DE3323591A1 - Verfahren zum isomerisieren von glucose in fructose - Google Patents
Verfahren zum isomerisieren von glucose in fructoseInfo
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Description
Verfahren zum Isomerisieren von Glucose in Fructose
Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zum
Umwandeln von Glucose (Dextrose) in Fructose (Lävulose).
Die meiste Nahrungsmittelglucose wird als enzymatisches Hydrolysat von Maisstärke zur Verfügung gestellt, d.h.
als handelsüblicher Maissirup. Glucose hat im allgemeinen eine 60- bis 80%ige Süße im Vergleich zu Saccharose
und wird deshalb mit einem entsprechend niedrigeren Preis gehandelt. Seit langem ist es bekannt, Glucose zu Fructose
(die noch süßer als Saccharose ist) zu isomerisieren unter Verwendung eines Enzyms mit Glucoseisomeraseaktivität,-vorzugsweise
eines solchen, das auf einem inerten Träger, wie Diethylaminoethylcellulose, porösem Glas
oder Chitin, immobilisiert wurde. Genauere Beschreibungen über die enzymatische Umwandlung von Glucose und Fructose
unter Verwendung von Glucoseisomerase findet man bei Hamilton, et al. "Glucose Isomerase: a Case Study of
Enzyme-Catalyzed Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et al., Plenum
Press, New York, (1974), Seiten 94-106, 112, 115-137; Antrim, et al., "Glucose Isomerase Production of High-Fructose
Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering,
-β-
Band 2, Academic Press (1979); Chen, et al., "Glucose Isomerase (a
Review)", Process Biochem. (1980), Seiten 30 bis 35; Chen, et al.
"Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem., (1980), Sercen 36-41;
Nordahl, et alf, "Fructose Manufacture from Glucose by Immobiled
Glucose Isomerase", Chem. Abstracts , Band 82, (1975), Abs. Nr.110316h;
and Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Band 81, (1974), Abs. Nr. 76474a. Darüber
hinaus sind zahlreiche Patente über die Isomerisierung von Glucose bekannt. Typische US-Patentschriften sind:
3 616 221; Reissue 28 885 (ursprünglich 3 623 953); .3 694 314; 3 708 397? 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714;
3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127 und 4 308 349.
Das Niveau an Fructose, das durch Isomerisierung von Glucosesirup mit Glucoseisomerase erhältlich ist, ist
durch das Gleichgewicht der Isomerierungsreaktion begrenzt. Geht man von einem Ausgangssubstrat aus reiner Dextrose
aus, so liegt bei 650C das Reaktionsgleichgewicht bei annähernd
51 Gew.-% Fructose. Wird eine raffinierte Dextroseflüssigkeit
als Substrat verwendet (enthaltend bis zu 6 Gew.-% an Nicht-Monosacchariden) und läßt diese eine
ausreichende Zeit in einem Enzymreaktor verweilen, dann erhält man einen annähernd 48 bis 52 %igen Fructosesirup
als höchste Konzentration nach den vorerwähnten Verfahren des Standes der Technik. Um Sirupe mit höherem Fructosegehalt
zu erzielen, muß man Fraktioniersysteme anwenden, durch welche die Kosten des Endproduktes erheblich erhöht
werden. Bei höheren Temperaturen wird das Gleichgewicht günstiger. Ein Glucoseisomeraseverfahren, das bei
einer Temperatur von etwa 90-1400C betrieben werden kann,
könnte man verwenden, um direkt Maissirupe mit hohem Fructosegehalt von 53-60 Gew.-% zu erzielen, wobei man
dann eine Fraktionierung und ein Kreislaufverfahren vermeiden würde. Die Neigung der bekannten Glucoseisomerasesysteme,
in der Wärme abgebaut zu werden, wodurch eine
35 scharfe Verminderung der Aktivität eintritt, hat die
Fachwelt bisher davon abgehalten, höhere Temperaturen anzuwenden,
um das Gleichgewicht der Isomerisierung zu Gunsten der Fructose zu verschieben. Darüber hinaus sind
Glucose und insbesondere Fructose empfindliche reduzierende Zucker, die eine ausgeprägte Tendenz haben, unerwünschte
Nebenprodukte wie Psicose, gefärbte Produkte, Farbstoff vorläufer, Fructosedianhydride, Mannose, Tagatose und
Säuren zu bilden, wenn man sie auf die Temperaturen erwärmt, die gemäß dieser Erfindung zur Isomerisierung er-
10 forderlich sind.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man bei der Durchführung eines Glucoseisomerisationsverfahrens in-ις
nerhalb bestimmter pH-Grenzen und Verweilzeiten in einem
j Enzymreaktor der nachfolgend beschriebenen Art und bei j Isomerisationstemperaturen von etwa 900C bis etwa 1400C
wirksam und direkt HFCS-Sirupe hoher Qualität mit einer
tolerierbaren Bildung von Nebenprodukten, mit einem Gehalt
2Q von etwa 52 bis etwa 60 Gew,-% Fructose erhalten kann
und dadurch kostspielige und verfahrensmäßig komplizierte Fraktionierungen und Kreislaufverfahren vermeiden kann,
die bei den bekannten Glucoseisomerisationsverfahren erforderlich sind, um HFCS-Sirupe mit dem vorerwähnten Be-
25 reich der Fructosekonzentration zu erhalten.
Erfindungsgemäß wird Glucose zu Fructose-Glucose-Sirupen
isomerisiert, indem man eine glucosehaltige Flüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwisehen
etwa 90 und etwa 1400C bei einem pH von etwa 3 bis etwa 8
eine ausreichende Zeit in Berührung bringt bis eine Endkonzentration von wenigstens 53 bis etwa 60 Gew.-% an
Fructose, bezogen auf den gesamten Kohlehydratgehalt in der Flüssigkeit, erhalten wurde und wobei keine wesentliche
J O Z O 3 j
3ildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Fructose-,
Nicht-Glucose-Z-uckern eintritt.
Die gemäß dar vorliegenden Erfindung in Fructose isomerisierte
Glucose kann aus allen bekannten Quellen für diesen Zucker stammen. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen stammt
die Glucose im allgemeinen aus den Hydroiysaten von
Cellulose oder Stärke unter Verwendung von Säuren und/oder Enzymen, vorzugsweise letzteren, in Übereinstimmung mit
bekannten Verfahren. Auf diese Weise erhaltene glucosehaltige Flüssigkeiten enthalten typischerweise kleinere
Mengen an Polysacchariden, Zuckeroligomeren etc., in Abhängigkeit von der angewendeten Kohlehydratquelle und
der angewendeten Hydrolysemethode. Getreidekörner, wie Mais, MiIo, Weizen, Roggen und dgl. und stärkehaltige
Quellen, wie Kartoffein,Süßkartoffeln, Karotten,
Tapioka und dgl. sind ausgezeichnete Quellen für Stärke, die in das Glucoseausgangsmaterial gemäß der Erfindung
umgewandelt wird. In den USA wird Maisstärke wegen seiner vergleichsweise niedrigen Kosten und leichten Verfügbarkeit
besonders bevorzugt. Da man bei der Herstellung von Wahrungsmittelglucose die Verwendung von enzymatischen
Stärkehydrolyseverfahren anwendet, werden solche Verfahren hier bevorzugt. Enzymatische Hydrolyseverfahren
werden in den US-Patentschriften 4 017 363, 3-912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 und 4 284 722 beschrieben, die
hiermit in die Offenbarung eingeschlossen werden.
Die hier, als Enzymquelle für die chemische Sitabilisierun<?
verwendete Glucoseisomerase kann aus aj len bekannten Glucoseisomerase-bildenden Mikroorganismen isoliert
werden, einschließlich Streptomyces,
-9-
flavovirens, Strsptomyces achromogenes, Streptomyces
aehinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis,
Straotomvces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae,
Q5 Streptorcycas olivochromogenes, Streptomyces venezuelae,
Äerobacter aerogens, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans,
Bacillus megatsrium, Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans
Acatobactsr suboxvdans, Acetobacter roseus, Acetobacter
mslanoaenus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis f
10 "Lactobacillus gavonii , Lactobacillus
Lactobacillus mannitopoeus , Lactobacillus pentoaceticus,
Pseudoinonas hvdror?hilia, Brevibacterium pentaaminoacidicum,
33c.herichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, and
Paracolobactrum aerogenoides, Darüber hinaus kann man
15 Glucoseisomerase, die durch die Genera Nocardia,
Micrcnionospora, Microbisporay Microellobospora und
Arthrobacter gebildet wird, verwenden. Streptoanyces sp.
MCC 21.175 ist eine ausgezeichnete Quelle für Glucoseisomerase, die
erfindungsgemäß verwendet werden kann. Wie schon festgestallt,
kann man vorteilhaft Glucoseisomerase verwenden, dia bei den hier angewandten verhältnismäßig hohen Isomerisierungstemperaturen
stabil ist, z.B. Glucoseisomerase, die von Bacillus stearothermophilus, gebildet wird, und
insbesondere von Stämmen ausgewählt aus Bacillus stearothermophilus
ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 und
NRRL 3-3682 gemäß US-PS 3 826 714; Glucoseisomerase, die von Mikroorganismen vom Genus Ampullarie11a gebildet
werden, wie Ainpullariella digitata, Ampullariella lobata,
Ampullariella campanulata und Ampullariella regularis
(ÜS-PS 4 308 349}; Glucoseisomerase, die von Bacillus
BAD ORIGINAL COPY
licheniformis (europäische Patentanmeldung 41213) gebildet
wird sowie Glucoseisomerase, die von Thermophilen der in der japanischen Patentveröffentlichung 74 30588 beschriebenen
Genera gebildet wird.
Außer den vorerwähnten Mikroorganismen schließt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Mutanten und
Varianten davon sowie von genetisch umgewandelten Mikroorganismen, die durch Einführung von mutierten"Glucoseisomerase
dienen, in andere Mikroorganismen, einschließlich mesophilen und thermophilen Mikroorganismen, abgeleitet
werden, ein. Die mutierten Glucoseisomerasegene, die für einen solchen Zweck ausgewählt werden, sind solche,
die Glucoseisomerase ergeben, die bei höheren Temperaturen, insbesondere oberhalb 900C und vorzugsweise
bis zu etwa 1400C stabil ist. Solche Gene können durch übliche Verfahren, wie sie zum Mutieren von Mikroorganismen
verwendet werden, z.B. durch Bestrahlen oder Chemischherstellen. Alternativ kann man isolierte Glucoseisomerasegene,
die eine Glucoseisomerase mit einer ausreichenden Wärmestabilität ergeben, und wie sie beispielsweise durch
gewisse Streptomyces-Stämme gebildet werden, in vitro mutieren. Die Auswahl von geeigneten mutierten Genen ist
begleitet von dem Wiedereinführen des mutierten Gens y
in entweder dem Eltern- oder einem anderen Organismus
und anschließendem Wachstum und Vervielfältigen des Organismus und Prüfen der Wärmestabilität der gebildeten
Glucoseisomerase.
