DE2017043A1

DE2017043A1 - Verfahren zur Gewinnung von hochreinen maltosereichen Zuckerlösunfen bzw. -siruoen

Info

Publication number: DE2017043A1
Application number: DE19702017043
Authority: DE
Inventors: Kaname; Hi-"8o Ma^oru; Okayama Sugimoto (Japan)
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1969-04-09
Filing date: 1970-04-09
Publication date: 1970-10-22
Also published as: NL7005070A; US3804715A; CA951665A; SE390736B; BE748651A; GB1319460A; IT1035512B; JPS529739B1; NL164901C; NL164901B; ZA702354B; FR2043054A5; CH531045A

Description

ZELLENTiN-u. UUYKEN

8000 München 22

Hayashibara Company 9- April 1970

Okayama / Japan . ' ^u

hao

Verfahren zur Gewinnung von hochreinen maltosereichen Zuckerlösungen "bzw. -sirupen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Zukkerlösungen bzw. Zucker sirupen mit ho/ihem Gehalt an hochreiner Maltose durch enzymatischen Stärkeabbau. .

Maltosehaltige Zucker aufweisende sogenannte Malzsirupe werden bekanntlich entweder durch Verflüssigung und Verzuckerung von Stärke mittels aus gekeimter Gerste bereiteter Malzamylase oder zuerst durch Verflüssigung von Stärkeauf schlämmungen mit Hilfe von 06-Amylase unter Erhitzen und dann Verzuckerung mittels Malzamylase gewonnen. Die erhaltenen Produkte enthalten jedoch verschiedene Verunreinigungen und hochmolekulare Dextrine; ihr Maltosegehalt ist lediglich etwa 50%· Deshalb ist deren Verbrauch in der Zuckerwarenindustrie gering, obwohl sie wegen ihrer günstigen nichthygroskopischen Eigenschaften und ihrer Haltbarkeit begehrt sind. Entwickelt wurden zwar

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kürzlich ein wirtschaftliches Verfahren zur Extraktion der zur Verzuckerung anwendbaren reinen ß-Amylase aus Weizenkleie, sowie ein farbloser reiner Maltos esirjjup, der Aussicht hat, bald am meisten von allen Stärkesirupen erzeugt zu werden; jedoch ist dessen Maltosegehalt ebenfalls noch niedrig, so daß ein Bedarf an Stärkesirupen mit hohem Maltosegehalt oder reiner Maltose besteht.

Bei den Arbeiten über die Extraktion reiner ß-Am^lase aus Weizenkleie hatten die Erfinder kürzlich ein Verfahren zur Gewinnung maltosereichen Zuckers mit Hilfe dieser reinen ß-Amylase und verschiedener ^-1,6-Glukosidasen entwickelt. Die hierbei aus Stärke - entweder in äußerst verdünnter Lösung oder in Gegenwart einer größeren Menge ß-Amylaseyin wirtschaftlicher Weise in einer Menge von etwa 65% erhaltene Maltose liegt in den gewonnenen Zuckergemischen bis zu etwa 65% vor. Da ß-Amylase nur zur Zersetzung der geraden Stärkeketten in Maltose befähigt, nicht aber zur Aufspaltung von «?6-1,6-Glukosidbindungen verzweigter Ketten, wurde der Einsatz der ß-Amylase begrenzt und zusätzlich ^-1,6-Glukosidasen, die durch Zerstörung der «?6-1,6-Glukosidbindungen in der Stärke die Einwirkung der ß-Amylase erleichtern, eingesetzt.

Die letztgenannten Enzyme sind als Isoamylase der Hefe und > als R-Enzym höherer Pflanzen bekannt} kürzlich trug die aus Aerobacter aerogenes erhaltene Pullulanase zur Untersuchung der Mulekularstruktur von Stärke bei ("Biochem.Z." 334/1961,79).

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Obgleich diese Enzyme unterschiedliche Wirkungen auf Keimböden aufweisen, haben sie gemeinsam die Fähigkeit zur Hydrolyse der ^-1,6-Glukosidbinduhgen der Stärke, jedoch den

Nachteil der geringen Hitzefestigkeit· Die Erfinder entdeckweitere

ten mehr als 10 /geeignete neue Stamme, vor allem Pseudomonas amyloderamosa (ATCC 21262) und Escherichia intermedium (ATCC 21073), sowie fünf industriell wichtige hitzefeste Strahlenpilse, wie Streptomyces diastochromogenes (IFO 5337) sowie Lactobacillus plantarum (ATCC 8008). Versuche zur Anwendung der neuen hitebestandigen Enzyme führten zur vorliegenden Erfindung. ■■.'*■-

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgäbe besteht nun in der EntwickiuDig eines industriellen Verfahrens zur wirtschaftlichen Massenherstellung von derartigen Zuckerlösungen bzw. Zukkersirupen und Zuckerpulvern hieraus Von beliebigem Maltosegehalt, die dank ihrer Nichtkristallisierbarkeit, Nichthygroskopizität, chemischer Stabilität, reinerSüße und Geschmaeksrichtung für die Lebensmittelindustrie von großem Wert wären.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man gleichmäßig verflüssigte Stärken bei möglichst hohen Konzentrationen und Temperaturen mit Kombinationen von ß-Amy-¹^aseNöfd ^-1,6-Glukosidase zu über 50, vorssugsweise über 60% Maltöie im Zuckeranteil enthältenden Lösungen bzw. Sirupen verzuckert und diese gegebenenfalls durch Eindampfen bzw.Trock— iien in eingedickte Sirupe oder Feststoffe überführt*

009843/1282 ...λ

Als Ausgangsstoff dient jegliche Stärke über- und unterirdischen Ursprungs, wie solche von Mais, wachsartigem Mais,: klebrigem Reis und Weizen sowie Süßkartoffeln, Weißkartoffeln und Tapioka.

(A). Die Verflüssigungsstufe.
Diese kann vorzugsweise erfolgen:
(1). durch übliche Säureeinwirkung

(2). mittels ^'-Amylase, insbesondere solcher aus Bacillusfe substillis,

(3). mittels der im Malz enthaltenden Amylase, (4). durch wenige Minuten dauerndes Erhitzen ohne Enzym unter Rühren bei 100 bis 170⁰O.

Die Auswahl der Verflüssigungsmethode richtet sich nach wirtschaftlichen Gesichtspunkten sowie dem Maltosegehalt im Rohstoff und Endprodukten. .

