ES2199933T3 - Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas. - Google Patents

Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas.

Info

Publication number
ES2199933T3
ES2199933T3 ES91914256T ES91914256T ES2199933T3 ES 2199933 T3 ES2199933 T3 ES 2199933T3 ES 91914256 T ES91914256 T ES 91914256T ES 91914256 T ES91914256 T ES 91914256T ES 2199933 T3 ES2199933 T3 ES 2199933T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
enzyme
clec
crystal
crosslinked
thermolysin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES91914256T
Other languages
English (en)
Inventor
Manuel A. Navia
Nancy L. St. Clair
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vertex Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharmaceuticals Inc filed Critical Vertex Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2199933T3 publication Critical patent/ES2199933T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C12Q1/003—Functionalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Piezo-Electric Or Mechanical Vibrators, Or Delay Or Filter Circuits (AREA)

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA INMOVILIZAR UNA ENZIMA Y, GENERALMENTE, TAMBIEN ENLAZANDO LOS CRISTALES RESULTANTES MEDIANTE EL USO DE UN REAGENTE BIFUNCIONAL; ASIMISMO SE PRESENTAN LOS CRISTALES DE ENZIMA ENLAZADOS, INMOVILIZADOS (CLECS) HECHOS MEDIANTE ESTE METODO; LA LIOFILIZACION DE LOS CLECS HECHOS MEDIANTE ESTE METODO; LOS CLECS LIOFILIZADOS, ENLAZADOS, INMOVILIZADOS Y UN METODO PARA FABRICAR UN PRODUCTO DESEADO POR MEDIO DE UNA REACCION CATALIZADA POR UN CLEC O AJUSTADA POR LOS CLECS.

Description

Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilización de enzimas.
Antecedentes de la invención
Las enzimas se utilizan como catalizadores industriales para la producción económica experimental y a gran escala de productos químicos especializados y de química fina (Jones, J. B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1986)), para la producción de alimentos (Zaks et. al., Trends in Biotechnology 6: 272-275 (1988)), y como herramientas para la síntesis de compuestos orgánicos (Wong, C.-H., Science 244: 1145-1152 (1989); CHEMTRACTS-Org. Chem. 3:
91-111 (1990): Klibanov, A.M., Acc. Chem. Res. 23: 114-120 (1990)).
La fabricación basada en enzimas puede reducir significativamente la carga de contaminación medioambiental implícita en la fabricación a gran escala de productos químicos intermedios no utilizables de otro modo, según se muestra en la producción a gran escala de acrilamida usando la enzima nitrilo hidratasa (Nagasawa, T. y Yamada; H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)).
Las enzimas también se usan en aplicaciones de biosensor para detectar diversas substancias de interés clínico, industrial u otro (Hall, E., "Biosensors", Open University Press (1990)). En el área clínica, las enzimas pueden utilizarse en terapias extracorpóreas, tales como hemodiálisis y hemofiltración, en donde las enzimas separan selectivamente los desechos y los materiales tóxicos de la sangre (Klein, M. y Langer, R., Trends in Biotechnology 4: 179-185 (1986)). Las enzimas se utilizan en estas áreas porque funcionan de manera eficaz como catalizadores para una amplia gama de tipos de reacción, a temperaturas moderadas, y con especificidad de sustratos y estereoselectividad. No obstante, existen desventajas asociadas con el uso de catalizadores de enzimas solubles, los cuales han limitado su uso en procesos químicos industriales y de laboratorio (Akiyama et. al., CHEMTECH 627-634 (1988)).
Las enzimas son costosas y relativamente inestables en comparación con la mayoría de los catalizadores industriales y de laboratorio, aun cuando se utilizan en medios acuosos, en donde funcionan normalmente. Muchas de las reacciones químicas más interesantes desde el punto de vista económico efectuadas en la práctica común son incompatibles con medios acuosos, en donde, por ejemplo, los sustratos y los productos son por lo general insolubles o inestables, y en donde la hidrolisis puede competir significativamente. Asimismo, la recuperación del catalizador enzimático soluble a partir del producto y del sustrato que no ha reaccionado en la materia básica por lo general requiere la aplicación de tecnología de separación costosa y compleja. Finalmente, resulta difícil almacenar las enzimas de forma tal que conserven su actividad e integridad funcional durante períodos de tiempo razonables desde el punto de vista comercial (de meses a años) sin tener que recurrir a la refrigeración (temperaturas de 4ºC a -80ºC a N_{2} líquido), o al mantenimiento en disolventes acuosos de intensidad iónica apropiada, pH apropiado, etc.
En muchos casos, gracias a los métodos de inmovilización de enzimas, se han encontrado soluciones para estas desventajas. La inmovilización puede mejorar la estabilidad de los catalizadores de enzimas y proteger su integridad funcional en los medios de disolventes agresivos y temperaturas extremas característicos en los procesos químicos industriales y de laboratorio (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149-153 (1985)). Los procesos de flujo continuo pueden operarse con partículas de enzimas inmovilizadas en columnas donde, por ejemplo, la materia básica soluble pasa por encima de las partículas y se convierte gradualmente en producto. Según se utiliza en la presente invención, la expresión "inmovilización de enzimas" se refiere a la insolubilización del catalizador enzimático mediante sujeción a, encapsulación de o aglomeración en partículas macroscópicas (10^{-1} mm).
Han aparecido varias reseñas útiles sobre métodos de inmovilización de enzimas en fuentes bibliográficas (Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984); Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45-50 (1985)). Maugh describe cinco enfoques generales sobre la inmovilización de enzimas. Éstas incluyen: adsorción sobre soportes sólidos (tales como resinas de intercambio de iones); sujeción covalente a soportes (tales como resinas de intercambio iónico, materiales cerámicos porosos o perlas de vidrio); atrapamiento en geles poliméricos; encapsulación; y precipitación de proteínas solubles mediante reticulación con reactivos bifuncionales de manera no definida y aleatoria. El documento EP-A-367302 (Soejima et al.) describe una proteasa Achromobacter I reticulada soluble en agua que se puede utilizar en un proceso para semi-sintetizar insulina humana. El documento EP-A-341503 (Visuri) describe una glucosa isomerasa insoluble en agua formada por una enzima cristalina convertida a forma sólida mediante reticulación con dialdehído (glutaraldehído) en presencia de un compuesto que contiene un grupo amino. Asimismo, es posible inmovilizar células enteras (por lo general muertas y convertidas en permeables) que han expresado la actividad enzimática deseada a niveles elevados (ej. Nagasawa, T. y Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)).
Cada uno de estos procedimientos de inmovilización tiene sus propias ventajas y limitaciones y ninguno de ellos puede considerarse óptimo o dominante. En la mayor parte de ellos, el catalizador enzimático en el fondo sólo representa una pequeña fracción del volumen total de material presente en el reactor químico. Como tal, la masa del medio inmovilizado está compuesta por material portador inerte, pero por lo general costoso. En todos ellos, las interacciones de inmovilización de las moléculas del catalizador enzimático entre ellas y/o con el material portador tienden a ser aleatorias y no definidas. Como resultado, si bien estas interacciones otorgan cierta estabilidad mejorada a las moléculas del catalizador enzimático, su inespecificidad e irregularidad relativas hacen que esta estabilización sea subóptima e irregular. En la mayor parte de los casos, el acceso al sitio activo del catalizador enzimático continúa estando mal definido. Además, con los métodos de inmovilización descritos anteriormente es imposible resolver problemas asociados con el almacenamiento y la refrigeración. Y las enzimas inmovilizadas por medios convencionales por lo general tampoco pueden ser manipuladas, como por ejemplo convirtiéndolas en uno u otro disolvente a elección, sin poner en riesgo la integridad funcional y estructural de la enzima. En la práctica, a no ser por el enlace con la partícula portadora, las enzimas inmovilizadas por medios convencionales se asemejan fuertemente a las enzimas solubles, y comparten con ellas una susceptibilidad a la desnaturalización y pérdida de función en entornos agresivos.
En términos generales, los métodos de inmovilización conducen a una reducción de velocidades de reacción catalizada por enzimas observadas en relación con las obtenidas en solución. Esto constituye mayormente una consecuencia de los límites de difusión interna de sustrato y difusión externa de producto dentro de la partícula enzimática inmovilizada (Quiocho, F.A., y Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). La presencia necesaria de portador inerte en las partículas enzimáticas inmovilizadas aumenta el recorrido libre medio entre el disolvente fuera de la partícula enzimática inmovilizada y el sitio activo del catalizador enzimático y, por ende, exacerba estos problemas de difusión. Al tratarse de células inmovilizadas, el problema de difusión es particularmente grave, incluso cuando las paredes y membranas de las células se permeabilizan al sustrato y al producto de algún modo. Un motivo adicional de preocupación sería la multitud de actividades enzimáticas contaminantes, metabolitos y toxinas contenidos en las células y la estabilidad de las células en entornos operacionales de disolventes agresivos y temperaturas extremas. Una técnica de inmovilización mejorada que no contenga las limitaciones de los métodos disponibles actualmente resultaría útil para fomentar el uso de enzimas como catalizadores industriales, en particular si se demostrara que puede usarse a gran escala (Daniels, M.J., Methods in Enzymology 136: 371-379 (1987)).
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método para inmovilizar una enzima mediante la formación de cristales de la enzima y también, por lo general, mediante la reticulación de los cristales resultantes utilizando un reactivo bifuncional; a cristales de enzimas inmovilizadas reticulados (referidos como CLEC o CLIEC) producidos con este método; a la liofilización de los CLEC como medio para mejorar las propiedades de almacenamiento, manejo y manipulación de enzimas inmovilizadas y a un método para fabricar un producto deseado a través de una reacción catalizada por un CLEC o conjunto de CLEC.
En el método de la presente invención, se producen cristales de proteínas pequeños (10^{-1} mm) a partir de soluciones acuosas o soluciones acuosas que contienen disolventes orgánicos, en los cuales el catalizador enzimático es estructural y funcionalmente estable. En una realización preferida, los cristales luego son reticulados con un reactivo bifuncional, tal como glutaraldehído. Este proceso de reticulación da como resultado la estabilización de los contactos de la red cristalina entre las moléculas del catalizador enzimático individual que componen el cristal. Como resultado de esta estabilización agregada, los cristales de la enzima inmovilizada reticulados pueden funcionar a temperaturas elevadas, valores de pH extremos y en medios acuosos, orgánicos o cuasi-anhidros agresivos, incluyendo sus mezclas. Es decir, un CLEC de la presente invención puede funcionar en entornos incompatibles con la integridad funcional de la correspondiente enzima no cristalizada, no reticulada y nativa o de los catalizadores enzimáticos inmovilizados por medios convencionales.
Por otra parte, los CLEC realizados con este método pueden ser sometidos a liofilización, con lo cual se produce un CLEC liofilizado que puede almacenarse en esta forma liofilizada a temperaturas no refrigeradas (ambiente) durante períodos de tiempo prolongados, y que pueden reconstituirse fácilmente en disolventes acuosos, orgánicos o acuoso-orgánicos mezclados a elección sin que se formen suspensiones amorfas y con un riesgo mínimo de desnaturalización.