Man kann gleichfalls rekombinierte DNA-Verfahren anwenden, um Glucoseisomerase mit einer für die vorliegende
Erfindung geeigneten verbesserten Wärmestabilität zu erhalten. Argos et al. (Biochemistry 18 (25):5698-5703
(1979)) hat festgestellt, daß gewisse Substitutionen von
'Λ :.: :K.X. ^323591
Alanyl für Glycyl, Seryl, Valyl und Lysyl in Enzymen
,von mesophilen Organismen in den entsprechenden Enzymen aus thermophilen Organismen gefunden werden. Perutz
(Science, 2_01_, 1187-91 (1978)) stellt fest, daß die
Enzyme von thermophilen Bakterien ihre Extrastabilität hauptsächlich durch zusätzliche Salzbrücken an der Proteinoberfläche
erlangen. Zuber gibt in "Biochemistry of Thermo-. phily", Freidman, S.M., ed., Seiten 267-285, Academic
Press, N.Y., 1978) weitere Informationen über den Aufbau thermostabiler Enzyme. Sind die Aminosäuresequenz und
die dreidimensionale (tertiäre) Struktur einer Glucoseisomerase bekannt, dann ist es möglich, in den Isomerasegenen
eine verbesserte Stabilität durch seitenspezifische Mutationen zu entwickeln unter Ausbildung von Enzymen,
die erhöhte Mengen an solchen Aminosäuren enthalten und dadurch stabilere Strukturen aufweisen. Nachdem man die
DNA-Sequenz der Glucoseisomerase bestimmt hat, kann ein Gensynthesizer verwendet werden, um eine neue Sequenz
zu erzeugen und durch solche künstlich gemachten Gene wird die Wärmestabilität von derart erzeugter Glucoseisomerase
erhöht. Man kann erwarten, daß solche manipulierten Enzyme für die Praxis der vorliegenden Erfindung besonders
brauchbar sind.
Da Glucoseisomerase typischerweise intrazellulär von diesen* und anderen Mikroorganismen gebildet wird, kann
man eine Quelle für Glucoseisomerase durch einfaches Ernten dieser Zellen gewinnen. Die Glucoseisomerase kann
von den Zellen in bekannter Weise abgetrennt werden,z.B.
durch Zellautolyse oder durch Beschallung in einem Enzymreaktor bekannter
Bauart. Vorzugsweise wird die hier verwendete Glucoseisomerase, unabhängig von ihrer Quelle, auf einem
inerten Substrat in üblicher und bekannter Weise immobilisiert. Verfahren und Material, die zum Immobilisieren
von Enzymen verwendet werden können, sind bekannt und werden in zahlreichen Publikationen beschrie-
ben einschließlich Wang et al., Fermentation & Enzyme Technology/ John Wiley & Sons, Inc., New York (1979),
Seiten 318-338 und Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical
Technology, 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc., New York (1980), Band 9, Seiten 148-172, die in die Offenbarung
der Erfindung einbezogen werden. Die Gegenwart von geringen Mengen an Kobaltkation und/oder einem wasserlöslichen
Salz von schwefeliger Säure, wie Natriumsulfit, Natriumbisulfit, Magnesiumsulfit und/oder
Magnesiumbisulfit gemäß US-Reissue-Patent Nr. 28 885, um die Denaturierung der Glucoseisomerase während des
Verfahrens zu vermindern, kann ebenfalls vorgesehen werden.
Es ist erforderlich, daß die Konzentration an Kohlehydrat in der glucosehaltigen Flüssigkeit im Bereich von etwa
20 bis etwa 85 und vorzugsweise etwa 30 bis etwa 50 Gew.-%, liegt
Es ist auch erforderlich, daß man die Isomerisierung bei
einem pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 8 und vorzugsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa ^und insbesondere
zwischen 5 · und 6,5 durchführt. Nimmt man die Isomerisierung erheblich unterhalb oder oberhalb des vorerwähnten pH-Bereiches
vor, dann bilden sich sehr große Mengen an unerwünschten Nebenprodukten, wie Psicose, organischen Säuren,
gefärbten Produkten, Farbvorläufern, Fructosedianhydriden
und dergleichen.
Es-wurde festgestellt, daß der pH für eine optimale Aktivität
der Glucoseisomerase merklich bei hohen Temperaturen abnimmt. Für Glucoseisomerase aus Streptomyces rubingenosus
liegt das Aktivitätsoptimum bei pH 8,6-9;2 bei 250C,
bei pH 6,9-7,5 bei 75°C und bei pH 5,6-6,2 bei 125°C.
Wenn, also die Isomerisationstemperatur ansteigt, kann
man den pH der Isomerisierung erniedrigen, um eine maxi-
*. ° * * : IVi * ;":. "* 3 2 3 b 3 Ί
male Enzymaktivität aufrechtzuerhalten und um die Bildung
von Nebenprodukten zu vermeiden.
Eine weitereswichtiges Erfordernis bei der vorliegenden
Erfindung ist die Kontaktdauer der glucosehaltigen Flüssigkeit mit der chemisch stabilisierten Glucoseisomerase*
Diese Kontaktzeit muß im Bereich von etwa 1 s bis etwa 5 h, vorzugsweise etwa 30 s bis etwa 1 h und ganz
besonders bevorzugt etwa 2 min bis etwa 30 min aufrechterhalten
werden, um einen Fructosesirup einer annehmbaren Qualität zu ergeben.
Die bevorzugte Kontaktzeit zwischen der Glucoseisomerase
und der glucosehaltigen Flüssigkeit hängt zu einem großen Teil von dem pH ab, bei dem Isomerisierungsreaktion
durchgeführt wird. Am unteren Ende des pH-Bereiches kann man längere Kontaktzeiten tolerieren, ohne daß ein zu
großer Glucose- und Fructoseabbau durch Bildung von Psicose und anderen unerwünschten Abbauprodukten eintritt.
Am oberen Ende des Bereiches sind kürzere Kontaktzeiten erforderlich, um die Bildung· von Psicose und von
Farbstoffen zu vermeiden. In der Praxis wird die Gesamtzeit, bei welcher sich der glucosehaltige Sirup bei oder
in* der Nähe der Endreaktionstemperatur befindet, als die
wirksame Kontaktzeit angesehen, weil die auftretenden Zuckerabbaureaktionen nicht enzymatisch sind und ablaufen
unabhängig davon, ob die Flüssigkeit in Berührung mit der Glucoseisomerase ist. Deshalb ist es beim Durchführen
von Isomerisierungen oberhalb 900C wichtig, die Zeit, die erforderlich ist, um die Glucoseflüssigkeit auf die
gewünschte Isomerisierungstemperatur zu bringen (z.B.
indem man die Flüssigkeit unmittelbar vor oder während
des Kontaktes mit Isomerase mit Wasserdampf vermischt) zu minimalisieren und sobald man das gewünschte Fructoseniveau
erreicht hat, soll man die Flüssigkeit schnell von der aktiven Isomerase abtrennen und so schnell wie
möglich auch unter 900C, vorzugsweise auf weniger als
700C, abkühlen. Wenn eine lösliche Form der Glucoseisomerase
verwendet wird, dann ist es erforderlich, diese zu inaktivieren (z.B. indem man den pH auf einen
Bereich vermindert, bei welchem die Isomerase inaktiviert wird).bevor man abkühlt, um eine Wiederumwandlung
der während der Hochtemperatürisomerisierungsstufe gebildeten
Fructose in Glucose zu vermeiden, weil die Isomer is ierungsreakt ion selbstverständlich reversibel ver-
15 läuft. .
Der erzielbare maximale Umwandlungsgrad von Glucose in
Fructose wird durch das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Glucose und Fructose bestimmt, welches wiederum
von der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt wird, abhängig ist. Sehr sorgfältige Untersuchungen
über Gleichgewichtsmischungen von Glucose und Fructose haben folgende Beziehung ergeben:
25 F * 100 K/(K+1) (1)
InK = - — + 2,3005
T+273 ' . (2)
worin F der Prozentsatz an Fructose beim Gleichgewicht,
bezogen auf Gesamtgewicht von Glucose und Fructose, T die Temperatur (0C), bei welcher die Isomerisierung
durchgeführt wird und K die Glucose-Fructose-Gleichgewichtskonstante darstellen.
.-: : : ::.. "·." A Q Ί I1 c q ι
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-15-
Die tatsächliche Kontaktzeit zwischen dem glucosehaltigea
Sirup und der Isomerase in dem Reaktor kann unter Bezug auf die nachfolgende Gleichung errechnet werden, wenn man
einen Reaktor, der Isomerase in immobilisierter Form enthält, verwendet,
t = CV In
F - F e ο
F - F e
(3)
kA
Darin bedeuten:
15 t = die tatsächliche Kontaktzeit C = Konzentration an Glucose und Fructose
15 t = die tatsächliche Kontaktzeit C = Konzentration an Glucose und Fructose
V = das freie Flüssigkeitsvolumen in dem gepackten Bett (Bettvolumen minus dem von den immobilisierten Enzymteilchen
eingenommenen Volumen) Fe = Fructosefraktion in der Glucose/Fructosemischung beim
Gleichgewicht bei der Isomerisierungstemperatur F = Fraktion von Fructose (bezogen auf G + F) am Eingang
des gepackten Bettes
F = Fraktion an Fructose (bezogen auf G + F) in der aus dem gepackten Bett austretenden Lösung
k β Reaktionkonstante für die Isomerisierung unter Iso-
merisierungsbedingungen
Ä - Isomeraseaktivität' in dem gepackten Bett.
Ä - Isomeraseaktivität' in dem gepackten Bett.
Werte für k für die in den Beispielen hergestellte immobilisierte Isomerase liegen im Bereich von etwa 0,07 bis
etwa 5 g h IGIU bei Temperaturen von 900C bzw.
