DE3043380A1

DE3043380A1 - Verfahren zur isomerisierung von glucose zu fructose

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Publication number: DE3043380A1
Application number: DE19803043380
Authority: DE
Inventors: Steven P. Byron Ill. Barrett; William J. Camanche Ia. Nelson
Original assignee: Standard Brands Inc
Current assignee: Stabra AG
Priority date: 1979-11-15
Filing date: 1980-11-17
Publication date: 1981-06-04
Also published as: ES496887A0; GB2064542A; DE3043380C2; FR2470798A1; IN151063B; JPS56501630A; NL8006221A; BE886199A; MX6672E; US4288548A; WO1981001418A1; IT1134284B; ES8202587A1; JPS6328598B2; IT8025995A0; AR221786A1; CA1156951A; SU1179933A3; GB2064542B; FR2470798B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose in einem Glucose enthaltenden flüssigen Medium. Im einzelnen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung eines Glucose enthaltenden flüssigen Mediums mit einem Ionenaustauschermaterial und zum nachfolgenden Kontaktieren des behandelten flüssigen Mediums mit immobilisierter Glucose-isomerase, um einen Teil der Glucose in Fructose umzuwandeln.

Die Verwendung mikrobieller und fungaler Enzyme, die auf inerten Trägern adsorbiert oder gebunden sind, um immobilisierte biologische Katalysatoren zu schaffen, hat größtenteils ältere Methoden zurückgedrängt, wonach lösliche Enzyme oder Ganzzellen von Mikroorganismen eingesetzt werden. Im allgemeinen bieten immobilisierte Enzyme eine ganze Reihe von bedeutsamen Vorteilen gegenüber löslichen oder zellgebundenen Enzymen, insbesondere bei technischen Systemen zur Durchführung kontinuierlicher Conversionsprozesse. Wegen der wirtschaftlichen Vorzüge dieser Systeme ist es von allergrößter Bedeutung, daß die Enzyme im wesentlichen nicht durch das zur Bewirkung ihrer Immobilisierung angewendete Verfahren inaktiviert oder denaturiert werden. Es ist gleichermaßen wichtig, daß die Bedingungen, unter denen die immobilisierten Enzyme eingesetzt werden, derart sind, daß die Stabilität der Enzyme für eine ausreichende Zeit lang auf-

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rächt erhalten wird, um eine Umwandlung großer Mengen an Substrat zu gewährleisten. Deshalb kann zum Beispiel die Anwesenheit von Materialien im Substrat, die in verschiedener Hinsicht Glucose-isomerase stören oder inaktivieren, einen störenden Einfluß auf die Stabilität des immobilisierten Enzyms haben und dessen wirksame Lebensdauer in bedeutendem Ausmaß verkürzen.

Allgemein werden vor der Isomerisierung Glucose enthaltende flüssige Medien mit üblichen Maßnahmen raffiniert oder aufgearbeitet, z.B. durch Behandeln der flüssigen Medien mit Kohlen- und Ionenaustauschermaterialien, um störende Metall- und Kohlehydrat-Nebenprodukte zu entfernen, die Glucoseisomerase in einer wirtschaftlich unannehmbar kurzen Zeit inaktivieren oder denaturieren könnten. Es hat sich jedoch gezeigt, daß, obgleich solche Behandlungen eine gewisse Verlängerung der wirksamen Lebensdauer von immobilisierter Glucose-isomerase erreichen, die Stabilität des Enzyms längst nicht so groß ist, wie es bei kontinuierlichen Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose erwünscht wäre.

Die US-PS Re. 28 885 (Cotter et al.) betrifft eine enzymatische Methode zur Isomerisierung von Glucose-Sirupen unter Verwendung löslicher Glucose-isomerase oder von Zellmaterial, das dieses Enzym enthält. Inkorporierung einer Quelle für SO- in Glucose enthaltenden flüssigen Medien während der Isomerisierung soll die Denaturierung der Glucose-isomerase vermindern und eine unerwünschte Farbbildung im Endprodukt verhindern. Cotter et al. lehren, daß es bevorzugt ist, lösliche Salze von schwefligen Säuren im Glucose enthaltenden flüssigen Medium vorzulegen, bevor der Isomerisierungsprozeß begonnen wird, um damit vollständige Mutzung der vorgegebenen Gehalte zu·erreichen. In der US-PS Re. 28 885 wird außerdem berichtet, daß wirksame Gehalte an SO₂ zur Verhinderung un-

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erwünschter Farbbildung im Endprodukt dadurch vorgelegt werden können, daß das flüssige Medium durch Ionenaustauscherharze in der Sulfitform geschickt wird.

Die DE-PS 2 160 919 (Takasaki) lehrt ein Verfahren zur Trennung eines Gemisches aus Kohlehydraten durch Behandlung des Gemisches mit einem Anionenaustauscher in der Sulfit- oder in der Bisulfit-Form.