La presente invención también se refiere a CLEC producidos mediante el presente método y a su uso en la producción industrial a gran escala y de laboratorio de materiales seleccionados tales como moléculas orgánicas quirales, péptidos, carbohidratos, lípidos, u otras especies químicas. Actualmente, estos últimos típicamente se preparan utilizando métodos químicos convencionales que pueden requerir condiciones agresivas (p. ej. disolventes acuosos, orgánicos o cuasi-anhidros, disolventes acuosos/orgánicos mixtos o temperaturas elevadas) que resultan incompatibles con la integridad funcional del catalizador enzimático no cristalizado, no reticulado y nativo. También pueden incorporarse otras macromoléculas con actividad catalítica a la tecnología CLEC propuesta. Estas macromoléculas pueden incluir anticuerpos catalíticos (Lerner, R. A., Benkovic, S.J., y Schultz, P.G., Science 252: 659-667 (1991)) y polinucleótidos catalíticos (Cech, T.R., Cell 64: 667-669 (1991); Celander, D.W., y Cech, T.R. Science, 251: 401-407 (1991)).
La presente invención también se refiere a un método para realizar un producto seleccionado mediante una reacción catalizada por un CLEC de la presente invención.
En un ejemplo del método y práctica de la presente invención, la enzima termolisina, una metaloproteasa de zinc, se utilizó para sintetizar un precursor quiral del edulcorante artificial dipeptidilo, aspartamo. La enzima termosilina se cristalizó a partir de una solución acuosa inicial de 45% de dimetilsulfóxido y 55% de acetato de calcio 1,4 M, cacodilato sódico 0,05 M a pH 6,5. Los cristales resultantes fueron reticulados con glutaraldehído para formar un CLEC de termolisina. El CLEC de termolisina se transfirió luego desde la solución de cristalización acuosa en la cual se formó a la solución de acetato de etilo que contiene los sustratos, ácido N-(benciloxicarbonil)-L-aspártico
(Z-L-Asp) y éster metílico de L-fenilalanina (L-Phe-OMe). A continuación, el CLEC de termolisina se utilizó para catalizar una reacción de condensación de los dos sustratos para sintetizar éster metílico de N-(benciloxicarbonil)-L-aspartil-L-fenilalanina (Z-L-Asp-L-Phe-OMe), que es el precursor dipeptidilo del edulcorante artificial aspartamo. Utilizando cualquiera de la gran cantidad de técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lindeberg, G., J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987)), el ácido L-aspártico en el precursor dipeptidilo sintetizado puede ser desprotegido mediante la separación del grupo benciloxicarbonilo (Z-) para producir aspartamo (L-Asp-L-Phe-OMe).
En un segundo ejemplo del método y práctica de la presente invención, la enzima termolisina se utilizó para producir CLEC de termolisina. La actividad y estabilidad de los CLEC de termolisina se compararon con las de la termolisina soluble en condiciones óptimas y condiciones extremas de temperatura y pH, y a continuación se realizó una incubación en presencia de disolventes orgánicos y luego una incubación en presencia de proteasa exógena.
La enzima termolisina se cristalizó a partir de una solución de acetato de calcio 1,2 M y dimetilsulfóxido al 30% a pH 8,0. Los cristales resultantes fueron reticulados con glutaraldehído a una concentración de 12,5% para formar un CLEC de termolisina. A continuación, el CLEC de termolisina fue liofilizado mediante un procedimiento estándar (Cooper, T.G., The Tools of Biochemistry, páginas 379-380 (John Wiley and Sons, NY (1977)) para formar un CLEC de termolisina liofilizado. Este CLEC liofilizado se transformó luego directamente en los distintos disolventes acuosos, orgánicos y acuosos/orgánicos mixtos a elección sin necesidad de recurrir a un procedimiento de intercambio de disolvente, sin que se formaran suspensiones amorfas, y con un riesgo de desnaturalización mínimo. Se incluyeron entre estos disolventes, sin carácter limitativo, acetonitrilo, dioxano, acetona y tetrahidrofurano. Después de la incubación, la actividad se analizó espectrofotométricamente mediante la escisión del sustrato dipéptido de la furil-acriloil-glicil-L-leucina-amida (FAGLA).
En un tercer ejemplo del método y práctica de la presente invención, la enzima elastasa (porcina pancreática) se cristalizó a partir de una solución acuosa de 5,5 mg/ml de proteínas en acetato sódico 0,1 M a pH 5,0 a temperatura ambiente (Sawyer, L. et al., J. Mol. Biol. 118: 137-208). Los cristales resultantes fueron reticulados con glutaraldehído a una concentración de 5% para formar un CLEC de elastasa. El CLEC de elastasa fue liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
En un cuarto ejemplo del método y práctica de la presente invención, y según se describe en la misma, la enzima esterasa (porcina del hígado) se cristalizó a partir de una solución acuosa de 15 mg/ml de proteínas en acetato de calcio 0,25 M a pH 5,6 a temperatura ambiente. Los cristales resultantes fueron reticulados con glutaraldehído a una concentración de 12,5% para formar un CLEC de esterasa. El CLEC de esterasa fue liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
En un quinto ejemplo del método y práctica de la presente invención, y según se describe en la misma, la enzima lipasa (Geotrichum candidum) se cristalizó a partir de una solución acuosa de 20 mg/ml de proteínas en Tris 50 mM a pH 7 a temperatura ambiente. Los cristales resultantes fueron reticulados con glutaraldehído a una concentración de 12,5% para formar un CLEC de lipasa. El CLEC de lipasa fue liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
En un sexto ejemplo del método y práctica de la presente invención, la enzima lisozima (clara de huevo de gallina) se cristalizó a partir de una solución acuosa de 40 mg/ml de proteínas en tampón acetato sódico 40 mM con cloruro de sodio al 5% a pH 7,4 a temperatura ambiente (Blake, C.C.F. et al., Nature, 196: 1173 (1962)). Los cristales resultantes se reticularon con glutaraldehído a una concentración de 20% para formar un CLEC de lisozima. El CLEC de lisozima fue liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
En un séptimo ejemplo del método y práctica de la presente invención, la enzima asparaginasa (Escherichia coli) se cristalizó a partir de una solución acuosa de 25 ng/ml de proteínas en acetato sódico 50 mM y etanol al 33% a pH 5,0 a 4ºC. La cristalización constituye una modificación al procedimiento descrito por Grabner et al. [Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 3.664.926)(1972)]. Según se describe en la presente memoria, los cristales resultantes se reticularon con glutaraldehído a una concentración de 7,5% para formar un CLEC de asparaginasa. El CLEC de asparaginasa fue liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
Otras enzimas que se pueden inmovilizar de manera similar y que se pueden utilizar para catalizar una reacción apropiada incluyen luciferasa y ureasa; otras enzimas, tales como las que figuran en las Tablas 1-5, también pueden ser cristalizadas y reticuladas utilizando el presente método, para producir un CLEC deseado que, a su vez, puede ser utilizado para catalizar una reacción que resulta en la fabricación de un producto seleccionado o para catalizar una reacción que constituye una etapa intermedia (es decir, una en una serie de reacciones) en la fabricación de un producto seleccionado. Es sabido que si bien la reticulación contribuye a estabilizar la mayoría de los cristales, no es ni necesaria ni preferible en todos los casos. Algunas enzimas cristalinas retienen la integridad funcional y estructural en entornos agresivos, incluso cuando no exista reticulación. Si bien en la realización preferida el cristal se reticula, la reticulación no es siempre necesaria para producir una enzima cristalizada útil en el presente método.
Los CLEC presentan varias características fundamentales que les confieren ventajas significativas en relación con los métodos de inmovilización de enzimas convencionales en uso en la actualidad. Los CLEC eliminan la necesidad de una estructura de soporte inerte separada. La falta de un soporte inerte mejorará las propiedades de difusión del sustrato y del producto dentro de los CLEC y ofrece concentraciones de enzimas dentro del cristal que se acercan al límite teórico de empaquetamiento para moléculas de tal tamaño. Las concentraciones elevadas de enzimas pueden conducir a un ahorro operacional significativo gracias a la actividad eficaz aumentada de un volumen determinado de catalizador, la reducción en tiempo de contacto del sustrato con la enzima y la reducción total del tamaño de planta y gastos de capital (Daniels, M.J., Methods in Enzymol., 136: 371-379 (1987)). La uniformidad en todo el volumen del cristal y la estabilidad mejorada de la enzima constitutiva en los CLEC crea nuevas oportunidades para el uso de la catálisis enzimática en condiciones agresivas, tales como temperatura elevada, y disolventes acuosos, orgánicos o cuasi-anhidros, así como también sus mezclas. Asimismo, el acceso restringido del disolvente y el entorno de proteína normal implícitos en una red cristalina deberían conducir a una retención mejorada de iones metálicos y cofactores para los CLEC en relación con los sistemas de enzimas inmovilizadas convencionales.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la actividad enzimática de un CLEC soluble y uno de termolisina.
La Figura 2 es una representación gráfica de los resultados de una comparación de dependencias de pH de un CLEC de termolisina y de termolisina soluble.
La Figura 3 es una representación gráfica de la medición de la actividad de termolisina soluble y cristalina después de una incubación a 65ºC.
La Figura 4 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la resistencia de un CLEC soluble y uno de termolisina a la degradación proteolítica exógena.
La Figura 5 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la actividad enzimática para elastasa soluble y el correspondiente CLEC de elastasa.
La Figura 6 es una representación gráfica de la resistencia de la elastasa soluble y el correspondiente CLEC de elastasa a degradación proteolítica exógena.
La Figura 7 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la actividad enzimática para esterasa soluble y el correspondiente CLEC de esterasa.
La Figura 8 es una representación gráfica de la resistencia de la esterasa soluble y el correspondiente CLEC de esterasa a degradación proteolítica exógena.
La Figura 9 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la actividad enzimática para lipasa soluble y el correspondiente CLEC de lipasa.
La Figura 10 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la actividad enzimática para lisozima soluble y el correspondiente CLEC de lisozima.
La Figura 11 es una representación gráfica de los resultados de la evaluación de la actividad enzimática para asparaginasa soluble y el correspondiente CLEC de asparaginasa.
Descripción detallada de la invención
Resultaría sumamente útil contar con un procedimiento general y simple que asegure la estabilidad y la función para una enzima determinada o un conjunto de enzimas en condiciones que resultan de interés para el químico de síntesis y que son demasiado agresivas para su uso con enzimas que utilizan los métodos disponibles en la actualidad. Los cristales de enzimas inmovilizadas reticulados (referidos como CLEC o CLIEC), según se describen en la presente memoria, pueden servir para este propósito. La estabilización de la red cristalina y de los catalizadores enzimáticos constitutivos en el cristal a través de la reacción de reticulación permite el uso de los CLEC en entornos entre los cuales se incluyen disolventes acuosos, orgánicos o cuasi-anhidros, sus mezclas, valores de pH extremos y temperaturas elevadas, los cuales resultan incompatibles con la función de la enzima que utiliza los métodos disponibles en la actualidad. Asimismo, la estabilización de la red cristalina en los CLEC permite la liofilización de los CLEC por métodos estándar. Los CLEC liofilizados pueden almacenarse durante períodos de tiempo interesantes desde el punto de vista comercial (de meses a años) sin refrigeración, y facilitan la rápida y simple utilización de los CLEC en procesos a escala de laboratorio y a escala industrial mediante la simple adición de disolventes a elección, sin necesidad de procesos intermedios de intercambio de disolventes. Los CLEC son, además, altamente resistentes a la digestión llevada a cabo por proteasas exógenas. El método de la presente invención facilita el uso de catalizadores enzimáticos versátiles en los principales procesos químicos industriales, así como también en la síntesis de laboratorio de nuevos compuestos para la investigación.