1400C. Diese Beziehung zeigt die Notwendigkeit, die Kontaktzeit
bei hohen Temperaturen bei Verwendung von gepackten Betten mit hoher Aktivität pro Volumeneinheit zu minimieren.
Die nach den in den folgenden Beispielen beschriebenen
Verfahren hergestellten gepackten Betten können bis zu 2000 IGIU/ml erhalten, wodurch man in weniger als 1 min
in einem Hochtemperaturreaktor einen Gleichgewichts-Fructosegehalt von 99,5 % erzielt, wenn man Stufenreaktoren,
die bei unterschiedlichen Temperaturen betrieben werden, verwendet und die Zufuhr zu einem ersten Reaktor
bei einer niedrigen Temperatur isomerisiert wird, bevor
man in einem zweiten Reaktor bei einer höheren Temperatur isomerisiert. Wendet man ein Stufenreaktorsystem an,
dann ist es vorteilhaft, ein Verfahren zum enzymatischen Umwandeln von Glucose in Fructose anzuwenden, bei man
eine glucosehaltige Flüssigkeit, enthaltend etwa 20 bis etwa 85 Gew.-% Kohlehydrate, mit Glucoseisomerase bei
einer Temperatur von etwa 200C bis etwa 800C und einem
pH von etwa 6,0 bis 9,0 bei einer Kontaktzeit von etwa
15 0,5 bis etwa 2 h in Berührung bringt, um 40 bis etwa
45 Gew.-% der·in der Flüssigkeit enthaltenen Glucose in
Fructose umzuwandeln, worauf man dann die Temperatur in dem Isomerisierungsmedium auf etwa
9O0C bis etwa 14O0C erhöht und den pH im Isomerisierungsmedium
auf einen Bereich von etwa 3 bis etwa 8, je nachdem, wie es erforderlich ist, einstellt und dann die
fructosehaltige Flüssigkeit mit der Glucoseisomerase eine weitere Zeit zwischen etwa 1 s bis etwa 5 h in Berührung
bringt, um dadurch das Umwandlungsniveau auf etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% der in der ursprünglichen glucosehaltigen
Lösung enthaltenen Glucose zu bringen, wobei sich dann im wesentlichen keine Psicose oder andere Nicht-Fructose-,
Nicht-Glucose-Zucker bilden. Die Verwendung von hochaktiven gepackten Betten kann somit zu sehr niedrigen wirksamen
Kontaktzeiten führen, wodurch wiederum .ein Abbau der Fructose, der bei den erfindungsgemäß erforderlichen hohen
Temperaturen eintritt, minimiert werden kann.
- Yt-
Bei der Auswahl der Immobilisierungstechnik für die Glucoseisomerase werden Methoden bevorzugt, die in der
Lage sind, kleine im wesentlichen nicht-komprimierbare poröse Katalysatorteilchen zu ergeben, so daß eine Limitierung
der Ispmerisierungsrate durch Diffusionseffekte minimiert wird. Alternativ kann man die Isomerase in
den Poren einer Membran immobilisieren, durch welche die Glucoselösung während der Hochtemperaturisomerisierung
hindurchgezwängt wird, so daß ein guter Kontakt zwischen dem Enzym und dem Substrat vorliegt und Diffusionseinschränkungen
minimiert werden. Der zum Immobilisieren verwendete Träger ist vorzugsweise vollkommen unlöslich
und inert, um eine unzulässige Verunreinigung oder einen Abbau der Glucose/Fructosekomponenten in den Substratlö-
15 sungen zu vermeiden.
In der Praxis werden jedoch fructosehaltige Sirupe nicht
aus reiner Glucose hergestellt. Vielmehr verwendet man Stärkehydrolysate, die nach den vorerwähnten Druckschriften
hergestellt werden, als Glucoseguelle und diese enthalten immer'Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Saccharide
(nachfolgend als Polysaccharide bezeichnet), die sich von einer unvollständigen StärkeTtiydrolyse- ableiten und
die Umwandlungsprodukte von Glucose. Typischerweise ma-chen"
diese 3 bis 8 % des Gesamttrockengewichts von den durch die Stärkehydrolyse erhaltenen Sacchariden aus.
Deshalb ist es erforderlich, unter Berücksichtigung der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt
werden soll, daß alle in der Glucoseflüssigkeit enthaltenen Polysaccharide sowie auch die anderen Faktoren, wie
der Gesamtfructosegehalt auf Trockenbasis, die Bildung von Psicose und von anderen Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Produkten
während der effektiven Kontaktzeit der Glucoseflüssigkeit und der Isomerase berücksichtigt
werden. Die Beziehungen zur Berechnung der Isomerisationstemperatur werden nachfolgend gezeigt:
_ 18-
τ = 255 3 (4)
1 2.3005-InK
F (5)
K = 100-F
10,000 (M+C) ίβ)
05 Q(IOO-P)
T = Isomerisierungstemperatur (0C)
F = Gleichgewichtsfructosegehalt (%, bezogen auf Gesamt-
glucose + Fructose) bei der Temperatur T M_ = % Fructosetrockengehalt, erforderlich in dem isomerisierten
Produkt
C = Psicose und andere Abbauprodukte, die sich während
der effektiven Isomerisierungskontaktzeit bilden Q = % des Gleichgewichts, das sich während der Isomeri-
sierungsreaktion einstellt
15 P = % Polysaccharidgehalt der Glucoseflüssigkeit.
15 P = % Polysaccharidgehalt der Glucoseflüssigkeit.
Typischerweise bilden sich weniger als 1 % und vorzugsweise weniger als 0,5 % Psicose und andere Abbauprodukte
und man kann ein 99,5 %iges Gleichgewicht erzielen. Um deshalb Sirupe mit 55,5 % Fructose (Trockengehalt) herzustellen,
benötigt man die nachfolgenden Isomerisierungstemperaturen für Glucoseflüssigkeiten-mit den angegebenen
Polysaccharidgehalten.
25 Polysaccharid in Isomerisierungs-
der Glucoseflüssig- temperatur keit
(% Trockenbasis) (0C)
0 95.7
1 99jl
2 104.3 30 3 108,9
4 113.8
6 124,3 8
Für den Handel geeignete Produkte enthalten durchschnittlich
55,5 % Fructose auf Trockenbasis. Dies beruht darauf,
daß bei einem solchen Fructosegehalt ein Maissirup mit ; hohen Fructosegehalt (HFCS) die gleiche Süße entwickelt,
ι wie Saccharose, jeweils auf das gleiche Trockengewicht
bezogen. Weiterhin ist ein HFCS mit 55,5 % Fructosegehalt
Q5 ein im Handel eingeführter Artikel, den man ganz oder zum
Teil als Ersatz für Saccharose in zahlreichen Nahrungsmitteln und insbesondere in kohlensäurehaltigen Säften
und Getränken verwendet. Der Verbrauch von HFCS in den USA beträgt erwartungsgemäß 1,31*10 kg (2,9 billion pounds)
10 in 1982 und wächst 1983 auf 1,8-1O6 kg (4,0 billion
pounds). Aufgrund der Schwierigkeiten, die beim Liefern, Lagern, Abmessen und Formulieren von HFCS in Nahrungsmitteln
auftreten, besteht ein großer Bedarf an gleichmäßigen Produkten, unabhängig von den HFCS-Herstellern,
so daß man Produkte aus unterschiedlichen Quellen austauschbar und gleichzeitig verwenden kann. Deshalb haben Fructoseniveaus
von 55 - 56 % auf Trockengewichtbasis eine besondere Bedeutung bei den HFCS-Herstellern erlangt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt Fructoseniveaus von wenigstens 53 % und vorzugsweise wenigstens 54 %
und insbesondere wenigstens 55 %.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, anstelle
von einer Lösung, die nur Glucose als Substrat enthält, eine Lösung von Glucose zu verwenden, in welcher
bereits ein Teil der Glucose zu Fructose isomerisiert ist. Beispielsweise kann man nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren eine Lösung von isomerisierter Glucose, die bis zu 50 % Fructose enthält,behandeln, um dadurch die
Konzentration der Fructose auf die erwünschteren Niveaus oberhalb 50 % und vorzugsweise auf Niveaus von 55 bis
56 % oder darüber zu bringen.
BAD OFUGlNAL
COPY
Lösungen von Glucose, die Fructose in Mengen von weniger als 50 Gew.-%, bezogen auf die Kohlehydrate enthalten,
können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Unter Berücksichtigung der vorerwähnten Erfordernisse des pH-Wertes und der Kontaktzeit kann man bekannte
Glucoseisomerisierungsverfahren in geeigneter Weise so anpassen, daß sie bei etwa 90 bis etwa 1400C und vorzugsweise
bei etwa 100 bis etwa 1100C betrieben werden und wobei man die erfindungsgemäßen Hoch-Glucose-Fructose-Sirupe
erhält.
Die Thermostabilität der Glucoseisomerase kann durch ein oder mehrere chemische Behandlungen merklich erhöht werden,
wobei das Enzym jedoch eine beachtliche Aktivität beibehält. Ein so behandeltes Enzym wird als "chemisch
stabilisierte Isomerase" bei der vorliegenden Erfindung bezeichnet.
Die chemische Stabilisierung der Isomerase kann auf verschiedene Weise, mittels welcher man eine erhöhte Stabilität
erzielen kann, erfolgen. Eine fundamentale Arbeitsweise besteht darin, daß man strukturelle Elemente in
das Enzymmolekül derart einführt, daß das Enzym beim Erhitzen oberhalb seines normalen thermischen Denaturisierungspunktes
beständig bleibt. Eine bevorzugte Methode, um dies zu erzielen, besteht darin, daß man das
Enzym durch chemische Substitution mit Resten, welche polymerisierbare Vinylgruppen enthalten, modifiziert,
wobei die letzteren fest an die Oberfläche des Enzymmoleküls an einigen Punkten gebunden sind. Anschließend
wird das modifizierte Enzym mit einer oder mehreren polymerisierbaren
Vinylverbindung(en) in einer wässrigen Lösung vermischt und die Mischung wird unter Ausbildung
35 eines chemisch stabilisierten Enzyms, in welchem das
Enzym fest an verschiedenen Punkten an eine dreidimensionale Polymermatrix gebunden ist, welche eine Struktur auf-
332359'
weist, die komplementär der Struktur des Enzyms ist, -i copolymerisiert.
t. Beispiele für diese Art der Stabilisierung werden
j 05 von Martinek et al. in Biochem. Biophys. Acta 485,
* 1-12 (1977) und von Kulys et al. in Biokhimiya, 42,
\ Nr. 3, 453-59 (1978) beschrieben.
v Es ist wichtig, daß man bei der Durchführung der vorer-
.' 10 wähnten Reaktionen Bedingungen vermeidet, die zu einer
- Denaturisierung der Isomerase mit einem dadurch bedingten Aktivitätsverlust führt. Beispielsweise muß man extreme
pH-Werte und Temperaturen während aller Manipulationen, die erforderlich sind, um die obigen Umsetzungen durchzuführen,
vermeiden.
