DE3215650A1 - Verfahren zur herstellung eines glukose/fruktose-sirups aus unraffinierten staerkehydrolysaten - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines glukose/fruktose-sirups aus unraffinierten staerkehydrolysatenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glukose/Fruktose Sirupen. Sie betrifft insbesondere ein
Verfahren zur Herstellung von Glukose/Fruktose-Sirupen, bei dem man ein unraffiniertes glukosehaltiges Stärkehydrolysat
mit immobilisierter Glukoseisomerase behandelt.
Es sind Verfahren zur Herstellung von glukosehaltigen Stärkehydrolysaten aus dem Stand der Technik bekannt,
die im wesentlichen in zwei Kategorien einzuordnen sind: Das Säure-Enzym-Umwandlungsverfahren und das Enzym-Enzym-.Umwandlungsverfahren.
Das let/.tere Verfahren wird im allgemeinen bevorzugt, weil es weniger Reversionsprodukte
ergibt, die gegenüber einer Weiterbehandlung beständig sind und dadurch die Gesamteffizienz des Verfahrens vermindern
wurden.
Bei dem Enzym-Enzym-Verfahren bildet man eine wäßrige Aufschlämmung,
die etwa 30 bis 40 % Stärketrockensubstanz enthält, und dann gibt man ein Stärke-verdauendes Enzym,
typischerweise bakterielle <X~Amylase zu und erwärmt die
Aufschlämmung auf eine Temperatur im Bereich von 80 bis 9O0C/ um dadurch die Stärke teilweise zu hydrolysieren
oder zu verflüssigen. C(-Amylase ist ein endoamylolytisches
Enzym, das in der Lage ist, die Spaltung von OC-1,4-glukosidischen Bindungen innerhalb des Stärkemoleküls
zu beschleunigen und wird von einer Anzahl von Mikro-
* w V * ♦ *
Organismen, ζ. B. von solchen der general Bacillus und Aspergilla erzeugt und kommt auch in gemalzten Getreidekörnern
vor.
Bei der tf-Amylasebehandlung erfolgt nur eine Teilhydrolyse
des Stärkemoleküls, weil das Enzym nicht auf tf-1,6-glukosidische
Bindungen in dem Molekül in beträchtlichem Maße einwirkt. Daher besteht CX-Amylase-behandelte Stärke
hauptsächlich aus Oligosacchariden unterschiedlichen Molekulargewichts und aus Fragmenten davon, die gegen einen
weiteren Aufschluß durch produktspezifischer Enzyme empfindlicher sind als unbehandelte Stärke. Um die Stärke
weiter zu hydrolysieren und ein Hydrolysat mit einem beachtlichen Anteil an Glukose zu erhalten, wird die verflüssigte
Stärke mit einem glukogenem Enzym behandelt, üblicherweise
ist dieses glukogene Enzym Glukoamylase.
Bei dem Säure-Enzymverfahren wird Stärke zunächst teilhydrolysiert
oder -verflüssigt, z. B. indem man eine wäßrige Suspension mit einem Gehalt von etwa 35 bis 40 %
Stärke herstellt und dazu eine Säure, wie Salzsäure, gibt. Die angesäuerte Suspension wird dann auf hohe Temperaturen
erhitzt, gekühlt und mit Glukoamylase bei einer geeigneten Konzentration und einem geeigneten pH behandelt, um
die teilhydrolysierte Stärke in Glukose zu überführen.
Die Verwendung von Glukoseisomerase, die auf einen Träger
adsorbiert oder gebunden ist unter Erhalt eines immobilisierten biologischen Katalysators hat die älteren Methoden,
bei denen lösliche Enzyme oder ganze Zellen von Mikroorganismen verwerdet wurden, zum großen Teil verdrängt.
Im allgemeinen ergeben immobilisierte Enzyme ge-
genüber den älteren Verfahren eine Reihe von Vorteilen, insbesondere in technischen Anlagen zur Durchführung
von kontinuierlichen Umwandlungsverfahren. Wegen der
bei der Verwendung von solchen Systemen vorliegenden Wirtschaftlichkeit ist es von äußerster Wichtigkeit,
daß die Stabilität oder das effektive Leben des immobilisierten Enzyms während einer langen Zeit aufrechterhalten
wird, um die Umwand]ung von großen Mengen des Substrates zu ermöglichen.
Verfahren zum Herstellen von immobilisierter Glukoseisomerase schließen das Binden oder anderweitige Anhaften
des Enzyms an einen· inerten Träger wie einer derivatisierten Zellulose, Ionenaustauschern oder anderen
polymeren Materialien sowie das Einkapseln des Enzyms oder das Einbauen des Enzyms in Fasern etc. ein.
Die bisherigen Versuche, unraffinierte Stärkehydrolysate
als Substrate in kontinuierlichen enzymatischen Verfahren zur Herstellung von Glukose/Fruktose-Sirupen zu verwenden,
haben sich als nicht effizient herausgestellt, weil die immobilisierte Glukoseisomerase zu einem erheblichen
Teil nach verhältnismäßig kurzer Zeit inaktiviert wird. Dies ist wahrscheinlich hauptsächlich in der
Anwesenheit von Materialien in dem unraffinierten Stärkehydrolysat
zurückzuführen, welche die Aktivität dieser Enzyme inhibieren oder in anderer Weise nachteilig beeinflussen.
Vorliegende Untersuchungen haben nun gezeigt, daß die Stabilität oder das effektive Leben von immobilisierter
Glukoseisomerase durch die Anwesenheit von Materialien, die sich während der üblicherweise angewendeten Verfahren
- Sr -
zum \ferflüssigen und Saccharifizieren der Stärke in dem
Stärkehydrolysat befinden, verringert wird. Obwohl diese Materialien nicht vollständig charakterisiert werden
können, nimmt man an, daß die Bedingungen zur Herstellung von Stärkehydrolysate^durch welche die Bildung von solchen
Materialien erhöht wird, auch dazu neigen, die nichtenzymatische Bildung von Ketosezuckern wie Maltulose und
Fruktose oder deren Vorläufern zu beschleunigen. Die Gesamtkonzentration an einem oder beiden dieser Zucker
kann, wenn sie durch nicht-enzymatische Wirkung in einem unraffinierten Hydrolysat erzeugt wurden, als Nachweis
für die Eignung des Hydrolysats für die enzymatische Isomerisierung dienen, soweit die Verlängerung der Aktivität
der Glukoseisomerase in Betracht kommt.
Bisher war es allgemeine Praxis, glukosehaltige Stärkehydrolysate nach bekannten Verfahren vor der Isomerisie-'
rung zu Glukose mit Glukoseisomerase gründlich zu raffinieren oder zu reinigan. Die üblicherweise angewendeten
Kaffinationsverfahren bestehen darin, daß man das gereinigte Hydrolysat mit Kohle und lonenaustauschmaterialien
behandelt, um unerwünschte Bestandteile, einschließlich Metallionen und Kohlenwasserstoffabbauprodukte, zu entfernen.
Stärkeverflüssigungsverfahren werden allgemein bei hohen
Temperaturen durchgeführt, um eine vollständige Gelatinisierung
der Stärkekörner zu erreichen. Verflüssigungen unter Verwendung von Calcium-abhängigen '-X-Amy las ez über ei tungen,
z. B. von solchen von B. subtilis, können die Gegenwart von soviel wie 200 ppm Calciumionen, bezogen
auf Stärketrockensubs :anz (dss) erfordern, um diesem Enzym eine optimale Wämestabilität zu verleihen. Calcium
.9.
in Form von Kalk ist schon häufig für diesen Zweck bei
der Stärkeverflüssigung verwendet worden, wo es auch
noch dazu dient, den pH-Wert auf das gewünschte Niveau einzustellen. Die Gegenwart von erheblichen Niveaus
an Calciumionen ergibt jedoch einen unerwünscht hohen Ascheanteil in dem Hydrolysat, und es ist auch bekannt,
daß Calciumionen die Glukoseisomeraseaktivität inhibieren. Obwohl es wahrscheinlich unmöglich ist, die Gegenwart
von Calcium in einem mit tX-Amylase hergestellten Stärkehydrolysat vollständig auszuschließen, soll das
für die vorliegende Erfindung verwendete Hydrolysat eine Konzentration an Calciumionen von nicht mehr als etwa
100 ppm, bezogen auf die Stärkegehalt, enthalten.
Indem man die Bedingungen, unter denen die Hydrolysate hergestellt werden, sorgfältig überwacht und solche Bedingungen
vermeidet, welche darin die Entwicklung von nicht-enzymatisch erzeugten Ketosezuckern sowie einen
hohen Aschegehalt begünstigen, kann man aufwendige Verfahren zum Raffinieren oder Reinigen des Hydrolysats
vor der Isomerisierung mit immobilisierter Glukoseisomerase vermeiden, ohne daß dadurch die Stabilität oder
das effektive Leben des Enzyms merklich verringert wird.
Der Stand der Technik in bezug auf die enzymatische Verflüssigung und Saccharifizierung von Stärke unter Bildung
von glukosehaltigen Hydrolysaten, die für eine enzymatische Umwandlung in Glukose/Fruktose-Sirupen geeignet
ist, wird ausführlich in einem Aufsatz von N.H.
Aschengreen, et al. in Starke, Band 31, Seiten 64-66
(1979) beschrieben. In diesem Aufsatz wird ein vierstufiges
Verfahren zur Umwandlung von Stärke in Fruktose-
-χ-.40.
sirup beschrieben: (1) Verflüssigung; (2) Saccharifizierung; (3) Reinigung und (4) Isomerisierung. Die erste
Stufe zur Herstellung des HydrolysatS/ die Verflüssigung oder Verdünnung der Stärke, besteht darin, daß man eine
Stärkeauf schlämmung mit (5*~-Amylase bei einer Temperatur
von 1500C während etwa 5 Minuten und bei einem pH von
6 oder mehr behandelt. Es wird dort auch offenbart, daß ein erhebliches Niveau an Calciumionen in der Aufschlämmung
während der Verflüssigung wünschenswert ist, um die Aktivität der oL-Amylase bei den hohen angewendeten Temperaturen
aufrechtzuerhalten. Es wird ganz besonders empfohlen, daß ein Minimum von 40 ppm Ca in einer 30 bis 35
%igen dss-Aufschlämmung während der Verflüssigung vorliegen
soll. Dies ist äquivalent zu 114 bis 135 ppm, bezogen auf das Stärketrockengewicht. Bei der nachfolgenden
Wärmebehandlung wird die teilhydrolysierte Stärke mit
einem glukogenen Enzym behandelt, wobei man ein Hydrolysat mit hohem Glukosegehalt erhält. Das Glukose-angereicherte
Hydrolysat wird geklärt, raffiniert und mit Glukoseisomerase
behandelt, um einen Teil der Glukose in Fruktose umzuwandeln.