Si bien la reticulación contribuye a la estabilidad de una enzima cristalizada, no es ni necesario ni preferible en todos los casos. Algunas enzimas cristalizadas retienen la integridad funcional y estructural en entornos agresivos, aun cuando no haya reticulación. La realización preferida del presente método incluye la reticulación de una enzima cristalizada y se describe en detalle en las secciones que siguen. No obstante, se ha de entender que las enzimas cristalizadas que posteriormente no son reticuladas pueden utilizarse en algunas realizaciones de la presente invención.
Las interacciones regulares entre las moléculas enzimáticas constitutivas en la red cristalina de un CLEC dan como resultado poros bien definidos de tamaño limitado que conducen a las moléculas enzimáticas dentro del cuerpo de un CLEC. Como consecuencia, los sustratos que sean más grandes que el tamaño de poro disponible no podrán penetrar el cuerpo de la partícula del CLEC.
Como consecuencia de la limitación en el tamaño de poro, muchas reacciones enzimáticas de interés académico y comercial que comprenden sustratos mayores que el tamaño de poro de los CLEC quedarían fuera del alcance de la presente invención. Esto incluiría la mayoría de las reacciones que comprenden polímeros grandes, tales como proteínas, polinucleótidos, polisacáridos, y otros polímeros orgánicos, en donde el número de subunidades poliméricas haría que el polímero sea más grande que el tamaño de poro de cristal de los CLEC. Sin embargo, en dichos casos, la catálisis puede llevarse a cabo en la superficie del CLEC.
La presente invención constituye un método de inmovilización de una proteína seleccionada, en particular de una enzima, mediante la cristalización y la reticulación de la proteína, lo cual da como resultado un cristal de enzima inmovilizada reticulado (CLEC) que puede utilizarse para catalizar la fabricación de un producto seleccionado, a saber, péptido, carbohidrato, lípido o molécula orgánica quiral. La presente invención también se refiere a dichos CLEC y al método para fabricar un producto seleccionado mediante una reacción catalizada por un CLEC o una etapa catalizada por un CLEC dentro de una serie de reacciones. En una realización de la presente invención el precursor dipeptidilo de aspartamo se ha producido en una reacción de condensación catalizada por termolisina inmovilizada reticulada realizada mediante el presente método. En otra realización de esta invención, el sustrato indicador FAGLA se ha escindido para obtener un producto colorimétrico, cuya presencia es indicativa de actividad enzimática en un CLEC de termolisina. La hidrólisis de FAGLA se ha utilizado como reacción modelo para indicar la resistencia del CLEC de termolisina en varios entornos que normalmente serían incompatibles con la actividad de dicha enzima.
En otras realizaciones de esta invención, las enzimas elastasa, esterasa, lipasa, asparaginasa y lisozima se han utilizado para escindir diversas sustancias indicadas, tales como acetato de p-nitrofenilo (esterasa y lipasa), succinil-(ala)3-p-nitroanilida (elastasa), 4-metilumbeliferil N-acetil-quitriosidasa (lisozima) y NADH (asparaginasa).
Mediante el método de esta invención, una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede adaptar un protocolo para realizar un producto deseado mediante una reacción catalizada por una enzima inmovilizada. La enzima de interés, cuando se cristaliza a partir de una solución apropiada, puede ser reticulada con glutaraldehído u otro reactivo bifuncional adecuado en la solución de cristalización para producir un CLEC de dicha enzima. Posteriormente, el CLEC de la enzima elegida puede ser liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
El uso de un CLEC ofrece varias ventajas en comparación con los métodos catalizados por enzimas disponibles en la actualidad. Por ejemplo, la matriz de cristal reticulado en un CLEC se soporta a sí misma. No se requieren perlas portadoras, vidrios, películas o geles costosos para unir el catalizador enzimático, a diferencia de los métodos de inmovilización disponibles en la actualidad. Como resultado, la concentración de enzima en un CLEC es cercana al límite teórico de empaquetamiento que se puede alcanzar para moléculas de un determinado tamaño, lo cual excede ampliamente las densidades alcanzables aun en soluciones concentradas. El CLEC entero se compone de una enzima activa (y no portador inactivo) y, por ende, debería minimizarse la reducción relacionada con la difusión de las velocidades de reacción enzimática observadas normalmente con enzimas inmovilizadas por medios convencionales en relación con las enzimas en solución, ya que el recorrido libre medio para sustrato y producto entre la enzima activa y el disolvente libre se acortará en gran medida para los CLEC (en comparación con las partículas portadoras de enzimas inmovilizadas por medios convencionales). Estas densidades elevadas de proteínas resultarán particularmente útiles en aplicaciones de biosensor, analíticas y otras que requieren grandes cantidades de proteína en pequeños volúmenes. En procesos industriales, gracias al rendimiento y la compacidad superiores de los CLEC es posible realizar un ahorro operacional significativo mediante el incremento de la actividad eficaz de un volumen determinado de catalizador, con lo cual se pueden lograr reducciones en el tamaño de planta, así como también en los gastos de capital (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371:379 (1987)). Los CLEC son relativamente monodispersos con un tamaño macroscópico y una forma que reflejan las características de crecimiento natural del cristal de los catalizadores enzimáticos individuales. El reemplazo de los medios de enzimas inmovilizadas-portadoras existentes por los CLEC no debería resultar difícil, ya que ambos sistemas son comparables en tamaño y forma, y ambos pueden recuperarse en forma similar a partir del material de alimentación mediante una cantidad cualquiera de métodos simples, incluyendo operaciones económicas básicas tales como filtración, centrifugación, decantación de disolvente y otros.
Asimismo, el uso de CLEC liofilizados permite realizar el almacenamiento y manejo de rutina de estos materiales antes de utilizarlos (almacenamiento en seco a temperatura ambiente sin refrigeración durante períodos de tiempo prolongados). Los CLEC liofilizados también permiten realizar una formulación de rutina mediante la adición directa de disolventes y sustratos de interés, sin procesos de intercambio de disolventes prolongados o formación de suspensiones amorfas. La forma CLEC liofilizado extiende la utilidad general de las enzimas como catalizadores llevándola a un espectro más amplio de enzimas y condiciones funcionales.
Una segunda ventaja de los CLEC es que la reticulación de la enzima cristalizada estabiliza y refuerza la red cristalina y las moléculas enzimáticas constitutivas, tanto mecánica como químicamente. Como resultado, un CLEC puede ser el único medio para alcanzar concentraciones significativas de catalizador enzimático activo en disolventes acuosos, orgánicos, cuasi-anhidros agresivos o en mezclas de disolventes acuosos-orgánicos. El uso de enzimas como catalizadores en síntesis orgánicas ha sido obstaculizado por su tendencia a desnaturalizarse en presencia de disolventes no acuosos y, en particular, en mezclas de disolventes acuosos y no acuosos (Klibanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141-144 (1989)). En los CLEC la restricción de movilidad conformacional que conduce a la estabilidad se ofrece mediante los contactos químicos y reticulaciones inter-moleculares entre las moléculas enzimáticas constitutivas que conforman la red cristalina más que mediante la cuasi-ausencia de agua en el medio. Como resultado, las enzimas pueden tolerar concentraciones de agua intermedias cuando dichas enzimas son formuladas como CLEC, lo cual no había sido posible hasta hoy (véase la Tabla 12). En aplicaciones comerciales las mezclas de disolventes acuosos-orgánicos permiten la manipulación de la formación del producto aprovechando las solubilidades relativas de los productos y sustratos. Incluso en medios acuosos, los catalizadores enzimáticos, inmovilizados o solubles, están sometidos a fuerzas mecánicas dentro de un reactor químico las cuales pueden causar desnaturalización y una semivida más corta. Las reticulaciones químicas dentro del CLEC ofrecen la resistencia mecánica necesaria (Quiocho y Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833-839 (1964)) que da como resultado una vida de reactor incrementada para el catalizador enzimático.
Una tercera ventaja de los CLEC es que como resultado de su naturaleza cristalina, un CLEC puede lograr uniformidad en todo el volumen del cristal reticulado. Las enzimas cristalinas según se describen en la presente memoria se desarrollan y reticulan en un entorno acuoso y, por ende, la distribución de las moléculas dentro de la red cristalina permanece uniforme y regular. Esta uniformidad se mantiene gracias a los contactos inter-moleculares y las reticulaciones entre las moléculas enzimáticas que constituyen la red cristalina, incluso cuando se intercambien por otros medios acuosos, orgánicos o cuasi-anhidros o disolventes acuosos/orgánicos mixtos. En todos estos disolventes, las moléculas enzimáticas mantienen una distancia uniforme entre sí, con lo cual se forman poros estables bien definidos dentro de los CLEC que facilitan el acceso de sustrato a los catalizadores enzimáticos, así como también la separación del producto. La uniformidad de la actividad enzimática es crítica en aplicaciones industriales, médicas y analíticas en donde la reproducibilidad y la consistencia son de vital importancia.
Una cuarta ventaja de la utilización de un CLEC es que éste debería exhibir una semivida operacional y de almacenamiento aumentada. Es sabido que las interacciones de red cristalina, aun cuando no exista reticulación, estabilizan proteínas, debido, en parte, a restricciones en los grados de libertad conformacionales necesarios para la desnaturalización de proteínas. En los CLEC, las interacciones de red cristalina, cuando se fijan mediante reticulaciones químicas, son de particular importancia para prevenir la desnaturalización, especialmente en mezclas de disolventes acuosos y no acuosos (Klibanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences 14: 141-144 (1989)). Las enzimas que han estado en estado cristalino durante meses y años retienen de forma rutinaria un alto porcentaje de su actividad catalítica. Los cristales de enzimas inmovilizadas reticulados almacenados en disolventes anhidros estarán aun más protegidos contra la contaminación y daño microbianos, lo cual constituye un serio problema cuando se almacenan grandes cantidades de proteína en un entorno acuoso rico en nutrientes. En el caso de un CLEC liofilizado, la enzima inmovilizada se almacena en ausencia de disolvente. Gracias a esto último y a la estabilización alcanzada mediante reticulación es posible realizar el almacenamiento sin refrigeración durante períodos de tiempo prolongados.
Una quinta ventaja de la utilización de un CLEC es que éste debería presentar una estabilidad de temperatura mejorada como consecuencia de la estabilización de la red cristalina a través de la reticulación. La realización de reacciones a una temperatura mayor que la utilizada con los métodos convencionales incrementaría las velocidades de reacción para las reacciones químicas de interés, tanto termodinámicamente como mejorando la velocidad de difusión al entrar y salir de la red cristalina de CLEC. Estos efectos combinados representarían una gran mejora en la eficacia de las reacciones, porque maximizarían la productividad de una cantidad determinada de catalizador de enzima que, por lo general, es el componente más costoso del proceso de reacción (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371-379 (1987)). La estabilidad de temperatura exhibida por los CLEC es extraordinaria, porque la mayoría de los sistemas de enzimas requieren condiciones de reacción suaves. Los CLEC también se estabilizarían contra la desnaturalización mediante temperaturas elevadas transitorias durante el almacenamiento.