Beispiele für Reagentien, die zum Modifizieren der Isomerase unter Einführung von polymerisierbaren Vinylgruppen
geeignet sind, sind Acryloylchlorid, Methacryloyl-Chlorid, Acrolein, Crotonaldehyd, Maleinsäureanhydrid,
3,4-Depoxybuten, Acrylsäure-2,3-epoxypropylester, Acrylsäure
—2,3-thioglycidylester, 1-Allyloxy-3-(N-ethyleniBiin)-2-propanol,
Acrylsäure-O-succinamidester, Chlormaleinsäureanhydrid,
Maleinsäureazid, 3-Brompropen und Allylisothiocyanat. Einige Verbindungen sind in der Lage
mit den freien Aminogruppen der Isomerase zu reagieren, z.B. epsilon-Aminogruppen von Lysinresten.
Weitere Verbindungen, die in der Lage sind, mit den freien Carboxylgruppen der Isomerase zu reagieren, kann man
auch verwenden, um polymerisierbare Vinylreste als Substituenten einzuführen, wie für jeden Fachmann ersichtlich
ist.
Beispiele für Vinylverbindungen, die man mit der modi-
fizierten Isomerase copolymerisieren kann, sind Natriumacrylat, Natriummethacrylat, Acrylamid, Hydroxyethylmethacrylat,
Acryloylpiperidin-4-spiro-2'-(1'r3'-dioxacrylopentan),
1-Acryloyl-4-piperidon und Acryloylmethoxyamin.
Im allgemeinen bevorzugt man wasserlösliche Monomere oder Monomerengemische, welche wasserlösliche
Polymere ergeben (wenn man sie in Abwesenheit eines Vernetzungsmittels polymerisiert).
Typische difunktionelle Vinylverbindungen werden in die
Monomerengemische (in Mengen von 0,1 - 5 % der Gesamtmonomeren)
eingebracht, um Vernetzungsstellen auszubilden, die dann zu dreidimensionalen Polymerennetzwerken führen.
Geeignete Verbindungen sind N,N1-Methylen-bis-acrylamid
und Ethylenglykoldimethacrylat. Bei Verwendung dieser Verbindungen bilden die polymerisierten Mischungen unlösliche
Gele unter Erhalt einer immobilisierten Isomerase.
Die üblicherweise bei Vinylpolymerisationen verwendeten Initiatoren können auch hier verwendet werden, z.B.
Ammoniumpersulfat plus Natriumbisulfit, Hydrogenperoxid
plus Ferrosulfat, Kaliumsulfat plus N,N,N1,N'-Tetramethyl-ethylendimain
und Riboflavin (plus Licht).
Alternativ können nicht-kovalente Bindungen an die dreidimensionale
Polymermatrix ausreichen, um dem Isomerasemolekül die gewünschte Festigkeit zu geben und dadurch
eine merkliche Erhöhung der Thermostabilität zu bewirken. Dies kann man erzielen, wenn man Isomerase mechanisch
in ein vernetztes Polymergel einhüllt. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, daß man die Isomerase durch Einführen
einer Vinylverbindung vor der Polymerisationsstufe
modifiziert. Die Konzentration des Gels muß jedoch größer als etwa 30 Gew.-% betragen, um eine merkliche Stabilisierung
zu erzielen, wobei Gele mit einer Konzentration
BAD ORIGINAL
332359
von etwa 50 % bevorzugt werden. Monomere, die Polymergele ergeben, die elektrostatische und Wasserstoffbindungen
mit der Isomerase ausbilden, sind beispielsweise Natriumacrylat, Natriummethacrylat, Acrylamid und Hydroxyethylmethacrylat.
Beispiele für die Stabilisierung durch Inkorporieren in einen Gel werden von Martinek et al. in Biochem. Biophys.
Acta 485, 13-28 (1977) und von Kulys et al. in J. Solid
Phase Biochem. 3_, 95-105 (1978) angegeben.
Eine dritte Methode zur Verfestigung der Isomerase besteht in einer intramolekularen Vernetzung, wodurch eine zusätzliche
Thermostabilität erzielt wird.
Beispiele für solche Stabilisatoren werden von Torchilin et al in Biochem. Biophys. Acta, 522, 277-283 (1978), Martinek
et al. in J. Solid Phase Biochem, ^, 343-85 (1977) und
Torchilin et al. in Biochem. Biophys. Acta, 568, 1-10
20 (1979) beschrieben.
Geeignete erfindungsgemäß verwendbare Vernetzungsmittel sind
zweifunktionelle Verbindungen, die in der Lage sind, mit den entsprechenden funktionellen Gruppen an dem Enzymmolekül
zu reagieren. Meistens sind solche funktionellen Gruppen Aminogruppen, und zwar im allgemeinen primäre Aminogruppen,
die mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, wie Carboxylsäuren, SuIfony!halogeniden, Aldehyden, Isocyanaten,
Propiolaten und dergleichen reagieren können.
Die Vernetzungsmittel schließen somit Dicarbonsäureanhydride,
wie Bernsteinsäureanhydrid und Adipinsäureanhydrid ein und die entsprechenden Dialdehyde schließen Glyoxal, Bernsteinsäureanhydrid
und Glutaraldehyd ein. Ungesättigte Verbindüngen, wie Acrolein und Crotonaldehyd, Diolpropiolate,
wie Sthylenglykol-bispropiolat, Propylenglykolbispropxolat
BAD ORIGINAL
und Hexamethylenglykolbispropiolat sowie Disulfonylhalogenide, wie Benzol-1,3-disulfonylchlorid, Naphthalin-1,5-disulfonylchlorid
und ToIy1-2,4-disulfonylchlorid
sind eingeschlossen.
Da das Enzym Säuregruppen enthält oder so modifiziert wird, daß es Säuregruppen enthält, die mit Aminen reaktiv
sind, kann man difunktionelIe Amine als Vernetzungsmittel
verwenden. Dazu gehören beispielsweise Diamine mit
10 bis zu 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Phenylendiamin,
Butylendiamin, Hexylendiamin, Octylendiamin,
Pentylendiamin, Ethylendiamin und Dodecylendiamin.
Die Menge des Vernetzungsmittels kann erheblich variieren, wobei das Verhältnis von Enzym zu Vernetzungsmittel im
Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,0001 liegt. Das Verfahren zur Erzielung der jeweiligen Bindung hängt zu einem gewissen
Grad von der Art des ausgewählten Vernetzungsmittels und des Enzyms ab. Im allgemeinen wird das Reagens
in einem geeigneten inerten Lösungsmittel gelöst und die Umsetzung wird bei einer ausreichend niedrigen Temperatur
durchgeführt, um negative Wirkungen auf das Enzym, das
gegenüber hohen Temperaturen empfindlich ist, zu vermeiden. Im allgemeinen wird daher die Umsetzung vorzugsweise
bei etwa Raumtemperatur durchgeführt unter Verwendung von Wasser oder wässrigen Lösungsmitteln als Reaktionsmedium.
Außer der Einführung von polymerisierbaren Vinylgruppen
in das Enzymmolekül und anschließender Polymerisation gemäß den vorerläuterten Verfahren schließt eine weitere
Ausführungsform ein, daß man ein vorgebildetes Polymer
mit der Isomerase unter Ausbildung von intermolekularen kovalenten Bindungen und Bildung eines stabilisierten
Moleküls kondensiert. Beispielsweise kann man Polypeptide, wie natürlich vorkommende Proteine und deren Hydrolyse-
produkte nach bekannten Verfahren unter Ausbildung von
Peptidbindungen mit Glucoseisomerase unter Bildung eines stabilisierten Enzyms umsetzen. Die so hergestellten
Produkte können wasserlöslich sein, aber man kann sie unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, wie Glutaraldehyd,
unlöslich machen und das dabei gebildete vernetzte Enzym ist dann gewöhnlich besonders stabil. Die Peptidbildungsreaktionen
werden in bekannter Weise durchgeführt, z.B.
unter Verwendung von Carbodiimiden. 10
Gewünschtenfalls kann das Ausgangsenzym derivatisiert
werden, um eine gewünschte Funktionalität in das Molekül zum Zwecke der Kondensation mit dem vorgebildeten Molekül
einzubringen. So kann man zum Einbringen einer Carboxyfunktionalität ein freies Amino-enthaltendes Enzym mit
einer Dicarbonsäure umsetzen unter Ausbildung eines Carboxy-enthaltenden
Enzyms.
Bevorzugte Polymere, die in der vorerwähnten Ausführungsform verwendet werden können, sind alle solche, die die
jeweiligen Arten und Mengen der funktioneilen Gruppen, z.B. Amino oder Carboxy, für die beabsichtigte Reaktion
enthalten. Bevorzugt werden Polypeptide, wie natürliche Proteine, z.B. Chitosan, Hefeprotein und dergleichen und
auch Mischungen davon und als aminohaltige Polymere PoIyethylenimin.
Im allgemeinen bilden die bevorzugten vorgebildeten Polymere wasserlösliche Produkte, wobei diese
dann vorzugsweise durch Umsetzen mit einem Vernetzungsmittel, z.B. mit Glutaraldehyd und in anderen vorher
erwähnten unlöslich gemacht werden.
Bei den vorerwähnten Modifizierungsmethoden für das Enzym
ist es wesentlich, daß eine ausreichende chemische Funktionalität, z.B. Amino- oder Carboxy-Gruppen, vorliegen,
um ein ausreichendes Niveau des gewünschten Ergebnisses
zu erzielen.
BAD ORIGINAL
Bei der Auswahl des vorgebildeten Polymers, das mit dem
Enzym umgesetzt werden soll, ist es beispielsweise erforderlich, daß das Polymer Gruppen enthält, die mit den
verfügbaren Gruppen an dem Enzymmolekül reaktiv sind.