In dem vorerwähnten Aufsatz wird festgestellt, daß es zum Stand der Technik gehört, Glukosekonversionssirupe, "
die aus Stärkehydrolysat erhalten wurden, vor der Isomerisierung mit Glukose..somerase gründlichen Reinigungsverfahren
zu unterwer/en, um solche Materialien zu entfernen, die die Stabilität des Enzyms nachteilig beeinflussen
und auch solche Materialien, die in dem fertigen Sirup eine unerwünschte Farbe ergeben. Wie in dem Aufsatz
festgehalten wird, werden die Stärkehydrolysate sowohl mit Kohle als auch mit Ionenaustauschmaterialien
vor der Isomerisierung mit Glukoseisomerase behandelt.
Ein weiterer naher Stand der Technik wird von C. Bücke
in Topics in Enzyme Fermentation and Biotechnology, A. Wiseman, Herausgeber, Band 1, Kapitel 7 (1976) beschrieben.
Dort wird die Qualität der als Substrat für die GIukoseisomeraseumwandlung
zugeführten Glukose diskutiert. In "Die Stärke", Band 25, Nr. 9, Seiten 304 bis 308
(1973) beschreiben Madsen u. a. eine wärmestabile £*-Amylasezubereitung
mit einer verringerten Calciumabhängigkeit für eine Stabilität bei hohen Temperaturen. In US-PS
4 025 389 wird ein Verfahren zum enzymatisehen Isomerisieren
von glukosehaltigen Sirupen in Glukose/Fruktose-Mischungen
beschrieben, bei dem ein Stärkehydrolysat
mit begrenzten Konzentrationen und Anteilen an Calcium- und Magnesiumionen verwendet wird. US-PS 4 230
betrifft ein Verfahren für die Verwendung von unraffinierten Glukosesirupen als Substrat bei der enzymatischen
Isomerisierung von Glukose zu Fruktose. Der substrathaltige Stärkekonversationsschlamm wird ohne Zugabe von
Kobalt- und/oder Magnesiumsalz isomerisiert. US-PS 4 235 965 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von
verflüssigter Stärke mit hohen Feststoffkonzentrationen unter Verwendung von Ot-Amyläse, die sich von Bacillus
licheniformis ableitet. Ein Überblick über die Produktion von Glukose/Fruktose-Sirupen in technischem Maßstab findet
sich in einem Aufsatz von B. J. Schnyder in "Die Stärke", Band 26, Nr. 12, S. 409 - 412 (1974). Ein Beispiel
für die zahlreichen patentierten Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von glukosehaltigen Stärkehydrolysaten
mit immobilisierter Glukoseisomerase ist die US-PS 3 909 35 4. Verfahren zur Herstellung von Niedrig-DE-Stärkehydrolysaten
durch zweistufige Verflüssigungs-
Al-
technik werden unter anderem in den US-PSen 3 551 293, 3 654 081, 3 663 369, 3 783 100, 3 853 706 und 3 912
sowie in DE-PS 2 216 854 beschrieben.
Die Reinigung oder Raffination von Stärkehydrolysaten vor der Isomerisierung wird in den zuvor erwähnten Aufsätzen
von Aschengreen et al.und von Schnyder sowohl in den Aufsätzen von Scallet et al. in "Die Stärke", Band
26, Nr. 12, Seiten 405-408 (1974) und von Aschengreen in "Process Biochemistry", Mai 1975, Seiten 17-19, beschrieben.
Stärke wird unter kontrollierten Bedingungen verflüssigt
und enzymatisch saccharifiziert unter Erhalt von glukose-
15· haltigem Hydrolysat mi.t nicht mehr als etwa 100 ppm Calcium,
bezogen auf Stärketrockensubstanz, wobei das Molverhältnis von nicht-enzymatisch erzeugten Ketosezuckern
weniger als etwa 2 Mo!.e pro 100 Mole Hexoseeinheiten
beträgt. Ein Glukose/Fruktose-Sirup wird hergestellt,
indem man unraffiniert.es Hydrolysat mit immobilisierter
Glukoseisomerase in Berührung bringt.
Um die Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen, ist eine sorgfältige Kontrolle der Bedingungen, unter
25 denen das Stärkehydrolysat hergestellt wurde, erforderlich.
Stärke aus üblichen Quellen, z. B. durch Naßvermahlung von Mai«, wird gewaschen und daraus eine wäßrige Aufschlämrrmng
hergestellt , die 30 bis 35 % Stärketrockensubstanz enthält. Vorzugsweise hat die Aufschlämmung einen
niedrigen Ionengehalt, z. B. von nicht mehr als 0,2 %
als sulfatisierte Asche, bezogen auf Trockenbasis. Andere
Stärken, die sowohl aus Knollenfrüchten oder aus Getreide stammen können, können ebenfalls zur Herstellung
des Hydrolysate verwendat werden, einschließlich solche aus Kartoffeln, Tapioca, Weizen, Sorghum und
wachsiger Maisstärke.
Die glukosehaltigen Stärkehydrolysate der vorliegenden Erfindung können durch ein S.iure-Enzym-Verfahren oder
ein Enzym-Enzym-Verfahren erhalten werden. Beim Säure-Enzym-Verfahren
wird die Stä.rke zunächst durch eine milde saure Behandlung verflüssigt und dann wendet man
ein Enzym an, um die verflüssigte Stärke in Glukose zu überführen. Bei einem typischen Enzym-Enzym-Verfahren
wird die Stärke durch Behandlung mit ίλ'-Amylase
verflüssigt und.dann verwendet man Glukoamylase, um die verflüssigte Stärke in Glukoise umzuwandeln. Vorzugsweise
verwendet man zur Herstellung des glukosehaltigen Stärkehydrolysats ein En;',ym~Enzym-Verfahren.
20
Die Herstellung von glukosehciltigen Stärkehydrolysäten,
bei denen man vor der Behandlung mit immobilisierter Glukoseisomerase keine Reinigung vornehmen muß, erfordert
eine sorgfältige Überwachung der während der Verflüssigung
und Saccharifizierung vorliegenden Reaktionsbedingungen. Die Temperatur, die Zeit und der angewendete
pH sollen so liegen, daß die Bildung von wesentlichen -Mengen an Materialien, die nachteilig die Stabili-·
tat von Glukoseisomerase beeinflussen, inhibiert wird.
Ebenfalls ist es erforderlich, daß man den Calciumgehalt des Substrates für die Isomerisierung auf ein Minimum
einstellt. Es ist bekannt, daß gewisse· ^X-Amylasezube-
reitungen die Gegenwart einer hohen Calciumionenkonzentration erfordern, um die Aktivität während der Verflüssigung
zu erzielen. Ist eine hohe Konzentration an Calcium während der Verflüssigung vorhanden, dann
ist es erforderlich, Calciumionen aus dem Hydrolysat vor der Isomerisierung zu entfernen. Alle bekannten
Verfahren zur Entfernung von ionischem Calcium kann man hierbei anwenden, z. B. die Behandlung von glukosehaltigen
Flüssigkeiten iait Oxalsäure und anschließendem Filtrieren.
Vorzugsweise wendet nan eine ^-Amylasezubereitung während
der Verflüssigung an, die die Gegenwart einer hohen Konzentration an zugefügten Calciumionen zur Aktivierung
und Wärmestabilz.tät nicht erfordert. Befriedigende Ergebnisse kann man erzielen unter Verwendung von (Κ-Άιαγ-lasezubereitungen
aus; Bacillus licheniformis (Termamyl-60L
-Amyläse; Novo Enzyme Corporation). Diese Zubereitung
zeichnet sich durch eine gute Wärmestabilität und Aktivität über einen breiten pH-Bereich sowie durch eine verminderte
Abhängigkeit gegenübe r der Gegenwart von Calcium aus. Andere geeignete (X-Amylasezubereitungen sind Taka-Therm
(Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) und Hi-Tempase (Biocon Inc., Lexington, Kentucky).
Die Zeit, während der die Gelatinisierung und Verflüssigung der Stärke erfolgt sowie die angewendete Temperatur
sind voneinander abhängig. Wird die Stärkeaufschlämmung
bei einer niedrigen Gelatinisierungstemperatur während einer kurzen Zeit gehalten, so bleibt eine erhebliche
Menge der wärmebeständigeren Stärke ungelatinisiert, so daß die tX-Amylase nicht so wirksam ist wie
sie. zur Verminderung der Viskosität.der Aufschlämmung er-
* /f5.
wünscht ist. Im allgemeinen ergibt die Anwendung von
Temperaturen im unteren Bereich der Gelatinisierung, von beispielsweise unterhalb otwa 800C bei Maisstärke,
nicht befriedigende Ergebnissn, weil ein erheblicher
Teil der Stärke ungelatinisiert bleibt und deshalb nicht einer Einwirkung des Enzyms zugänglich ist. Da die
Gelatinisierung in Gegenwart von cA~-Amyläse vorgenommen
wird, dürfen die angewendeten Temperaturen nicht
derartig hoch sein, daß dadurch die Aktivität der verwendeten Enzymzubereitung nachteilig beeinfliaßt wird.
Besonders wichtig ist die Aufrechterhaltung von Reaktionsbedingungen
während der Verflüssigung und Saccharifizierung, die die chemische oder nicht-enzymatische
Bildung von Ketosezuckern nicht beschleunigen. Genauer
gesagt sollten solche Bedingungen eingehalten werden, die ein Hydrolysat mit einer Calciumionenkonzentration
von nicht mehr als etwa 100 ppm, bezogen auf die Stärketrockensubstanz, ergeben und ein Molverhältnis von nichtenzymatisch
erzeugten Ketosezuckern von weniger als etwa 2 ergeben. Es ist bevorzugt, daß das Hydrolysat eine CaI-ciumionenkonzentration
von nicht mehr als etwa 30 ppm und ein Molverhältnis von nicht-enzymatisch erzeugten
Ketosezuckern von weniger als etwa 1 aufweist. "Molverhältnis" wird hierbei als die Anzahl an Molen von nichtenzymatisch
erzeugten Ketozuckern pro 100 Molen Hexoseeinheiten
definiert. Da die Wirkungen von Temperatur, Zeit und pH während der Verflüssigung miteinander verbunden
sind, müssen diese Faktoren innerhalb yerhältnis-
30 mäßig enger Grenzen überwacht werden.