Una ventaja final del uso de un CLEC es que se crean poros de tamaño y forma regulares entre las moléculas enzimáticas individuales en la red cristalina subyacente. Esta accesibilidad restringida del disolvente mejora en gran medida las características de retención del ion metálico o cofactor del CLEC en comparación con las enzimas inmovilizadas por medios convencionales y las enzimas en solución. Esta propiedad de los CLEC permitirá el uso de procesos de flujo continuo superiores desde el punto de vista económico en situaciones (véase, por ejemplo, Oyama et al. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)) en las cuales la enzima, de lo contrario, sería inactivada por un ion metálico o lixiviación de cofactor. Por ejemplo, en la síntesis mediada por termolisina del precursor dipeptidilo de aspartamo, Z-L-Asp-L-Phe-OMe, es sabido que la enzima inmovilizada por medios convencionales pierde actividad catalítica en procesos de columna de flujo continuo, en parte por la lixiviación de iones calcio esencial para la actividad de la termolisina. En la práctica, la lixiviación de los iones calcio ha obligado a usar procesos discontinuos menos eficientes (Nakanishi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). La lixiviación se produce cuando los complejos de iones calcio se forman con sustrato Z-L-Asp, compitiendo con los sitios de unión de calcio natural sobre la superficie de la enzima, lo cual provoca la pérdida de la actividad catalítica. La alta densidad de enzima y, por consiguiente, el volumen limitado de acceso para el disolvente en los intersticios de los CLEC no estimula la formación de los complejos L-Asp-Ca^{++} de competencia responsables de la lixiviación del ion metálico.
\newpage
Preparación de los CLEC - cristalización de enzimas
En el método de la presente invención, se prepara un cristal de enzima inmovilizada reticulado (CLEC) de la siguiente forma:
Los cristales de enzima crecen mediante la precipitación controlada de proteína a partir de solución acuosa o solución acuosa que contiene disolventes orgánicos. Las condiciones que deben controlarse incluyen, por ejemplo, la velocidad de evaporación del disolvente, la presencia de cosolutos y tampones apropiados, y el pH y la temperatura. Una reseña completa de los diversos factores que afectan a la cristalización de proteínas ha sido publicada por McPherson (Methods Enzymol. 114: 112 (1985)). Además, tanto McPherson como Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)) han compilado listas completas de todas las proteínas y ácidos nucleicos que según se informó fueron cristalizados, así como también de las condiciones que conducen a su cristalización. Existe un compendio de cristales y recetas de cristalización, así como también se lleva un repositorio de datos de coordenadas de estructuras cristalizadas de ácidos nucleicos y proteínas resueltas en el Protein Data Bank (Bernstein et al. J. Mol. Biol. 112: 535-542 (1977)) del Brookhaven National Laboratory. Dichas referencias pueden utilizarse para determinar las condiciones necesarias para la cristalización de una proteína determinada o una enzima previamente cristalizada como preludio de la formación de un CLEC apropiado, y pueden servir de guía para la formulación de una estrategia de cristalización para las proteínas que no la tienen. Como alternativa, una estrategia de búsqueda de prueba y error inteligente (véase, por ejemplo, Carter, C.W. Jr. y Carter, C.W., J. Biol. Chem. 254: 12219-12223 (1979)) puede, en la mayoría de los casos, producir condiciones de cristalización apropiadas para la mayor parte de las proteínas, incluyendo, sin carácter limitativo, las mencionadas anteriormente, siempre y cuando se pueda alcanzar un nivel aceptable de pureza en ellas. El nivel de pureza requerido puede variar ampliamente entre proteína y proteína. En el caso de la lisozima, por ejemplo, la enzima se ha cristalizado directamente a partir de su fuente no purificada, la clara del huevo de gallina (Gilliland, G.L., J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)).
Para utilizar cristales como CLEC en el método de esta invención, no se requieren los mismos cristales simples y de gran tamaño necesarios para el análisis de difracción de rayos X y, en realidad, éstos pueden resultar indeseables a causa de los problemas de difusión relacionados con el tamaño del cristal. Las lluvias de microcristales (es decir, cristales de orden de 10^{-1} mm en tamaño/sección transversal) son apropiadas para los CLEC y se observan con frecuencia si bien raramente se tratan en el material bibliográfico sobre cristalografía por rayos X. Los microcristales resultan muy útiles en el método de esta invención para minimizar los problemas con la difusión (véase, por ejemplo, Quiocho, F.A. y Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)).
En términos generales, los cristales se producen mediante la combinación de la proteína que será cristalizada con un disolvente acuoso apropiado o un disolvente acuoso que contiene agentes precipitantes apropiados, tales como sales o compuestos orgánicos. El disolvente se combina con la proteína a una temperatura que según los experimentos realizados es apropiada para la inducción de la cristalización y es aceptable para el mantenimiento de la estabilidad y la actividad de la proteína. Opcionalmente, el disolvente puede incluir cosolutos, tales como cationes divalentes, cofactores o agentes caotrópicos, así como también especies tampón para controlar el pH. La necesidad de cosolutos y sus concentraciones se determina en forma experimental para facilitar la cristalización. En un proceso a escala industrial, la mejor forma de llevar a cabo la precipitación controlada que conduce a la cristalización es mediante la combinación simple de proteína, precipitante, cosolutos y, opcionalmente, tampones en un proceso discontinuo. También se pueden adaptar métodos de cristalización de laboratorio alternativos, tales como diálisis o difusión de vapor. McPherson (Methods Enzymol. 114: 112 (1985)) y Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)) proporcionan una lista completa de condiciones apropiadas en sus reseñas de la bibliografía sobre cristalización. Ocasionalmente, la incompatibilidad entre el agente de reticulación y el medio de cristalización podría requerir que se cambien los cristales por un sistema disolvente más apropiado.
Muchas de las proteínas para las cuales ya se han descrito las condiciones de cristalización en la bibliografía tienen un potencial considerable como catalizadores enzimáticos prácticos en procesos químicos industriales y de laboratorio, y están directamente sujetas a ser formuladas como CLEC dentro del método de esta invención. La Tabla 1 constituye un muestreo de enzimas que ya se han cristalizado. Obsérvese que las condiciones reseñadas en la mayor parte de estas referencias han sido optimizadas para el crecimiento de cristales de calidad difractaria de gran tamaño, por lo general mediante un gran esfuerzo. En algunos casos podría ser necesario un cierto grado de ajuste de condiciones para los cristales más pequeños utilizados en la fabricación de los CLEC.
TABLA 1
Enzima Fuente microbiana o biológica Referencias (incluyendo las citadas dentro de las mismas)
\bullet Alcohol Hígado equino Eklund et al., J.Mol.Biol. 146: 561-587 (1981)
deshidrogenasa
\bullet Alcohol oxidasa Pichia pastoris Boys et al, J.Mol.Biol.. 208: 211-212 (1989)
Tykarska et al., J.Protein Chem. 9: 83-86 (1990)
\bullet Aldolasa Músculo de conejo Eagles et al., J.Mol.Biol. 45: 533-544 (1969)
(fructosa-bisfosfato) Heidmer et al., Science 171: 677-680 (1971)
Goryunov et al., Biofizika 14: 1116-1117 (1969)
Músculo de ternero Millar et al., Trans.Roy.Soc.Lond. B293: 209- 214 (1981)
Músculo humano Brener et al., J.Biol.Chem. 257: 11747-11749 (1982)
Drosophila melanogaster
\bullet Aldolasa (PKDG) Pseudomonas putida Vandlen et al., J.Biol.Chem. 248: 2251-2253 (1973)
\bullet Fosfatasa alcalina Escherichia coli Sowadski et al., J.Mol.Biol. 150: 245-272 (1981)
\bullet Asparaginasa Erwinia carotova North et al., Nature 224: 594-595 (1969)
Escherichia coli Epp et al., Eur.J.Biochem. 20: 432-437 (1971)
Escherichia coli Yonei et al., J.Mol.Biol. 110: 179-186 (1977)
Tetsuya et al., J.Biol.Chem. 248: 7620-7621 (1972)
Proteus vulgaris
\bullet Anhidrasa Eritrocito humano (C) Kannan et al., J.Mol.Biol. 12: 740-760 (1965)
carbónica Eritrocito humano (B) Kannan et al., J.Mol.Biol. 63: 601-604 (1972)
Eritrocito bovino Carlsson et al., J.Mol.Biol. 80: 373-375 (1973)
\bullet Catalasa Eritrocito equino Glauser et al., Acta Cryst. 21: 175-177 (1966)
Micrococcus luteus Marie et al., J.Mol.Biol. 129: 675-676 (1979)
Vainshtein et al., Acta Cryst. A37: C29 (1981)
Penicillin vitale Eventoff et al., J.Mol. Biol. 103: 799-801 (1976)
Hígado bovino
\bullet Creatina quinasa Corazón bovino Gilliland et al., J.Mol.Biol. 170: 791-793 (1983)
Músculo de conejo
\bullet Glutaminasa Actenobacter Wlodawer et al., J. Mol. Biol. 99: 295-299 (1975)
glutanimasificans
Pseudomonas 7ª Wlodawer et al., J. Mol. Biol. 112: 515-519 (1975)
\bullet Glucosa Oxidasa Aspergillus Níger Kalisz et al., J. Mol. Biol. 213: 207. 209 (1990)
\bullet\beta-lactamasas Staphylococcus aureus Moult et al., Biochem J. 225: 167-176 (1985)
Bacillus cereus Sutton et al., Biochem J. 248: 181-188 (1987)
\bullet Lactato Porcino Hackert et al., J. Mol. Biol. 78: 665- 673 (1973)
deshidrogenasa Pollo Pickles et al., J. Mol. Biol. 9: 598-600 (1964)
Adams et al., J. Mol. Biol. 41: 159-188 (1969)
Pintarroja Schar et al., J. Mol. Biol. 154: 349-353 (1982)
Bacillus stearothermophilus
\bullet Lipasa Geotrichum candidum Hata et al., J. Biochem. 86: 1821-1827 (1979)
Pancreática equino Lombardo et al., J. Mol. Biol. 205: 259-261 (1989)
Brady et al., Nature 343: 767-770 (1990).
