einem pH-Wert von 8 betrieben wird, »b« identifiziert die pH-7-Säule, »cwdie pH-6-Säu-Ie und »d« die pH-9-Säule. Wie aus dieser Figur ersichtlich, ist es zweckmäßig, den pH-Wert der Dextroselösung, die isomerisiert werden soll, auf etwa 7,0 bis 8,5 zu halten, um die immobilisierte Isomerase während der Isomerisierungsreaktion stabil zu halten, wobei die immobilisierte Isomerase am stabilsten bei einem pH-Wert von etwa 8 ist.

Wird die kontinuierliche Isomerisierungsreaktion bei einem pH-Wert von etwa 8 durchgeführt, dann wird die Gleichgewichtsgeschwindigkeit der Isomerisierung (52% Lävulose) während einer Zeitspanne von 15 Tagen aufrechterhalten. Danach nimmt jedoch die Geschwindigkeit allmählich ab und fällt auf die Hälfte des anfänglichen Werts (26%) in 22 Tagen ab. Die Zeit, innerhalb welcher die Isomerisierungsgeschwindigkeit einer immobilisierten Isomerase auf die Hälfte des anfänglichen Wertes absinkt, wird als »Halbwertszeit« bezeichnet.

Wie nachfolgend näher erläutert, übt die Reinheit dor Dextroseisomerase. die für die Immobilisierung verwendet wird, nur eine geringe Wirkung auf die Stabilität der erhaltenen immobilisierten Isomerase während der Isomerisierungsreaktion aus.

Einige Säulen werden mit jeweils 12 g Harz A (feucht), einem MR-artigen stark basischen Anionenaustauscherharz, beschickt Nachdem das Harz gründlich mit einer 0,01 m MgCijz-Lösung (pH 7,5) äquiilibriert worden ist, werden die Säulen jeweils wie folgt beschickt: mit einer Lösung von 1000 Einheiten einer rohen Isomerase (extrahiert aus Zellen durch Autolyse), mit einer teilweise gereinigten Glucoseisomerase (abgetrennt von Nucleinsäure durch Protaminbehandlung) sowie kristalliner Isomerase, in der gleichen Lösung. Dann wird eine Giucoselösung, die 0,01 m MgCI₂ (pH 8,0) enthält, durch die Säule bei einer Temperatur von 70° C sowie mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 geschickt Die immobilisierten Enzyme, die aus diesen Arten von Dextroseiscimerase

hergestellt worden sind, haben Halbwertszeiten von etwa jeweils 17 Tagen, so daß keine Wirkung ersichtlich ist, welche auf die Reinheit der Ausgangsisomerase zurückzuführen ist. Wird eine immobilisierte Isomerase industriell hergestellt, dann ist es daher vorteilhaft, rohe Glucoseisomerase einzusetzen.

Wird Glucose kontinuierlich nach den vorstehend beschriebenen Methoden isomerisiert, dann enthält die Zuckerlösung, die aus den Harzsäulen austritt, Lävulose, die anfänglich 52% der festen Substanz ausmacht, wie aus Fig.3 hervorgeht. Dieser Lävulosegehalt wird während einer Zeitspanne von 10 bis 15 Tagen aufrechterhalten. Das Isomerisierungsausmaß (52%) ist der Gleichgewichtswert, der dann erreicht wird, wenn die Isomerisierung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt wird. Danach fällt jedoch der Wert auf die Hälfte des Anfangswertes oder auf 26% in 17 bis 22 Tagen ab.

Nachfolgend wird die Methode der Reaktivierung der Säulen, deren Isomerisierungsaktivität abzufallen be- 2« gönnen hat, erläutert.

Zuerst wird eine Dextroseisomerase in der gleichen Glucoselösung. die für die Isomerisierung eingesetzi worden ist, aufgelöst. Dann wird eine bestimmte Menge der erhaltenen Enzymlösung, die Iu bis 15 Einheiten r> (vorzugsweise 25 bis 50 Einheiten) Isomerase pro g des feuchten Harzes enthält, durch die Säulen mit der gleichen Fließgeschwindigkeit geschickt, die derjenigen der Glucoselösung entspricht, die zum Isomerisieren durchgeschickt worden ist. Beim Durchlaufen durch die so Säule wird mehr Enzym adsorbiert, wobei gleichzeitig die Glucose isomerisiert wird.