• m # * * ♦
-Vf-,·· A(o -
Die Polymerstruktur von körniger Stärke wird durch Oi-Amylase nicht in einem merklichen Maße beeinflußt,
bis die Körner gelatinisiert sind. Die Gelatinisierung wird bewirkt/ indem man die Stärke in Wasser auf
einenTemperaturbereich erwärmt, innerhalb dessen die Körner quellen und die die Stärkemoleküle aneinanderbindenden
Kräfte ausreichend geschwächt werden und dadurch eine Gelatinisierung verursachen. Da Oc -Amylasen
wärmeempfindlich sind und dazu neigen, bei Temperaturen oberhalb 1000C denaturisiert zu werden, werden
während der Verflüssigung Temperaturen unterhalb 1000C angewendet, um die Wirksamkeit dieser Enzyme
zu verlängern. Da die Kräfte, welche die Stärkemoleküle in der Kornform zusammenhalten, in ihrer Stärke
variieren, werden einige'Körner bei Temperaturen unterhalb 1000C gelatinisiert und werden dann für die Einwirkung
von Oc-Amyläse empfänglich, während andere ungelatinisiert
bleiben und gegenüber einer solchen enzymatisehen
Wirkung noch res-istent sind. Infolgedessen wird es bevorzugt, die Stärke mit Oc-Amyläse in zwei Stufen
zu verflüssigen mit einer kurzen dazwischenliegenden Autoklavisierungsstufe. Während der ersten Stufe wird
die Stärke innerhalb gewisser Grenzen teilgelatinisiert und verflüssigt unter Erhalt eines Teilhydrolysats. Der
Zweck der Autoklavisierungsstufe besteht darin, alle resistenten Stärkekörner, die noch nicht während der
ersten Verflüssigungsstufe gelatinisiert wurden, zu gelatinisieren.
Das Stärkehydrolysat wird dann in der zweiten Verflüssigungsstufe auf das gewünschte Niveau weiter
verdünnt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es. wichtig, das
Substrat bei einem pH von etwa 6,0 oder weniger während
der Verflüssigung zu halten. Bei einem pH-Niveau von etwa 6,0 werden Abbauprodukte, die die Isomeraseaktivität
inhibieren, geformt, und zwar insbesondere bei hohen Temperaturen und/oder längeren Reaktionszeiten.
Die Verflüssigung wird vorzugsweise in zwei Stufen bei
einem pH im Bereich von etwa 5,0 bis 6,0 und insbesondere in einem Bereich von etwa 5,2 bis etwa 5,4 durchgeführt
und bei Temperaturen, die innerhalb des Gelätinisierungsbereiches der Stärke liegen und die auch für
die Enzymverflüssigung der Stärke geeignet sind. Im Falle von naßvermahlener Maisstärke ist es im allgemeinen
erforderlich, den pH nach oben zu regulieren, um das erwünschte Verflüssigungsausrnaß zu erzielen. Calciumverbindungen,
z. B. Kalk.'oder Calciumcarbonat werden üblicherweise zum Einstellen des pH während der Verflüssigung
mit (X-Amyläse angewendet, insbesondere bei
solchen Reaktionen, bei denen calciumabhängige ^-Amylasezubereitungen
verwendet v/erden. Da Calcium die Aktivität von Glukoseisomerase nachteilig beeinflußt, wird
es bevorzugt, die Zugabe von Quellen für Calciumionen zu dem Hydrolysat zu vermeiden. Wenn jedoch Calciumionen
zugegeben werden, ist es erforderlich, sie vor der Isomerisierung zu entfernen, wenn man die Ziele der
Erfindung erreichen will. Obwohl eine Reihe von Materialien bekannt sind, die man zur Einstellung des pH während
der Verflüssigungsreaktion anwenden kann, werden besonders vorteilhaft Magnesiumverbindungen zu diesem
Zweck verwendet, weil Glukoseisomerase, die sich von einer Reihe von Mikroorganismen ableitet, Magnesium für eine
optimale Aktivität benötigt.
Die Menge an in der Aufschlämmung inkorporierten 0(~Amylase
hängt von einer Anzahl von Faktoren ab und wird im wesentlichen durch die inherente Aktivität der Enzymzubereitung,
die Konzentration der Stärke in der Aufschlämmung und dem Ausmaß der gewünschten amylolytischen
Umwandlung bestimmt. Im allgemeinen werden in einem zweistufigen Verflüssigungssystem gleiche oder etwas
geringere Mengen an QC-Amylaseaktivität in die zweite
Stufe, in Bezug auf die erste Stufe, eingeführt. Wird
10 eine Autoklavenbehandlung zwischen den beiden Stufen
durchgeführt, so wird alle restliche iX-Amylaseaktivität
in der ersten Stufe im wesentlichen zerstört. Typischerweise werden etwa 6 bis etwa 10 Liquefone an iX-Amylaseaktivität
pro Gramm Stärketrockensubstanz in der ersten Stufe verwendet und/etwa 5 bis etwa 10 Liquefone
an CX-Amylaseaktivität, auf der gleichen Basis, in der
zweiten Stufe.
Die in beiden Stufen angewendete Verflüssigungstemperatür
liegt vorzugsweise unterhalb etwa 1000C und insbesondere
in einem Bereich von etwa 82 bis etwa 950C, wobei
ein besonders bevorzugter Temperaturbereich bei etwa 84 bis etwa 880C liegt. Bei Verflüssigungstemperaturen
innerhalb der genannten Bereiche kann man befriedigende Ergebnisse bei Erhitzungszeiten zwischen etwa 1 bis etwa
3 Stunden erzielen.
Die erste Verflüssiguigsstufe ergibt ein Teilhydrolysat
mit einem DE von /orzugsweise im Bereich von etwa 6 bis etwa 12. Im Anschluß an die erste Verfiüssigungsstufe
kann man die Aufschlämmung einer Autokiavisierung unterwerfen, wobei ma:i dann ein Tei!hydrolysat erhält,
-fg..
•λ*
das im wesentlichen frei von ungelatinisierter Stärke ist. Eine längere Aussetzung der teilverflüssigten Stärke
unter Autokiavisxerungsbecingungen ergibt die Bildung
von Substanzen, die gegenüber Glukoseisomerase schädlich sind und die man vcr.der Isomerisierung entfernen
muß, um deren Stabilität zu verlängern. Deshalb sollten die Autokiavisierungszeiten und -temperaturen
nicht etwa 2 min bzw. 1600C übersteigen. Die bevorzugten
Autoklavisierungstemperaturen sind etwa 1250C während
einer Zeit von etwa 1 min. ·
Da die in der ersten Verflüssigungsstufe vorhandene
6K-Amylase durch die Autoklavxsierungsbehandlung im wesentlichen
inaktiviert wird, ist es erforderlich, weiteres Enzym in der zweiten Verflüssigungsstufe zuzugeben. Im
allgemeinen ist die Menge an zugegebener CX-Amylase die
gleiche, wie sie in der ersten Stufe angewendet wurde. Während der zweiten Stufe reagieren die Stärkekörner,
die nunmehr alle-gelatinisiert sind, leicht mit dem Enzym
unter den angegebenen Bedingungen und ergeben ein verdünntes Hydrolysat, das vorzugsweise eine DE von etwa
14 bis etwa 20 hat und das im wesentlichen frei von roher oder rückgebildeter Stärke ist. Typischerweise hat das
Hydrolysat einen DE von etwa 16.
Die verflüssigte Stärkezubereitung wird dann mit einem glukogenen Enzym unter geeigneten Bedingungen behandelt,·
um dadurch die teilhydrolysierte Stärke enzymatisch in Glukose umzuwandeln. Ein typischweise hierfür verwendetes
Enzym ist Glukoamylase (die auch als Amyloglukosidase, Glukamylase, glukogenes Enzym etc. bezeichnet wird).
Glukoamylase, die von einer Anzahl von Mikroorganismen erzeugt wird, ist ein exo-amylolytisches Enzym, das die
sequenzielle Hydrolyse von Glukoseresten aus den nichtreduzierten Endstücken von Stärke oder Amylodextrinmolekülen
katalysiert. Unter den Glukoamylase-produzierenden
Mikroorganismen gibt es'eine Reihe von Stämmen 5 oder Fungi, die zum genus Aspergillus oder genus Rhizopus
oder genus Endomyces gehören.
Die Saccharifizierung und Verflüssigung der Stärkezubereitung
wird unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß eine hohe Umwandlungsrate der Stärke in Glukose erzielt
wird. Vorzugsweise enthält das Hydrolysat mehr als 92 % Glukose und besonders bevorzugt ist ein Glukosegehalt
oberhalb etwa 94 %. Die Bedingungen sollen auch so sein, daß eine Resynthese aus den freigesetzten Glukosemolekülen
unter Bildung von Oligosaccharide^ wie sie bei den Saccharifizierungsreaktxonen unter Verwendung
von Glukoamylase eintreten, nicht beschleunigt wird.
Die Behandlung mit Glakoamylase wird durchgeführt, indem
man die verflüssigte .Stärkesuspension, sofern erforderlich, auf einen Feststoffgehalt von etwa 30 % verdünnt,
und dann den Reaktion:3-pH auf einen pH von etwa 4,0
bis etwa 5,0, vorzugsweise von etwa 4,6, einstellt. Dann gibt man eine ausreichende Menge an Glukoamylasezubereitung
zu bis etwa 0,12 bis etwa 0,30 Glukoamylaseeinheiten pro Gramm S^ärkesubstanz vorliegen und erhitzt
die Suspension dann auf einen Temperaturbereich von etwa 54 bis etwa 62°C währond einer ausreichenden Zeit, um den
gewünschten Umwandlungsgrad zu erzielen. Die bevorzugte Erwärmungszeit liegt bei etwa 30 bis etwa 80 h. Besonders
bevorzugte Bedingungen schließen eine Temperatur der Stärkesuspension von etwa 58°C während etwa 60 h ein.
- 2Sr -
Um ein für die Isomerisierung geeignetes Substrat zu erzielen, wird die Flüssigkeit dann abfiltriert, um
Nicht-Stärkerückstände zu enbfernen, und das Filtrat
wird vorzugsweise auf etwa 5 3% Trockensubstanz eingedampft. Ein lösliches Salz öler Salze aus Glukoseisomeraseaktivatoren
kann dann zn der konzentrierten Flüssigkeit gegeben werden, und der pH wird auf ein Niveau
von etwa 7,0 bis etwa 8,5 mi- einer Lösung von Natriumhydroxid eingestellt. Typisciierweise wird die Flüssigkeit
auf eine Temperatur von ebwa 50° bis etwa 700C erwärmt
und während etwa 20 bis etwa 60 min dabei gehalten, und dann filtriert man den Niederschlag nochmals
ab und entfernt suspendierte Feststoffe, die sich bei dem höheren pH-Niveau gebildet haben können. Bevorzugte
Bedingungen schließen ein Erwärmen auf etwa 600C und Halten dieser Temperatur während etwa 30 min vor dem
nochmaligen Filtrieren ein. Vorzugsweise vermeidet man ein zu langes Erwärmen der ScLCcharif izierten Flüssigkeit
oder Erhitzen auf Temperaturen oberhalb etwa 700C vor der Isomerisierung, insbesondere nach Anpassung,
des pH auf den alkalischen Be;reich. Unter alkalischen
Bedingungen kann das Erhitzen der Lösung vor der Isomerisierung Abbauprodukte bilden, die die Aktivität
von Glukoseisomerase inhibieren.