05 So würde man ein Protein mit Carboxygruppen auswählen,
um mit den entsprechenden Aminogruppen des Enzyms zu reagieren. Darüber hinaus muß eine ausreichende Anzahl der
reaktiven Gruppen bei den ausgewählten Reaktanten vorliegen, um eine Bindung an vielen Stellen zu bewirken,
und dadurch eine merkliche Stabilisierung zu erzielen. Die Bestimmung der Art und der Zahl solcher reaktiven
Gruppen für die jeweiligen Reagentien ist natürlich aus dem Stand der Technik bekannt.
Ein weiteres Verfahren, mittels dessen man die Thermostabilität von Enzymen erhöhen kann, besteht darin, daß man
die Oberflächenstruktur chemisch verändert, und zwar ohne
merklichen Aktivitätsverlust. So kann man Oberflächenaminogruppen amidinieren (Ludwig, M.L. und Hunter, M.J.,
Meth. Enzymol. 11, 595-604 (1967)) oder guanidinieren
(Kimmel, J.R., Meth. Enzymol·. 11, 584-589 (1967)), um
Substituenten auszubilden, die Arginin sehr ähnlich sind. Milchsäuredehydrogenase und andere Proteine sind so
stabilisiert worden (siehe Tuengler, F. und Pfleiderer,
G., Biochem. Biophys. Acta, 284, 1-8 (1977); Minotani,N.,
et al., Biochim. Biphys. Acta, 581, 334-341 (1979); und
Cupo, P., et al., J. Biol. Chem., 255, 10828-10833 (1980)).
Die Aktivität von löslichen Isomerasezubereitungen wurde bestimmt nach Lloyd et al. in Cereal Chemistry, 49, Nr. 5,
Seiten 544-553 (1972). Ein IGIU ist die Menge an Isomerase, die 1 μ.Μο1 Glucose pro min in Fructose umwandelt, und zwar
in einer Lösung, die 2 Mol Glucose pro 1, 0,02 Mol MgSO4
pro 1 und 0,001 Mol CoCl2 pro 1 bei einem pH von 6,85
(0,2 M Natriummaleat) enthält und eine Temperatur von
BAD ORIGINAL
6O0C aufweist.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird die direkte Isomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus raffiniertem
Maisstärkehydrolysat besteht unter Erhalt einer Zu-Sammensetzung
mit 55,5 % Fructose (Trockenbasis) und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahren
beschrieben. Zunächst wird eine Niedrigtemperaturisomerisierung bei 700C durchgeführt und das Produkt dieser
Umsetzung wurde in einem zweiten Hochtemperaturreaktor (105,20C), enthaltend chemisch stabilisierte Isomerase,
eingeführt. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein lösliches
Polymer gebunden war, welches dann unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators insolubilisiert wurde.
Das Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach dem in US-PS 3 644 126 (Verflüssigung) und US-PS 3 280 006 (Saccharifizierung)
beschriebenen Verfahren hergestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 3 834 940 raffiniert
unter Erhalt von 95,3 %iger Glucose (Trockenbasis). Es wurde ausreichend kristalline Glucose zugegeben und der
Gesamtglucosegehalt auf 97,6 % (Trockenbasis) gebracht. Die erhaltene Lösung hatte folgende Zusammensetzung:
Gesamttrockensubstanz (%) | 50,2 |
Glucose (% Trockenbasis) | 97,6 |
Fructose (% Trockenbasis) | 0,0 |
Polysaccharid (% Trockenbasis) | 2,4 |
Psicose (% Trockenbasis) | 0,0 |
NaHSO3 (mM) | 50,0 |
MgSO4 (mM) | 5,0 |
CoCl2 (mM) | 0,1 |
PH | 6,8 |
Die Niedrigtemperaturisomerisierung wurde durchgeführt,
indem man die obige Substratlösung durch den Niedrigtemperaturreaktor mit einer Fließrate von 3,2 ml/min
bei 7O0C pumpte. Der Niedrigtemperatur(700C)-Isomerasereaktor
bestand aus gepackter Isomerase, die auf DEAE-Cellulose (hergestellt gemäß US-PS 3 788 945)
immobilisiert war und die in eine Säule eingebracht wurde mit einem Durchmesser von 2,54 cm, wobei die
Säule einen Einlaß und einen Auslaß hatte und die mit
10 einem Mantel zum Zirkulieren von Wasser aus einem
Thermostaten versehen war. Der Kopfraum oberhalb der
Packung enthielt ein Thermometer und war im übrigen mit Glasperlen gefüllt, um den toten Raum soweit wie möglich
zu minimieren. Der Reaktor enthielt ausreichend immobilisierte Isomerase, um 20.000 IGIU zu ergeben und
das gepackte Bett hatte eine Höhe von etwa 15 cm. Die ersten 1000 ml, die aus dem Reaktor heraustraten,
wurden verworfen. Anschließend wurde der Abfluß zur Verwendung in der. zweiten Hochtemperaturisomerxsierung
20 gesammelt.
Der chemisch stabilisierte Katalysator für den Hochtemperaturreaktor
wurde in folgender Weise hergestellt:
Eine Spezies von Streptomyces rubigenosus, erhalten von
S. rubigenosus ATCC 21175 wurde in einer aeroben Tauchfermentation
auf dnem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Gew.-%
30 Dextrose 9,0
Mäismeische 1,6
Diammoniumphosphat 0,08 Mangansulfat % " 0,06
Antischaummittel 35 (Pluronic PL-61) 0,003
BAD ORIGINAL
Das Medium wurde 45 min bei 1210C sterilisiert, abgekühlt
und auf den pH 6,8-7,0 eingestellt. Dann wurde es mit
14 % (V/V) eines Inokulums aus dem Gehalt eines Impfgutfermenters, hergestellt mit der S. Rubigenosus-Varlante
der oben erwähnten Art, inokuliert. Die Fermentierung wurde unter aseptischen Bedingungen bei 300C während etwa
60 h unter Belüftung mit 0,65 wm. durchgeführt. S. rubigenosus ATCC 21175 kann auch zum Inokulieren und
zur Herstellung von Isomerase verwendet werden, wobei in diesem Fall ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet
wird.
Gew.-%
Dextrose 0,24
Maismeische (Feststoffe) 1,5 15 Sorbit 1,6
! CoCl2 0,02
Diammoniumphosphat 0,56
Xylose 1,0
Glucoseisomerase wurde aus dem S. rubigenosus extrahiert
durch Zugabe von 0,35 % Maquat MC 1412 (Mason Chemical Co.)
und 10 ppm Hühnereilysozym und 5-stündigem Schütteln bei
400C und einem pH von 6,3-6,6. Das Gemisch wurde dann filtriert,
wobei man eine Lösung von roher, ungereinigter
25 Glucoseisomerase erhielt.
Die rohe Isomerase wurde dann Absorption auf DEAE-Cellulose
(hergestellt gemäß US-PS 3 823 133) gereinigt, filtriert und das adsorbierte Produkt wurde mit 0,1 M NaCl-Lösung
gewaschen unter Entfernung der Verunreinigungen und dann durch Kontaktieren, mit 0,45 M NaCl-Lösung desorbiert.
Während der Reinigungsstufen wurde der pH-Wert aller Lösungen auf 7,5 gehalten. Die Lösung der partiell gereinigten
Isomerase wurde mit 3 Volumina 95%igera'Ethanol bei
O0C zum Ausfällen der Isomerase vermischt. Perlite-Filter-
BAD ORIGINAL
hilfe wurde zugegeben und der gewonnene Feststoff wurde
durch Filtrieren gewonnen und an der Luft getrocknet, wobei man eine lösliche Isomerasezubereitung erhielt,
die 2500 IGIU/g enthielt.
Die gereinigte Isomerase wurde in 1 HIM MnCl2 bei Raumtemperatur
gelöst unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 10 mg Isomerase pro ml und die Mischung wurde zur Entfernung
der Filterhilfe filtriert. Die spezifische Akti-
10 vität dieser Zubereitung betrug 37,3 IGIU/mg Protein.
Eine Lösung aus einem löslichen Polyaminpolymer wurde
hergestellt, indem man 39,0 g Chitosan in 13 1 0,08 N HCl auflöste. Die ChitosanlÖsung wurde durch Zugabe von
380 g NaCl auf 0,5 M NaCl eingestellt und die erhaltene Lösung wurde mit 8 N NaOH auf 6,15 eingestellt. Dann wurde
die ChitosanlÖsung durch einen Whatman ^-Papierfilter zum Entfernen von unlöslichem Material filtriert.
Zu 13 1 von 0,3 % Chitosan in 0,5 M NaCl bei pH 6,15
wurde folgendes zugegeben: 100 ml lösliche Isomerase enthaltend 100.000 IGIU-Aktivität, 197,6 g Xylit und
0,619 g CoCl2"6H2O. Diese Lösung wurde 2 h gerührt und
anschließend wurden 6,24 g 1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid
zugegeben und dadurch wurden die Carboxylgruppen der Isomerase kovalent an vielen Punkten mit den
Aminogruppen des Chitosans gebunden. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurden 15,6 ml einer 50%igen (V/V) Glutaraldehydlösung,
eingestellt mit 8 N NaOH auf pH 6,0, zugegeben, um den kovalent gebundenen Isomerase-Chitosan-Komplex
zu insolubilisieren. Nach 15 min wurden 2 1 1 M Phosphatlösung bei pH 8,0 zugegeben, um das Zerkleinern
des bei der Glutaraldehydzugabe gebildeten Gels zu erleichtern. Das gebildete insolubilisierte Isomerase-Chitosan
wurde mit entionisiertem Wasser auf einem
35 Buchner-Vakuumfilter gewaschen. Diese Zubereitung ließ
man über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft trocknen
und siebte sie dann auf einer Maschengröße von 12-60 mesh
(1,4 - 0,25 mm). Der trockene Katalysator hatte eine Aktivität .von 384 IGIU/g.
Der bei 105,20C betriebene Reaktor wurde in folgender Weise
hergestellt: Ein 13 g-Anteil des Katalysators wurde im Substrat suspendiert und unter einem Laborvakuum bei
Raumtemperatur während 60 min entlüftet. Die entlüftete
TO Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5 χ 20 cm-Bettes
in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 4992 IGIU.