Auf diese Weise gewinnen die Harzsäulen wieder ihr ursprüngliches Isomerisierungsvermögcn (52%) zurück. Darüber hinaus zeigt die immobilisierte Isomerase, die r, reaktiviert worden ist, die gleiche »Halbwertszeit« wie die ursprüngliche (17 bis 22 Tage). Wird diese Methode wiederholt, dann ist es möglich, die Isomerisierung ohne ein erneutes Füllen der Säulen durchzuführen, so lange die Ionenaustauscherharze arbeiten. Ferner kann der Lävulosegehalt in dem Ablauf aus den Harzsäulen konstant bei einem gegebenen Isomerisierungsausmaß von bis zu ungefähr 52% (den normalen Gleichgewichtswert) in der folgenden Weise gehalten werden. Stellt man fest, daß das Isomerisierungsvermögen 4-, abfällt, wie sich durch Messen mit einem Polarimeter ermitteln läßt, dann wird die Harzsäule sofort in der vorstehend geschilderten Weise reaktiviert oder es wird wahlweise die Fließgeschwindigkeit allmählich reduziert, um das Isomerisierungsvermögen konstan' zu halten, worauf die Säule erneut zu einem geeigneten Zeitpunkt aktiviert wird.

Ein günstiges Merkmal dieser Methode der kontinuierlichen Isomerisierung besteht darin, daß der erhaltene isomerisierte Sirup praktisch farblos ist. Es ist nur ein Entsalzen mit lonenaustauscherharzen zur Durchführung einer Raffiniation nötig. Keine Entfärbung mit Aktivkohle vor dtm Verkauf ist erforderlich.

Wie nachfolgend gezeigt werden wird, ist die immobilisierte Dextroseisomerase, die in der Weise mi hergestellt worden ist, daß sie an einem MR-artigen oder porösen stark basischen Anionenaustauscherharz adsorbiert ist, der Isomerase überlegen, die unter Einsatz anderer Ionenaustauscherharze hergestellt worden ist, und zwar im Hinblick auf die Fähigkeit einer Inaktivierung.

10 g eines jeden dieser Harze (feucht) werden in 3 verschiedene Säulen eingefüllt. Nachdem die Harze gründlich mit einer 0,01 m MgCI₂- Lösung (pH 7,5 äquilibriert worden sind, wird eine Lösung von teilweise gereinigter Isomerase (1000 Einheiten) in der gleicher Lösung durch jede der Säulen geschickt. Dann wire Glucose, die 0,01 m MgCI₂ (pH 8,0) enthält, bei 70⁰C durch jede Säule mit einer Fließgeschwindigkeit vor SV 1 geschickt.

Das Isomerisierungsvermögen der jeweiligen Isome rasezubereitungen, die unter Verwendung von verschie denen lonenaustauscherharzen hergestellt worden sine (die Prozentsätze an Lävulose in der festen Substanz ir den Abläufen, die aus den verschiedenen Säüler austreten), wird mit einem Polarimeter gemessen.

Alle Enzymzubereitungen zeigen zunächst einer Lävulose wert von 52% in dem Ablauf. Im Verlaufe dei Zeit nimmt jedoch der Wert allmählich ab. Nachdem ei auf 26% (die Hälfte des Anfangswertes) gefallen ist wird eine Lösung von 250 Einheiten an Isomerase ir einer Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ (pH 8,0) enthält durch die Säule geschickt. Die Isomerisierungsreaktior wird dann in der Weise fortgesetzt, daß mit dem Durchschicken der ursprünglichen Glucoselösung durch die Säule fortgefahren wird.

Die erhaltenen Ergebnisse gehen aus der Fig.A hervor. In der Figur zeigt (1) die Ergebnisse für das Harz A. (2) für das Harz G, und (3) für das Harz H.