Die Isomerisierung des unraffinierten Substrats wird
vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt, indem man das Substrat unter geeigneten Bedingungen durch eine
Säure oder Säuren mit Betten aus immobilisierter GIukoseisomerase leitet. Geeignete Verfahren zum Isomerisieren
von Glukose zu Fruktose unter Verwendung von Festbetten aus immobilisierter Glukoseisomerase werden
in den üS-PSen 3 909 354 und 3 788 945"beschrieben.
Außer den naheliegenden wirtschaftlichen Vorteilen, die vorliegen, weil es nicht mehr erforderlich ist,
das Hydrolysat vor der Isomerisierung zu raffinieren, können bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
weitere Vorteile realisiert werden. Indem man die Verflüssigungs- und Saccharifizierungsbedingungen derart
einstellt, daß niedrige Mengen an nicht-enzymatisch erzeugten Ketosezuckern gebildet werden, kann man eine
höhere Umwandlung von Stärke in Glukose erzielen. Als Ergebnis der Aufrechterhaltung eines niedrigen Aschegehaltes
in der Ausgangsstärkeaufschlämmung und während
der nachfolgenden Verarbeitungsstufen benötigt man weniger Ionenaustauschkapazität, um das fertige Glukose/
Fruktose-Produkt zu entmineralisieren.
Beschreibung und Ausdrücke und analytische Verfahren
Das Dextroseäquivalent (DE) ist definiert als die Konzentration des vorhandenen reduzierten Zuckers, ausgedrückt
als Dextrose und berechnet als Prozentsatz der Trockensubstanz. Es wird bestimmt durch die Methode E-26 beschrieben
in "Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Industry Research Foundation, Inc.",
1001 Connecticut Ave., N.W. Washington, D.C. 20036.
30 Aktivität von bakterieller ff-Amylase
Die Aktivität von bakterieller Cf-Amylase-Zubereitungen
wird bestimmt durch eine Modifizierung der Standard-Testmethode
AATCC 103-1965 "Bacterial Alpha Amyläse
Enzymes Used in Desizing, Assay of" veröffentlicht in
der 1967-Ausgabe vom Technical Manual of the American Association of Textile Chemists and Colorists, Band 43,
Seiten B-174 und B-175.
Die Modifizierungen der veröffentlichten Methoden sind
die folgenden:
10
10
(1) Die Pufferlösung für das Stärkesubstrat wurde hergestellt durch Auflösen von 25,3 g c.p. Natriumhydroxid
und 340 g c.p. Kaliumdihydrogenphosphat in Wasser und Verdünnung auf 2 1.
(2) 125 ml der Pufferlösung wurden zu dem gekühlten, angepaßten Stärkesubstrai: gegeben, bevor man das'
Substrat auf 500 ml Volumen eingestellt hat.
(3) Der pH des Stärkesubstrats wurde bestimmt und erforderlichenfalls
auf 6,20 _+ 0,05 eingestellt.
(4) Eine 0,025 molare Calciumchloridlösung wurde für
die Enzymprobenverdünnung verwendet. Diese wurde hergestellt durch Auflösen von 11,1 g wasserfreiem c.p.
Calciumchlorid in Wasser und Auffüllen auf ein Volumen von 4 1.
(5) Die Formel· zum Umwandeln von BAU in Liquefone ist
BAU χ 2,85 = Liquefone.
Glukoamylaseaktivitä':
Die Glukoamylaseaktivität (GU) wird definiert als die Menge des Enzyms, die die Bildung von 1 g Dextrose
pro Stunde bei 6O0C und einen pH von 4,5 in dem nachfolgend
beschriebenen Verfahren katalysiert.
10 ml einer 10 %igen Lösung von teilhydrolysierter Stärke
(wie Maltrin-10, ein Produkt der Grain Processing Company in Muscatine, Iowa) enthaltend 20 mMol Acetatpuffer von
pH 4,5, wurden in einen geschlossenen Reaktor, der bei 600C gehalten wurde, einpipettiert. 1 ml Glukoamylaselösung,
enthaltend 0,03 bis 0,15 GU wurden dazugegeben und der Rest vermischt und die Mischung wurde 1 h bei
15· 6O0C gehalten. Nach Leendigung einer 1-stündigen Inkubationsperiode
wurde die enzymatische Wirkung durch Zugabe eines vorbestimmten Volumens von 1 M Natriumhydroxid
gestoppt, se daß man einen pH von 8,5 bis 10,5 erhielt. Die Mis-chunc wurde dann auf Raumtemperatur ge-
20 kühlt.
2,5 ml des so erhaltenen Assay-Hydrolysats wurden zu
25 ml Fehling1scher lösung, deren Herstellung bei dem
vorhergehenden Verfatren zur DE-Bestimmung wird, pipettiert.
Die Mischung vurde zum Sieden gebracht und dann mit einer Standardde>troselösung enthaltend 5 g Dextrose
pro Liter nach den für die DE-Bestimmung beschriebenen Verfahren titriert. line Kontrollmischung wurde hergestellt
und titriert in genau der gleichen Weise wie für das obige Assayhydrolysat mit der Ausnahme, daß 1 ml
Glukoamylaselösung zu der Substratlösung nach einer 1 stündigen Inkubationsperiode gegeben wurde und nach der
•2S-
Zugabe von Natriumhydroxidlösung. Die Glukoamylase aktivität wurde wie folgt berechnet:
Darin bedeutet V das Gesamtvolumen (ml) des Assay-Hydrolysats (im allgemeinen 11,2 ml); C bedeutet die ml der
Standarddextroselösung, die man für die Titration der Kontrollmischung verwendet hat; A bedeutet die ml der
für die Titrierung des Assay-Hydrolysats verwendeten
Standarddextroselösung und W ist das Gewicht des Enzyms pro ml in der verdünnten Enzymlösung.
Die immobilisierte Isomeraseaktivität wurde nach der folgenden Verfahrensweise bestimmt:
Eine immobilisierte Isomeraseprobe, enthaltend 1400 bis 2200 IGIU, wurde abgewogen. Die Probe wurde in einen
ml-Kolben mit 125 ml Dextroseassaylösung (die zuvor
auf 650C erwärmt worden war) gewaschen und dazu wurden
10 ml einer 0,1 M tris-Hydroxymethylaminomethan (THAM)-Lösung
(pH 7,8) gegeben. Die Dextroseassaylösung enthielt 3,33 M Dextrose, 20 mMol Magnesiumsulfat, 1OmM
Natriumsulfit, 100 mM THAM und 1 mM Kobaltchlorid (pH 7,8). Bei 65°C hatte diese Dextroselösung einen pH-Wert
von 7,0. Der Kolben wurde in ein Wasserbad von 650C ein-
getaucht und 1 h geschüttelt. Die Mischung wurde durch eine 45 mm grobe Glasfritte, die mit einem Glasfaserfilter
ausgerüstet war und die zuvor mit 1 g einer Filterhilfe beschichtet worden war, vakuumfiltriert.
Der Kolben und der Enzymkuchen wurden mit kleinen Aliquoten von 100 ml THAM Pufferlösung (pH 7,8) in einer
Gesamtmenge von 100 ml gewaschen.
Dieses gewaschene Enzym wird in einen 250 ml-Kolben r
der 125 ml Dextroseassaylösung (zuvor auf 65°C erwärmt)
gegeben. Das gewaschene Enzym wird quantitativ in den Kolben mit 10 ml eine'S 10 mMol THAM-Puffers (pH 7,8)
gewaschen und der Kolben wird genau 60 min geschüttelt. Dann gibt man 12,0 ml Eisessig hinzu, und die so angesäuerte
Mischung wird weitere 15 min geschüttelt. Die Mischung
wird durch eine 45 ml Glasfritte, die mit einem Glasfaserfilter
und zuvor mit 1 g Filterhilfe beschichtet war, im Vakuum filtriert. Der Kolben und die Substanz auf
der Fritte werden mit entmineralisiertem Wasser gewasehen, bis insgesamt annähernd 400 ml Filtrat gesammelt
sind. Das Filtrat wird auf 250C gekühlt und auf 500 ml
verdünnt. Die Drehung der Lösung wird in einer 2 dm-Zelle bei 250C als R~ bestimmt.
Eine Blindprobe wurde in gleicher Weise wie zuvor hergestellt mit der Ausnahme, daß kein Enzym zugegeben wurde.
Die optische Drehung der Blindprobe wurde gleichfalls bei 25°C als R.. bestimmt. Der Isoraerisxerungsgrad wird
nach folgender Gleichung errechnet:
(R2 - R1 ) .
• 21-
Darin bedeutet ^i die Veränderung der spezifischen
Drehung, wenn Fruktose vollständig in Dextrose umgewandelt
ist; Cp ist die Konzantration des Zuckers in der Lösung (0,15 g/ml) und L ist die Länge des Polarimeterrohres
(2 dm).
Feste Aktivitätseinheiten (FAU) der Isomeraseaktivität
werden wie folgt berechet:
10 FAU/g = JC/kftw.
— 1 —1 Darin bedeutet kf eine Ratenkonstante (1,21 Ih FAU
mg Glukose); t ist die Reaktionszeit in Stunden (1 h); w ist das Gewicht in Gramm der Probe, C ist die Anfangskonzentration
in mg pro 125 ml Reaktionsgemisch (75 000 mg Glukose) und J ist wie folgt definiert:
J =
20
20
+ 1 ■ + IJ hA- - 1
Darin bedeuten:
I = Isomerisierungsgrad beim Gleichgewicht in Mol-
Fraktionen von Fruktose (0,513)
I = Isomerisierungsgrad in Mol-Fraktionen von Fruktose
C = Anfangsmolare Konzentration von Glukose (3,33 M)
K_ = Michaelis-Konstante für Glukose (0,7 M)
K = Michaelis-Konstante für Fruktose (1,43 M) 30
1 IGIU ist gleich 15,8 FAU1s.
- 20 -
IGIU
IGIU ist die Abkürzung für International Glucose Isomerase Unit und bedeutet die Menge eines Enzyms, die 1 Mikromol
Glukose in Fruktose pro Minute in einer Lösung, die zu Beginn 2 Mole Glukose pro Liter enthält sowie 0,02 Mole
MgSO. und 0,001 Mol CoCl2 pro Liter bei einem pH
von 6,84 bis 6,85 (0,2M Natriummaleat) bei einer Temperatur
von 6O0C umwandelt. Glukoseisomerasebestimmungen werden durchgeführt nach der Methode beschrieben von
N. E. Lloyd et al, Coreal Chem. 49, Nr. 5, Seiten 544 553
(1972).
'15 Bestimmung von Sacch^riden
. Die Analyse für die Fydrolysate von Glukose, Fruktose,
Maltulose und anderer Sacchariden wurden unter Verwendung von Hochdru"ck-F]üssigchromatographie durchgeführt.