Das aus der ersten bei·700C durchgeführten Isomerisation
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,75 eingestellt und auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch
die Hochtemperaturreaktorsäule unter einem Druck von 1,7 bar
(10 psig) mit einer Fließrate von 1,96 ml/min bei 600C
während 30 min gepumpt. Die Temperatur in der Säule wurde mittels eines Thermometers überwacht, welches direkt oberhalb
des Bettes angebracht war und von 0,5 cm Glasperlen umgeben war, um das tote Volumen so weit wie möglich zu
minimieren. Die Säulentemperatur wurde dann schnell erhöht, indem man öl, das in einem thermostatisch gesteuerten Bad
auf 1060C eingestellt war, in Kreislauf fuhr.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter gemessen. Der Fructosegehalt betrug
50-58 %. Nachdem die Säulentemperatur 105,20C erreicht hatte und nachdem der Fructosegehalt des Abflusses das
gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt und direkt in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde auf 4,90 durch
Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt. Der Abfluß
wurde gesammelt bis der scheinbare Fructosegehalt unterhalb
55 % abfiel.
Die aus dem bei 700C und bei 105,2°C-Reaktoren erhaltene
isomerisierte Lösung wurde auf die Kohlehydratzusammensetzung und Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden
mit gleichen Analysenergebnissen verglichen, die mit einer unisomerisierten Substratlösung erhalten wurden und
werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.
10
10
Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 700C und
105,20C isomerisiert wurden
105,20C isomerisiert wurden
unisomerisiert
bei 700C isomerisiert
bei 105,20C isomerisiert
Kohlehydratzusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Fructose Glucose Psicose Polysaccharld
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Fructose Glucose Psicose Polysaccharld
0 51 ,-3
55,5
0
0
0,3
0
0,3
2,4
2,3
2,6
2,3
2,6
Farbe (CIRFX100)
0,5
.. 0,7 14,1
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55f5%ige Fructose
erhält, wobei der Gehalt an Psicose unterhalb 0,4 Gew.-% (Trockenbasis) lag. Die Erhöhung der Farbe betrug
<£ 20
(CIRF X 100).
05
(CIRF X 100).
05
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer
glucosehaltigen Lösung (bestehend aus raffiniertem Mais-
glucosehaltigen Lösung (bestehend aus raffiniertem Mais-
'i 0 stärkehydrolysat plus kristalliner Glucose) bei einer
hohen Temperatur unter Erhalt einer Zusammensetzung,
die 55,2 % Fructose auf Trockenbasis enthielt, gezeigt, wobei eine zweistufige Isomerisierung angewendet wurde
und man bei der zweiten Stufe eine chemisch stabiliserte Isomerase verwendete, die aus Glucoseisomerase bestand,
die mit Polyethylenimin einen Komplex bildete und wobei
der Komplex durch Behandeln mit Glutaraldehyd unlöslich
gemacht wurde.
hohen Temperatur unter Erhalt einer Zusammensetzung,
die 55,2 % Fructose auf Trockenbasis enthielt, gezeigt, wobei eine zweistufige Isomerisierung angewendet wurde
und man bei der zweiten Stufe eine chemisch stabiliserte Isomerase verwendete, die aus Glucoseisomerase bestand,
die mit Polyethylenimin einen Komplex bildete und wobei
der Komplex durch Behandeln mit Glutaraldehyd unlöslich
gemacht wurde.
20 Herstellung von stabilisierter Isomerase
Eine lösliche Glucoseisomerase wurde wie im Beispiel 1 beschrieben
hergestellt. Die gereinigte Isomerase wurde
in 1 mM MnCl^ unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 9 mg Isomerase pro ml bei Raumtemperatur gelöst und von der
in 1 mM MnCl^ unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 9 mg Isomerase pro ml bei Raumtemperatur gelöst und von der
Mischung wurde die Filterhilfe abfiltriert. 60 ml 10%iger (W/V) PEI-6 (Polyethylenimin, Molekulargewicht 600,
pH 8) und 3 g Xylit wurden zu 300 ml der Enzymlösung gegeben und die erhaltene Lösung wurde für 15 min gerührt.
pH 8) und 3 g Xylit wurden zu 300 ml der Enzymlösung gegeben und die erhaltene Lösung wurde für 15 min gerührt.
10 ml 2,5 M Glutaraldehyd wurden zugegeben und die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das insolubilisierte
Enzym wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht in einem Konvektionsofen bei 370C getrocknet.
Nach dem Trocknen erhielt man 12,8 g immobilisierte Isomerase, enthaltend etwa 775 IGIU/g. 12g des immobilisierten Enzyms
wurden in dem Substrat suspendiert, im Vakuum bei 60 min
BAD OBlGiNAL
bei Raumtemperatur entlüftet und zur Herstellung eines
Hochtemperaturreaktors mit einem Durchmesser von 1,5 cm verwendet.
Das Substrat für den Reaktor, wurde in der ersten Stufe
der zweistufigen Isomerisierung wie im Beispiel 1 hergestellt. Dieses Substrat hatte folgende Zusammensetzung:
Gesamttrockensubstranz (%) 42,6
Glucose (% Trockenbasis) 46,4
Fructose (% Trockenbasis) 51,3
Polysaccharid (% Trockenbasis) 2,3 Psicose (% Trockenbasis) 0,0
0 MqSO, (mM) 50
0,1 6,75
Das Substrat wurde durch.den Reaktor während 45 min bei
600C in einer Rate von etwa 5 ml/min gepumpt. Die Säulentemperatur
wurde auf 101,60C erhöht und die Fließrate auf 2 ml/min verringert. Ein Rückdruck von 1,84 bar
(12 psi) wurde an die Säule angelegt, um ein Sieden des Substrats zu verhindern. Der Abfluß wurde mit einem kalibrierten
Aufzeichnungspolarimeter überwacht und enthielt
50-58% Fructose. Der Abfluß,der mehr als 55% Fructose enthielt, wurde in einem Eisbad gesammelt und mit 1,0 M
Zitronensäure auf pH 4,0 eingestellt.
Der Abfluß aus dem Hochtemperaturreaktor, das Substrat aus dem Reaktor der ersten Stufe und die ursprüngliche glucosehaltige
Lösung, die als Substrat in dem Reaktor der ersten Stufe verwendet worden war, wurden analysiert auf
die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 2 gezeigt.
NaHSO3 | (mM) |
MgSO4 | (mM) |
CoCl2 | (mM) |
pH |
Zusammensetzungen der Lösungen aus dar Isomerisierung der
ersten und zweiten Stufe
unisomerisiert isomerisiert bei 700G
isomerisiert bei 101,60C
Fructose
Kohlehydratzusammensetzung Farbe
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis (CIRF
X100)
Glucose Psicose Polysaccharid
O | 97 | ,6 | O | 2 | ,4 |
51,3 | 46 | ,4 | O | 2 | /3 |
55,2 | 42 | ,1 | O | 2 | ,7 |
0,5
0,7
51,7
51,7
CJ
332359
Dlese Ergebnisse zeigen, daß man 55,2%ige Fructose erhält,
wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) liegt.
05 Beispiel 3
In diesem Beispiel wird die Direktxsomerxsierung von Glucose zu einer 57,2%igen Fructose durch ein zweistufiges
Isomerisierungsverfahren gezeigt, wobei der erste Reaktor bei 700C und der zweite (Hochtemperatur-)Reaktor
bei 110,40C betrieben wurde. Die bei der Hochtemperaturreaktion
verwendete chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein
lösliches Polymer gebunden war, welches dann unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators insolubilisiert
wurde.
Das Substrat und dessen Umwandlung in dem bei 700C betriebenen
Reaktor der ersten Stufe wird in Beispiel 1 beschrieben.
Der in dem Hochtemperatur-Reaktor bei 110,40C verwendete
immobilisierte Katalysator wird gleichfalls im Beispiel 1 beschrieben.
Der 110,4°C-Reaktor wurde in folgender Weise hergestellt.
Ein Anteil von 28,4 g des Katalysators wurde in dem Substrat gelöst und unter einem Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur
während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung
wurde zur Herstellung eines 2,5 χ 12,4 cm-Bettes in
einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 10.885 IGIU.
Das in der ersten, bei 700C betriebenen Isomerisierungsstufe
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,47 eingestellt
BAD ORIGINAL
und auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsaule unter einem
Druck von 1,84 bar (12 psi) mit einer Fließrate von 3,38 ml/min bei einer Temperatur von 600C während 30 min
gepumpt. Die Temperatur innerhalb der Säule wurde mittels eines Thermometers, das direkt oberhalb des Bettes
angebracht war und das durch 0,3 cm Glasperlen umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren,
überwacht. Die Säulentemperatur wurde dann schnell erhöht,
10 indem man öl mit einer Temperatur von 1110C aus einem
thermostatisiertem Bad durch die Ummantelung zirkulierte.
Der Abfluß aus der Kolonne wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter überwacht und enthielt 50-58 %
Fructose. Nachdem die Säulentemperatur 110,4° erreicht
hatte, und nachdem der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt und
unmittelbar darauf in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde auf 4,0 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.
Die bei 700C und 110,4° aus den Reaktoren erhaltenen isomerisierten
Lösungen wurden auf die Kohlezydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden
mit Analysen verglichen, die man mit unisomerisierten
25 Substratlösungen erhielt. Die Ergebnisse werden in der
Tabelle 3 gezeigt.
BAD ORIGINAL
Zusammensetzungen von Substratlösungen, isomierisiert
bei 7O0C und bei 110,40C
Kohlehydratzusammensetzung (Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharld
unisomerisiert 0
isomerisiert bei70°C 52,3
isomerisiert bei 110,4 57,2
0C
0
0
0,3
0
0,3
Farbe
(CIRFX100)
(CIRFX100)
0,6
0,7
19,8
LJ
VO
»3 9«
j«}«
j«}«
O Ο ί, O <J O I
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 57,2%ige Fructose
erhält mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,4 Gew.-% (Trockenbasis) und wobei der Farbwert (CIRFX100) unterhalb
20 liegt.
05
05
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer
glucosehaltigen Lösung aus hauptsächlich raffiniertem
Maisstärkehydrolysat gezeigt, wobei man eine Zusammensetzung mit 56,3 % Fructose auf Trockenbasis unter Anwendung
eines zweistufigen Isomerisierungsverfahren erhielt. Zunächst wurde eine Isomerisierung bei niedriger Temperatur
bei 700C durchgeführt und das Produkt aus dieser Umsetzung
wurde als Zufuhr für einen zweiten Hochtemperaturreaktor (103,30C) verwendet, wobei der Hochtemperaturreaktor
chemisch stabilisierte Isomerase enthielt. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei
welcher das Enzym mit einem Schutzprotein (z.B. einem solchen,
das sich von Hefe ableitet) koreagiert worden war.