Dextroseisomerase, die mit dem Harz A immobilisiert worden ist, gewinnt ihr anfängliches Isomerisierungsvermögen (52%) nach der Reaktivierung zurück. Ferner besitzt sie nach der Aktivierung die gleiche Halbwertszeit wie am Anfang.

Im Falle einer immobilisierten Isomerase, die mit dem Harz G bzw. H hergestellt worden ist, ist andererseits eine vollständige Regenerierung des Anfangsgrades der Isomerisierung nicht möglich. Die Aktivität nach dei Reaktivierung steigt nur etwas an, wie aus Fig.4 hervorgeht, wenn diese schwach basischen Anioncnaustauscherharze als Träger verwendet werden.

Die folgenden spezifischen Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Teil- und Prozentangaben bezichen sich sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

Beispiel 1

Isomerisierung mit einem Enzym,
das auf dem Harz A immobilisiert worden ist

100 g eines feuchten Harzes A, ein MR-artiges stark basisches Anioncnaustauscherharz (Bettvolumen: 150 ml), werden in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit 0,05 m tris-HCI-Puffcrlösung (pH 7,5) äquilibriert Dann werden 400 ml einer Lösung einer teilweise gereinigten üextroseisomerasc (die 10 000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Flicßgcschwindigkcit von SV 1 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist werden 2000 ml Wasser durch die Säule geschickt, um etwa noch vorhandene nicht adsorbierte Isomerase wegzuwaschen. Dann wird das Ionenaustauscher!™^ aus der Säule genommen und auf seine Glucoseisomcrascaktivität untersucht. Als Ergebnis stellt man fest, daß pro g des Harzes (feucht) eine Aktivität von 28 Einheiten entfällt.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (feucht) (HcU-volumcn: 75 ml) werden in eine Säule (25 χ 20 cm] eingefüllt. Diese Säule wird bei einer Temperatur von 70"C gehalten. Eine b0%ige Glucoselösung, die atil einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die .Säule mit einer Flicßgcschwindigkcit von SV 1

geschickt Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52% der festen Substanz. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 15 Tagen gehalten. 20 Tage später ist jedoch das Ausmaß der Isomerisierung auf 26%, die Hälfte des anfänglichen Wertes, abgefallen. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 10 Tagen gehalten und nimmt dann in 15 Tagen auf 26%, die Hälfte des Anfangswertes, ab.

Beispiel 2

Isomerisierung mit einem Enzym,
das auf dem Harz D immobilisiert worden ist

100 g eines feuchten Harzes D, eines porösen stark basischen Anionenaustauscherharzes (Bettvolumen: 150 ml), werden in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit einer 0,01 m MgCb-Lösung, die auf einen pH-Wert von 8 eingestellt worden ist, äquilibriert. Dann werden 400 ml einer teilweise gereinigten Isomerase in der gleichen Lösung (die 10 000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 2000 ml Wasser durch die Säule geleitet, um noch vorhandene nicht adsorbierte Isomerase wegzuwaschen. Anschließend wird das lonenaustauscherharz aus der Säule entnommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht. Man stellt fest, daß jedes g des Harzes (feucht) eine Aktivität von 20 Einheiten besitzt.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (feucht) (Bettvolumen: 75 ml) werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt. Die Säule wird bei einer Temperatur von 7O⁰C gehalten. Eine 60%ige Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52% der festen Substanz. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 6 Tagen gehalten und fällt dann in 10 Tagen auf 26%, die Hälfte des Anfangswertes, ab.