Anet beschreibt in Adv. Carbohydrate Chem., 19, S. 212 bis 213 (1964), daß die Inhibierung der nichtenzymatischen Braunfärbung in Nahrungsmitteln durch Sulfit teilweise von dem Einfangen verschiedener reaktiver Zwischenverbindungen und ihrer Umwandlung in Carbonyl-Bisulfit-Additionsverbindungen von Sulfonsäuren abhängt.

In "Die Stärke", 2£, 1976/Nr. 10, S. 350 bis 356, empfehlen Oestergaard et al., Glucose enthaltende Substrate zu filtrieren und mit Kohle- und Ionenaustauschermaterialien zu behandeln, bevor kontinuierliche Isomerisierungen mit Glucose-isomerase ausgeführt werden, um Verunreinigungen zu entfernen, die störend und gegenläufig die Aktivität des Enzyms beeinträchtigen können. Die Autoren geben außerdem an, daß möglicherweise schädliche Enzymverunreinigungen im Sirup, die anscheinend während der Isomerisierung gebildet werden, abgeschirmt werden können, indem man eine spezielle Anordnung von mehreren Säulen benutzt, die die immobilisierte Glucose-isomerase enthalten.

Hauptziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Glucose enthaltenden Substrats, mit dem die Stabilität oder die wirksame Lebensdauer von immobilisierter Glucose-isomerase, die zur Umwandlung eines Teils der Glucose in Fructose verwendet wird, erhöht werden kann.

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Erfindungsgegenstand ist das in den Patentansprüchen angegebene Verfahren.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung eines Glucose enthaltenden Substrats mit Ionenaustauschermaterial in der Bisulfit/Sulfit-Form, wodurch die Stabilität oder wirksame Lebensdauer von immobilisierter Glucose-isomerase, die zur Umwandlung von einem Teil der Glucose in Fructose verwendet wird, erhöht werden kann.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Glucose enthaltenden Substrats mit Anionenaustauscherharz in der Bisulfit/Sulfit-Form, wodurch die Stabilität oder wirksame Lebensdauer von immobilisierter Glucose-isomerase, die zur Umwandlung eines Teils der Glucose in Fructose verwendet wird, erhöht werden kann.

Diese und weitere Ziele und hierzu vorgeschlagene Lösungen gehen aus der folgenden Beschreibung der Erfindung und den Ansprüchen hervor.

Erfindungsgemäß wird ein Glucose enthaltendes flüssiges Medium mit lonenaustauschermaterial in der Bisulfit/Sulfit-Form behandelt und das behandelte flüssige Medium mit immobilisierter Glucose-isomerase in Kontakt gebracht, um einen Teil der in dem flüssigen Medium vorhandenen Glucose in Fructose umzuwandeln.

Glucose-haltige Lösungen werden gewöhnlich hergestellt durch Behandeln von Stärke nach einer der folgenden drei Methoden. Bei der ersten Methode wird eine Säure bei relativ hohen Temperaturen verwendet, um die Stärke zu hydrolysieren; bei der zweiten Methode wird Stärke zunächst durch eine Säurebehandlung flüssig gemacht und dann erfolgt die Verzuckerung mit enzymatischen Mitteln; bei der dritten Methode werden sowohl

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die Verflüssigung als auch die Verzuckerung durch enzymatische Mittel bewirkt. Die Säure-Enzym- und Enzym-Enzym-Prozesse finden in der Industrie weitverbreitete Anwendung.

Die Stabilität oder wirksame Lebensdauer immobilisierter Glucose-isomerase wird wahrscheinlich größtenteils durch die Qualität des Substrats beeinflußt. Die Qualität von Glucosehalt'igen flüssigen Medien, die im Industriezweig des Getreide- und Mais-Naßmahlens erzeugt werden, kann stark variieren. Im allgemeinen werden diese flüssigen Materialien vor der Isomerisierung durch herkömmliche Methoden raffiniert; die US-PS Re 28 882 lehrt zudem, daß die Anwesenheit kleiner Mengen an SO„ in Glucose-haltigen Flüssigkeiten während der Isomerisierung die Denaturierung löslicher oder interzellulärer Glucoseisomerase ebenso herabsetzt, wie sie die Farbbildung im fertigen Sirup unterdrückt.

Obwohl die bisherigen Verfahren bis zu einem gewissen Grade Vorteile erbrachten, sind die kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren unter Verwendung immobilisierter Glucose-isomerase bisher nicht so wirksam wie erwünscht durchzuführen gewesen, aufgrund der Tatsache, daß das Enzym nach relativ kurzer Gebrauchsdauer inaktiviert wird.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß, wenn Glucose-haltige flüssige Materialien, die mit Kohle- und Ionenaustauschermaterial in herkömmlicher Weise behandelt worden sind, mit einem Ionenaustauschermaterial in der Bisulfit/Sulfit-Form in Berührung gebracht und die kontaktierten flüssigen Materialien nachfolgend mit immobilisierter Glucose-isomerase isomerisiert werden, dann die Stabilität oder wirksame Lebensdauer des immobilisierten Enzyms wesentlich erhöht werden kann, im Vergleich

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zu dem durch die bisherigen Verfahren Erreichten.