Falls das durch Verflüssigung in ungerader Glukosezahl erhaltene Glukosepolymer beim. Verzuckern vollkommen in Maltose P oder Disaccharide zersetzt wäre, würde die Bildung von Glukose oder Maltotriose nicht zu vermeiden sein; letzterer Vorgang erniedrigt naturgemäß den Anteil an gebildeter Maltose aus kurzkettigem Glukosepolymer..Daher muß zwecks Gewinnung hochreiner Maltose das Dextroseäquivalent (D.E.) verflüssigter Stärke möglichst lange so niedrig wie möglich gehalten werden, nämlich auf 0,5 bis 5%i vorzugsweise ΛI bis .2$, ;r'-'in ·

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Abhängigkeit von der angewandten Verflüssigungsmethode (2) oder (4).

Bei einem Maltosegehalt der gewonnenen Stärkesirupe von etwa 50 "bis 80% ist die der Verzuckerung nachfolgende Reinigung einfach und eine Rückgängigkeit des Dextrins während der Verzuckerung bei einem D.E. im Bereich von 5 his 30% entsprechend der Verflüssigungsmethode (2) nicht zu befürchten; jedoch wird bei einem D.E. über 10 der Endgehalt von Maltose mit Erhöhung des D.E. allmählich erniedrigt.

Geeignete Stärkekonzentrationen liegen im Bereich von 10 bis 30%. Bei einer Konzentration über 40% tritt eine hohe Viskosität auf, und die Behandlung wird beschwerlich. Besonders wenn ein maximaler Maltosegehalt erwünscht ist, liegt die bevorzugte Konzentration zwischen 10 und 20%.

Hinsichtlich der Unterschiede im Stärkerohstoff ist die Verflüssigungsmethode (4·) besonders für überirdische Stärken wie Maisstärke geeignet, da diese sich schwierig vollständig gelatinieren läßt. Die Methode (2) ist bei Benutzung einer erhöhten Enzymmenge ebenfalls zufriedenstellend anwendbar. Für derartige Verflüssigungen verschiedener Stärkeaufschlämmungen ist ein kontinuierlicher Verflüssigungsapparat anwendbar.

(B). Die Verzuckerunftsstufen.

Der Ablauf der ersten Stufe hängt von oben angegebenem D.E.-

Werten ab. Ein Zuckerprodukt mit maximalem Maltosegehalt, z.B. von 90 bis 95%» wird erzielt bei weitgehender Einwirkung der Enzymkombination auf ein Verflüssigungsprodukt vom D.E. 1 bis 2. Schwierig wird es, wmn bei höherer Temperatur verflüssigte Stärke auf etwa 5O⁰G abgekühlt wird, demzufolge die Viskosität sich stark erhöht und eine Rückläufigkeit derart fortschreitet, daß die Enzymeinwirkung rückgängig gemacht wird. Es ist daher notwendig, daß ein bei hoher Temperatur verflüssigtes Produkt schnell gekühlt wird und unverzüglich die Enzyme eingeführt werden, wodurch die Viskosität eher herabgesetzt wird, bevor eine Rückläufigkeit eintritt; hierdurch erfolgt ein Abbau unter Erniedrigung der Viskosität und Verhütung der Rückläufigkeit. Dies kann man in einer der folgenden Weisen durchführen:

(a). Das verflüssigte Produkt wird zweks Kühlung auf eine festgesetzte Temperatur im Vakuum in einen Kühler eingesprüht und gleichzeitig die Enzymlösung mit einer bestimmten Geschwindigkeit eingespritzt. In der gemischten Lösung wird hierdurch die Viskosität schnell herabgesetzt und die Rückläufigkeit erfolgt nur langsam; behandelt man die Lösung länger als eine Stunde in einem Mischbehälter, so ist die erhaltene Lösung frei von Rückläufigkeit und wird im Verzuckerungsbehälter bei optimalen pH-Werten und Temperaturen solange behandelt, bis die Verzuckerung beendet ist.

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-I-

(b). Sine au bevorzugende Methode besteht im Kühlen der bei hoher Seeperatur verflüssigten Stärke auf eine verhältnismäßig hohe Temperatur von 50 bis 65⁰G₁ Zugeben eines aus besondere hitzebeständigem Lactobacillus-Stamm, einem Strahlenpila oder hochhitsefester ß-Amyläse erhaltenen Enzyms, Mischen in einem {fischbehälter zwecks Zersetzung und Viskositätsernledrigungt Herabsetzen der Temperatur in einem zweiten Mischbehälter und Einführen eines weniger hitzefesten Enzyms. Bei Anwendung hit Bebeständiger ^-1,6-Glukosidasen können beide Ensyaarten eu Anfang bei hoher Temperatur oder getrennt in verschiedenen Stuf en bei bestimmten pH-Verten und Temperaturen eingeführt werden, wobei die hitzebeständige ^-1,6-Glukosidase entweder in der ersten oder in der zweiten Stufe eingesetzt werden kann.

BIe in Rede stehenden Maßnahmen können durch schnelles Abkühlen der Stärkelöeung und sofortiges Vermischen der beiden Enzyme mit der Lösung durchgeführt werden. Beseer ist es, die bei hohe)? Temperatur verflüssigte Stärke auf eine Temperatur von etwa 6O⁰O, bei welcher eine Rückläufigkeit zu verhindern möglich. 1st, abzukühlen, ein oder beide Enzyme zwecks teilweiser ZereetBung einzuführen, das Gemisch während oder nach Abfal^L der Tiakoeität su kühlen, dann das andere Enzym einzuführen und die Hydrolyse bei optimalen pH-Werten und Temperaturen BU beenden.

r . . .6

009043/ma

ORIGINAL INSPECTED

Jede ^-1,6-Glukosidase "besitzt eine mehr oder weniger spezifische Wirkung auf Stärke. Insbesondere wirkt das aus Pseudomonas-Stämmen "bereitete Enzym etwas anders als die aus anderen Stämmen erhaltenen Enzyme, so daß man "bei Anwendung des ersteren in Kombination mit einem anderen Enzym eine starke· ß-Amylolyse erzielt. Ähnliche oder noch bessere Wirkungen erreicht man "bei Benutzung von ß-Amylase in Kombination mit zwei oder mehr cL -1,6-Glukosidasen.

Bisweilen bleibt im Endprodukt eine äußerst geringe Dextrinmenge, verursacht durch einen zu niedrigen D.E.-Wert bei der Verflüssigung bzw. einen Fehler in der Arbeitsweise oder Apparatur, zurück. Dieser Dextrinrest kann durch Zusatz einer geringen Menge, z.B. von weniger als 5 Einheiten je g Stärke (E/g St) <C-Amylase in der Heak-tionsmitte oder gegen Ende der Verzuckerung bei erhöhter Temperatur von 70 bis 80°C vollständig entfernt und hierdurch auch der Reinigungsprozeß unter Gewinnung einwandfreier Produkte erleichtert werden.