Die Niedrigtemperaturisomerisierung'sstufe einschließlich
der Beschreibung des Substrats und der Versuchsbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1.
Das chemisch stabilisierte Glucoseisomeraseenzym, welches
in dem Hochtemperaturreaktor verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: Lösliche Glucoseisomerase, die chemisch
stabilisiert werden sollte, wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt. Die
spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug etwa 40 IGIU/mg Protein. Ein Schutzprotein wurde aus Bäckerhefe
wie folgt erhalten: Zu 1229 g eines feuchten Kuchens aus Bäckerhefe wurden 1000 g Wasser und 500 g Toluol gegeben.
Die Mischung wurde über töacht bei Raumtemperatur erwärmt und dann auf 850C erhitzt und bei dieser Tempera-
BAQ ORIGINAL
tur etwa 30 min gehalten. Dann wurde die Mischung auf einem Buchner-Trichter filtriert. Nahezu das gesamte
Toluol verblieb in der unlöslichen Zelldebris, während das wässrige Filtrat lösliches Hefeextrakt enthielt.
Das wässrige Filtrat wurde auf einem Drehverdampfer bei 400C auf 276 g vermindert und dann wurden 41 g Tr ichloressigsäure
unter Rühren zugegeben. Das ausgefallene Hefeprotein wurde gesammelt und in 0,1 M Natriumphosphatpuffer
(pH 7,0) wieder aufgelöst. Dann wurde durch Filtrieren geklärt und die Lösung wurde mit 900 ml (etwa 3 Volumina)
Aceton behandelt. Der Niederschlag wurde gesammelt, in 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und die
erhaltene Lösung wurde gegen einen 0,01 M Natriumphosphatpuffer dialysiert. Das erhaltene Produkt (150 ml) war m.t
den aus Bäckerhefe erhaltenem Schutzprotein markiert.
Eine 0,6%ige Chitosanlösung wurde hergestellt, indem man 24 g Chitosin in 4 1 0,08 N HCl löste. Die Lösung wurde
mit .8 N auf den pH-Wert 6,2 eingestellt, durch ein Whatman #3-Filterpapier filtriert und dann gegen 16 1
entionisiertes Wasser dialysiert. In ein 400 ml Glas wurden etwa 100.000 IGIU lösliches Glucoseisomeraseenzym
(vermischt mit Filterhilfe), 1 g Xylit und 100 ml (2/3) des aus der Bäckerhefe erhaltenen Schutzproteins vorgelegt.
Zu dieser Mischung wurden 2,4 mg MgSO -7H2O und
24 μΐ einer molaren Kobaltchloridlösung gegeben. Von der
Mischung wurde die Filterhilfe abfiltriert und die Lösung wurde auf einem Drehverdampfer bei etwa 400C bis nahezu
zur Trockne in einem 2 1 Rundkolben konzentriert. Zu dem Kolben wurden dann 800 ml Chitosan (pH 6,2) gegeben. Die
Mischung wurde auf einem Drehverdampfer von etwa 400C auf nahezu zur Trockne konzentriert und dann wurden 640 μΙ
50%ige Glutaraldehydlösung (pH auf 6,5 eingestellt) zugegeben. Die Mischung wurde in einem kalten Raum über Nacht
aufbewahrt. Dann wurde das Gel aus dem Kolben entnommen
und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,595 mm gepreßt und bei etwa 370C ofengetrocknet. Die trockene
Enzymzubereitung wurde zur Entfernung von Feinstoffen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,177 mm
gesiebt und dann wurden (8,9 g des Endproduktes) für die Hochtemperaturisomerisxerung verwendet.
Ein Reaktor, der bei 103,30C betrieben wurde, wurde wie
folgt hergestellt: Die obige Glucoseisomerasezubereitung (8,9 g) wurde in dem Substrat suspendiert und unter
einem Laboratoriumsvakuum 30 min bei Raumtemperatur entlüftet.
Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5 χ 29 cm-Bettes in einer ummantelten Glassäule
verwendet.
Das aus der ersten bei 700C betriebenen Isomerisierung
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,75 eingestellt und auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde
durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einer Fließrate
20 von etwa 1,5 ml/min und bei einer Temperatur von 600C
während 30 min gepumpt. Die Temperatur innerhalb der Säule
wurde mit einem Thermometer, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und das von Glasperlen (0,5 mm
Durchmesser) umgeben war, um das tote Volumen zu minimieren, überwacht. Die Säulentemperatur wurde dann schnell
durch durch die Ummantelung zirkulierendes öl aus einem 1040C thermostatisierten Bad erhöht.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter,
das Ablesungen von 50-58 % Fructose zeigte, überwacht. Fraktionen (etwa 5 ml) wurden gesammelt bis
55 % oder mehr Fructose gebildet wurden und an diesem Punkt wurde der. Versuch abgebrochen. Während der Probenentnahme
wurde der Abfluß schnell auf einem Eisbad gekühlt und der pH wurde auf etwa 4,0 durch Zugabe von
molarer Zitronensäure (0,1 ml) und dann durch verdünnte
-43-HCl auf etwa 4,0 eingestellt.
Die bei 700C und bei 103,30C aus den Reaktoren erhaltenen
isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydrat zusainmensetzung
und die Farbe untersucht und die Ergebnisse
wurden mit Analysen verglichen, die mit unisomerisierter Substratlösung erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
wurden mit Analysen verglichen, die mit unisomerisierter Substratlösung erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 700C und bei 103,3°
isomerisiert wu'rden
KohlehydratZusammensetzung Farbe
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis) (CIRFX100)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis) (CIRFX100)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
unisomerisiert 0 97,6 0 2,4 0,5 Λ ♦
isomerisiert bei 700C 51,3 46,4 0 2,3 0,7 t ';;'
isomerisiert bei 103,30C 56,3 41,5 0,1 2,2 34,0 '·...,
GO GJ NJ GJ
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 56,3%ige Fructose
erhält, wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) lag.
05 Beispiel 5
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus einem
raffinierten Maisstärkehydrolysat mit einer niedrigen
10- Salzkonzentration bestand, gezeigt unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 55,4 % Fructose auf Trockenbasis
und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahrens.
Zunächst wurde eine Niedrigtemperaturisomerisierung bei 700C durchgeführt und das Produkt aus
dieser Umsetzung wurde als Zufuhr in einem zweiten Hochtemperaturreaktor (112,6°C), enthaltend chemisch
stabilisierte Isomerase, verwendet. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das
Enzym kovalent an ein lösliches Polymer mit zahlreichen Bindungen gebunden war und welches unter Ausbildung eines
immobilisierten Katalysators dann unlöslich gemacht worden war.
Das Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach den in US-PS 3 644 126 (Verflüssigung) und US-PS 3 280 006 (Saccharifizierung)
beschriebenen Verfahren hergestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 3 834
gereinigt unter Erhalt eines Produktes, enthaltend
93.8 % Glucose (Trockenbasis). Es wurde soviel kristalline
Glucose zugegeben, daß der Gesamtglucosegehalt
96.9 % (Trockenbasis) betrug. Die erhaltene Lösung hatte
folgende Zusammensetzung:
NaHSO^ | (MM) |
MgSO4 | (mM) |
CoCl2 | (mM) |
pH |
-46-
Gesamttrockensubstanz (%) 50,3
Glucose (% Trockenbasis) 96,9
Fructose (% Trockenbasis) ■ 0,1 Polysaccharid (% Trockenbasis) 3,1
Psicose 0,0
2,5 2,5 0,1 6,8
Die Niedrigtemperaturisomerisierung wurde durchgeführt,
indem man die obige Substratlösung bei 70°C durch den in Beispiel 1 beschriebenen Niedrigtemperaturreaktor
mit einer Fließrate von 2,5 ml/min pumpte. Die ersten aus dem Reaktor abfließenden 1000 ml wurden verworfen. ■-Der
anschließend aus dem Reaktor erhaltene Abfluß wurde für die Verwendung bei der zweiten Hochtemperaturisomerisierung
gesammelt.
Der in dem Hochtemperaturreaktor verwendete chemisch stabilisierte Katalysator wurde in· folgender Weise hergestellt:
Lösliche Glucoseisomerase wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und
gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug etwa 40 IGIU/mg Protein. Eine Lösung eines löslichen
Polymers, eines Polyamins, wurde erhalten, indem man 48,4 g Chitosan in 15 1 0,08 N HCl löste. Die Chitosanlösung
wurde durch Zugabe von 438 g NaCl auf 0,5 M NaCl eingestellt und die erhaltene Lösung wurde mit
8 N NaOH auf den pH 6,1 eingestellt. Dann wurde die Chitosanlösung
durch ein Whatman #3-Filter zur Entfernung
von unlöslichem Material filtriert. Zu 15 1 0,3 % Chitoson in 0,5 M NaCl bei pH 6,1 wurden folgende Substanzen
zugegeben: 520 ml lösliche Isomerase, enthaltend etwa 602.000 IGIÜ-Aktivität, 236 g Xylit und 3,07 g MnCl2·4Η2Ο,
Diese Lösung wurde 2 h gerührt und dann wurden 7,44 g
1-Ethyl-S-dimethyl-aminopropylcarbodiimid zugegeben,
um die Carboxylgruppen der Isomerase an die Aminogruppen des Chitosans kovalent an zahlreichen Punkten zu
binden. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurden 15,5 ml einer 50%igen (W/W) Glutaraldehydlösung, eingestellt auf 6,0
mit 8 N NaOH, zu der Reaktionsmischung zugegeben, um den kovalent gebundenen Isomerase-Chitosan-Komplex
zu insolubilisieren. Nach 15 min wurden 4 1 einer 1 M Phosphatlösung bei pH 8,0 in das unlösliche Isomerase-Chitosan
eingemischt. Das immobilisierte Isomerase-Chitosan wurde mit entionisiertem Wasser auf einem
Buchner-Vakuum-Filter mit einem Whatman #3-Filterpapier gewaschen. Die Zubereitung wurde dann an der Luft getrocknet,
zerkleinert und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1,4 bis 0,25 mm gesiebt. Der trockene
Katalysator zeigte eine Aktivität von 803 IGIU/g.