Dieses Ergebnis ist überraschend angesichts der Tatsache/ daß die Konzentration an SO„ in den mit Harz kontaktierten flüssigen Medien ähnlich der jenigen ist, wie sie der Stand der Technik als bei der Herabsetzung der Denaturierung löslicher oder intrazellulärer Glucose-isomerase wirksam angibt. Mit anderen Worten, die Verbesserung in der Enzymstabilität geht nicht auf die Auslaugung oder den Ersatz von löslichem Bisulfit/Sulfit aus dem Harzbett in die Flüssigkeit zurück.

Im vorliegenden Verfahren kann eine Reihe von Typen an Ionenaustauschermaterialien verwendet werden; einziges Erfordernis ist, daß sie in die Bisulfit/Sulfit-Form überführt werden können. Beispiele für derartige Materialien sind Anionenaustauscher-Cellulose und Sephadex (dreidimensional vernetztes PoIysaccharid) und Anionenaustauscherharze. Harze werden bevorzugt, da sie einfacher in eine oder mehrere Kolonnen gesetzt werden können und die Glucoselösung durch diese in kontinuierlicher Weise hindurchgeleitet werden kann. Außerdem können sie relativ einfach regeneriert werden. Die bevorzugten Harze sind die schwach-basischen und stark-basischen Typen. Beispiele für geeignete stark-basische Harze sind Dowex 1,2 und 21K (Dow); Duolite A-101D und A-102(Diamond Shamrock); Ionac A-535 und A-540 (Ionac) und Amberlite IRA-900 (Rohm & Haas). Geeignete schwach-basische Harze sind beispielsweise Duolite A-6, A-7, A-30B und ES-561 (Diamond Shamrock) und Ionac A-300 (Ionac).

Die bevorzugten Harze sind jene, in welchen die Matrix hauptsächlich aus Polystyrol zusammengesetzt ist und welche einen relativ niedrigen Vernetzungsgrad aufweisen.

Um das Harz in die Bisulfit/Sulfit-Form zu überführen, wird es bevorzugt, daß das Harz zunächst in der OH-Form vorliegt.

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Dies kann dadurch geschehen, daß das Harz mit einem geeigneten Hydroxid behandelt wird. Nach dem Waschen zwecks Entfernung überschüssiger Salze kann das Harz mit einer Quelle für Sulfit- und Bisulfitionen in Kontakt gebracht werden. Lösungen von Salzen, die eine Quelle für diese Ionen stellen, können angewendet werden. Beispiele für geeignete Salze sind Natrium- und Kaliumsulfit und Natrium- und Kaliumbisulfit. Im allgemeinen werden überschüssige Mengen dieser Salze verwendet, ure das Harz in die gewünschte Form zu überführen und sicherzustellen, daß die vollständige Austauscherkapazität des Harzes erreicht wird. Danach werden die Harze gespült oder anderweitig gewaschen, um das überschüssige Generat zu entfernen.

In Lösungen existiert ein Gleichgewicht zwischen den Bisulfit- und Sulfitionen. Bei einem pH-Wert von etwa 7 sind diese Ionen in annähernd gleichen Mengen zugegeben, bei niedrigeren pH-Werten ist jedoch die Bisulfit-Form begünstigt. Deshalb ist selbstverständlich der Ausdruck "Bisulfit/Sulfit" nicht so gemeint, daß die Form des Austauschers derart ist, daß Bisulfit und Sulfit in beliebigen speziellen Anteilen vorliegen, sondern vielmehr dahingehend, daß das Harz bis zu einem gewissen Grade in beiden Formen existiert.

Die Bedingungen, unter denen das Glucose-haltige flüssige Medium mit dem Harz kontaktiert wird, können stark variieren, allerdings liegt das pH der Lösung zweckmäßigerweise im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 8,0 und vorzugsweise von etwa 3,5 bis etwa 6,5. Die Temperatur, bei der das flüssige Medium durch ein Bett oder durch die Säule des Harzes hindurchtritt, kann ebenfalls variieren; sie sollte jedoch nicht so hoch liegen, daß sich eine wesentliche Erzeugung von Abbauprodukten ergibt oder daß die Funktionalität des Harzes nachteilig beeinträchtigt wird. Die bevorzugten Harze werden bei Temperaturen über 8O⁰C nachteilig beeinträchtigt. Tempera-

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türen im Bereich von etwa 25⁰C bis etwa 70⁰C haben zufriedenstellende Ergebnisse gebracht. Der bevorzugte Temperaturbereich liegt bei etwa 5O⁰C bis etwa 65⁰C.