Soll ein Maltosegehalt von etwa 50 bis 60% erreicht werden, treten in den Kühl- und Verzuckerungsstufen keine Schwierig-

keiten auf, da bei der Verflüssigung ein D.E.-Wert über 5 erreicht \irerden kann. Die Hydrolyse kann vor allem dann einwandfrei zu Ende geführt werden, wenn ^-Amylase oder eine hitzebeständige ^-1,6-Glukosidase oder beide bei einer Temperatur von etwa 60°C, wie vorbeschrieben, einwirkt, das Gemisch dann

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gekühlt und mit Jj-Λ,6-Glukosidase oder ß-Amylase bzw. /beiden versetzt wird.

Die Verzuckerung kann in Gegenwart der Kombination verschiedener Enzyme bei einer !Temperatur auch unterhalb 5O⁰C durchgeführt werden. Dies ist aber hauptsächlich anwendbar zur Gewinnung von Zuckerlösungen mit geringem Maltosegehalt, da der Gehalt von Glukose und Maltotriose gerade dann zwischen 10 und 20% liegt, wenn ein aus Polymixa gewonnenes Enzym wie ß-Amylase bei der Verflüssigung den niedrigsten D.E.-Wert bewirkt.

Die angewandten Enzymmengen und Reaktionszeiten sind entsprechend den beabsichtigten «Zwecken zu regeln. Benötigt man z.B. hochreine Maltose, so ist der Einsatz von je 20 E/g St «^-1,6-. Glukosidase und ß-Amylase sowie eine Dauer von 30 bis 45 Stunden vorzuziehen. Erstrebt man Zucker mit geringem Maltosegehalt, so kann die ß-Amylasemenge auf 1 bis 10 E/g St herabgesetzt werden; vom industriellen Standpunkt ist eine Reaktionszeit von 30 bis 4-0 Stunden zu bevorzugen.

Cc). Die Aufbereitungsstufen.

Durch Erhitzen der erhaltenen Zuekerlösungen zwecks Unwirk-. sammachen oder Ausfällen der Enzyme und Reinigen mit Aktivkohle oder Ionenaustauschharz erhält: man farblose, durchsichtige Lö'.sungen, cdlfe durch. Eindampfen auf einen Zuckergehalt von 50% nichtkristallisierbar gemacht werden. Gerade bei hoher

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4+

Konzentration der Lösungen kommen auch deren weitere Merkmale, wie milde Süße, geringere Reizwirkung als bei üblichem Zucker, Nichthygroskopizität und Haltbarkeit, bei Anwendung als Rohstoff für Zuckerwaren zur Geltung.

Durch Sprühtrocknung der auf 50 bis 7°% eingedickten Lösungen erhält man fast wasserfreie Pulver. Durch Kristallisierenlassen der Lösungen und nachfolgende* Pulverisieren gewinnt man Produkte mit 10 bis 15% Wasser, d.h. gegebenenfalls wasseerhaltige Kristallpulver von Maltose. Durch Kristallisieren von Maltosehydrat aus hochreinen Maltoselösungen einer Konzentration über 70% und Trocknen durch Versprühen werden feine Pulver wasserhaltiger Kristalle, die im weiten Umfang verwendbar sind, erhalten.

(D). Die apparative Anlage.

Auf der beiliegenden Zeichnung ist eine Reaktionsapparatur zur kontinuierlichen Duchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens veranschaulicht; auf der Zeichnung sind mit V die Ventile, mit P die Pumpen, mit D der Dampfeinlaß, mit W die Wasserzuflüsse und mit E die Enzymvorratsbehälter bezeichnet.

Im Beschickungsbehälter (1) wird die Konzentration und der pH-Wert der Stärkeaufschlämmung sowie die Menge der aus dem / darüber angeordneten Enzymbehälter (E) zulaufenden <>C-Amylase eingestellt und das Gemisch fortlaufend in den mit Vielholmflügelrührern versehenen Gelatinierbehälter (2) gepumpt, in

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Ak

welchem die knttniii fimsmng unter starkem ßüliren aufgeheizt und schnell gelatiniert wird, worauf sie in den nachfolgenden 10 tie gO ummantelten Verflüssigungsbehältern (3) hei konstanter Temperatur bis sum optimalen Abbaugrad verflüssigt wird. Bd.* erhaltene Lösung sprüht man mittels eines Reduzierventils in den Vakuumkühler (4-), kühlt sie hierdurch bis auf die gewünschte Temperatur und pumpt sie sodann über den VakuumkÜhlfr X5) in den ersten Verzuckerungsbehälter (6), dem das erste Bäsja entweder unmittelbar oder durch vorhergehendes EineprÜhen in Am. Kühler (5) zugeführt wird.

Wird im Falle einer einstufigen Verzuckerung ein Gemisch von ß-Amylase und ^6-1,6-Glukosidase angewandt, so wird die im Behälter (6) vorrersuckerte Lösung zwecks Vollendung der Verzukkerung in den »weiten Verzuckerungsbehälter (8) überführt. Venn man. dagegen die Verzuckerung in zwei hinsichtlich der Enzyme und Temperatur unterschiedlichen Stufen durchführt, läuft die in ersten Terzuckerungsbehälter (6) eine bestimmte Zeit behandelte Lösung kontinuierlich in den Mischbehälter (7), dem das zweite Sozrm unter Erwärmung auf eine festgesetzte Temperatur kontinuierlich zuläuft, worauf das Gemisch in den zweiten Vereuckerungsbehälter (8) übergeführt wird. In den Behält*!». (6) und (?) wird das Einmischen der Enzyme durch kfSLftiges Verrühren sowie in allen drei Behältern der pH-Wert und die Temperatur getrednt geregelt.

...10

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BAD ORIGINAL

(E). Die Enzyme.

(a). Als Verflüssigungsenzym diente vorzugsweise die aus Bacillus subtillis (Handelsprodukt "Neospitase" der Japanischen Firma Nagase-Sangyo K.K.) erhaltene ^-Amylase, als ß-Amylase entweder das bereits erwähnte, aus Weizenkleie gemäß der britischen Patentschrift 1 13O 398 extrahierte oder das aus Bacillus polymixa (ATCC 8523) erhaltene Produkt.