Beispiel 3

Isomerisierung mit einem Enzym,
das auf dem Harz G immobilisiert worden ist

100 g eines feuchten Harzes G, eines MR-artigen schwach basischen Anionenaustauscherharzes (Bettvolumen: 164 ml) werden in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit einer 0,01 m MgCI₂-Lösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, äquilibriert. Dann werden 400 ml einer Lösung einer teilweise gereinigten Isomerase in der gleichen Lösung (die 10 000 Isomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt. Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 2000 ml Wasser durch die Säule geleitet, um etwa noch vorhandene nicht adsorbierte Isomerase wegzuwaschen. Anschließend wird das Harz aus der Säule herausgenommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht. Jedes gdes Harzes (feucht) besitzt eine Aktivität von 17 Einheiten.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (feucht) (Bettvolumen: 82 ml) werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) gepackt. Die Säule wird bei einer Temperatur von 70⁰C gehalten. Eine 60%ige Glucoselösung, die 0,01 m MgCI? enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgcschwindigkcit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52% der festen Substanz.

Beispiel 4

Isomerisierung mit einem Enzym,
das auf dem Harz A immobilisiert worden ist

ίο 100 g eines feuchten Harzes A, eines MR-artigen stark basischen Anionenaustauscherharzes (Bettvolumen 150 ml), werden in eine Säule (3 χ 30 cm) eingefüllt und mit einer 60%igen Glucoselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt ist, äquilibriert.

Dann werden 2500 ml einer Lösung einer rohen Isomerase in der gleichen Glucoselösung (die 10 000 Glucoseisomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule geschickt worden ist, werden 4000 mi Wasser durch die Säule geschickt, um etwa noch vorhandene nicht adsorbierte Glucoseisomerase wegzuwaschen. Dann wird das Harz aus der Säule entnommen und auf seine Isomeraseaktivität untersucht. Jedes g des Harzes (feucht) zeigt eine Aktivität von 15 Einheiten.

50 g dieser immobilisierten Isomerase (Bettvolumen: 75 ml) werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt. Die Säule wird bei einer Temperatur von 7O⁰C gehalten.

Eine 60%ige Glucoselösung, die 0,01 m MgCI₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt. Der Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52% der festen Substanz. Dieser Wert wird

υ während einer Zeitspanne von 13 Tagen gehalten und fällt dann in 18 Tagen auf 26%, die Hälfte des Anfangswertes, ab.

Beispiel 5
Demonstration mit 60%iger Dextrosekonzentration

50 g einer immobilisierten Isomerase werden hergestellt, wobei die Isomerase an dem Harz A nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise adsorbiert wird. Die an

■ο das Harz gebundene Isomerase wird in eine 2,5 χ 20 cm Säule (Bettvolumen: 75 ml) eingefüllt. Dann wird eine 60%ige Glucoselösung mit einem pH-Wert von 8,0, die 0,01 m MgCI₂ enthält, durch die Säule bei 6O⁰C geschickt, wobei dci Ablauf gesammelt wird. Der

w Lävulosegehalt des Ablaufs beträgt zuerst 52%. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 10 Tagen gehalten und fällt dann allmählich auf 26% in 40 Tagen ab.

V) B e i s ρ i e I 6

Kontinuierliche Isomerisierung
mit dem auf dem Harz A immobilisierten Enzym

50 g eines feuchten Harzes A, eines MR-artigen stark

wi basischen Anionenaustauscherharzes, werden in eine Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt. Das Harz wird mit einer 0,01 m MgCI₂-Lösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt ist, äquilibriert. 3000 ml einer Lösung einer rohen Dextroseisomcrasc in der gleichen Lösung (die

hi 5000 Isomeraseeinheiten enthält) wird durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt.

Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule gelaufen ist, wird eine 60%ige Dcxtroselösung, die

O₁Ol m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 bei 70⁰C geschickt

Die Isomerisierungsgeschwindigkeit wird mit einem Polarimeter gemessen und als Prozentsatz Lävulose der festen Substanz in dem Ablauf aus der Säule angegeben. Der Lävulosegehalt bleibt bei 52% (Gleichgewichtswert) während der ersten 12 Tage. Danach vermindert er sich jedoch allmählich und fällt auf 26°C am 17. Tag.