Mucor meihei Winkler et al., Nature 343: 771-774 (1990)
Pancreática humana
TABLA 1 (continuación)
Enzima Fuente microbiana o biológica Referencias (incluyendo las citadas dentro de las mismas)
\bullet Luciferasa Luciérnaga Green, A, A., et al., Biochem. Biophys. Acta. 20:
170 (1956)
\bullet Luciferasa Vibrio harveyii Swanson et al., J. Biol. Chem. 260: 1287-1289 (1985)
\bullet Nitrilo hidratasa Brevibacterium R312 Nagasawa et al., Biochem.Biophys.Res. Commun. 139:
1305-1312 (1986)
P.chlororaphis B23 Nagasawa et al., Eur.J.Biochem. 162: 691-698 (1987)
\bullet Peroxidasa Rábano picante Braithwaite et al., J.Mol.Biol. 106: 229-230 (1976)
Raíces de rábano picante Aibara et al., J.Biochem. 90: 489-496 (1981)
(Tipo E4)
Rábano japonés Morita, Acta Cryst. A28: S52 (1979)
\bullet Peroxidasa Caldaromyces fumago Rubin et al., J.Biol.Chem. 257: 7768-7769 (1982)
(cloruro)
\bullet Peroxidasa Saccharomyces cerevisae Poulos et al., J.Biol.Chem. 253: 3730-3735 (1978)
(citocromo)
\bullet Peroxidasa Eritrocito bovino Landenstein et al., J.Mol.Biol.104: 877-882 (1979)
(glutation)
\bullet Subtilisina Bacillus subtilis (Novo) Drenth et al. J.Mol.Biol. 28: 543-544 (1967)
Bacillus amyloliquefaciens Wright et al., Nature 221: 235- 242 (1969)
(BPN')
Bacillus subtilis (Carlsberg) Petsko et al., J.Mol.Biol., 106: 453-456 (1976)
\bullet Superóxido Bovina Richardson et al., J.Biol.Chem. 247: 6368-6369 (1972)
dismutasa Espinaca Morita et al., J.Mol.Biol., 86: 685-686 (1974)
Beem et al., J.Mol.Biol., 105: 327-332 (1976)
Saccharomyces cerevisae, Bridgen et al., J.Mol.Biol. 105: 327-332 (1976)
Escherichia coli
Bacillus stearothermophillus Yamakura et al., J.Biol.Chem. 251: 4792-4793 (1976)
Pseudomonas ovalis
\bullet Termolisina Bacillus thermoproteolyticus Matthews et al., Nature New Biol. 238: 37-41 (1972)
\bullet Ureasa Haba blanca Sumner,J.B., J.Biol.Chem. 69: 435 (1926)
\bullet Xilosa isomerasa Streptomyces rubiginosus Carrell et al., J.Biol.Chem. 259: 3230-3236 (1984)
Arthrobacter B3728 Akins et al., Biochym.Biophys.Acta 874: 375-377 (1986)
Streptomyces Farber et al., Protein Engineering 1: 459-466 (1987)
oilvochromogenes
Streptomyces violaceoniger Glasfeld et al., J.Biol.Chem. 263: 14612-14613 (1988)
Actinoplanes missouriensis Rey et al., Proteins:Struc.Func.Genet 4: 165-172 (1988)
Preparación de los CLEC - reacción de reticulación
Una vez que los cristales se desarrollan en un medio apropiado, se pueden reticular. La reticulación da como resultado la estabilización de la red cristalina mediante la introducción de enlaces covalentes en el cristal entre las moléculas enzimáticas constitutivas. Esto permite la transferencia de enzima a un entorno de reacción alternativo que, de lo contrario, sería incompatible con la existencia de la red cristalina, o incluso con la existencia de proteínas no desnaturalizadas intactas. La reticulación se puede lograr a través de una amplia variedad de reactivos bifuncionales, si bien en la práctica el glutaraldehído, económico y simple, se ha convertido en el reactivo elegido. (Para obtener un listado representativo de otros reactivos de reticulación disponibles se puede consultar, por ejemplo, el Catálogo de 1990 de Pierce Chemical Company).
La reticulación con glutaraldehído forma enlaces covalentes fuertes principalmente entre los residuos de aminoácidos de lisina dentro y entre las moléculas enzimáticas en la red cristalina que constituye el cristal. Las interacciones de reticulación evitan que las moléculas enzimáticas constitutivas dentro del cristal vuelvan a pasar a la solución, con lo cual las moléculas enzimáticas se insolubilizan y se inmovilizan de manera eficaz formando partículas microcristalinas (idealmente 10-1 mm). Los cristales macroscópicos, inmovilizados, insolubilizados pueden separarse fácilmente del material de alimentación que contiene producto y sustrato no reactivo mediante procedimientos simples tales como filtración, decantación y otros. También pueden utilizarse en columnas cargadas de CLEC en procesos de flujo continuo, donde muestran propiedades mejoradas de retención de ion metálico y cofactor.
A través del método de esta invención, se obtienen CLEC para ser utilizados como catalizadores de enzimas en entornos nuevos y existentes. La estabilidad mejorada de los CLEC, obtenida gracias a la reacción de reticulación, permite transferir el CLEC a un disolvente (por ej. disolventes acuosos, orgánicos o cuasi-anhidros o sus mezclas) en el cual sería incompatible de otra forma, y activar el funcionamiento del reactor químico a temperaturas elevadas o valores de pH extremos. Las partículas macroscópicas de catalizador de CLEC también pueden manipularse fácilmente, permitiendo una recuperación del material de alimentación a través de métodos simples, tales como filtración, centrifugación o decantación de disolvente. Asimismo, éstos pueden utilizarse en columnas cargadas en procesos de flujo continuo.
Preparación de los CLEC - liofilización
Una suspensión de un volumen de cristales de termolisina reticulados fue liofilizada en diez volúmenes de agua desmineralizada a pH 7,0 durante la noche utilizando un liofilizador VirTis Modelo Nº24. Los cristales liofilizados se almacenaron a temperatura ambiente o a 4ºC antes de su reconstitución, la cual fue realizada agregando diez volúmenes del disolvente elegido directamente sobre los cristales tomados de almacenamiento. Los cristales rehidratados fueron reconstituidos en tampón acetato de calcio 10 mM a pH 7,0 para los experimentos de escisión por FAGLA. Los CLEC liofilizados y reconstituidos se almacenaron a temperatura ambiente según el procedimiento de rutina. En cambio, fue necesario almacenar las enzimas solubles a -70ºC para mantener su actividad específica por más de una semana. Este protocolo fue utilizado para todas las enzimas descritas en las ejemplificaciones incluidas en la presente invención.
Síntesis del precursor de aspartamo con CLEC de termolisina
El método de la presente invención, mediante el cual se producen enzimas cristalizadas reticuladas, se describe a continuación y se ejemplifica mediante la producción de cristales de enzimas inmovilizadas reticulados de termolisina para ser utilizados en la producción del precursor dipeptidilo de aspartamo, en acetato de etilo, el cual es un disolvente cuasi-anhidro y orgánico. La termolisina, una proteína que ha sido cristalizada y cuya estructura ha sido resuelta en la resolución 1,6 A (Holmes y Matthews, J.Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)), es un ejemplo de una enzima que puede utilizarse como CLEC en el presente método. La termolisina se utiliza en la producción del edulcorante artificial aspartamo (Isowa et al. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Nº 4.436.925 (1984); Lindeberg, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Nakanishi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985); Oyama, et al., Methods in Enzymol, 136: 503-516 (1987)). En la actualidad, la mayoría del aspartamo se produce utilizando un enfoque de química sintética convencional, si bien el uso de termolisina inmovilizada por medios convencionales en medios cuasi-anhidros ha dado resultados alentadores (Oyama et al., J. Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Nakanishi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Las mejoras en el enfoque enzimático de la producción de aspartamo, como las que se pueden alcanzar a través del uso del presente método, lo harían competir con el método usado en la actualidad, tanto desde el punto de vista de la conveniencia como de los costes (Oyama, et al., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)).
Evaluación de los CLEC de termolisina
El método de la presente invención también se ha utilizado para producir CLEC de termolisina en los cuales se han evaluado dependencia de pH, estabilidad a temperaturas elevadas, resistencia a proteolisis exógena y estabilidad en presencia de un disolvente orgánico. Los CLEC de termolisina fueron comparados con termolisina soluble, según se describe en detalle en el Ejemplo 2 y en las Figuras 1-4. Los resultados de la evaluación mostraron lo siguiente:
1.
En cuanto a dependencia de pH y estabilidad, ambas formas demuestran actividad máxima a pH 7 y demuestran actividad similar en el intervalo acídico. En el intervalo de pH alcalino, el CLEC mantiene actividad máxima hasta pH 10; la termolisina soluble tiene 75% de actividad a pH 8,5, sólo 25% de actividad a pH 9 y es completamente inactiva a pH 9,5.
2.
La estabilización adicional alcanzada en los CLEC da como resultado una actividad enzimática a temperaturas más elevadas de las que son posibles con termolisina soluble. Gracias a la estabilidad mejorada de la termolisina de CLEC a temperaturas más bajas, el almacenamiento es más simple que para la enzima soluble. También se demostraron la estabilidad térmica y la resistencia a la autolisis para los CLEC de termolisina, los cuales retuvieron su actividad máxima al cabo de cinco días de incubación a 65ºC. En cambio, la termolisina soluble perdió 50% de su actividad inicial al cabo de dos horas de incubación y demostró actividad insignificante después de 24 horas de incubación a 65ºC.
\newpage
3.
La actividad enzimática de los CLEC de termolisina no se vio afectada por cuatro días de incubación en presencia de la potente proteasa estreptococal Pronase®. En cambio, la termolisina soluble se degradó rápidamente y perdió toda su actividad al cabo de 90 minutos de incubación.
4.
Los CLEC de termolisina y la termolisina soluble mostraron diferencias acusadas de estabilidad en presencia de disolventes orgánicos, según se muestra en la Tabla 12. Los CLEC de termolisina retuvieron más del 95% de su actividad máxima después de la incubación con todos los disolventes orgánicos evaluados.
Estas características hacen que los CLEC de termosilina y otros CLEC de enzimas resulten particularmente útiles, ya que son más fáciles de almacenar, más estables y se inactivan o degradan menos fácilmente que sus correspondientes enzimas solubles.
Evaluación de los CLEC de elastasa
El método de la presente invención también se ha utilizado para producir CLEC de elastasa en los cuales se han evaluado su actividad y resistencia a proteolisis exógena. Los CLEC de elastasa fueron comparados con elastasa soluble, según se describe en detalle en el Ejemplo 3 y las Figuras 5 y 6. Los resultados de la evaluación demostraron lo siguiente:
1.
Los CLEC de elastasa retienen aproximadamente el 50% de su actividad en comparación con la enzima soluble.
2.
La elastasa soluble fue degradada rápidamente por la proteasa. La actividad de la elastasa soluble se redujo al 50% con respecto a la actividad inicial al cabo de diez minutos de incubación en presencia de proteasa. Pasada una hora de incubación, la enzima soluble había perdido más del 90% de su actividad inicial. En cambio, la actividad enzimática del CLEC de elastasa no se vio afectada por la incubación con proteasa.
Evaluación de los CLEC de esterasa
El método de la presente invención también se ha utilizado para producir CLEC de termolisina en los cuales se han evaluado su actividad y resistencia a proteolisis exógena. Los CLEC de esterasa fueron comparados con esterasa soluble, según se describe en detalle en el Ejemplo 4 y las Figuras 7 y 8. Los resultados de la evaluación mostraron lo siguiente:
1.
Los CLEC de esterasa retienen aproximadamente el 50% de su actividad en comparación con la enzima soluble.
2.
La esterasa soluble fue altamente susceptible a la degradación proteolítica. La actividad de la esterasa soluble se redujo al 50% con respecto a la actividad inicial al cabo de diez minutos de incubación en presencia de proteasa. Pasada una hora de incubación, la enzima soluble había perdido más del 90% de su actividad inicial. En cambio, la actividad enzimática del CLEC de elastasa no se vio afectada por la incubación con proteasa.
Evaluación de los CLEC de lipasa
El método de la presente invención también se ha utilizado para producir CLEC de lipasa en los cuales se evaluó su actividad. Los CLEC de lipasa fueron comparados con lipasa soluble, según se describe en detalle en el Ejemplo 5 y la Figura 9. Los resultados de la evaluación demostraron que los CLEC de lipasa retienen aproximadamente el 90% de la actividad en comparación con la enzima soluble.
Evaluación de los CLEC de lisozima
El método de la presente invención también se ha utilizado para producir CLEC de lisozima en los cuales se evaluó su actividad y resistencia a proteolisis exógena. Los CLEC de lisozima fueron comparados con lisozima soluble, según se describe en detalle en el Ejemplo 6 y la Figura 10. Los resultados de la evaluación demostraron que los CLEC de lisozima retienen aproximadamente el 50% de la actividad en comparación con la enzima soluble.
Evaluación de los CLEC de asparaginasa
El método de la presente invención también se ha utilizado para producir CLEC de asparaginasa en los cuales se evaluó su actividad. Los CLEC de asparaginasa fueron comparados con asparaginasa soluble, según se describe en detalle en el Ejemplo 7 y la Figura 11. Los resultados de la evaluación demostraron que los CLEC de asparaginasa retienen aproximadamente el 77% de la actividad en comparación con la enzima soluble.