Als ,5^-1,6-Glukosidasen verwendete man - außer den oben genannten Stämmen Pseudomonas amyloderamosa (ATCC 21262) und Escherichia intermedia (ATCC 21073) sowie dem ebenfalls erwähnten Strahlenpilz Streptomyces diastatochromogenes (IFO 3337) noch folgende Strahlenpilze:

Actinomyces globisporus (IFO 12208) Nocardia asteroides (IFO 3384) Micromonospora melanospora (IFO 12515) und Thermonospora viridis (IFO 12207)

ferner die Stämme:

Agrobacterium tumefaciens (IFO 3085)

to
Az^bacter indicus (IFO 3744) Bacillus cereus (IFO 300-j) Erwinia aroyde (IFO 3057) Lactobacillus plantarJLum (ATCC 8008) Leuconostoc mesenteroides (IFO 3426) Mycobacterium phlei (IFO 3158) Micrococcus lysodeikticus (IFO 3333)

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Pediococcus acidilactici (IFO 3884) Sarcina rutea (IFO 3232)
Seratia indica (IFO 3759)
Staphylococcus aureus (IFO 306i)und Streptococcus faecalis (IFO 3128).

(b). Pie Bestimmung; der Enzymaktivität. (1). ^-Amylase:

Mehrere Probierröhrchen, Jeweils gefüllt mit 10,0 g Weißkartoffelstärke

1,0 ml einer 0,1 Mol-Acetatpufferlösung und 8,0 ml Wasser^

versetzte man mit 1,0 ml ^-Amylase verschiedener Konzentra- «. tion, bewegte sie dann heftig im Wasser, hielt sie nach der Starkegelatinierung 15 min im Wasser von 65°C und hierauf 10 min zur Enzyminaktivierung in kochendem Wasser, kühlte sie alsdann 3 min im Wasser von 17 G und gab 1 ml einer 0,1%igen Fuchsinlösung zu. Nun wurden die verschlossenen Röhrchen 5 rotiert. Unter den Röhrchen mit gleichmäßig gefärbter Lösung wurde die Lösung mit der niedrigsten Dichte als 1 Einheit be stimmt.

(2). ß-Amylase:

Eine Mischung von

5 ml einer 1%igen löslichen Stärke, 4- ml einer O,'}^HqI-Acetatpufferlösung und 1 ml einer ß-Amylase-Lösung

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ließ man 30 min bei 40⁰C reagieren und bestimmte den erhaltenen reduzierenden Zucker"als Maltose. Die Wirkung der Enzym lösung zur Bildung von 10 mg Maltose wurde als 1 Einheit bestimmt.

(3)· vL -1j6-Glukosidase:
Man ließ ein Gemisch von

1 ml Enzymlösung,

5 ml einer 1%igen löslichen klebrigen Reisstärke und

1 ml eines 0,5 Mol-Acetatpuffers vom pH 6,0 30 min bei 40⁰C reagieren, worauf 0,5 ml der Reaktionslösung in ein Gemisch von

0,5 ml einer 0,01 Mol-Jod-Jodkali-Lösung und 15,0 ml einer 0,01 N-Schwefelsäure

zwecks Bildung einer bläulich-purpurnen Färbung eingegossen wurden. Nach 15 min bestimmte man die Extinktion bei 620 mu-Wellenlänge und berechnete den Unterschied zur Extinktion bei Reaktionsbeginn. Die eine Differenz von 0,01 ergebende Enzymlösung wir de als 1 Einheit bestimmt.

(c). Bereitung der Enzymlösungen.

(1). Das aus Escherichia intermedium (ATCG 21073) erhaltene Enzym inokulierte man (in der Menge einer Platindrahtöse) in 100 ml eines in einer 500 ml Flasche enthaltenden Mediums der Zusammensetzung: ;

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is

0,5% Maltose

0,8% Pepton

0,5% Natriumnitrat.

Nach einem 48 h langen Schwenken der Kultur mit 125H/min "bei 90⁰C erlangte die ^-1,6-Grlukosidae-Aktivität ihren Höhepunkt, worauf die Bazillenzellen zur Bildung der Enzymlösung abgeschleudert wurden. Beim Abtrennen des Enzyms von der obigen, Isoamylase enthaltenden Lösung sonderte man die Fraktionen, die 15 bis 48% Ammoniumsulfat fällen, aus. Das entwässerte und getrocknet· Enzym wurde in Form einer Losung vorbestimm- " ter Konsentration, welche den verwendeten Mengen entsprach, beim optimalen pH von 5t5 bis 6,0 und der optimalen Temperatur von 45°C benutzt.

(2)· Sie au· Ffeeudomonas amyloderamosa (SB_rj15 ATCC 21262) erhaltene ^(,-1,6-Glukosidase inokulierte man in ein sterilisiertes Medium tob pH 7« enthaltend:

2,0% Maltose

0,2% Natriumglutamat

0,3% (D)HPO

0,05% ₄ y und unterwarf die Kultur 120 h bei 30⁰C dem Rütteln, worauf in der Kulturflüssigkeit eine Enzymaktivität von 180 bis Einheiten gefunden wurde. Nach 10 min langem Zentrifugieren mit 10.000 U/min zwecks Entfernung der Mikroorganismen ver-

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BAD OBSGlNAL

setzte man die überstehende Flüssigkeit unter Kühlung mit kaltem Aceton bis zu einer Konzentration Von 75% und rührte zwecks Ausfällung des Enzyms,das abgeschleudert und im Vakuum durch Gefriertrocknen in pulverige <*C-1,6-*Glukosidase überführt wurde. Ausbeute 80 bis 90%. Das im i?rocknen Zustand beständige Enzym konnte durch Aussalzen, z*B. mit Ammoniumsulfat, gereinigt werden. Es war im pH-Bereich von 3 bis 6 stabil·, das optimale pH betrug J. Die Arbeitstemperatur lag im Bereich von 4-0 bis 5O°C. '

(5)· (a) Den enzymbildenden Stamm Lactobacillus plantarum (ATCC 8088) inokuliert man in 7 ml eines sterilisierten Mediums, enthaltend:

0,7% verflüssigte Stärke

0,5% Maltose

1,0% Pepton _:

0,5% Hefeextrakt

0,05% NaGl

0,05%

0,001%

0,0002% ₄₂

kultivierte 1 Tag bei 30°C und nach Überführen der Mischung in weitere 10 ml des Mediums noch 2 Tage bei 3O⁰C, Die Endkul tür vom pH 4,0 hatte einen Exoaktivität voll 16, eine Endoaktivität von 1T und wies insgesamt 33 E/ml auf. Für das hitze«

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ORIGINAL INSPECTED

AT

beständige Enzym war optimal ein pH von 5 bis 6,5 und eine Temperatur von 50 bis60°.