Das Verfahren wird beschrieben in Standard Analytical
Methods, "Corn Refiner's Association, Inc., Methode E-61
Der Prozentsatz an Fruktose, der als Ergebnis der Isomerisierungsreaktion
erhalten wurde, wird wie folgt bestimmt: Ein 5 ml Aliquot des Substrats (des unraffinierten
Hydrolysats vor der Isomerisierung) wurde in einen 100 ml-Kolben pipettiert und mit entionisiertem Wasser
auf eine Konzentration von etwa 2,5 g Trockensubstanz
pro 100 ml verdünnt. Ein 5 m.-Aliquot des Abflusses
aus einer Säule/ enthaltend .anmobilisierte Glukoseisomerase,
durch welche das Substrat geleitet worden war, wurde ebenfalls auf 100 ml mit entionisiertem Wasser
5 verdünnt. Die optische Drehung wurde für die verdünnten Substrate und den Abfluß (i) bestimmt.
Eine Konstante (K) wurde abgeleitet, wobei
•in .ι/ _ d χ 100
k'~l {[adj,- [ψΓ
K = 59,08
Darin bedeutet:
d = Verdünnung = 20 '
d = Verdünnung = 20 '
L = Länge der Polarimeter zelle = 0,2000 dm
ία<$1 - Cci-fU = Veränderung der spezifischen Drehung bei
der Umwandlung von reiner Fruktose in rei-
20 ne Fruktose gemessen mit einer Quecksilber
lichtquelle = 169,3°.
Deshalb bedeutet:
25
25
% Fruktose, d.b. = 59,08 (CK - <X.)/C,
worin
^ = beobachtete Drehung des Substrats in Grad
^, . = beobachtete Drehung des Abflusses in Grad
C = Gramm an Trockensubstanz pro ml Substrat 30
bedeuten.
Berechnung der Reaktionsrate (k^) und der Enzymhalbzeit
(?) .
5
5
Die Stabilität oder die Halbwertszeit von Glukoseisomerase wurde für die hier beschriebene Isomerisierungsreaktion
bestimmt durch Einsetzen der jeweiligen Werte in die nachfolgende Gleichung:
10
10
Te " "ο
CK"
Darin bedeuten:
I = Grad der Isomerisierung der Reaktorzufuhr, P/(P+G)
I = Grad der Isomerisierung des Reaktorabflusses,
F/(F/G)
I=I beim Gleichgewicht, 0,514 β 650C oder 0,505 bei 600C
I=I beim Gleichgewicht, 0,514 β 650C oder 0,505 bei 600C
-1 -1 kf = Anfangsreaktion:;gradkonstante g(G+F)h IGIU
E, = Enzymaktivität, IGIU
C = Substratkonzentration, Glukose, g/ml R = Fließgeschwindigkeit, ml/h
T* = Halbwertszeit de;s Enzyms, h
t = Roaktorarbeitszoit, h
C = Substratkonzentration, Glukose, g/ml R = Fließgeschwindigkeit, ml/h
T* = Halbwertszeit de;s Enzyms, h
t = Roaktorarbeitszoit, h
kf für die Anfangsreciktionsgradkonstante und tau (TO wurden
bestimmt, indem man die obige Gleichung wie folgt umstellte:
log
R In
= log —ψ±- - 0.30102t/T
Die Neigung einer Kurve von log
R In
gegenüber der Zeit ist -0,30102/Y;
infolgedessen ist T* = -0,30102/Neigung. (X ) (Intercept)
zur Zeit O einer solchen Kurve wird verwendet zur Lösung
X= R In' Ie " X
Ό V L· - I
C χ TO^o
für die Anfangsreaktionsrate K-. Daher ist kf = — ρ
r tt
(1) F= Gewicht der Fraktion an Fruktose, bezogen auf
den Gesamtkohlehydrattrockengehalt und G = Gewichtsfraktion an Glukose, bezogen auf den
Ges amtkohlehydrattrockengehalt.
Das Produkt aus der Anfangsreaktionsratenkonstante (kf)
und dem Faktor, der die Halbwertszeit des Enzyms (T) ausdrückt, ergibt ein geeignetes Anzeichen für die Gesamteffizienz
des Verfahrens; je höher der für kf7^ erzielte
Wert ist, um so größer ist die Effizienz des Verfahrens ausgedrückt durch die Umwandlungsrate von Glukose in
Fruktose und die Wirkung des Verfahrens auf die Enzymhalbwertszeit.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.
• *> * V « W
•32·
In diesem Beispiel wird das erfindungsgemäße Verfahren
kontinuierlich durchgeführt und die hohe Stabilität der bei diesem Verfahren erhaltenen Glukoseisomerase demonstriert.
Die hier und in den nachfolgenden Beispielen verwendete Glukoseisomerase war auf DEAE-Zellulose immobilisiert
worden gemäß US-PS 3 788 945.
Maisstärke aus einem Mais-Naßmahlbetrieb wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann wurde eine Aufschlämmung
daraus enthaltend 33 Gew.-% Stärke als Trokkensubstanz hergestellt. Der pH-Wert der Aufschlämmung
wurde mit MgO auf 5,2 eingestellt und dann wurde eine ausreichende Menge ^-Amylase (Termamyl-60L) zugegeben,
so daß 7 Liquefone Cf-Amylaseaktivität pro Gramm Stärke- ·
trockensubstanz vorIngen. Die Aufschlämmung wurde durch
eine 13 mm dicke Rohrschlange geleitet und dort 2,5 h * bei einer Temperatur von 860C gehalten. Anschließend
an diese erste Behandlung wurde die Aufschlämmung durch eine 0,3 mm dicke Rohrschlange aus rostfreiem Stahl
geleitet und dort bei einer Temperatur von etwa 115 bis 13O0C und einem Druck von 3,5 bis 7,0 bar während
1 min gehalten. Dann wurde die Temperatur in der Aufschlämmung auf etwa 86°C heruntergekühlt und der gleichen
Menge 0(-Amylase wie in der ersten Erhitzungsstufe versetzt
und in eine dritte Heizschlange geleitet. In dieser
Schlange, die die; gleichen Eigenschaften wie die in der ersten Stufe verwendete Heizschlange hatte, wurde
die Aufschlämmung 2 h auf eine Temperatur von 860C
erhitzt.
Die verflüssigte Stärke wurde mit entipnisiertem Wasser
auf einen Trockengehalt von 30 % verdünnt und dann in einem mehrstufigen Rührtanksystem Saccharifizierungsbedingungen
unterworfen. Dabei wurde ausreichend Filterhilfe (Dicalite CP-175, GREFCD, INC.) zugegeben, so daß
diese in einer Konzentration von 1 %, bezogen auf Trokkenbasis,
vorlag und der pH warde auf etwa 4,5 mit HCl eingestellt. Die verflüssigte Stärkezubereitung wurde
zunächst in den ersten Reaktor in dem System gegeben und dazu wurde eine ausreichende Menge an Glukoamylasezubereitung
(AMG-150, Ansatz SN 3075, Novo Enzyme Corp.) zugegeben bis zu einer Menge von 0,27 Glukoamylaseeinheiten
(GU) pro Gramm Stärketrockensubstanz. Der Reaktor inhalt wurde auf 580C erwärmt und dann nach und nach
zu jeweils 7 weiteren Reaktoren, die bei der gleichen Temperatur betrieben wurden, geleitet. Die durchschnittliche
Verweilzeit in jedem Reaktor betrug 7,5 h. Nach Beendigung dieses Saccharifizierungszyklus wurde die
in dem Reaktor gebildete Produktlösung durch ein Filter geschickt, das zuvor mit Filtarhilfe bedeckt war und
wurde dann unter vermindertem Druck (254 mmHg) filtriert, wobei alle vorhandenen Nicht-Stärkerückstände entfernt
wurden.
Zur Herstellung eines geeigneten Substrats für die Isomerisierung
mit Glukoseisomerase wurde die Flüssigkeit in einem kontinuierlichen Verdampfer auf einen Feststoffgehalt
von etwa 50 % konzentriert. Die Flüssigkeit wurde zunächst auf 860C erwärmt und 4 min bei dieser Temperatür
gehalten, und anschließend wurde die Verdampfung bei 58°C bei einem Quecksilbervakuum von 630 mm durchgeführt.
Dann wurde eine Lösung von Mg(HSO3J2 zugegeben, bis sich
in der Flüssigkeit eine Konzentration von 0,002 Mol ergab und dann wurde die Flüssigkeit durch eine Lösung
von NaOH auf einen pH von 7,8 (bestimmt bei 250C) eingestellt.
Die Substratflüssigkeit wurde anschließend durch eine Mischschlange gepumpt und dann durch ein
Filter Whatman Nr. 3, wobei die Schlangen und das Filter bei einer Temperatur von 580C gehalten wurden.
Die Isomerisierung wurde durchgeführt, indem man das
filtrierte Substrat direkt durch vier in Serie verbundene Festbettreaktoren, die bei einer Temperatur von
6O0C gehalten wurden, leitete. Die Reaktoren bestanden aus Glassäulen mit einem Durchmesser von 2,5 cm
und einer Länge von 15,2 cm und in ihnen waren unterschiedliche
Mengen an immobilisierter Glukoseisomerase enthalten. Die Menge der in jedem der Reaktoren vorhandenen
Glukoseisomeraseaktivitäten lagen im Bereich von 2300 bis 5000 IGIU. Die Reaktoren wurden unter solchen
Bedingungen betrieben, daß ein System simuliert wurde, bei dem verbrauchte Reaktoren am Anfang des Systems
entfernt wurden und durch frische Reaktoren ersetzt wurden. Die Isomerisierung wurde mit einer Einlaßrate
von 2,4 ml Substrat/min durchgeführt, wobei man in dem
letzten Abfluß eine I'ruktosekonzentration von 42 bis 46 % erhielt. Nach Beendigung der Verweilzeiten in den
jeweiligen Reaktoren wurden vom Abfluß Proben entnommen und daraus die relevanten Daten bestimmt. Die Ergebnisse
der Isomerisierung des unraffinierten Hydrolysats
werden in der Tabelle I gezeigt.