Aplicabilidad general de los CLEC
Según se describe en la presente memoria, los CLEC representan una tecnología nueva de amplio uso en muchos campos, incluyendo, sin carácter limitativo, síntesis a escala industrial, herramientas de laboratorio, biosensores y aplicaciones médicas. Las Tablas 2-5 que aparecen a continuación muestran ejemplos de diversos sistemas que utilizan métodos de enzimas inmovilizadas por medios convencionales en su ejecución. Un experto en la técnica debería ser capaz de adaptar estos sistemas y sistemas similares a la tecnología CLEC descrita en esta solicitud. A modo ilustrativo se describen con mayor detalle ejemplos específicos de las categorías listadas.
La Tabla 2 incluida a continuación enumera ejemplos que utilizan enzimas inmovilizadas por medios convencionales en un proceso industrial, ejemplos que pueden adaptarse fácilmente a la tecnología CLEC descrita en la presente memoria.
TABLA 2
Enzima producción o Sustratos Referencias (incluyendo las mencionadas en ellas)
aplicación
\bullet Termolisina \bullet Precursor de Z-Asp, L-Phe-OMe Oyama et al., J.Org.Chem. 46: 5242-5244 (1981)
aspartamo Nakanishi et al., Trends in Biotechnology 3:
459-464 (1985)
\bullet Subtilisina \bullet Aspartamo L-Asp-L-Phe, OMe Davino, A.A., Patente de EE.UU. 4.293.648
(1981)
\bullet Lipasa \bullet Sustitutos de Aceites de palma Harwood, J., Trends in Biochemical Sciences 14:
grasa de cacao 125-126 (1989)
Macrae, A.R., J.Am.Oil Chem. Soc., 60:
291-294 (1983)
\bullet Nitrilo hidratasa, \bullet Acrilamida Acrilonitrilo Nagasawa, T. y Yamada, H., Trends in
nitrilasas, amidasa Biotechnology 7: 153-158 (1989)
\bullet Amino acilasa \bullet Aminoácido N-acil-D,L Schmidi- Kastner, G. y Egerer, P. en Biotechno-
(fúngica) aminoácidos logy vol 6a: 387-421 (1984) y referencias
dentro del mismo
\bullet Aminoácido \bullet Redisolución Ésteres
esterasa de D, L-aminoácidos
\bullet Subtilisina
\bullet Amidasas Amidas
de D, L-aminoácidos
\bullet Hidantoinasas Hidantoínas Fusee, M.C., Methods in Enzymology 136: 463
\bullet Deshidrogenasas (1987)
específicas
\bullet Aminopeptidasa Ácidos x-
hidroxicarboxílicos
\bullet Transaminasa Fusee, M.C., Methods in Enzymology 136: 463
(1987)
\bullet Aminoácido \bullet Producción Ceto o hidroxi Rozzeli, J.D., Methods in Enzymology 136: 479
Deshidrogenasa + de aminoácido: ácidos (1987)
formato general
deshidrogenasa
TABLA 2 (continuación)
Enzima producción o Sustratos Referencias (incluyendo las mencionadas en ellas)
aplicación
\bullet L-aspartasa \bullet Producción Fumarato/ácido Enzymes in Industry; Ed Gerhartz.W.,VCH Press
de aminoácido: fumárico 1990
ácido
L-aspártico
específico
\bullet L-aspartato L-alanina L-ácido aspártico,
4-decarboxilasa fumarato de amonio
aspartasa + L L-lisina D, L-a amino
aspartato 4 e-caprolactama
decarboxilasa (ACL)
\bullet ACL hidrolasa L-cisteína Ácido DL-2-
\bullet L-ACT L-isoleucina amino2-tiazolina-
hidrolasa L-metionina 4-carboxílico
\bullet Liasa L-fenilalanina Indol cinamato,
L-serina
\bullet L-triptófano L-triptófano
sintetasa
\bullet Fumarasa L-valina Fumarato
ácido L-málico
\bullet Hidantoinasa D-n-carbamoil- 5p-hidroxi-hidantoína
p-hidroxi-
fenilglicina
\bullet Lipasas, \bullet Redisolución química sintética Jones, J.B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1988)
esterasas de racematos Butt, S. y Roberts, S.M., Natural Product Reports
mediante 489-503 (1986), y las referencias citadas en el
síntesis mismo para una reseña más completa de este área
estereoselectiva
\bullet Fumarasa \bullet Ácido Ácido fumárico Chibata et al., Methods in Enzymology 136: 455
L-málico (1987)
\bullet Lactasa \beta- \bullet Síntesis de Lactosa y N-acetil Larsson et al., Methods in Enzymology 136: 230
galactosidasas disacáridos, galactosamina (1987)
p. ej. galactosil-
N-acetil
galactosamina
\bullet Lipasa, esterasa \bullet L-mentol Mezcla de 4 isómeros Fukui, S., Tanaka, A., Methods in Enzymology
136: 293 (1987)
TABLA 2 (continuación)
Enzima producción o Sustratos Referencias (incluyendo las mencionadas en ellas)
aplicación
\bullet Amidasas \bullet D-valina Amida de Schmidt-Kastner,G. y Egerer, P. en Biotechnology
(producto D.L.-aminoácido vol 6a: 387-421 (1984) y las referencias
químico en el mismo
intermedio
para fluvinato
insecticida
piretroide)
\bullet Lipasa (Candida \bullet Ácidos Ácidos 2 cloro- Biocatalysts in Organic Syntheses eds Tramper,
cylindricea) R(+)2fenoxi- propiónicos van de Plas \textamp Linko; Proceedings of International
propiónicos Symposium in Netherlands 1985
(herbicidas)
\bullet Lipasas, \bullet Síntesis Jones, J.B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1988)
esterasas, orgánicas Butt, S. Y Roberts, S.M., Natural Product Reports
amidasas, Péptidos 489-503 (1986), y las referencias citadas en el
aldolasas monoglicéridos mismo para una reseña más completa de este área
\bullet Proteasas, \bullet Ácido 2(p- Redisolución de éster
peptidasas clorofenoxi) racémico
\bullet Lipasa de propiónico:
levadura herbicida
\bullet Estrictosidina \bullet Producción Pfitzner et al., Methods in Enzymology 136:
sintasa de alcaloides 342 (1987)
p. ej.
estrictosidina
\bullet Penicilina \bullet Ácido 6- Penicilina G o V Enz Eng 6: 291 (1982)
acilasa amino- Enz Eng 8: 155
\bullet Penicilina penicilánico
amidasa y 7-ADCA
\bullet Hidroxieste- \bullet Transforma- Carrea et al., Methods in Enzymology 136: 150
roide-deshi- ciones de (1987)
drogenasas esteroides
\bullet 5'fosfodieste- \bullet 5'-ribonu- Keller et al, Methods in Enzymology 136: 517
rasa, nucleasas cleótidos (1987)
\bullet Esterasa \bullet Precursor Diésteres Solicitud de Patente de Japón: 82-159, 493 (1981)
\beta-lactama correspondientes Biseibutsu Company
(monoésteres
quirales
p. ej. éster
monoalquílico
de ácido
\betaamino
glutárico)
\bullet Lipasas \bullet\beta-bloquea- Kloosterman, M et al, Trends in Biotechnology
dores 6: 251-256 (1988)
Producción de acrilamida utilizando la tecnología CLEC
A continuación se incluye una descripción de un uso del método de la presente invención: la adaptación de la producción de acrilamida a partir de células inmovilizadas que sobre producen la enzima nitrilo hidratasa (Nagasawa, T. y Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)) a la tecnología CLEC descrita anteriormente en la presente invención.
La producción de acrilamida a escala industrial, un producto químico genérico de importancia, ha sido descrita por Yamada y colaboradores (Nagasawa, T. y Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)). Cada año se producen kilotoneladas de acrilamida en reactores químicos cargados con células aprisionadas seleccionadas como sobre-productores de la enzima nitrilo hidratasa. También se informa que la nitrilo hidratasa se purifica y cristaliza a partir de dos fuentes. Brevibacterium R312 (Nagasawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 139: 1305-1312 (1986) y P. chlororaphis B23 (Nagasawa et al., Eur. J. Biochem. 162: 691-698 (1987)). Según se describe en la presente memoria, estas enzimas cristalinas pueden inmovilizarse en cada caso por reticulación con glutaraldehído u otro reactivo de reticulación apropiado para producir un CLEC. Los CLEC de nitrilo hidratasa pueden luego utilizarse en un reactor convencional, en lugar de las células aprisionadas utilizadas en la actualidad. La adaptación de este proceso a la tecnología CLEC se traduce en ventajas inmediatas. Estas ventajas incluyen: menor tamaño de planta y rendimiento mejorado como resultado de la actividad mejorada por volumen unitario implícita en la mayor concentración de enzimas en los CLEC, y velocidades de difusión de producto y sustrato mejoradas; reducción de contaminación y reacciones colaterales no deseadas, como resultado de la mayor pureza de los CLEC; y sensibilidad reducida a la contaminación microbiana en ausencia de células. Asimismo existen otros beneficios únicamente disponibles para un método basado en CLEC. Estos beneficios incluyen: operación a temperatura elevada para mejorar las velocidades de reacción; la capacidad de operar en disolventes acuosos, orgánicos y cuasi- anhidros, con lo cual se hace posible la optimización de la reacción de producción de acrilamida; y semivida mejorada en operación y almacenamiento, como resultado de la mayor estabilidad mecánica y química de los CLEC, en particular en disolventes no convencionales.
Aplicaciones médicas de la tecnología CLEC - tratamiento extracorpóreo
El método de la presente invención y un CLEC o conjunto de CLEC seleccionados apropiadamente pueden utilizarse también para aplicaciones médicas. Se puede utilizar un CLEC o conjunto de CLEC para, por ejemplo, separar un componente de un fluido, tal como sangre, por lo general alterando el componente y, por ende, convirtiéndolo en una sustancia no deletérea para un individuo o que puede separarse mediante los procesos normales del cuerpo (p. ej. vía detoxificación, o degradación en el hígado, excreción vía renal). En esta solicitud, se pone en contacto un CLEC o conjunto de CLEC seleccionado apropiadamente con fluido corporal, el cual contiene el componente que ha de ser alterado, o un reactivo (producto o sustrato) de una reacción en la cual participa el componente, tras lo cual actúa la enzima en el CLEC. Como resultado, la enzima puede actuar sobre el componente que ha de ser alterado o con otra sustancia que es un producto de una reacción en la cual participa el componente que ha de ser alterado. La actividad de la enzima provoca la alteración directa del componente que ha de ser separado o la alteración del producto de la reacción en la cual participa el componente (con lo cual es imposible continuar la reacción). Esto último puede llevarse a cabo a través del uso de un dispositivo extracorpóreo que incluye un CLEC o conjunto de CLEC apropiadamente seleccionado y medios de retención hechos de un material como un material poroso sobre el cual se retenga el CLEC o un tubo en el que esté presente un CLEC, que permite el contacto entre el componente mismo o la sustancia en el fluido que resulta de una reacción en la cual participa el componente que ha de ser alterado.
Esto último también puede alcanzarse mediante la inserción de un CLEC apropiado dentro de un compartimiento corporal adecuado, tal como el peritoneo o un nódulo linfático, en donde el CLEC tendría acceso a los fluidos corporales. La inserción podría llevarse a cabo mediante cirugía o mediante la inyección de solución acuosa espesa de CLEC. La inyección directa de CLEC en el torrente sanguíneo no sería apropiada por el alto riesgo de embolia que esto conlleva.