(b). Den enzymbildenden Stamm Micrococcus rhisodicticus (IFO 8333)» erhalten aus einem frischen Schrägkulturmedium, inokulierte man (in der Menge einer Platindrahtöse) in 4 Medien vom pH 7jO, enthaltend jeweils;

1,0% Maltose

0,5% Pepton

0,25% Hefeextrakt

0,2 % Harnstoff :,

0,2 % Fleischextrakt

0,1 %

0,45%

0,05%

kultivierte die Gemische 1 Tag und unterwarf sie nach Überführung in 20iL-Gefäße 3 Tage einer belüfteten Kultur bei 30°C.

Das End-pH betrugt 8,2, die Exoaktivität 12, die Endoaktivität 39_? insgesamt 52 E/ml; optimal war für das hitzebeständige En- |

ο zym ein pH von etwa 6 bis 7 "und eine Temperatur von 45 C

(4). Enzymbildende Stämme der Gattungen Streptomyces, Actinomyces, HOcardia, Micromonospora und Thermonospora inokulierte man (jeweils in der Menge einer Platindrahtöse) in ein ste-, rilisiertes Kulturmedium vom. pH 7.»:P» enthaltend:

...16

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Λ,Vfc verflüssigte Stärke
0,5% Pepton
0,5% Fleischextrakt
0,5% Salz,

20 min bei 120°C und unterwarf die Gemische dann in 11-Flaschen 4 Tage "bei 30°C einer Büttelkultur, worauf jede Enzymflüssigkeit zwecks Reinigung mit Ammoniumsulfat ("bei 0,4-0,6-Sättigun) ausgesalzen, mit 0,02 IT-Ac etatpuff erlösungen vom pH 7>0 behandelt, mittels DEAE-Gellulose absorbiert und mit einer 0,02 N-Acetatpufferlösung und 0,5 N-HaOl-lösung eluiert wurde.

Pur die im Vergleich zu anderen Enzymen eine gute Hitee-

den Enzymß
beständigkeit aufw.eisen/ war optimal ein pH von 5,0 bis 7»0 und eine Temperatur von 50 bis 60°G.

(5). EnzymMldende Stamme der Gattungen Agrobaeterium, Azotobacter, Bacillus, Erwinia, Leuconostoc, Mycobacterium, Pediococcus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus und Streptococcus inokulierte man jeweils in 11—Flaschen in sterilisierteMedien, enthaltend

1,4% verflüssigte Stärke

1,0% Pepton

0,5% MgSO₄

0,01%

und unterwarf die Gemische einer 4tägigen Süttelkultur, worauf die Mikroben durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer 0;1%igen SDS-Pufferlösung suspendiert und 2 Tage bei $0°C rotiert wurden.

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Nach Abtrennen der überstehenden Lösung und Vereinigung mit der bei der Mikrobenabtrennung anfallenden Lösung wurde mit Ammoniumsulfat (bei 0,8-Sättigung) ausgesalzen, die Fällungen in Wasser gelöst, die Lösungen 24- h dialysiert und durch Zentrifugieren die überstehenden Lösungen als Enzymlösungen gewonnen, deren Optimum beim pH von 5 bis 7 und Temperaturen von 45 bis 5O°G lag.

en

(6). EinTB-fiisym bildenden Bacillus polymixa (ATCC 8625) inokulierte man in einer 11-Flasche in einem sterilisierten Hedium, enthaltend: ·

2,0% lösliche Stärke

0,15t Hefeextrakt

0,5%

0,055* 0,014%

0,025% 0,5% ₃

führte eine 4tägige Rüttelkultur bei 3O⁰C durch und zentri- λ fugierte die Mikroben ab, die 10 min danach in ein Gemisch von 2 ml Acetatpuffer vom pH 6,0 und 5 ml Wasser suspendiert, 20 min einer Oberschallbehandlung unterworfen und dann abgeschleudert wurden. Die überstehende Flüssigkeit verwendete man als fiisymlösung.

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BAD ORIGINAL

(F). Quantitative Analyse der Zuckerkompositionen.

Die durch Verzuckerung abgebauten Stärkelösungen wurden nach Reinigung mit Aktivkohle und einem Ionenaustauschharz papierchromatographisch untersucht, indem man jeden Teil des Papierchromatogramms mit Wasser extrahierte, das Extrahierte hydrolysierte und nach der Somogyi-Methode unter Ermittlung des prozentualen Gehalts jedes Bestandteils der Gesamtzuckermenge prüfte. Die Zersetzungsgrade der verflüssigten und verzucker- ■ ten Lösungen ermittelte man als prozentuale Werte im Vergleich zu den Gesamtzuckermengen nach Zersetzung des reduzierenden Zuckers mit Salzsäure und Multiplizieren mit 0,9.

(G). Gelatinierung und Verflüssigung von Stärke.

Der Ablauf dieser Vorgänge ist, wie oben erwähnt, für die Regelung des Maltosegehalts verzuckerter Stärke von Bedeutung. Als geeignet hatten sich vor allem die nachfolgenden drei Arbeitsweisen erwiesen.

(1). HochtemperaturRelatinierunK;

Die Stärkeauf schlämmung wurde gemäß der im Abschnitt (A) unter (4) genannten Methode in dem in der Zeichnung gezeigten Beschickungsbehälter (1) schnell unter Rühren bei 100 bis 170°C homogenisiert, auf ein pH 5 bis 6 eingestellt und dann im Gelatinierbehälter (2) unter Erhitzen und Rühren in 10 bis 30 min bis zum D.E. 0,5 bis 5 homogen verflüssigt. Die im vollständig und homogen dispergierten Zustand vorliegende Lösung hatte eine niedrige Viskosität, jedoch einen hohen PoIy-

0-09843/1282- •••¹⁹

merisatinnsgrad und war daher zur Gewinnung maltosereicher Produkte geeignet. Bei Einstellung der Stärkeauf schlämmung auf ein pH von 3»5 bis ^, erfolgte leicht ein Abbau bis zum D.E. 5" oder höher, jedoch war diese Arbeitsweise zur Gewinnung maltosereicher Produkte ungeeignet.