Kontinuierliches Verfahren zur enzymatisehen Isomerisierung eines unraffinierten
Hydrolysats
Wirkung auf die Enzymstabilisierung
Wirkung auf die Enzymstabilisierung
Reaktoren | Eo (IGIU) | Isomerisierungs- | ι | wurde von der Anfangsposition | Ratenkon | Enzymhalb | Enzymeffi |
(in Serie) | zeit (h) | stante kf (l) | wertszeit | zienz | |||
r(h) | k£^{2) | ||||||
1 | 2300 | 720 | 0,160 | 810 | 13,0 | ||
2 | 3075 | 1320 | 0,150 | 1000 | 15,0 | ||
3 | 4150 | 1320 | 0,160 | 1140 | 18,2 | ||
4 | 5000 | 1320 | 0,160 | 1060 | 17,0 | ||
5 (3) | 6000 | 600 | 0,159 | 1030 | 16,4 | ||
gewogener Purchschnitt: | 0,158 | 1030 | 16,3 | ||||
(1) g(G+F)IGIu"1h | |||||||
(2) g(G+F)IGIu"1 | |||||||
(3) Reaktor Nr. 1 | nach 720 h Betriebszeit entfernt und |
in
Reaktor Nr. 5 wurde dann an dessen Stelle geschaltet. —*
Periodische Analysen der isomerisierten Flüssigkeiten
ergaben die nachfolgenden Durchschnittswerte, jeweils bezogen auf das Trockensubstanzgewicht:
Fruktose ^ | 44,3 % |
Glukose | 51,6 % |
DP2 + | 4,1 %* |
Calcium, ppm | 30 |
Sulfatisierte | |
Asche | 0,28 % |
Trockensubstanz | 48,6 % |
* Schließt di- und höhere Saccharide ein.
Die obigen Daten und die . Tabelle I zeigen, daß ein Glukose/Fruktose-Sirup, enthaltend einen hohen Anteil
an Fruktose erhalten werden kann, indem man unter speziellen Bedingungen erhaltenes unraffiniertes Stärkehydrolysat
einer Isomerisierung mit immobilisierter Glukoseisomerase unterwirft. Die Daten zeigen auch an,
daß unter den gleichen Bedingungen das Enzym eine gute Stabilität oder Halbwertszeit (7') und einen hohen Grad
an Enzymeffizient (k^T) aufweist.
25 Beispiel 2
In diesem Beispiel werden die Einwirkungen von unterschiedlichen Bedingungen für die Verflüssigung und Saccharifizierung
von Stärke auf die Bildung von nlcht-enzymatisch erzeugten Ketosezuckern in dem glukosehaltigen
Substrat und auf die Stabilität von Glukoseisomerase, die zum Isomerisieren von Glukose zu Fruktose verwendet
wird, gezeigt.
- 3«er-
Stärke wurde in getrennten Versuchen verflüssigt, wobei man in einem Fall eine (Y-Amylasezubereitung verwendete,
die sich von B. licheniformis ableitete und in dem anderen Fall eine mehr calciumabhängige Of-Amylasezubereitung
aus B. subtilis. Die Verflüssigung wurde in zwei Stufen durchgeführt mit einer dazwischenliegenden
Autoklavenbehandlung, wodurch man Teilhydrolysate erhielt, die im wesentlichen frei von körniger
oder ungelatinisierter Stärke waren.
Zwei identische Stärkeaufschlämmungen mit jeweils 33 %
Trockensubstanz wurden hergestellt. Die eine Aufschlämmung, Substrat A, wurde mit von B. licheniformis abgeleiteter
Of-Amylase unter den die vorliegende Erfindung
charakterisierenden Verflüssigungsbedingungen behandelt
Die andere Aufschlämmung, Substrat B, wurde mit einer
. von B. subtilis abgeleiteten Of-Amylasezubereitung
(Dex-Lo-HC, Wallerstein Co.) behandelt und dann den bevorzugten Bedingungen, wie sie üblicherweise zur Verflüssigung
von Stärke bei der Verwendung dieses Enzyms angewendet werden, unterworfen.
Die Bedingungen, unter denen die getrennten Verflüssigungen durchgeführt wurden, werden in Tabelle II gezeigt.
Verflüssigungsbedingungen
PH
pH eingestellt mit
Erste Stufe
-1
Liquefone g dss Temperatur, 0C Zeit, h
Autokiavisierung Temperatur, 0C Zeit, min
Zweite Stufe
-1
Liquefone, g dss Temperatur, 0C Zeit, h
W · vv n - ae - .3?· |
* | II | 3215650 | 6,6 CaO |
Tabelle | (?f-Amylasequelle | 33 88 1 |
||
(B. | Substrat A Substrat B licheniformis) (B. subtilis) |
150 1 |
||
5,2 MgO |
11 88 1 |
|||
14 86 1 |
||||
125 1 |
||||
10 86 1 |
Die verflüssigten Stärkezubereitungen wurden, jeweils auf
25 30 % Trockensubstanz verdünnt, auf einen pH-Wert von 4,3 eingestellt und dazu wurden 0,41 GU g dss von Glukoamylase
gegeben. Die Saccharifizierung wurde bei 58°C während
32 h (für Substrat A) und 55 h (für Substrat B) durchgeführt. Die saccharifizierten Flüssigkeiten .wurden fil-30
triert und dann im Vakuum bei einer Temperatur von 350C
auf einen Trockengehalt von 50 % eingedampft.
-AO-
.39·
Es wurden drei Substrate zur Isomerisierung mit immobilisierter Glukoseisomerase hergestellt. In Substrat
(A) waren 0,0025 M Mg (HSO3)2 enthalten und der pH wurde
mit NaOH-Lösung auf 7,8 eingestellt. Substrat (B) wurde zunächst mit einer stöchioitietrischen Menge Oxalsäure
bei pH 4,8 behandelt. Der Calciumgehalt des Substrats wurde auf 30 ppm, bezogen auf Trockensubstanz,
verringert. Die Flüssigkeit wurde dann nochmals filtriert und auf eine Konzentration von 0,0025 M Mg(HSOo)2
eingestellt. Schließlich wurde der pH dieses Substrats mit MgO auf 6,0 und dann mit NaOH auf 7,8 eingestellt.
Substrat C wurde hergestellt, indem man eine ausreichende Menge an kristallisierter Dextrose in entionisiertem
Wasser auflöste, bis zu einem Dextrosegehalt von 50 % Trockensubstanz/ Die Lösung wurde auf eine
Konzentration von 0,0025 M Mg(HSO3J2 eingestellt und
dann wurde der pH auf 6,0 mit MgO und dann auf 7,8 mit NaOH eingestellt.
Die Substrate wurden Isomerisierungsbedingungen unterworfen·,
indem man sie durch ummantelte Glaskolonnen (25 mm χ 300 mm), die bei 650C gehalten wurden und jeweils
etwa 800 IGIU an immobilisierter Glukoseisomerase enthielten, leitete. Die Substrate wurden in abstei-
-25 gender Richtung in die Kolonnen eingeführt mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 mm pro min. Die Isomerisierungen
wurden kontinuierlich während 17 Tagen durchgeführt. Von den Substraten und den Kolonnenabflüssen
wurden täglich Proben entnommen und darin die Konzentrationen an Fruktose und Glukose bestimmt und es wurden
die kinetischen Parameter der Isomerisierungsreaktionen berechnet. Weder Substrat (A) noch das ,Substrat (B) wurden
tr ι* *
vor der Isomerisierung einer Reinigung unterworfen. Die
Ergebnisse werden in Tabelle III gezeigt.
5 Tabelle III
Einwirkung der Bedingungen für die Verflüssigung und
Saccharifizierung auf die Zusammensetzung von saccharifizierten
Substraten und auf die Stabilität von GIukoseisomerase
Sub | Sub | Sub |
strat (A) | strat (B) | strat (C) |
96,6 | 96,6 | 99,8 |
0/1 | 0,3 | 0,1 |
0,05 | 0,15 | 0,05 |
0,025 | 0,022 | 0,025 |
700 | 470 | 585 |
17,4 | 10,1 | 14,7 |
Glukose, % d.b. 15 Maltulose, % d.b.
Ketose-Molverhältnis
Ratekonstante Kp Enzymhalbwertszeit T* (h)
Enzymeff izienz k- T
20
(1) g(G+F)IGIÜ~1h~1
(2) g(G+F)IGIü"1
Diese Daten in Tabelle III zeigen, daß man die besten
Enzymstabilität und Imwandlungseffizienz erzielt, wenn
das unraffinierte Iscmerisatxonssubstrat niedrige Mengen an Maltulose enthielt. Erheblich niedrige Werte für
die Stabilität und Effizienz erzielte man unter Verwendung von unraffiniertem Substrat (B), welches ein höheres
Niveau an Maltvlose enthielt und das bei einem
höheren pH-Wert und tei einer höheren Autoklaventemperatur
erhalten worder war, also Bedingungen, wie sie nor-
malerweise unter Verwendung von B. subtilis-ft-Amyläse
angewendet werden. Die Ergebnisse der Isomerisierungsreaktion unter Verwendung von kristallisierter Dextrose
als Substrat zeigen, daß dieses Material nicht vollständig
von solchen Bestandteilen frei war, durch welche die Aktivität von Glukoseisomerase inhibiert wird
und dies betont nochmals die Wichtigkeit der Bedingungen, unter denen das unraffinierte Substrat hergestellt
wird.
10
10
In diesem Beispiel wird die Wirkung des pH-Werts und die Autoklavisierungstemperatur, die während der Stärkeverflüssigung
angewendet wird, auf die Stabilität des . Isomerisierungsenzyms und auf die Effizienz der Umwandlungsreaktion
gezeigt.
Fünf identische Maisstärkeproben (33 % Trockensubstanz) wurden unter Verwendung von Termamyl-60L OC-Amylase
in einem zweistufigen Verfahren unter unterschiedlichen
pH-Bedingungen und Aütoklavisierungstemperaturen, wie sie in Tabelle V aufgeführt werden, verflüssigt.
Die Proben wurden unter den in Tabelle IV gezeigten Bedingungen hinsichtlich der Zeit, der Temperatur und
der Enzymdosierung verflüssigt.
30
>·:": .·' 32Ί565Ο
Tabelle IV | Temperatur, 0C | Erste | Stufe | Zweite | Stufe |
Zeit, h | 8 | 6 | |||
Enzymdosierung (Liquefone #-Amy läse | Autoklavisierungszeit zwischen den | ||||
g~ dss) | Stufen = 1 Minute | 86 | 86 | ||
2 | /5 | 2, | 0 | ||
20 1 der jeweiligen verflüssigten Stärkeproben wurden unter
Verwendung einer Glukoamylasezubereitung (AMG-150 Batch
SN 3068, Novo Enzyme Corp.) mit einer Dosierungsrate von 0,41 GU dss saccharifiziert. Die Proben wurden auf
pH 4,3 eingestellt und dann 32 h bei 58°C erwärmt. Die saccharifizierten Flüssigkeiten wurden filtriert und zu
50 % Trockensubstanz eingedampft und dann mit MgO auf einen pH-Wert von 6,!>
eingestellt. Zu jeder Probe wurde Mg (HSO3)2 in einer Konzentration von 0,0025 M gegeben
0 und dann erfolgte eire letzte pH-Einstellung auf pH 7,8
(bestimmt bei 250C) mit NaOH. Die Flüssigkeiten wurden
auf Glukose und Maltulose analysiert und das Molverhältnis der Ketosezucker bestimmt.