Ein 112,6°C-Reaktor wurde wie folgt hergestellt. Ein ',Og
Anteil des Katalysators wurde in dem Substrat suspend ^ert
und unter einem Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur
während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung
wurde zur Herstellung eines 1,0 χ 40 cm-Bettes in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt
5621 IGIU.
Das bei der ersten 70°C-Isomerisierung erhaltene Substrat wurde auf pH 6,55 eingestellt und dann mit entionisiertem
Wasser auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt, wodurch auch die Salzkonzentration auf 2,1 mM NaHSO3 und 2,1 mM
MgSO, erniedrigt wurde. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einem Druck von 1,84
bar (12 psig) während 10 min mit einer Fließrate von 8 ml/min bei 6O0C gepumpt. Die Temperatur in der Säule
wurde mittels eines Thermometers überwacht, welches
BAD ORIGINAL
direkt oberhalb des Bettes angebracht und das mit
Sand bis zur Temperaturskala eingebettet war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu vermindern. Die
Säulentemperatur wurde dann schnell durch aus einem thermostatisierten Bad auf etwa 114°C erhitztes zirkulierendes
öl erhöht. Die Säulentemperatur wurde auf 112,6°C erhöht und die Fließrate auf 1,89 ml/min vermindert
.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter
überwacht, welches Ablesungen zwischen 50 und 58 % Fructose zeigte. Nachdem die Säulentemperatur
112,60C erreicht hatte und der Fructosegehalt
im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt. Der pH wurde unmittelbar darauf durch
Zugabe von 1 M Zitronensäure auf 4,0 eingestellt und der Abfluß wurde gesammelt bis der scheinbare Fructosegehalt
unterhalb 55 % absank.
20 Die aus den 700C- und 112,6°C-Reaktoren erhaltenen
isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse
wurden mit solchen Analysen verglichen, die mit unisomerisierten Substratlösungen erhalten wurden.
25 Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
Zusammensetzung der Sufcstratlösungen, die bei 700C und 112,60C
isomerisiert wurden
KohlehydratZusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
unisomerisiert °
isomerisiert bei 700C 51,4
isomerisiert bei 112,6°C 55,4
isomerisiert bei 112,6°C 55,4
0
0,1
0,1
3,1
2,7 2,5
Farbe
(CIRF X 100)
0 8,5
r »■ f
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,4%ige Fructose
mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) und einen Farbwert
<9 (CIRF χ 100) erhält.
05 Beispiel 6
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus raffiniertem
Maisstärkehydrolysat mit niedrigem Salzgehalt be-
10 stand, unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 54,8 %
Fructose auf Trockenbasis und einem sehr niedrigen Gehalt an Psicose (<0,1 %) und einer Farbe (
< 2 CIRF χ 100), und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungs-·
Verfahrens. Der erste (Niedrigtemperatur-)Reaktor wurde
15 bei 700C und der zweite (Hochtemperatur-)Reaktor bei
105,80C betrieben. Die im Hochtemperaturreaktor verwendete
chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein geeignetes Polymer
mit zahlreichen Verknüpfungspunkten gebunden war, worauf man dann einen insolubilisierten immobilisierten
Katalysator herstellte.
Das Substrat und dessen Umwandlung in dem bei 700C betriebenen
Reaktor in der ersten Stufe war das gleiche wie im Beispiel 5.
Der in dem Hochtemperaturreaktor bei 105,80C verwendete
immobilisierte Katalysator war der gleiche wie im Beispiel 5.
Der 105,8°C-Reaktor wurde wie folgt hergestellt: Ein 5,63 g
Anteil des Katalysators wurde in dem Substrat suspendiert und unter.Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur während
30 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,0 χ 32 cm Bettes in einer ummantelten
Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 4521 IGIU.
332359
Das in der Isomerisierung der ersten Stufe bei 700C
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,5 eingestellt und mit entionisiertem Wasser auf 42,0 % Trockensubstanz
verdünnt, wodurch auch die Salzkonzentration auf 2,1 inM
MgSO4 und 2,1 mM NaHSO3 erniedrigt wurde. Das Substrat
wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einem Druck von 1,7 bar (10 psig) und mit einer Fließrate
von 8 ml/min während 10 min gepumpt und dabei die Temperatur bei 600C gehalten. Die Temperatur in der Säule
"wurde mittels eines Thermometers überwacht, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und welches bis zum
Beginn der Temperaturskala mit Sand umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren. Die
Säulentemperatur wurde dann schnell durch in der ümwaidung zirkulierendes öl aus einem thermostatisierten
Bad von etwa 1070C erhöht.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter,
das auf Ablesungen zwischen 50 und 58 % Fructose kalibriert war, überwacht. Nachdem die Säulentemperatur
105,80C erreicht hatte und der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß
gesammelt. Der pH wurde direkt darauf auf 4,90 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.
Die isomerisierten Lösungen aus den 700C- und 105,80C-Reaktoren
wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe analysiert und die Ergebnisse wurden mit
Analysen verglichen, die mit der unisomerisierten Substratlösung erhalten worden waren und werden in der Tabelle
gezeigt.
Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 700C und 105,80C
isomerisiert wurden
KohlehydratZusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
Farbe
(CIRF X 100)
(CIRF X 100)
cn to I
unisomerisiert ^0,1
isomerisiert bei 700C 51,4 isomerisiert bei 105,80C
54,8
96,9 45,9
42,3
0 0
OO GO K) GO
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 54,8%ige Fructose
erhält, mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,1 Gew.% (Trockenbasis) und einem Farbwert (CIRF χ 100) unterhalb
2.
Claims (1)
- PATENT- UNB R^C MTSWNWWLT?^ .*PATENTANWÄLTE DIPL-INS. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPU-ING. W. LEHNOJPC-INQ. K. FDCHSLE ■ DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. SRAUNS · DIPL.-ING. K. GORGDIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE38 8β3 o/hlNabisco Brands, Inc.
Parsippany, N.Y. /V.St.A.Verfahren zum Isomerisieren von Glucose in FructosePatentansprüche1. Verfahren zum Isomerisieren von Glucose zu Fructose, dadurch gekennzeichnet , daß man eine glucosehaltige Flüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwischen etwa 900C bis etwa 1400C bei einem pH-Wert von etwa 3 bis etwa 8 und einer Kontaktzeit, die ausreicht, um eine Endkonzentration von wenigstens etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% Fructose, bezogen auf den Gesamtkohlehydrätgehalt in der Flüssigkeity zu erhalten und unter im wesentlichen keiner Bildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Fructose-, Nicht-Glucose-Zuckern in Berührung bringt.2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e η η -zeichnet, daß die glucosehaltige Flüssigkeit durch Hydrolyse von Maisstärke gewonnen wurde.3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die glucosehaltige Flüssigkeit durch Isomerisierung von Maisstärkehydrolysat bis zu einem Fructosegehalt von bis zu etwa 52 %, bezogen auf den Gesamtkohlehydrätgehalt, erhalten wurde.ARABELLASTRASSE 4 . D-SOOO MÖNCHEN Θ1 . TELEFON COBQJ ©11ΟΘ7 · TELEX Ο3-2ββ1β (.PATHE) · TELEKOPIERER O1B34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseisomerase erhalten wurde aus einem Mikroorganismus der Gruppe Streptomyces-Spezies, Mutanten, Varianten und genetischen Modifizierungen davon.5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseiso-' merase erhalten wurde aus einem Mikroorganismus der Gruppe Streptomyces sp. ATCC 21175, Mutanten, Varianten und genetischen Modifizierungen davon.6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Glucoseisomera-15 se erhalten wurde aus einem Mikroorganismus, inwelchem mutierte Glucoseisomerase unter Ausbildung von mutierten Genen, die eine Glucoseisomerase mit hoher Wärmestabilität ergeben, eingeführt wurden.7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoseisomerase eine thermisch stabile Glucoseisomerase ist.8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus Bacillus stearothermophilus erhalten wurde.-9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η z.eichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus Bacillus licheniformis erhalten wurde.10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus einem Thermophilen derGenera Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermomonospora oder Pseudonocardia erhalten wurde.T1. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die thermisch stabile Glucoseisomerase aus einem Mikroorganismus vom Genus Ampullarieila gewonnen wurde.12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch 10- gekennzeichnet,, daß man eine Enzym-denaturisierung inhibierende Menge eines wasserlöslichen Salzes von schwefeliger Säure dem Isomerisierungsmedium zugibt.13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche Γ bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß die glucosehaltige Flüssigkeit etwa 30 bis etwa 50 Gew.-% Kohlehydrate enthält.14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die glucosehaltige Flüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase bei etwa 1000C bis etwa 1100C behandelt wird.15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis .14, dadurch gekennzeichnet , daß der pH der Isomerisierungsmischung bei etwa 5 bis etwa 6,5 gehalten wird.16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Kontaktzeit etwa 2 min bis etwa 30 min beträgt.17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeic h η e t , daß die chemisch stabilisierte Glucoseisomerase in imnobilisierter Form verwendet wird.332352118. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch g e 3: e η η zeichnet , daß die Glucoseisomerase auf Diethylaminoethylcellulose immobilisiert wird.19. \ferfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß in einer ersten Stufe die glucosehaltige Flüssigkeit mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur von etwa 20 °C bis etwa 8O0C, einem pH-Wert von etwa 6 bis und bei einer Kontaktzeit von etwa 0,5 bis etwa 2 h in Berührung gebracht wird bis man eine etwa 52 gew.-%ige, bezogen auf den Gesamtkohlehydratgehalt in der Flüssigkeit, enthaltende Fructose erhält und daß in einer zweiten Stufe die Temperatur des Isomerisierungsmediums auf etwa 900C bis etwa 1400C erhöht wird, wobei der pH im erforderlichen Maße auf einen Bereich von etwa 3 bis etwa 8 eingestellt wird und daß man die fructosehaltige Flüssigkeit mit der chemisch stabilisierten Glucoseisomerase während einer weiteren ausreichenden Zeit in Berührung bringt, um den Fructosegehalt auf etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% zu erhöhen..20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet , daß der er-■ haltene Fructose-Glucose-Sirup auf eine Temperatur unterhalb etwa 800C gekühlt wird.21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Entfernung des Enzyms aus der Isomerisierungsmischung die Temperatur in der Isomerisierungsmischung auf etwa 200C bis etwa 800C senkt.BAD ORIGINAL
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