Die Gegenwart von Enzymaktivatoren ist während der enzymatischen Isomerisierungsprozesse im allgemeinen erwünscht. In der technischen Praxis werden kleine Mengen an Salzen, wie MgSO, und NaHSCU, zweckmäßigerweise vor der Isomerisierung dem Substrat zu diesem Zwecke zugesetzt.

Obwohl die Fließgeschwindigkeit, bei der das flüssige Medium durch eine oder durch mehrere Harzkolonnen strömt, nicht entscheidend ist, sind befriedigende Ergebnisse bei einer Geschwindigkeit von etwa 10,69 bis etwa 28,07 l/min/cm³ Harz erhalten worden. Das flüssige Medium kann durch die Säule(n) in aufwärts oder in abwärts strömender Richtung hindurchtreten.

Da verschiedene Möglichkeiten zur Erzeugung von Glucose enthaltenden flüssigen Medien unter etwas unterschiedlichen Bedingungen ausführbar sind, unterliegt die Zusammensetzung solcher flüssiger Medien einem gewissen Variabilitätsgrad. Es ist deshalb schwierig, die Beziehung zwischen dem Grad der Harzbehandlung und der Zunahme der Stabilität oder wirksamen Lebensdauer der erhaltenen immobilisierten Glucose-isomerase zu quantifizieren. Anscheinend muß das Harz,um die Ziele der Erfindung wirkungsvoll zu erreichen, mit einer ausreichenden Menge an einer Quelle für Bisulfit- und Sulfitionen unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht werden, daß das behandelte Harz nicht in wirtschaftlich unangebracht kurzer Zeit erschöpft wird.

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Analytische Methoden Bestimmung der SOp-Konzentration:

Das Schwefeldioxid wurde in den flüssigen Medien wie folgt bestimmt: Eine Flüssigkeitsprobe im Bereich von 50 bis 60 g wurde genauestens in eine Schüssel eingewogen und quantitativ in einen 800 ml-Kjeldahl-Kolben mit 300 ml destilliertem Wasser überführt. 10 ml konzentrierte Phosphorsäure wurde hinzugesetzt, gefolgt von 1 g Natriumbicarbonat. Der Kolben wurde sofort mit einer Standard-Kjeldahl-Destillationsapparatur verbunden, und annähernd 250 ml wurden in einen Erlenmeyer-Kolben destilliert, der 25 ml Wasser und 10 bis 12 ml 0,8%ige Natriumhydroxidlösung enthielt. Nach Beendigung der Destillation wurde das Destillat mit Phosphorsäure angesäuert und 2 ml Stärkepaste-Indikator wurden zugegeben. Die Lösung wurde dann mit 0,0625N Jodlösung (1 ml ist 0,002 g SO₂äquivalent) titriert, bis eine blaue Färbung 1 min anhielt. Die Prozent SO₂ auf Trockenbasis wurden wie folgt berechnet:

Titer (ml) χ 0,002

Prozent SO₂ =

Probengewicht (g) χ Trockensubstanz (V.)

Ermittlung der Stabilität (Halbwertszeit) der immobiliserten Glucose-isomerase

Eine bestimmte Menge an immobilisierter Glucose-isomerase mit einer Enzymaktivität von 1.000 IGIU wurde in eine ummantelte Glassäule (2,5 χ 30 cm) gegeben, die in üblicher Weise ausgerüstet war. Vor dem Einfüllen in die Säule wurde die immobilisierte Enzympräparation mit der Substratlösung unter Vakuum gerührt, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Das Substrat, welches aus einer entgasten Glucose-haltigen flüssigen Masse bestand, die durch enzymatische Verflüssigung und Verzuckerung von Maisstärke erhalten worden war,

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wurde kontinuierlich durch die Säule unter Isomerisierungsbedingungen geleitet, die in Beispiel 1 - unten - angegeben sind. Der Ausfluß aus der Säule wurde täglich der Probenahme unterzogen und die Fließgeschwindigkeit, das pH bei Raumtemperatur und die Prozent Fructose wurden bestimmt.

Die Halbwertszeit der immobilisierten Glucose-isomerase wurde durch Einsetzen der entsprechenden Werte in folgende Formel und graphische Lösung fürTund K- bestimmt:

, -0,693

J _ T 1 Tr -C Ι^β

In^{1 e}

I_e - I / CR

At = Zeitänderung (h)

I = Isomerisierungsgrad der Reaktorbeschickung, F/(F+G)

worin F und G die entsprechenden Konzentrationen von

Fructose und Glucose sind (g/ml)

I = Isomerisierungsgrad des Reaktorabflusses, F/(F+G)
I_e = I am Gleichgewicht (0,514 bei 65°C)
K_f = Reaktionsgeschwindigkeitskonstante zu Beginn,

g (G+F) h"¹IGIU"¹

E = Gesamtenzym im Reaktor (IGIU-Werte) C = Substratkonzentration, Glucose (g/ml) T = Halbwertszeit des Enzyms (h) R = Fließgeschwindigkeit(ml/h)

Ermittlung der Aktivität der immobilisierten Glucose-isomerase

Die Aktivität (IGIU) der immobilisierten Glucose-isomerase
wurde nach der in der US-PS 4 111 750 (Colilla et al.) angegebenen Methode bestimmt.