Die unraffinierten Flüssigkeiten wurden isomerisiert,
indem man sie durch Ciaskolonnen mit einem Durchmesser von 25 mm, die bei 6C0C gehalten wurden und immobilisierte
Glukoseisomerase enthielten, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min leitete. Die Gesamtaktivität des
Enzyms in jeder Kolonne betrug 800 IGIU. Die Ergebnisse der Isomerisierungen werden in Tabelle V gezeigt.
-M-
Es ist deutliche, daß der Maltulosegehalt des Substrats sowohl durch den pH bei der Verflüssigung
als auch die Autokiavisierungstemperatür beeinflußt
wurde. Wie die Daten in Tabelle V zeigen, variierte der Maltulosegehalt im umgekehrten Verhältnis zu der
Halbwertszeit der Isomerase, und dies zeigt an, daß die Verflüssigungsbedingungen, welche die nichtenzymatische
Bildung von Maltulosevorläufern beschleunigen, auch die Enzymstabilität negiitiv beeinflussen. Diese
Daten zeigen auch, daß die Menge an während der Saccharifizierung
gebildeten Glukose unvorteilhaft mit der Maltulosekonzentration verbunden ist.
Wirkungen des pH-Werts bei der Verflüssigung und der Autoklavisxerungstemperatur
auf die Stabilität von Glukoseisomerase und die Umwandlungseffizienz
Probe
Nr.
Nr.
Verflüssigungsvariablen pH Autoklaventemperatur (0C)
Isomerisationssubstrat
Maltulo- Glukose se, % d.b. % d.b.
Ketose
.(D
Enzym- Enzymeffihalbzienz
Molverhältnis n} wertszeit kf
1 | 5,2 | 125 |
2 | 5,2 | 160 |
3 | 7,2 | 125 |
4 | 7,2 | 160 |
5 | 8,0 | 170 |
0,05
0,18
1,10
2,83
3,90
0,18
1,10
2,83
3,90
(1) Mole'Ketose pro 100 Mole Anhyfdrohexose
(2) g(G+F)IGIU
~1
95,8 95,3 94,9 92,7 92,0
0,025
0,09
0,55
1,42
1,95
577 | 13,2 |
456 | 10,1 |
412 | 11,2 |
290 | 7,1 |
243 | 6,6 |
cn cd cn
• ds·
In diesem Beispiel wird die Einwirkung der Temperatur, auf welche das unraffinierte Substrat vor der Isomeri-■5
sierung erhitzt wird, auf die Stabilität von Glukoseisomerase und die Effizienz der Isomerisierungsreaktion
gezeigt.
Stärke wurde unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen verflüssigt und dann unter den in Beispiel 3
beschriebenen Bedingungen saccharifiziert. Die saccharifizierte
Flüssigkeit wurde unter Verwendung von Dicalite-Filterhilfe
filtriert und das Filtrat wurde auf 50 % Trockensubstanz eingedampft. Zu der konzentrierten Flüssigkeit
wurde eine ausreichende Menge einer 5 %igen Lösung von Mg(HSO-,)- zugegeben, bis die Konzentration
darin 0,0025 M betrug und dann wurde der pH-Wert auf 7,8 bei 25°C mit NaOH eingestellt.
Teile des Substrats wurden durch eine 25 mrn dicke ummantelte
Kolonne, die bei den in Tabelle IV gezeigten Temperaturen gehalten wurde, geleitet. Nach einer Verweilzeit
von 30 min bei den bei einer speziellen Temperatur gehaltenen Kolonnen wurden die Substrate gekühlt,
filtriert und auf Glukose und Ketosezucker analysiert. Ein Teil des nichterhitzten alkalischen Substrats·wurde
in gleicher Weise analysiert.
Die Substratanteile wurde individuell isomerisiert, und
zwar ohne daß sie zuvor raffiniert wurden, indem man sie durch ummantelte Glaskolonnen, die bei einer Temperatur
von 650C gehalten wurden und die jeweils ein Bett an
20
25
immobilisierter Glukoseisomerase mit einer Aktivität
von 800 IGIU hatten. Die Isomerisierungen wurden während 500 h durchgeführt mit einer Substratfließgeschwindigkeit
in den Kolonnen von 0,3 ml/min. Die Ergebnisse werden in Tabelle VI gezeigt.
Aus den Daten der Tabelle VI geht hervor, daß höhere Behandlungstemperaturen die Bildung von nicht-enzymatisch
erzeugten Ketosezuckern, insbesondere Fruktose, bei Substraten,
die unter bevorzugten Verflüssigungs- und Saccharifizierungsbedingungen
hergestellt wurden, beschleunigen. Gleichzeitig wird die Konzentration der Glukose in dem
Substrat vermindert.
15 30
Wirkung der Substrat-Hitzebehandlung auf die Stabilität von Glukoseisomerase und
die Umwandlungseffizienz
Glukose | 94,8 | Substratanalyse | Nicht-Enzym- | Molver | Enzym | Enzym | |
Tempera | % d.b. | 93,8 | Maltulose | Fruktose | hältnis (1) | halbwerts | effizienz |
tur (0C) | 91,9 | % d.b. | % d.b. | zeit, 7-'(h) | kf 7"(2) | ||
Umgebungstemp. 95,3 | 89,5 | 0,10 | 0,10 | ||||
70 | Ketose pro | 0,05 | 0,43 | 0/43 | — | — | |
80 | ?)IGIU~1 | 0,05 | 1,35 | 1,35 | 484 | 11,4 | |
90 | 0,05 | 3,38 | 3,38 | 351 | 8,5 | ||
100 | 0,07 | 5,84 | 5,84 | 220 | 4,6 | ||
(ί) Mole | 0,10 | 100 Mole Anhydrohexose | 85 | 2,0 | |||
(2) G(G+I | |||||||
-M-
In diesem Beispiel wird die Wirkung auf die Stabilität von Glukoseisomerase und die Umwandlungseffizienz bei der
Isomerisierung eines unraffinierten Stärkehydrolysats/
welches nach dem anerkannten Stand der Technik erhalten wurde, gezeigt.
Ein Verfahren zur Herstellung von Stärkehydrolysaten
wird in dem zuvor erwähnten Aufsatz von Aschengreen (Process Biochemistry, Mai 1975) gezeigt, wobei betont
wird, daß gründliche Raffinierung des Substrats erforderlich ist, um daraus Materialien zu entfernen, welche die
Glukoseisomeraseaktivität inhibieren.
Stärke aus einem Mais-Naßmahlbetrieb wurde mit entionisiertem
Wasser auf einen Gehalt von 33 % Trockensubstanz aufgeschlämmt. Der Aufschlämmungs-pH wurde auf 6,5 %
mit MgO eingestellt und dann wurde eine ausreichende Menge an von B. licheniformis abgeleiteter ^-Amylase (Termamyl-60L)
zugegeben, um darin 20 Liquefone/g dss zu 0 erhalten. Die Verflüssigung wurde durchgeführt, indem man
die Aufschlämmung mit einer Rate von 12 ml pro Minute durch Schlangen aus rostfreiem Stahl leitete, worin die
Aufschlämmung bei einer Temperatur von 105 - 1070C während
7 min gehalten wurde. Die Aufschlämmung wurde dann auf 65°C gekühlt und in einer zweiten Schlange 1,5 h bei dieser
Temperatur gehalten. Das Teilhydrolysat (33 % Trokkensubstanz) mit einem DE von 18,6 enthielt keine rohe
Stärke mehr wie durch die Jodprobe festgestellt wurde und wurde vor der Saccharifizierung bei 6O0C gelagert.
Die verflüssigte Stärke wurde auf 30 % Trockensubstanz
verdünnt, der pH wurde auf 4,5 eingestellt und dann wurde
eine ausreichende Menge an Glukoamylasezubereitung (Novo AMG-150) zugegeben, bis zu einem Gehalt von 0,25
GU pro Gramm dss. Der Ansatz wurde 48 h bei einer Temperatur
von 600C und bei dem oben angegebenen pH erwärmt.
Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde unter Verwendung
von Dicalite CP-175-Filterhilfe filtriert und das Filtrat
wurde in einem Vakuumverdampfer bei einer Temperatur von
43°C auf eine Konzentration von 49,6 % Trockensubstanz eingedampft. Die Analyse der Flüssigkeit zeigte, daß der
Glukosegehalt etwa 95 % und der Maltulosegehalt etwa 0,2 % betrug.
Zur Herstellung eines Isomerisierungssubstrats wurde die
Flüssigkeit auf 0,002MMg(HSO3J2 eingestellt, und dann
wurde der pH mit einer Lösung von NaOH auf 7,9 eingestellt.
Die Flüssigkeit wurde dann 20 min bei 650C gehalten
und anschließend filtriert,
Das Substrat wurde mit immobilisierter Glukoseisomerase
isomerisiert, ohne daß zuvor eine Reinigungsbehandlung oder Raffination erfolgte. Die Isomerisierung wurde durchgeführt,
indem man das Substrat mit einer Eingabefließgeschwindigkeit von etwa 0,4 mm/min durch eine Säule
von 25 mm bei 65°C leitete, wobei in der Säule ein Bett aus immobilisierter Glukoseisomerase mit einer Aktivität
von 1000 IGIU vorhanden war. Die Isomerisierung wurde 570 h durchgeführt. Als Kontrolle wurde eine Lösung aus
kristallisierter Dextrose unter den gleichen Bedingungen isomerisiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle VII gezeigt.
•50·
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Substrat mit niedrigem Calciumgehalt und niedrigem Gehalt an nicht-enzymatisch
erzeugten Ketosezuckern vor der Isomerisierung keine besondere Raffination benötigt. Dies steht im direkten
Gegensatz zu der Lehre des Standes der Technik.
Wirkung auf die Glukoseisomerasestabilität und die Umwandlungseffizienz
beim Isomerisieren eines Stärkehydrolysats des Standes der Technik ohne
1
vorherige Raffination '
Substrat
Glukose Maltulose Ketose
% d.b. % d.b.
Molverhältnis
Ratenkonstan-
te k <2)
te k <2)
Enzym- Enzymhalb- effiwertszeit zienz
Kontrolle . 99,8 <0,10 <0,05 Substrat des
Standes der 94,9 0,19 0,10 Technik
(1) Mole Ketose pro 100 Mol Anhydrohexose
(2) g(G+F)h~1IGIU~1
(3) g(G+f)IGIU
.—I
0,026
0,021
528
545
13,7
11,6
cn
CD
cn
-Λ -
, 5a·
In diesem Beispiel wird die Isomerisierung eines unraffinierten
Stärkehydrolysats, das durch ein Säure-Enzym-Umwandlungsverfahren
erhalten wurde, gezeigt.