(2). Enzymatisohe Verflüssigung«

Gemäß der im Abschnitt (A) unter (2) genannten Methode wurde eine Stärkeaufschlämmung vom pH 6,0, welcher eine geeignete Menge der aus Bacillus subtillis erhaltenen rC-Amylase (vgl. Abschnitt E/a) zugesetzt sind, in der gleichen Weise wie bei der üblichen Gewinnung von Glukose oder Malzsirup behandelt, indem man die Aufschlämmung im Gelatinierbehälter (2) bei 80 bis 90⁰O bis zum D.E. 0,5 bis 2,0 verflüssigte. Wird ein D.E. von 5 bis 35 gewünscht, so wäre die Zahl der Verflüssigungsbehälter (3) zu erhöhen und die Temperatur auf 80⁰G einzustellen. Im letzten der Behälter (3) wurde die Stärkelösung zwecks Enzyminaktivierung auf 120 bis 125°C erhitzt. Im Einzelnen ist zu beachten: (J

(a). Wahl der Stärkekonzentration;

Nach vorstehender Methode läßt sich Jegliche, unter 40% Stärke enthaltende Aufschlämmung homogen verflüssigen. Die Konzentration wird entsprechend der in der zweiten Verzuckerungsstufe beabsichtigten Arbeitsweise eingestellt. Wird ein Endhydrolysat mit einem Maltosegehalt von 50 bis 80% gewünscht.,, so ist eine Lösung mit 20 bis 35# verflüssigter Stärke geeigaet;

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sollen dagegen die höchsten Maltosegehalte erreicht werden, so sind Konzentrationen von 10 bis 20% verflüssigter Stärke als Ausgangsstoffe zweckmäßig.

. Wahl des D.E.-Wertes;
Ein D.E. von 5 bis 30% ist einzuhalten, falls Maltosegehalte von etwa 50 bis 80% im Zuckerprodukt erhalten werden sollen, dagegen ein D.E. von 0,5 bis 3,0, wenn das Endprodukt über 80% Maltose aufweisen soll. Diese Voraussetzungen sind von Einfluß auf die Ergebnisse der VerzuckeBungsvorgange.

(c). Wahl der Stärkeart:

Die Hochtemperaturverflüssigung ist für die schwer zu gelatinierende Maisstärke nötig; falls enzymatisch verflüssigt werden soll, so ist die Enzymmenge um 50% zu erhöhen.

Beispiel 1 (Tabelle I).

(A). Eine 10%ige Aufschlämmung von Süßkartoffelstärke wurde mit 0,2% ^-Amylose bei pH 6,0 und 90°C bis zum D.E. 2,7 verflüssigt, worauf man mittels 2,5 E/g St einer aus Weizenkleie erhaltenen ß-Amylase in 16 h bei 55°O verzuckerte.

(B). Die gleiche verflüssigte Stärke wurde in analoger Weise mit einer Kombination von 10. E/g St einer aus einem Lactobacillus-Stamm erhaltenen ^C -1,6-Glukosidase und 25 E/g St ß-Amylase verzuckert.

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Aus Tabelle I ist eindeutig ersichtlich., daß im EaIle B weit höhere^Maltosegehalte erzielt wurden als im Falle A. Die Anwendung der aus den vorgenannten übrigen 18 Gattungen erhaltenen _<£-1_J6-Glukö8idasen ergab ähnliche Ausbeuten, wobei der Maltosegehalt lediglich um 1 bis 2% schwankte; lediglich das Pseudomonas-Enzym hatte bisweilen unterschiedliche Wirkungen sowie eine geringere Reaktionsgeschwindigkeit und benötigte daher ein niedrigeres pH-Optimum.

Beispiel 2 (Tabelle II), <

Gemäß Beispiel 1 verflüssigte 10 bis 20%ige Stärkeaufschlämmungen wurden mit 10 E/g St ß-Amylase und 20 E/g St. <A--1,6-Glukosidase in 10 h bei 4-5°C verzuckert. Tabelle II zeigt, daß eine Stärkekonzentration von 10% am günstigsten war.

Beispiel 5 (»»belle III).

10%ige Stärkeauf schlämmungen wurden mit 0,5% <?G-Amylase beim pH 6,0 und bei 85°C im Gelatiniergefäß (2), dann längere Zeit bei 75⁰G in den Verflüssigungsgefäßen (3) behandelt, unter Ab- f bau der Stärke bis zu verschiedenen D.E.-Werten, hierauf schnell auf 50⁰C abgekühlt und nach sofort bewirktem Zusatz von 15 E/g St ß-Amylase und 20 E/g St Lactobacillus-Enzym unter Rühren in 50 h bei pH 6,0 und 45°C verzuckert. Die Tabelle III zeigt, daß bei der Verflüssigung am günstigsten ein Abbaugrad von D.E. 10,8 war; niedrigere und höhere Werte ernie-

• \ ...22

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. ORIGINAL iNSPECTH)

drigen die Maltoseausbeute.

Beispiel 4- (Tabellen IV und V);

(a). Die nach Beispiel 1 erhaltene verflüssigte Stärke vom _# D.E. 2 wurde in 30 h bei 4-5⁰C einerseits mittels jeweils 30 E/g St ß-Amylase, jedoch mit wechselnden Mengen (0 bis 200 E/g St) «sC-1,6-Glukosidase verzuckert. Wie aus Tabelle IV zu ersahen, waren 10 bis 20 E/g St ^-1,6-Glukosidase ausrei-' chend wirksam.

(b). Andererseits wurde die vorbeschriebene Arbeitsweise derart abgeändert, daß man jeweils 20 E/g St <tC-1 ,6-Glukosidase, aber wechselnde Mengen (20 und 60 E/g St) ß-Amylase einsetzte. Die Tabelle V zeigt, .daß bereits 20 E/g St ß-Amylase ausreichend waren, jedoch war zur Gewinnung hochreiner Maltose-Produkte eine erhöhte ß-Amylose-Menge bisweilen zweckmäßig.

Beispiel 5 (Tabelle Vl): Gewinnung von Produkten mit höchstem Maltosegehalt.

Verglichen wurde in 8 Versuchen (a bis h) die Wirkung unterschiedlicher Mengen verschiedener cL-Λ,6-Glukosidasen auf mehrere Stärkearten. Das eine andersartige Wirkung als die anderen. Enzyme aufweisende Pseudomonas-Enzym prüfte man auch im Gemisch mit einer anderen ^C -Λ ,6-Glukosidasen-

Das zur Erreichung eines Maltosegehalts von etwa 90% die Ver-

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flüssigung bei möglichst niedrigem D.E.beendet werden mußte, wurde nur bis zu D.E.-Werten von 0,5 bis 5» vorzugsweise 1 bis 2 hydrolysiert. Dementsprechend war die Viskosität der verflüssigten Stärken sehr hoch; auch waren Schwierigkeiten beim Einmischen der Enzyme unter Kühlung und das Verbleiben nicht abgebauter Anteile infolge Rückläufigkeit des Stärkeabbaues zu befürchten. Daher wurde das Kühlen und das Enzymeinmischen in 2 bis 3 Stufen in der vorbeschriebenen Anlage durchgeführt, indem man die verflüssigte Lösung zwecks unverzüglicher Abkühlung sogleich im Vakuum versprühte und das wei- ' tere Kühlen mit gleichzeitigem Enzymeinmischen verband. Vorsichtshalber wurde das Kühlen bei einer Temperatur von 50 bis 60⁰G abgebrochen.