El uso de CLEC apropiados en este área podría servir como alternativa a métodos genéticos en terapias de reemplazo de enzimas para corregir una deficiencia natural, tal como, por ejemplo, fenilcetonuria.
La Tabla 3 ilustra algunas de las aplicaciones médicas en las cuales se podrían usar los CLEC. Para la mayoría de estos casos, el tratamiento extracorpóreo se encuentra aún en la fase de investigación, pero los beneficios que ofrecen los CLEC podrían proporcionar tratamientos nuevos en áreas en las cuales no existía tratamiento alternativo previo.
TABLA 3
Enzima utilizada Separación de: Enfermedades/ Referencias
pacientes tratados
\bullet Asparaginasa \bullet Asparagina \bullet Leucemia Klein, M., Langer, R., Trends in Biotechnology 4:
(separación de un 179-185 (1986) y referencias incluidas
asparagina, en el mismo.
importante Chang, T.M.S., Methods in Enzymology 137:
nutriente del cáncer, 444-457 (1987) y referencias en el mismo
daña células
leucémicas que no
pueden fabricar el
aminoácido esencial:
asparagina; las
células normales
pueden fabricar
asparagina y, por
ende, no son
afectadas por este
tratamiento).
\bullet Heparinasa \bullet Heparina \bullet Desheparinización Langer, R., et al., Science 217:
para pacientes de 261-263 (1982)
hemoperfusión, p.
ej. diálisis renal
\bullet Oxidasa \bullet Bilirrubina \bullet Ictericia neonatal Levin, A., et al., Science 230:
bilirrubina 543-545 (1985)
\bullet Carboxipep- \bullet Metotrexato \bullet Pacientes de Pitt,A.M., et al., Appl.Biochem.Biotechnol. 8:
tidasa quimioterapia 55-68 (1983)
\bullet Tirosinasa \bullet Aminoácidos \bullet Insuficiencia Chang, T.M.S., Sem.Liver Dis.Ser. 6: 148 (1986)
aromáticos hepática que
presente
elevaciones
patológicas de
aminoácidos
\bullet Fenilalanina \bullet Fenilalanina \bullet Fenilcetonuria e Ambrus, C.M., et al., J. Pharm. Exp. Ther. 224:
amonio liasa insuficiencia 598-602 (1983)
hepática
\bullet Sistema multi- \bullet Urea \bullet Destoxificación Chang, T.M.S., Methods in Enzymology 137:
enzimático que (convertida en para pacientes con 444-457(1987) referencias incluidas en el mismo.
incluye: ureasa, aminoácido insuficiencia renal Chang, T.M.S., Enzyme Eng 5: 225 (1980)
glutamato glutámico y crónica
deshidrogenasa, en otros
glucosa, aminoácidos,
deshidrogenasa vía amoníaco)
y transaminasa
\bullet Arginasa \bullet Arginina \bullet Hiperargininemia Kanalas, J.J., et al., Biochem. Med. 27: 46-55
familial (1982)
\bullet Glutamato \bullet Amoníaco \bullet Insuficiencia renal Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984)
deshidrogenasa y
amoníaco
Una aplicación particular del presente método es el sistema de heparina liasa para la desheparinización de la sangre (Bernstein et al., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987)) que se comenta a continuación.
Todos los dispositivos extracorpóreos perfundidos con sangre, tales como diálisis renal, hemofiltración arteriovenosa continua u oxigenadores de membrana extracorpórea, requieren la heparinización del paciente para evitar que la sangre se coagule. No obstante, la heparinización del paciente provoca complicaciones hemorrágicas y continúa siendo una amenaza a la salud humana. Estos problemas aumentan a medida que aumentan los tiempos de perfusión, por ejemplo, con el oxigenador de membrana, y pueden provocar una hemorragia grave. Después de la terapia extracorpórea, la heparina puede separarse de la sangre utilizando un dispositivo de heparinasa en el efluente del dispositivo extracorpóreo que elimina toda la heparina de la sangre que vuelve al paciente y evita, así, los problemas de heparinización actuales.
Las investigaciones publicadas (Langer et al. Science 217: 261-263 (1982); Bernstein et al., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987)) explican en detalle los problemas presentados por enzimas inmovilizadas por medios convencionales utilizadas en dispositivos extracorpóreos. El problema principal es que la inmovilización convencional provoca una baja retención de la actividad enzimática por volumen unitario, con lo cual se requiere un gran volumen de enzima inmovilizada para realizar la heparinización necesaria. Este volumen no resulta práctico para el uso en seres humanos por su gran tamaño. Sin embargo, la alta retención de actividad por volumen unitario en los CLEC debido a la falta de soporte inerte resuelve este problema y ofrece una solución práctica a la desheparinización de seres humanos. La estabilidad mejorada de los CLEC reducirá la disociación de la enzima del cristal reticulado. Esta característica hace que los CLEC sean superiores a las enzimas inmovilizadas por medios convencionales menos estables, porque se reducirán las respuestas inmunitarias que resultan de la pérdida de enzima. La estabilidad de temperatura del CLEC evita la desnaturalización de la enzima debido a las altas temperaturas transitorias durante el almacenamiento; es probable que los CLEC retengan su actividad alta aun cuando se almacenen a temperatura ambiente. Asimismo, los CLEC resultarán más económicos y convenientes de utilizar que sus enzimas homólogas inmovilizadas por medios convencionales debido a sus vidas de almacenamiento y operacionales más prolongadas.
Aplicaciones adicionales de la tecnología CLEC: biosensores
Es posible utilizar un CLEC o conjunto de CLEC como componente de un sensor, referido como biosensor, que sirve para detectar y/o cuantificar un analito de interés en un fluido, tal como fluido corporal (p. ej. sangre, orina), medios de reacción química y de laboratorio, medios orgánicos, agua, medios y bebidas de cultivo. En algunos casos, el fluido en cuestión puede ser gas, como en un analizador electrónico de consumo de alcohol (Barzana, E., Klibanov, A., y Karell, M., NASA Tech Briefs 13: 104 (1989)). En esta Aplicación se pone en contacto un CLEC o un conjunto de CLEC seleccionado apropiadamente con un fluido que ha de ser analizado para el analito de interés. El analito de interés puede medirse directamente (p. ej. nivel de glucosa en sangre) o indirectamente (p. ej. detectando o cuantificando una sustancia que es reaccionante (producto o sustrato) en una reacción en la cual participa el analito de interés). En cualquiera de los casos, el CLEC puede actuar sobre el analito o la sustancia que es un reaccionante en una reacción en la que también participa el analito. La actividad de la enzima provoca un cambio detectable (p. ej. cambio en el pH, generación de luz, calor, cambio en el potencial eléctrico) que se detecta y/o cuantifica a través de medios de detección apropiados (p. ej. electrodo de pH, dispositivo de detección de luz o calor, medios para medir cargas eléctricas) (Janata, J., et al., Anal. Chem. 62: 33R- 44R (1990)). Se puede utilizar cualquier medio útil para detectar el cambio que resulta del método catalizado por enzima. Un biosensor de la presente invención incluye un CLEC o conjunto de CLEC y medios de retención para el CLEC que permite el contacto entre el o los CLEC y el analito de interés o la sustancia en el fluido que es un reactivo en la reacción en la que participa el analito de interés.
La Tabla 4 ilustra algunas de las aplicaciones del biosensor en las cuales se podrían usar los CLEC. En estas aplicaciones se utilizan enzimas inmovilizadas actualmente, pero éstas tienen baja estabilidad, baja densidad enzimática, vidas breves y falta de reproducibilidad. Estos ejemplos pueden adaptarse con facilidad a la tecnología CLEC descrita en esta memoria.
TABLA 4
Enzima utilizada Detección de: Aplicación Referencia
\bullet Glucosa \bullet Glucosa \bullet Diabetes \bullet Daniles, B., Mossbach, K, Methods in
oxidasa Enzymology 137: 4-7 (1987)
\bullet Hall,E ``Biosensors'' Open University Press
(1990)
\bullet Taylor, R., Proceed. Biotechnology Conference
1989; 275-287
\bullet Anthony et al., ``Biosensors, Fundamentals and
Applications'', Oxford University Press (1987)
TABLA 4 (continuación)
Enzima utilizada Detección de: Aplicación Referencia
\bullet Creatinina \bullet Creatinina \bullet Función renal \bullet Tabata, M., et al., Anal.Biochem. 134:
deiminasa 44 (1983)
\bullet Ureasa \bullet Urea \bullet Función renal \bullet Hsuie,G.H., et al., Polym. Mater. Sci. Eng. 57:
825-829 (1987)
\bullet Kobos, et al., Anal.Chem. 60: 1996-1998 (1988)
\bullet Lactasa \bullet Lactato \bullet Aplicaciones \bullet Blaedel, W.J. Jenkins, R.A., Anal. Chem. 48(8):
oxidasa y químicas 1240 (1976)
deshidrogenasa \bullet Sagaguchi, Y., et al., J. Applic. Biochem 3:
32 (1981)
\bullet Glucosa-6- \bullet Glucosa-6- \bullet Diabetes y otras \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
piruvato fosfato, saca- aplicaciones
deshidrogenasa rosa y adenosi- médicas
natrifosfato
(ATP)
\bullet Alcohol- \bullet Etanol y otros \bullet Analizadores \bullet Romette, J.L.et al., Methods in Enzymology 137:
deshidrogenasa, alcoholes: electrónicos de 217-225 (1987)
alcohol-oxidasa ácidos acéticos, consumo de alcohol \bullet Ho,M.H., Methods in Enzymology 137:
fórmicos y aplicaciones 271-288 (1987)
industriales
\bullet\beta-fructosidasa \bullet Sacarosa \bullet Aplicaciones \bullet Romette, J.L.et al., Methods in Enzymology 137:
industriales 217-225 (1987)
\bullet Colesterol- \bullet Colesterol \bullet Análisis de \bullet Satoh,I.Methods in Enzymology 137:
oxidasa colesterol 217-225 (1987)
\bullet Catalasa \bullet Ácido úrico, \bullet Aterosclerosis y \bullet Satoh,I. Methods in Enzymology 137:
colesterol otras aplicaciones 217-225 (1987)
médicas
\bullet Carboxipepti- \bullet Metotrexato \bullet Cáncer \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
dasa
\bullet Anhidrasa \bullet Dióxido de \bullet Aplicaciones \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
carbónica carbono industriales, de
laboratorio y
ambientales
\bullet L-aminoácido \bullet Aminoácidos \bullet Aplicaciones \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
oxidasa médicas e
industriales
\bullet\beta-lactamasa- \bullet Penicilina \bullet Aplicaciones \bullet Anzal et al., Bull.Chem.Soc.Jpn. 60:
penicilinasa médicas 4133-4137 (1988)
\bullet Fosfatasa \bullet Fosfato \bullet Monitoreo de \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
alcalina metabolitos
\bullet Nitrato/nitrilo \bullet Nitratos y \bullet Monitoreo de \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
reductasa nitritos metabolitos y
alimentos
TABLA 4 (continuación)
Enzima utilizada Detección de: Aplicación Referencia
\bullet Arilsulfatasa \bullet Sulfato \bullet Monitoreo de \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
metabolitos
\bullet Succinato \bullet Succinato \bullet Aplicaciones \bullet En la misma bibliografía que glucosa oxidasa
deshidrogenasa industriales
\bullet Luciferasa FMNH_{2} y \bullet Detección de \bullet Wannlund,J.,et al., ``Luminiscent assays:
bacteriana reacciones cantidades molares Perspectives in endocrinology and clinical
acopladas 10^{-18} de FMNH_{2} a chemistry''Eds Serio, M. y Pazzagli, M. 1:
través de la medición 125 (1982)
de fotones \bullet Kurkijarvi et al., Methods in Enzymology 137:
171-181 (1987)
\bullet Luciferasa Adenosina- \bullet Detección de \bullet Kurkijarvi et al., Methods in Enzymology 137:
de luciérnaga trifosfato (ATP) cantidades molares 171-181 (1987)
y reacciones 10^{-12} de ATP a \bullet Murachi et al., Methods in Enzymology 137:
acopladas través de la medición 260-271 (1988)
de emisión de
fotones
En el método de la presente invención, según se lleva a cabo para el análisis de muestras en un biosensor, se prefiere, en particular, que se produzca la mayor señal detectable posible a partir de la menor cantidad posible de sustrato y catalizador. A este respecto, la tecnología CLEC descrita en la presente memoria resulta de especial interés, ya que alcanza la mayor concentración posible de catalizador enzimático en un volumen determinado.