Stärke aus einem Mais-Naßmahlbetrieb wurden in entionisiertem
Wasser auf einen Gehalt von 33 % Trockensubstanz aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde mit konzentrierter
Salzsäure auf einen pH von 2,2 eingestellt. Die Verflüssigung erfolgte, indem man die Aufschlämmung
durch eine Schlange aus rostfreiem Stahl mit einer Geschwindigkeit von 22 ml/min während 4 min pumpte, wobei
die Aufschlämmung bei einer Temperatur von 135 bis
♦ ■
14O0C gehalten wurde und worauf man die Aufschlämmung
anschließend an die Atmosphäre abgab. Der pH wurde auf •den Bereich von 4,0 bis 4,4 eingestellt, indem man kontinuierlich
eine Natriumhydroxidlösung zugab, und die Temperatur wurde"auf 600C erniedrigt. Der Durchschnitts-
20 D.E. der verflüssigten Stärke war 18.
Etwa 70 1 der verflüssigten Stärke wurden saccharifiziert,
filtriert und konzentriert wie im Beispiel 5 beschrieben mit der Ausnahme, daß der pH 4,4 betrug und die Gesamtsaccharifizierungszeit
etwa 62 Stunden betrug. Die Saccharifizierungsflüssigkeit
bei 50,3 % Trockengehalt wurde mit MgO auf pH 5,8 eingestellt und dann wurde ausreichend
Mg(HSOo)2 zugegeben, bis die Konzentration daran 0,020 Mol
betrug und dann wurde der pH mit Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde
wärmebehandlet, filtriert und isomerisiert unter den in
Beispiel 5 angegebenen Bedingungen. Die'Isomerisierung
wurde 667 h durchgeführt.
Die Ergebnisse, die in Tabelle VIII gezeigt werden, vergleichen ein isomerisiertes kristallisiertes Dextrosesubstrat
mit einem unraffinierten Säure-Enzym-Substrat.
Isomerisierung | von | Kristallisierte | d.b. | unraffiniertem Säure-Enzym-Stärke-Hydrolysat | Raten | ,05 | te kf (2) | Enzymhalb- | Enzymeffi |
Dextrose (Kontrolle) | Substratanalyse | Maltulose Ketose, Molverhält- konstan- | ,05 | wertszeit | zienz | ||||
Substrat Glukose | Säure-Enzym | 99,8 | % d.b. nis | 0,026 | r« | kf r ο) | |||
% | 90,6 | 0,023 | |||||||
<0,10 <0 | 528 | 13,7 | |||||||
<0,10 /0 | 551 | 12,7 > | |||||||
(1) Mole Ketose pro 100 Mol Anhyrohexose
(2) g(G+F)h"1IGrj"1
(3) g(G+F)IGIU~1
d.b. = Trrockenbasis
CO
cn cn cn CD
- BG -
•SS
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein nach einem Säure-Enzym-Verfahren hergestelltes Stärkehydrolysat mit einem niedrigen
Gehalt an nicht-enzymatisch erzeugten Ketosezuckern wirksam ohne vorhergehende Raffination gereinigt werden
kann.
In diesem Beispiel wird die· Verwendung einer von Bacillus
coagulans Mikroorganismus abgeleiteten Glukoseisomerase zum Isomerisieren von Glukose zu Fruktose nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren gezeigt.
· Zwei Stärkehydrolysate wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt, ausgenommen
der pH bei der Verflüssigung und die Autoklavisierungstemperatur.
Diese Bedingungen für die jeweiligen Zubereitungen A und B werden in Tabelle IX gezeigt.
Verflüssigungs-pH 5,2 6,7
25 · Autoklaventemperatur (0C) 125 150-160
Die Analyse des Stärkehydrolysate auf Maltulosegehalt zeigte
einen Gehalt von <0,1 % für die Zubereitung A und einen
Durchschnitt von 1,10 % für die Zubereitung B. 30
Jede Zubereitung wurde filtriert und auf einen Trockengehalt
von 50 % im Vakuum konzentriert und dann auf einen Ge-
halt von 0,0025 M Mg(HSO3J2 eingestellt und anschließend
wurde der pH-Wert auf 7,9 mit Natriumhydroxidlösung eingestellt. Die unraffinierte Stärkehydrolysatzubereitungen
wurden jeweils kontinuierlich durch eine auf 6O0C
erhitzte Schlange mit einer Rate von 0,4 ml/min geleitet, was eine Verweilzeit von 20 min ergab und dann filtriert
und einer Isomerisierung unterworfen, indem man sie durch eine ummantelte Glaskolonne, die bei 650C gehalten
wurde, mit einer Fließrate von 0,4 ml/min leitete. In jeder Kolonne war ein Bett aus immobilisierter
Glukosexsomerase (Sweetzyme-Type S, Batch No. 70122 von Novo Industrie, Dänemark) enthalten mit einer Gesamtaktivität
von 800 IGIU.
15 Die Ergebnisse werden in Tabelle X gezeigt.
Zube- Be- Maltu- Ketose, Ratenkon- Enzymhalb- Enzym-
rei- trieb lose Molver-,.., stante wertszeit effi-
tung (h) % Trok- hältnislu kf (2>
T(b) zienz
kengeh. kp 7"''^'
A 871 <0,1 <0,05 0,0260 947 24,2
B 660 1,10 0,55 0,0262 551 14,4
25 (1) Mole Ketose pro 100 Mol Anhydrohexose
CGI -1
(2) g(G+F)h~1IGIU~1
(3) g(G+F)IGIU
Die Daten in Tabelle X zeigen die Wichtigkeit, solche Bedingungen einzuhalten, die eine niedrige Konzentration
an Maltulose in dem unraffinierten Hydrolysat ergeben.
• SI-
Die positiven Wirkungen auf die Stabilität der Glukoseisomerase und auf die Gesamtumwandlungseffizienz aus der
Verwendung von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Stärkehydrolysaten für Isomerisierungsreaktio
nen, ermöglicht es, daß man die Notwendigkeit der Raffination des Hydrolysats vor der Isomerisierung eliminieren
kann. Indem man die Bedingungen, unter denen die
Stärke verflüssigt und saccharifiziert wird, sorgfältig
kontrolliert, erhält man Substrate, in denen die Niveaus an solchen Materialien, welche nachteilig die Stabilität von Glukoseisomerase beeinflussen, derart sind, daß eine wirtschaftliche Herstellung von Glukose/Fruktose-Sirupen aus unraffinierten Hydrolysaten in einem technischen Ver fahren möglich wird.
Stärke verflüssigt und saccharifiziert wird, sorgfältig
kontrolliert, erhält man Substrate, in denen die Niveaus an solchen Materialien, welche nachteilig die Stabilität von Glukoseisomerase beeinflussen, derart sind, daß eine wirtschaftliche Herstellung von Glukose/Fruktose-Sirupen aus unraffinierten Hydrolysaten in einem technischen Ver fahren möglich wird.
Claims (19)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung eines Glukose/Fruktose-Sirups, bei dem man unraffiniertes glukosehaltiges Stärkehydrolysat mit immobilisierter Glukoseisomerase in Berührung bringt und wenigstens einen Teil der Glukose und Fruktose umwandelt, dadurch g.e k e η η zeichnet , daß das glukosehaltige Hydrolysat nicht mehr als etwa 100 ppm Calciumionen, bezogen auf Stärketrockensubstanz, enthält und daß ein Molverhältnis von nicht-enzymatisch erzeugten Ketosezuckern von . weniger als etwa 2 Molen pro 100 Molen Hexoseeinheiten vorliegt.·» ρ —
- 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / daß das Hydrolysat hergestellt wurde durch ein Säure-Enzym-Verfahren, bei dem Stärke unter kontrollierten Bedingungen verflüssigt und5 saccharifiziert wurde.
- 3. Verfahren gemäß Anspruch 1/ dadurch gekennzeichnet , daß das Hydrolysat durch ein Enzym-Enzym-Verfahren hergstellt wurde/ bei dem Stärke unter kontrollierten Bedingungen verflüssigt und saccharifiziert wurde.
- 4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet / daß die Stärke unter Ver-1-5 wendung von Of-Amylase/mit einer verminderten Abhängigkeit gegenüber Calciumionen verflüssigt wird.
- 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch g e k e η η zeichne.t , daß die CX-Amylase sich von B. Ii-20 cheniformis ableitet.
- 6. Verfahren gemäß eirem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeic hnet , daß die Stärke in Gegenwart von Calciun ionen einer Konzentration von nicht25 mehr als etwa 30 ppm verflüssigt wird.
- 7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6/ dadurch gekennzeichnet , daß die Stärke in zwei Stufen mit einer dazwischen liegenden Autoklavisierungs-30 stufe verflüssigt wird.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Stärke bei einem pH von etwa 5 bis 6, vorzugsweise 5,2 bis 5,4, verflüssigt wird.· ■
- 9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man die Stärke bis zu einem D.E. von etwa 16 verflüssigt.
- 10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Stärke hergestellt wird aus einer Stärkeaufschlämmung mit einem Ionengehalt von nicht mehr als etwa 0,2 % als sulfatisierte Asche auf Trockenbasis.
- 11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Glukosehydrolysat einen Glukosegehalt von mehr als etwa 92 % und vorzugsweise etwa 94 %, bezogen auf die Stärketrocken-20 substanz, aufweist.
- 12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß das Glukosehydrolysat erhalten wird, indem man die verflüssigte Stärke mit Glukoamylase bei einer Temperatur im Bereich von etwa 54 bis etwa 620C während etwa 30 bis etwa 80 h saccharifiziert.
- 13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die Saccharifizierung bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 5 und vorzugsweise etwa 4,6 durchführt. ^- 4 /5 -
- 14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet / daß der Maltulosegehalt des unraffinierten Hydrolysats weniger als etwa 4 %, bezogen auf Stärketrockensubstariz, beträgt.
- 15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14/ dadurch gekennzeichnet/ c.aß der nicht-enzymatische Fructosegehalt des unraffinierten Hydrolysats weniger als etwa 1 % / bezogen auf Stärketrockensubstanz,10 beträgt.
- 16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet / daß das unraffinierte Hydrolysat/ bevor es mit der immobilisierten Glukose^15' Isomerase in Berührung gebracht wird/ auf eine Temperatur im Bereich von etwa 50 bis etwa 700C während einer Zeit von etwa 20 bis 60 min erwärmt wird.
- 17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet/ daß man das unraffinierte Hydrolysat auf eine Temperatur von etwa 60aC während etwa 30 min erwärmt.
- 18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das unraffinierteHydrolysat durch wenigstens ein Bett von immobilisierter Glukoseisomerase unter geeigneten Bedingungen geleitet wird, um wenigstens einen Teil der Glukose in dem Hydrolysat zu Fruktose zu isomerisieren. 30
- 19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Bett aus immobilisierter Glukoseisomerase aus Glukoseisomerase, die adsorbiert oder gebunden ist an DEAE-Zellulose oder an ein Anionenaust.auschharz, besteht.
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