Die erste Vorverzuckerungsstufe führte man mit einem Lactobacillus- oder Streptomyces-Enzym oder einer hitzebeständigen ß-Amylase durfih.· Im Laufe mehrerer Behandlungsstunden sank die Viskosität und die Gefahr der Rückläufigkeit des Stärkeabbaues. In der zweiten Vorverzuckerungsstufe wurde im zweiten g Rührbehälter (7) otC-I,6-Glukosidase oder ß-Amylase in eine große Menge der bereits weitgehend verzuckerten Zuckerlösung eingeführt, demzufolge die niedrigkonzentrierte Zuckerlösung verdünnt und mit frischem Enzym unter Verhinderung der Rückläufigkeit des Stärkeabbaues in Berührung gebracht. Die Temperatur in der 1. Stufe wurde möglichst hoch gehalten, in der 2. Stufe aber auf die Arbeitstemperatur herabgesetzt.

...24

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Im letzten Verzuckerungsbehälter (8) beendete man die Verzuckerung bei optimaler Temperatur in 2 Tagen im Chargenbetrieb. Die Reaktions-, Rühr- und Mischbehälter wurden vom Eintritt fremder Keime geshhützt, da die Verzuckerung bei einer verhältnismäßig niedrigen Temperatur von 45 bis 5O⁰C erfolgte.

Wie aus Tabelle VI zu ersehen, ist es sehr zweckmäßig, in einer beim Verzuckern erhaltenen Stärkelösung von hoher Konzentration und niedrigem D.E. durch einen zweistufigen Einsatz eines hochhitzebeständigen Enzyms die Verzuckerung zu beschleunigen. Schwierigkeiten beobachtet man beim Versuch "f", jedoch wurde die anschließende Reinigung durch Zusatz einer geringen Menge oC-Amylase am Ende der letzten Reaktionsstufe erleichtert, (vgl. auch die Versuche "c" und "h"). Die Anwendung des Polymixa-Enzyms beim Versuch "e" begrenzt die Malto— seausbeute (auf 83%) und kommt daher nur in begrenzten Fällen in Frage.

Beispiel 6 (Tabelle VII); Gewinnung von Sirupen mit niedrigem

Maltosegehalt.

Zur Erreichung von Zuckerprodukten mit 50 bis 80% Maltose war keine besondere Vorsicht bei der enzymatischen Verflüssigung ₎ erforderlich; letztere wurde in 8 Versuchen (i bis q) bis zu D.E.-Werten von 5 bis 30 durchgeführt. In die niedrigviskose Lösung führte man eine oder zwei oC-1,6-Glukosidasen ein, wobei die Reihenfolge wie im Beispiel 5 weitgehend geändert und

009843/1282 '"²^

hierdurch die Behandlung erleichtert werden konnte. Auch die Reinigung der verzuckerten Lösungen verlief sehr einfach. In allen Fällen war eine nachträgliche Behandlung mit <£. -Amylase, wie im Beispiel 5 (vgl. die'Versuche "c","f" und "h" der Tabelle VI), nicht erforderlich.

In Tabelle VII ist gezeigt, daß die Verzuckerung einfach verläuft, wenn bei der Verflüssigung ein D.E. über 5 erreicht wird, und daß die Enzymwirkung bei erhöhten D.E.--Wert en sinkt. λ

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* ORIGINAL iNSPECTED

Tabelle I

Beziehung zwischen Zuckeranteilen u. Abbauenzymen.

ZuckerzusammensetzunK in %

Maltose Glukose Maltοtriose Dextrin

69,6 90,4

1,1 0,4

1,3

35,7 7,9

Tabelle II

Beziehung zwischen Zuckeranteilen, Stärkekonzentration u. D.E.-Werten. .

Stärke gehalt in %	D.E.	Maltose	Zuckerzusammensetzung in % Glukose Maltotriose	7,	9	Dextrin
10'	56,8	78,1	0,2	7	9	15,8
15	55,5	78,0	0,2	8.	0	15,9
20	54,1	75,0	0,3	16,7

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ORiGiHAL SHSPECTED

Tabelle III

Beziehung zwischen Zuckeranteilen u. D.E.-Werten

-D.E. verflüssigter Stärke	D.E.	Zückerzusammensetzung in % Maltose Glukose Maltotriose Dextrin	0,3	6,7	9,5
2,5	49,9	8,35	0,8	12,5	11,9
10,8	53,3	74,8	1,0	22,3	9,0
19,5	.55,8	67,7	1,3	25,0	8,6
30,1	58,5	65,1

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Tabelle IV

Beziehung zwischen Maltogehalt u. Enzymmenge (ß-Amylase stets 30 E/g Stärke)

pC-Λ , 6-Glukosidase	Maltose	ZuckerZusammensetzung in %	Maltotriose
in E/g Stärke	86,1	Glukose	6,5
10	87,8	0,5	6,2
20	82,0	0,8	12,4
200	69,2		5,8
0	1,2

Tabelle V .

Beziehung swisehen fiisyaaeng·, Bauer, B»E. u. Zuckeranteilen ^- 1,6-Glukosidaee stets 20 E/g Stärke)

ß-Amylase	Reak-	End-	Zuckersammensetzung in %	Glukose Maltotriose	11,0	Dextrin
in E/g Stärke	tions- dautr	D.E.	Maltose	11,1	13,1	4,4
20	24	58,5	83,5	1,2	8,4	2,6
20	48	60,1	83,1	2,0	7,5	5,1
60	24	60,3	^ 86,5	2,1		2,1
60	48	61,5	88,3

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GRIÖSNAL INSPECTED

Tabella YI

Versuch -	a	b	C	d	e	f ,	g	h
Stärke von	HaIa	Wachs- artigem Hais .	Hais	Süßkartoffel	Kar toffel	Mais

Verflüssigungsstufe:

Temp.⁰O	150 -160	150 -160	150 -160	150 -160	88 -95	88 -95	88 -95	88 -95
Enzym E/g St.	_—		_		*C15	^15	^15	^15
pH	5,5	5,5	4,0	5,0	6,0	6,0	6,0	6,0
D.E.	1 ,0	2,1	3,0	2,0	2,5	0,5	2,1	2,5
Konz. %	10	15	20	20	12	15	20	15.■■■'.