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_ 13 —

Um die Natur der Erfindung deutlicher zu erläutern und zu beschreiben, werden nachfolgend spezielle Beispiele für bevorzugte Ausgestaltungen gegeben. Selvstverständlich kann und soll durch diese Beispiele der Gegenstand der Erfindung nicht eingeengt und das Beanspruchte nicht beschränkt werden.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung eines schwach-basischen Anionenaustauscherharzes in der Bisulfit/Sulfit-Form zur Durchführung des erfindungsgemaßen Verfahrens.

1760 ml Duolite ES-561-Anionenaustauscherharζ (schwach-basisch) wurde in eine Säule gegeben, die einen Innendurchmesser von cm und eine Höhe von 39 cm hatte. Zur Aktivierung des Earzes wurden die folgenden Schritte ausgeführt. In jedem Schritt wurden die Reagentien durch die Harzkolonne aufwärts geführt.

1. Harzkolonne wurde mit entionisiertem Wasser zwecks Entfernen von Harzfeinteilchen rückgewaschen.

2. 3.500 ml einer 7%igen HCl-Lösung wurden durch die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min hindurchgeschickt.

3. Harzsäule wurde mit etwa 6.000 ml entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Abfluß ein pH größer als 4 aufwies.

4. 3.000 ml einer 4%igen NaOH-Lösung wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min hindurchgeschickt.

5. Harzsäule wurde mit entionisiertem Wasser gespült, bis der Abfluß ein pH kleiner als 10 aufwies.

6. 4.600 ml 1N NaESO₃ wurden durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min hindurchgeschickt.

7. Harzsäule wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Abfluß ein pH von etwa 5,5 aufwies.

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Das aktivierte Harz wurde in zwei Kolonnen gefüllt, die einen Innendurchmesser von 8 cm und eine Höhe von 39 cm hatten, und zwei Proben von raffinierten Glucose enthaltenden Lösungen (mit Kohle behandelt und mit Karz entionisiert), hergestellt durch die Enzym-Enzym-Methode, wurden bei Raumtemperatur durch die Kolonnen (Säulen) geschickt, das Eintritts-pH war 4,5, die Geschwindigkeit betrug etwa 1 ml/min,Fließrichtung war aufwärts gerichtet.

Die Kohlehydrat-Zusammensetzung der Glucose enthaltenden Lösungen vor und nach der Behandlung mit den Harzen wurde bestimmt und wird in der folgenden Tab. I wiedergegeben.

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Tabelle I

Analyse der Glucose enthaltenden Lösungen,
behandelt mit regeneriertem Anionenaustauscherharz Duolite ES-561

Probenbe ze ichnung

(O	A.	Kontrolle
O CD		(ohne Behandlung)
N>
CO	A.	Harzbehandelt
O
σ>	B.	Kontrolle
ο		(ohne Behandlung)
OO

B. Harzbehandelt

Prozente auf Trockenbasis

Maltulose

⁽¹⁾

0,3

Dextrose

94,2

2,9

DP₅₊ ⁽²⁾ Fructose

3,0

	0,3	94	,2	2,	7	3	,0	0	,7
nicht	best.	93	,5	3,	1	2	,6	0	,7
nicht	best.	93	,3	3,	3	2	,7	0

(D (2)

d. Gas-Flüssig-Chromatographie
d. Flüssigchromatographie

-F-OJ

Aus obiger Tabelle wird ersichtlich, daß die Harzbehandlung der Lösungen auf ihre Kohlehydratzusammensetzung· keinen Einfluß hatte, wenn man mit der Kontrolle vergleicht.

Glucose-isomerase wurde auf DEAE-Cellulose gemäß der in der US-PS 3 909 354 (Thompson et al.) beschriebenen Methode immobilisiert und die immobilisierte Enzympräparation wurde in zwei ummantelte Säulen gepackt.