Zu diesem Zeitpunkt werden 1500 ml einer Lösung von Isomerase in einer 60%igen Dextroselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist (entsprechend 2500 lsomeraseeinheiten), durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt Dann wird die Isomerisierungsreaktion in der Weise fortgesetzt, daß die gleiche Dextroselösung (ohne Isomerase) durch die Säule unter den gleichen Bedingungen geschickt wird, wie ve zur Durchfährung der Isomerisierungsreaktion eingehalten worden sind.

Als Ergebnis dieser Arbeitsweise gewinnt die Harzsäule ihr ursprüngliches Isomerisierungsvermögen von 52% wieder zurück und behält diesen Wert während einer Zeitspanne von weiteren 12 Tagen bei. In den darauf folgenden 5 Tagen fällt jedoch das Isomerisierungsvermögen auf 26% ab. Zu diesem Zeitpunkt wird die Harzsäule erneut in der gleichen Weise reaktiviert. Sie erlangt wieder vollständig ihre Anfangsaktivität zurück.

(ohne Isomerase) durch die Säule mit der anfänglichen Fließgeschwindigkeit und zwar SV 3, fortgesetzt Wiederholt man diese Arbeitsweise, dann ist es möglich, die Isomerisierung mit einem Isomerisierungsvermögen von 52% fortzusetzen, so lange das Ioneuaustauscherharz funktioniert Es ist unnötig, die Säule während dieser Zeitspanne erneut zu füllen.

Beispiel 7

Kontinuierliche Isomerisierung

mit auf dem Harz D immobilisiertem Enzym

i^r>

50 g eines feuchten Harzes D, eines porösen stark basischen Anionenaustauscherharzes, werden in eine Säule (2,5 χ 2,0 cm) eingefüllt. Nachdem das Harz mit einer 0,01 m MgC^-Lösung, die auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, äquilibriert worden ist, werden 200 ml einer Lösung einer teilweise gereinigten Dextroseisomerase in der gleichen Lösung (die 5000 lsomeraseeinheiten enthält) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt.

Dann wird eine 60%ige Dextroselösung, die 0,01 m MgCl₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 3 geschickt, wobei die Säule bei einer Temperatur von 70⁰C gehalten wird. Das Isomerisierungsvermögen wird kontinuierlich unter Einsatz eines ^r>o Polarimeter gemessen. Es bleibt bei 52% während der ersten 3 Tage bestehen und beginnt dann allmählich abzufallen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Fließgeschwindigkeit der Dextroselösung herabgesetzt, so daß das Isomerisierungsvermögen auf 52% gehalten werden π kann. Diese Methode wird durch die Herabsetzung der Fließgeschwindigkeit der Dextroselösung um SV 0,25 pro Tag ermöglicht.

10 Tage nach dem Zeitpunkt, bei welchem die Verminderung der Flietfgeschwindigkeit begonnen bo wurde (nachdem die Fließgeschwindigkeit auf SV 0,5 gefallen war), werden 100 ml einer Lösung von Isomerase in einer 60%igen Dextroselösung, die 0,01 m MgCI₂ enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist (entsprechend 2500 Glucoseisomeraseein- 6^r> heiten) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 0,5 geschickt. Danach wird die Isomerisierungsreaktion durch Durchlaufenlassen der Dextroselösung

Beispiel 8

Kontinuierliche Isomerisierung
mit auf dem Harz A immobilisiertem Enzym

50 g eines feuchten Harzes A, ein MR-artiges stark basisches Anionenaustauscherharz, wird in eine 2,5 χ 20 cm Säule (Bettvolumen: 75 ml) eingefüllt Das Harz wird mit einer 0,01 m MgCI₂-Lösung (pH 8,0) äquilibriert worauf 206 ml einer isomeraselösung, die 5000 lsomeraseeinheiten enthält, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 1 geschickt wird.