Erste Vorver-

Enzym E/g St.	E20 ß20	ß20	L25	ß25	EI5 P20 ·	ß25	S25	ß30
pH	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0
Temp.°0	45	60	60	60	45	60	60	60

Zweite Vorverguckerungssttif e;

Enzym E/g St,	-	Ps50	ß2D	Ps20 E 10	-	E20	ß20 *	Ps15 L 15
pH	-	5,5	6,0	5,5	-	6,0	6,0	5,5
Temp.⁰G	-	^5	50	45	-	4-5	50	45

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ORIGINAL INSPECTED

Versuch	a	b	C	wachs artig. Mais J	Mais	d	e	f	S	H
Stärke von	Mais	Süßkartoffel	Kar tof- fei	Mais

Hauptverzuckerungsstufe:

pH	6,0	5,5	6,0	5,5	6,0	6,0	6,0	5,5
Temp.⁰O	45	45	45 50	45	45	45	50	45. ■
Dauer h	48	48	50	45	45	50	45	45
Maltose %	93.	92	90	92,5	83	92	92	93
Zusatz bei 80⁰C nach	-	-	Reak tions- ende	- --	-	Voll endung	-	48 h stehen

ß - ß-Amylase aus Weizenkleie Ps = Pseudomonas-Enzym E = Escherichia-Enzym L = Lactobacillus-Enzym S - Strahlenpilz-Enzym _t P =.ß-Amylase aus Bacillus polymixa

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ORIGINAL INSPECTED

Tabelle VII	i	k	Stärke von] Mais F J	1	. ■ ^ wachs artig. Mai Sj	'Mais	Verflüssigungs stufe:	150 -160	150 -160	130	m	η	0	P-:	. q.	85 -90
			Temp.⁰O	5,0	5,0	3,5	Tapi- oka	Kartof fel	wachs artig Mais		- · Süß kartof fel	6,0
Versuch			pH	-	—	- -					-/ Λ El
Enzym E/g St.	3	3	5	150 -160	85 -90	85- 90	35 -90	30
D.E.	30	20	25	5,0	6,0	6,0	6,0	30
Konz.%		—	^15	■'&.	,615
2	6	10	20
30	20	30	30

Erste Vorverzuckerungsstufe:

Enzym E/g St.	ß3	's 5,-.: L15	S15	e/10 L10	ß5 E15	ß5	P20	* E20
Temp.°0	70	55	60	60	45	60	60	60
pH	6',0		6,0	6,0.	6,0	6,0	6,0	4,5

Zweite VorverzuckerunRsstufe:

Enzym E/g St.	P20 Ps10	- -	ß3	ß3	- - - '	L 10 Ps15	. ß5	P10
pH	5,5	- -	6,0	6,0	—	5Γ5-	6,0	6,0
Temp.°0	45	—	50	50	45	50	45

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Versuch

HauptverzuckeruiiRSstuf e:

pH	5,5	6,0	6,0	6,9	6,0	5,5	6,0	6,0
Temp.⁰C	45	50	50	50	45	45	50	45
Dauer h	40	30	35	40	40	35	40	45
Maltose %	72	80	72	76	71	75	68	63
Malto- triose %	12	10	16	15	14	14	23	2?

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Claims

Palonfanwältfc ^LC

Moire Ii en 22

9. April 1970 SJ/Hu

hao-7094

Patentansprüche

.y Verfahr en zur Gewinnung von hochreinen maltosereichen Zuckerlösungen bzw· -sirupen und Feststoffen hieraus durch enzymatischen Stärkeabbau, dadurch g. e - λ kennzeichnet , daß man gleichmäßig verflüssigte Stärken bei möglichst hohen Konzentrationen und Temperaturen mit Kombinationen von ß-Amylase und ^--1,6-GlUkO-sidase zu über 5Pt Vorzugsweise über 60% Maltose im Zukkeranteil enthaltenden Lösungen bzw. Sirupen verzuckert und diese ggflls. durch Eindampfen bzw. Trocknen in eingedickte Sirupe oder Feststoffe überführt.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stärkeverflüssigung durch Erhitzen bei 100 bis 170, \ vorzugsweise 15Ο bis 160⁰C bis zumBextroseäquivalent (D.E.) von 0,5 bis 5, insbesondere 1 bis 5i durchführt.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stärkeverflüssigung mittels o^-Amylase bei 85 bis 100⁰C bis zum D.E. 1 bis 30 durchführt.

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ORIGINAL INSPECTED

-.'ir- ■ - ■

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3i dadurch gekennzeichnet, daß man die verflüssigte Stärke zwecks Verhütung einer Rückläufigkeit des Stärkeabbaues unverzüglich abkühlt und mit Enzymen versetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Verzuckerungsstufe mittels einer hitzebeständigen ß-Amylase oder einer hitzebeständigen ^ -1,6-Glukosidase bei 45 bis 60⁰G und die zweite Verzuckerungsstufe in Gegenwart eines anderen Enzyms bei ggflls. nie- . drigeren Temperaturen durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als ^-1,6-Glukosidasen die aus den hitzebeständigen Strahlenpilzen

Streptomyces diastatochromogenes (IFO 5357) Actinomyces globisporus (IFO 12208) Nocardia asteroides (IFO 5384)
Micromonospora melanospora (IFO 12515) Thermonospora viridis (IFO 12207 und Lactobacillus plantarum (ATOC 8008)

ί
gewinnbaren Enzyme verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als .^{,-1,6-Glukosidasen die aus den Stämmen Pseudomonas amyloderamosa (ATCO 21262) Escherichia intermedia (ATCC 21073)

•.. 3 009843/1282

Agrobaoterium tumefaciens (Ii¹O 3085) ..* :

Azotobacter indicus (Ii¹O 3744)
Bacillus cereus (IPO 3001)
■-■» Erwinia aroyde (IFO 3057)

■Leuconostoc mesenteroides (Ii¹O 3426) Mycobacterium phlei (Ii¹O 3158
Micrococcus lysodeikticus (IFO 3333) Pediococcus acidilactici (IFO 3884) Sarcina rutea (IFO 3232)

Serratia indica (IFO 3759)
Staphylococcus aureus (IFO 3061)
Streptococcus faecalis (IFO 3128) gewinhbaren Enzyme verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Gemische von mehr 2 verschiedenen 06-1,6-Glukosidasen verwendet.

9· Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, ^. daß man aus Bacillus polymixa (ATOO 8623) bereitete Enzyme zur Gewinnung von Produkten mit einen verhältnismäßig niedrigen Maltosegehalt aufweisendem Zuckeranteil verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus hochreiner Weizenkleie bereitete Jä-Amyl".ase zur ■-,--—-Gewinnung von besonders maltosereichen Produkten verwendet.

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