Die zur Isomerisierung angewendeten Bedingungen waren folgende:

Temperatur:	65°C
Substrat-Glucosekonzentration	50 % (d.b.)
Flie ßgeschwindigke it	0,42 ml/min
MgSO₄.7H₂O	0,005M
NaHSO₃	0,005M
pH bei 25⁰C am Säuleneintritt	7,8

Harzbehandelte (Duolite ES-561) und unbehandelte Glucose enthaltende Lösungen wurden getrennt durch die Säulen geschickt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Wirkung der Behandlung von Glucosehaltigem Substrat (mit Duolite ES-561 behandelt) auf Stabilität der immobilisierten Glucose-isomerase

Substrat Kontrolle Harzbehandelt

Säulenaktivität anfangs (IGIU) 1066 1065

Halbwertszeit der immobilisierten
Glucose-isomerase (h) 288 696

Die obigen Daten demonstrieren, daß die Behandlung einer GIucose-haltigen Lösung mit einem Harz in der Bisulfit/Sulfit-

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Form die wirksame Lebensdauer (Gebrauchsdauer) von immobilisierter Glucose-isomerase stark verbessert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung und Anwendung eines; stark-basischen Anionenaustauscherharzes in der Bisulfit/Sulfit-Form zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

960 ml Amberlite IRA-900-Harz wurde in eine Säule gefüllt, die einen Innendurchmesser von 8 cm und eine Höhe von 39 cm hatte. Die folgenden Schritte dienten der Aktivierung des Harzes. In jedem Schritt wurden die Reagentien aufwärts strömend durch die Harzsäule geschickt.

1. 3.000 ml einer 4%igen NaOH-Lösung wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min geschickt.

2. Harzsäule wurde mit etwa 5.000 ml entionisiertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min gespült.

3. 3.000 ml INNaHSO₃ wurden durch die Säule geschickt.

4. 5.000 ml entionisiertes Wasser passierte die Säule mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min, um überschüssiges NaHSO₃ zu entfernen.

Das aktivierte Harz wurde in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 8 cm und einer Höhe von 39 cm gefüllt; eine Glucosehaltige Lösung, erhalten aus einem technischen Getreide-Naßmahlbetrieb (Maisverarbeitung), wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit von etwa 6 ml/min geschickt. Nach der Harzbehandlung wurde das flüssige Medium filtriert (Millipore-Filtration, 0,45 μΐη Porengröße), um irgendwelche mikrobielle Verunreinigungen zu entfernen, die sich in der Säule gebildet haben konnten.

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Isomerisierungstests wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur ausgeführt. Die Ergebnisse finden sich in Tab. III.

Tabelle III

Wirkung der Behandlung von Glucose-haltigem Substrat mit Amberlite IRA-900 auf die Stabilität von immobilisierter Glucose-isomerase

Substrat Isomerase Kontrolle Harzbehandelt

Säulenaktivität zu Beginn (IGUI) 920 918

Halbwertszeit der immobilisierten
Glucose-isomerase (h) 321 702

Der Stand der Technik lehrt, daß die Inkorporierung kleiner Mengen einer Quelle für SO₂ in das Glucose enthaltende Substrat während der Isomerisierung mit Glucose-isomerase die Denaturierung des Enzyms herabsetzt. Deshalb wird in der US-ΡΓ. Rg 28 885 vorgeschlagen, SO₂-Spiegel von 0,02 bis 0,3 Prozont-Trockenbasis-in dem Glucose-haltigen Substrat zur Verlängerung der wirksamen Lebensdauer von Glucose-isomerase zu verwenden.

Es wurde ein Versuch durchgeführt (Beispiel 3), um zu ermitteln, ob die verbesserte Stabilität der immobilisierten Glucose-isomerase, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bewirkt wird, auf die Gegenwart von löslichem Bisulfit/Sulfit zurückgeführt werden kann, das aus der Säule oder dem Bett des lonenaustauschermaterials ausgelaugt wurde.

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inspected

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht den Betrag der Auslaugung in die Lösung von löslichem Bisulfit/Sulfit, die eintritt, wenn ein Glucose-haltiges flüssiges Medium durch ein Ionenaustauscherharz in der Bisulfit/Sulfit-Form geschickt wird.

Ein Bett aus einem stark-basischen Anionenaustauscherharz (Amberlite IRA-900), das in einer Säule mit den Abmessungen 4 9,2 χ 0,6 inch /125x1,52 cm/ enthalten war, wurde in die Bisulfit/Sulfit-Form überführt durch Passage von 2 Bettvolumina an 1M NaHSO-. mit einer Fließgeschwindigkeit von 4,3 ml/min. Das Bett wurde dann mit 1 Bettvolumen entionisiertem Wasser mit gleicher Fließgeschwindigkeit gespült. Eine Glucose-haltige Lösung aus einem raffinierten Enzym-Enzym-Maisstärke-Hydrolysat mit einem Trockenfeststoffgehalt von 45 %, das etwa 93 Ί Glucose auf Trockenbasis enthielt, wurde durch das Bett mit einer Fließgeschwindigkeit von 4,2 ml/min geschickt. Die Temperatur der Säule wurde bei 60⁰C gehalten und das pH der Lösung betrug 5,5, gemessen bei Raumtemperatur.

Die Glucose enthaltende Lösung wurde fortlaufend 120 h durch die Säule geschickt und der SO^-Gehalt des Abflusses wurde periodisch gemessen.