Nachdem die ganze Isomeraselösung durch die Säule gelaufen ist, wird eine 60%ige Dextroselösung (pH 8,0), die 0,01 m MgCI₂ enthält, durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 2,5 bei 60⁰C geschickt. Das Isomerisierungsvermögen des Ablaufs wird kontinuierlich unter Einsatz eines Polarimeters gemessen. Das Isomerisierungsvermögen wird zuerst zu 45% ermittelt und dann konstant (45%) durch Herabsetzung der Fiießgeschwindigkeit der Dextroselösung um SV 0,04 pro Tag gehalten. Nachdem die Fließgeschwindigkeit auf SV 0,5 nach 50 Tagen abgefallen ist, werden 5000 lsomeraseeinheiten, gelöst in 200 ml der Dextroselösung, durch die Säule bei SV 0,5 geschickt, um das Harz zu reaktivieren.

Dann wird die Isomerisierungsreaktion in der Weise fortgesetzt, daß die Dextroselösung (ohne Isomerase) durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von SV 2,3 geschickt wird. Dabei wird ein Isomerisierungsvermögen von 45% erzielt. Die Fließgeschwindigkeit wird in der gleichen Weise, wie vorstehend geschildert worden ist, vermindert. Wiederholt man diese Arbeitsweise, dann ist es möglich, die Isomerisierung bei einem Wert von 45% fortzusetzen, so lange das Harz funktioniert.

Erfindungsgemäß immobilisierte Enzymzubereitungen können im allgemeinen zur Isomerisierung von Dextrose bei einem pH zwischen etwa 6 und etwa 9 sowie bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 80⁰C verwendet werden. Bevorzugtere Bereiche liegen bei pH-Werten von 7,0 bis 8,5, insbesondere beträgt der pH-Wert 8,0, während vorzugsweise die Temperatur zwischen 60 und 70°C schwankt. Die zu isomerisierende Dextroselösung kann jede verarbeitbare Konzentration aufweisen. Für praktische Zwecke stellt eine 40%ige Zuckerkonzentration in einem Glucosesirup die obere Grenze der praktischen Verarbeitbarkeit dar. Das Verfahren läßt sich jedoch bei jeder Konzentration, bei welcher ein Kontakt erfolgt, durchführen, und zwar unabhängig davon, ob eine chargenweise oder kontinuierliche Arbeitsweise angewendet wird.

Die zur Durchführung der Erfindung eingesetzten Harze liegen in Form von Einzelteilchen vor, damit gute hydraulische Eigenschaften in dem Isomerisierungsreaktionsgefäß ermöglicht werden. Die Harzteilchen zeichnen sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren innerhalb der Polymermatrix eines jeden Teilchens aus, so daß eine große Oberfläche für die Adsorption und den Kontakt zur Verfügung steht.

19 20

Wenn auch die immobilisierten Enzymzubereitungen sie in einfacher Weise in Kontakt mit der Dextrosevor-

hauptsächlich im Zusammenhang mit einer Verwen- ratsflüssigkeit gebracht werden können. Es können

dung in Säulen beschrieben worden sind, so eignen sie daher Säulen, Filterpressen oder irgendwelche anderen

sich dennoch auch für die Durchführung von Isomerisie- Kontaktvorrichtungen oder -systeme verwendet wer-

rungen in beliebigen Formen, bei deren Durchführung -, den.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Immobilisierte Dextroseisomerase-Zubereitung in Form von Einzelteilchen, wobei das Enzym an die Oberfläche eines stark basischen Anionenaustauscherharzes adsorbiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß als Austauscherharz ein poröses Anionenaustauscherharz mit der Gruppierung

-N(CH₃J₂Xe
C₂H₄OH

als lonenaustauschergruppe eingesetzt worden ist

2. Dextroseisomerase-Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Anionenaustauscherharz ein makroretikulares Harz oder ein solches ist, das sich durch das Vorliegen eines Netzwerkes von Poren innerhalb der Polymermatrix auszeichnet

3. Verfahren zur Herstellung der immobilisierten Dextroseisomerase-Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Dextroseisomerase an dem porösen, stark basischen Anionenaustauscherharz in der Weise adsorbiert wird, daß eine Dextroseisomerase enthaltende Lösung mit dem in Form von Einzelteilchen vorliegenden porösen Anionenaustauscherharz in Kontakt gebracht wird.

4. Verwendung der Dextroseisomerase-Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2 für die Isomerisierung von Dextrose.