Die Menge an löslichem, aus dem Harz ausgelaugtem Bisulfit/ Sulfit in der Lösung zu verschiedenen Probenahmezeiten ist in der folgenden Tab. IV wiedergegeben durch die SO^-Konzentration (Trockenbasis) zu den in der Tabelle verzeichneten Probenahme ze iten.

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- 20 Tabelle IV

Abfluß-Probenahme Abfluß-SO₉-Konzentration Zeit (h) (%, Trockenbasis)

18	0,026
42	0,032
66	0,060
90	0,010
114	0,007

Die Daten der obigen Tabelle zeigen, daß der Betrag an in die Lösung ausgelaugtem Bisulfit/Sulfit, ausgedrückt als SO~- Konzentration, nicht über ca. 0,06 % hinausging. Es ist deshalb offensichtlich, daß das behandelte Harz nicht als Quelle für SO., in einer solchen ausreichenden Menge dienen konnte, ur.. die beobachtete Zunahme in der Stabilität der iir.mobiliüiorten Glucose-isomerase gegenüber derjenigen zu bewirken, die durch Methoden dos Standes der Technik erreicht wird.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert den Effekt der Inkorporierung steigender Mengen an Natriumbisulfit in einer Glucose-haltigen Lösung auf die Stabilität von immobilisierter Glucoseisomerase.

Immobilisierte Glucose-isomerase wurde hergestellt durch Absorbieren aus einer Lösung von Streptomyces sp.-Glucose-isomerase auf DEAE-Cellulose, wie in der US-PS 3 788 94 5 (Thompson et al.) beschrieben. Die immobilisierte Präparation besaß eine Aktivität von 384,4 IGIU pro g, Trockenbasis. Eine Substratlösung wurde hergestellt, die ein raffiniertes Enzym-L'nxyif.-üydrolysat aus Maisstärke enthielt mit etwa 93 % GIuco:/j a\:[ Trockenbasis. Variierende Mengen an Natriumbisulf it

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wurden zu Portionen der Substratlösung vor der endgültigen pH-Einstellung gegeben; die Portionen wurden getrennt durch Säulen mit immobilisiertem Enzym unter den folgenden Isomerisierungsbedingungen geschickt:

Substratkonzentration

Temperatur

PH

Fließgeschwindigkeit

MgSO₄

CoCl₂

Enzym

Betriebsdauer

SO„-Konzentrationen im Substrat (%, Trockenbasis)

50 % (Trockenfeststoff)

68,8°C

7,25 bei 27°C

0,4 5 ml.min"¹

0,005M im Substrat

0,0005M im Substrat

Pfropf aus 1,6 g immobilisierter Glucoseisomerase, gemischt mit 3,2 g chemischer Cellulose

ca. 200 h

0,06 0,10 0,30 0,50 und 1,00

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

Wirkung variierender Konzentrationen an S0„ im Glucosesubstrat auf die Stabilität von immobilisierter Glucose-isomerase

Substratteil

SO„-Konzentration (%, Trockenb.)

Halbwertszeit ν. immob. G.Ii (h)

1
2
3
4
5

0,06 0,10 0,30 0,50 1,00

210 213 285 347 398

* G.I. = Glucose-isomerase

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Die Daten aus der obigen Tabelle zeigen, daß eine Zunahme von SO„ in der Glucose-Flüssigkeit von 0,06 auf 1,0 % zu einer unbedeutenden Zunahme in der Enzym-Halbwertszeit resultiert. Behandlung mit Harz in der Bisulfit/Sulfit-Form erhöht das SO„ in der Glucose-Flüssigkeit um etwa 0,01 bis 0,06 %, wie Beispiel 3 belegt. Es wird hieraus deutlich, daß die bemerkenswerte Verbesserung hinsichtlich der Enzym-Halbwertszeit, wenn die Glucose-Flüssigkeit mit dem Harz in der Bisulfit/Sulfit-Form behandelt wird, nicht auf Auslaugung von SO„ aus dem Harz in die Glucose-Flüssigkeit zurückgeführt werden kann. Obwohl der Grund für die Verbesserung nicht vollständig verständlich ist, mag es sein, daß die Harzbehandlung die Wirkung bestimmter unidentifizierter Enzym-Inaktivatoren 'beseitigt oder unterbindet, die in den Glucose-Sirupen zugegen sein können, und somit zu einer erhöhten Enzym-Halbwertszeit führt. Aber auch andere Erklärungen müssen in Betracht gezogen werden.

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung eines stark-basischen Anionenaustauscherharzes in der Bisulfit/Sulfit-Form bei den Glucose-Isomerisierungsreaktionen, die mit zwei Typen von immobilisierter Glucose-isomerase durchgeführt werden.

Amberlite IRA-900 in der Bisulfit/Sulfit-Form, aktiviert nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise, wurde in vier Säulen von 60 cm χ 2,5 cm gefüllt. Jede Säule enthielt etwa 235 cm³ (0,0083 ft³) Harz. Die Säulen wurden in Reihe geschaltet und bei einer Temperatur von etwa 40 + 2⁰C gehalten. Eine technische Glucose-haltige Lösung, enzymatisch verflüssigt und verzuckert, wurde durch die Harzsäulen mit einer Fließgeschwindigkeit von 12 bis 16 ml/min hindurchgeschickt.

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Isomerisierungstests wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Typen von immobilisierter Glucose-isomerase durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI zusammengefaßt.

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ORIGINAL INSPECTED

Tabelle VI

Wirkung d. Behandlung eines Glucose-haltigen Substrats mit einein stark-basischen Anionenaustauscherharz in der Bisulfit/Silfut-Form auf die Stabilität von zwei Typen an immobilisierter Glucose-isomerase

	Typ d. immobilisierten	Substrat	Säulen	annähernde	Durchfluß
	Glucose-isomerase	Kontrolle	aktivität (IGIU)	Halbwertszeit*(h)	dauer (h)
	Novo Sweetzyme	(keine Harzbe	1018	334	402,5
I \ CO	Typ S	handlung)
CD		harzbehandelt
CD	Novo Sweetzyme		1018	523	331
tO	Typ S	Kontrolle
	Glucose-isomerase	(keine Harzbe	1000	233	402,5
O	immobilisiert auf	handlung)
<—>	DEAE-Cellulose
OQ	(US-PS 3 909 354)	harzbehandelt
	Glucose-isomerase		1000	643	331
	immobilisiert auf
	DEAE-Cellulose
	(US-PS 3 909 354)

* Halbwertszeit d. immobilisierten Glucose-isomerase

Die Daten in der obigen Tabelle zeigen, daß die Behandlung eines Glucose-haltigen Substrats mit einem stark-basischen Anionenaustauscherharz die Lebensdauer von immobilisierter Glucose-isomerase, die nach verschiedenen Methoden hergestellt sein kann, wirksam verlängert.

Die Begriffe und /ausdrücke, die hier benutzt werden, dienen der Umschreibung, nicht jedoch zur Einschränkung, so daß durch deren Benutzung Äquivalente der erläuterten Merkmale oder Teile davon keineswegs ausgeschlossen sein sollen. Es ist vielmehr erkennbar, daß verschiedene Modifikationen innerhalb des Rahmens der beanspruchten Erfindung möglich sind.

Von den oben genannten, im erfindungsgemäßen Verfahren cjoo1«tneten Ionenaustauscherharzen werden besonders bevorzugt die stark basischen Dowex-Anionenaustauscher mit einer Styrol-Divinylbenzol-Copolymerxsatmatrix und daran gebundenen ionisierbaren Gruppen; die stark basischen Amberlite-Anionenaustauscherharze vom Typ IRA-900 (ein makroretikulares Harz mit quaternären Ammoniumgruppen; s. Rohm & Haas Co. Bulletin IE-100-66, 1966); und die schwach basischen Duolite-Anionenaustauscher wie A-6, das ein makroporöses Anionenaustauscherharz mit tertiären Amingruppen und einer vernetzten Phenol-Formaldehyd-Harzmatrix ist (s. Diamond Alkali Co. Bulletin Duolite Techn. Sheet 118-b, 1967).

Dr.Ro/bm

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Claims

STANDARD BRANDS INCORPORATED

625 Madison Avenue, New York, New York, V. St. A.

Patentansprüche

\ 1_% Verfahren zur enzymatisehen Isomerisierung von Glucose in einem Glucose enthaltenden flüssigen Medium zu Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium mit einem Ionenaustauschermaterial in der Bisulfit/Sulfit-Form behandelt und das behandelte flüssige Medium mit immobilisierter Glucose-isomerase unter Glucose-isomerisierenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird, um einen Teil der Glucose in Fructose umzuwandeln.
2. Verfahren.nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauscherraaterial ein Anionenaustauscherharz in der Bisulfit/Sulfit-Form verwendet wird.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauschermaterial ein schwach-basisches Anionenaustauscherharz in der Bisulfit/Sulfit-Form verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauschermaterial ein stark-basisches Anionenaustauscherharz in der Bisulfit/Sulfit-Form verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das pH, boi dem das Glucose enthaltende flüssige Medium mit dom Harz behandelt wird, auf einen Bereich von etwa 1,0 bis 8,0 eingestellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das pH, bei dem das Glucose enthaltende flüssige Medium mit dem Harz behandelt wird, auf einen Bereich von etwa 3,5 bis etwa 6,5 eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucose enthaltende flüssige Medium mit dem Harz bei einer Temperatur unter etwa 8O⁰C behandelt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucose enthaltende flüssige Medium mit dem Harz bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25°C bis etwa 70⁰C behandelt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucose enthaltende flüssige Medium mit dem Harz bei einer Temperatur im Bereich von etwa 5O⁰C bis etwa 65⁰C behandelt wird.

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