Con frecuencia se realizan esfuerzos considerables para acoplar una reacción enzimática fundamental de interés, ya sea directamente o a través de productos químicos intermedios apropiados, a la generación de luz mediante enzimas como luciferasa (Kurkijarvi et al., Methods in Enzymol. 137: 171-181 (1988)). Esto último se lleva a cabo con el fin de aprovechar la sensibilidad y eficacia sin precedentes de los equipos de detección de fotones, que permiten detectar concentraciones femtomolares de productos de reacción enzimática bajo condiciones apropiadas. Siguiendo este principio, se han diseñado sistemas biosensores utilizando enzimas inmovilizadas por medios convencionales para detectar diversos sustratos de interés clínico u otro interés. Se han acoplado las reacciones de generación de luz para analizar reacciones que detecten sustratos tales como D-glucosa, L-lactato, L-glutamato y etanol, entre otras, en concentraciones extremadamente bajas.
Con respecto a esta aplicación, se ha informado que la enzima luciferasa de Vibrio harveyii es cristalizada (Swanson et al., J. Biol. Chem. 260: 1287-1289 (1985)). Los cristales de esta luciferasa pueden reticularse con glutaraldehído u otro reactivo apropiado para formar un CLEC de luciferasa. Para usos de biosensor y analíticos, un CLEC de luciferasa ofrece una gran cantidad de ventajas en comparación con las enzimas inmovilizadas por medios convencionales. En un CLEC, el volumen entero del CLEC de luciferaza consistiría en una enzima emisora de luz. En un sistema de enzimas inmovilizadas por medios convencionales, sin embargo, como máximo el 95% del volumen total es absorbido por un material portador "inerte", que muy probablemente funciona como absorbente de la luz emitida por la enzima. Asimismo, la estabilidad mejorada de los CLEC debería facilitar el almacenamiento a temperatura ambiente y también permite el uso de nuevas aplicaciones de detección en medios agresivos y temperaturas elevadas.
Aplicaciones adicionales de la tecnología CLEC - reacciones de laboratorio
Los CLEC pueden utilizarse como reactivos de laboratorio en columnas pequeñas o en procesos discontinuos, los cuales pueden servir para llevar a cabo reacciones de laboratorio. Algunas de las categorías amplias de reacciones figuran en la Tabla 5.
TABLA 5
Enzima utilizada Tipo de reacción catalizada Referencia
\bullet Lipasas, \bullet Síntesis estereoselectiva \bullet Zaks,A. y Klibanov,A.M. Proc.Nat.Acad. Sci.USA. 82:
fosfolipasas incluyendo esterificación, 3192-3196 (1985)
transesterificación, \bullet Klibanov,A.M.Acc. Chem. Res. 23: 114-120 (1990)
aminolisis, lactonizaciones, y referencias en el mismo.
policondensaciones, \bullet Wong, C.H., Chemtracts-Organic Chemistry 3:
acilación, oximolisis y 91-111 (1990) y referencias en el mismo.
redisolución de mezclas
racémicas
\bullet Esterasas \bullet Síntesis estereoselectiva \bullet Kobayashi et al., Tetrahedron Letters Vol 25, Nº24:
y redisolución 2557-2560 (1984)
\bullet Schneider et al., Angew.Chem.Int.Ed.Ensl. 23 (Nº1):
64-68 (1984)
\bullet Tirosinasa \bullet Oxidación de fenoles \bullet Kazandjian,R.Z y Klibanov,A.M. J.Am.Chem.Soc.
para producir quinonas 110: 584-589 (1986)
\bullet Proteasas, \bullet Acilación estereoselectiva \bullet Riva et al., J.M.Chem.Soc. 110: 584-589 (1988)
p. ej. subtilisina de carbohidratos
\bullet Oxidasas \bullet Oxidación selectiva \bullet Klibanov,A.M. Acc.Chem. Res. 23: 114-120 (1990)
de hidrocarburos y referencias en el mismo.
\bullet Otras enzimas \bullet Síntesis estereoselectiva \bullet Wong, C.H., Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91-111
que no requieren (1990) y referencias en el mismo.
cofactores:
isomerasas,liasas,
aldolasas, glicosilo,
transferasas,
glicosidasas
\bullet Otras enzimas \bullet Síntesis estereoselectiva \bullet Wong, C.H., Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91-111
que no requieren (1990) y referencias en el mismo.
cofactores
agregados:
flavoenzimas,
enzimas pirodoxal
fosfato,
metaloenzimas
\bullet Enzimas que \bullet Síntesis estereoselectiva \bullet Wong, C.H., Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91-111
requieren (1990) y referencias en el mismo.
cofactores:
quinasas (adeno-
sinatrifosfato-ATP),
oxidoreductasas
(NAD/P), metil
transferasas (SAM),
enzimas que
requieren CoA,
sulfurasas (PAPS) 
\newpage
Schneider et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 (Nº1): 64-68 (1984)) ilustra cómo utilizar enzimas en síntesis orgánicas. Se utilizó esterasa de hígado porcino en la transformación de meso-éster a mono-éster quiral en un tampón fosfato acuoso.
Las ventajas de las reacciones catalizadas por CLEC para uso de laboratorio son triples. En primer lugar, los CLEC retienen actividad alta en entornos agresivos (p. ej. disolventes acuosos, orgánicos, cuasi-anhidros y sus mezclas, y a temperaturas elevadas), típicos en experimentos de síntesis químicas de laboratorio. En segundo lugar, los CLEC presentan alta estabilidad operacional y de almacenamiento, lo cual resulta apropiado para experimentos de laboratorio intermitentes. En tercer lugar, su alta actividad por volumen unitario permitirá alcanzar tiempos de reacción más breves y requerirá volúmenes menores de enzima (por unidad de actividad). Así, las ventajas que ofrecen los CLEC en comparación con las enzimas libres o inmovilizadas proveen a los químicos orgánicos de una herramienta sintética alternativa altamente selectiva.
Un experto ordinario en la técnica puede adaptar el método de esta invención en todos los casos que se describen antes, sin carácter limitativo, para convertir un proceso que utilice un catalizador de enzimas inmovilizadas por medios convencionales en el uso de un CLEC de la enzima apropiada. Los CLEC pueden no sólo reemplazar las enzimas inmovilizadas por medios convencionales, sino también pueden ser usados en transformaciones mediadas por células. A continuación se ilustrará la presente invención con los ejemplos que siguen, que de ninguna manera pretenden ser de carácter limitativo.
Ejemplo 1 Cristalización y reticulación de termolisina para la síntesis del precursor de aspartamo, Z-Asp-Phe-OMe Cristalización
250 mg de termolisina de Bacillus thermoprotecolyticus se adquirieron de Boehringer-Mannheim GmbH y luego se disolvieron en 4 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) al 45% y de acetato de calcio 1,40 M al 55%, 0,50M de cacodilato sódico a pH 6,5. Estas condiciones iniciales son similares a las descritas por Matthews et al. para la producción de cristales de termolisina de calidad difractaria (véase, por ejemplo, Holmes y Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)). La solución de proteína se concentró luego a 1 ml en un micro-concentrador Centricon 10. Se obtuvo una buena producción de microcristales mediante un proceso de cristalinización instantánea, descrito ahora en la presente invención, en el cual se inyectó rápidamente 1 ml de agua o 1,40 M de acetato de calcio y 0,50 M de cacodilato sódico a pH 6,5 dentro de cualquiera de las soluciones de termolisina-DMSO descritas anteriormente. Este proceso da como resultado una lluvia de microcristales hexagonales de dimensiones aproximadamente uniformes (aproximadamente 10^{-1} mm de longitud).
Reticulación de microcristales de termolisina
El protocolo utilizado en este ejemplo específico del método de esta invención es una adaptación del descrito por Nakanishi et al. (Biotechnology 3: 459-464 (1985), en el que la termolisina fue primero adsorbida sobre una perla portadora compuesta por la resina de intercambio iónico Amberlite XAD-7 y posteriormente inmovilizada por reticulación con glutaraldehído (Quiocho y Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833-839 (1964)). En esta ejemplificación, los microcristales de termolisina obtenidos anteriormente fueron centrifugados y granulados y se descartó el sobrenadante. A continuación se agregaron a los microcristales 5 ml de glutaraldehído de calidad técnica al 17,5% en DMSO al 2,5%, 0,05 M de acetato de calcio y 0,025 M de cacodilato sódico a pH 6,5. La mezcla se incubó con agitación leve a 37ºC durante 4 horas. La reacción de reticulación fue detenida mediante lavado repetido de los cristales con porciones alícuotas de 10 ml de agua para separar la solución de glutaraldehído. Los cristales de termolisina reticulados lavados constituyen el CLEC de termolisina utilizado como catalizador a continuación.
Síntesis de Z-Asp-Phe-OMe en una solución acuosa
Se agregaron 5 ml de una suspensión de CLEC de termolisina a un reactor discontinuo de agitación continua incubado a 37ºC. Después de la centrifugación y la decantación del sobrenadante, se agregó una mezcla de reacción acuosa a los CLEC. Esta solución se preparó mezclando 80 mg de Z-L-Asp y 80 mg de L-Phe-OMe-HCl en 1 ml de agua con ácido acético agregado para obtener un pH de 7,0. Se tomaron muestras para ser analizadas por HPLC. La Tabla 6 muestra la altura máxima de la HPLC del pico del sustrato Z-L-Asp después del tiempo de reacción indicado, normalizado a 1 en el tiempo t=0. Dado que el Z-L-Asp es limitante de velocidad en esta reacción, medir su agotamiento equivale a medir la aparición del producto Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Nakanishi et al. Biotechnology 3: 459-464 (1985)). La Tabla 6 también incluye la altura máxima normalizada del sustrato limitante Z-L-Asp que resta, y una estimación del grado de compleción de la reacción. Es evidente que la reacción alcanzó aproximadamente 20% de compleción dentro de los primeros 30 segundos y se estancó en ese punto. Estos resultados coinciden con las observaciones de Nakanishi et al. (Biotechnology 3: 459-464 (1985)) cuando se utiliza termolisina inmovilizada por medios convencionales en una mezcla de reacción acuosa como la que se describe anteriormente, y se atribuyen a la escasa solubilidad del producto Z-L-Asp-L-Phe-OMe en agua.
TABLA 6
Tiempo de reacción (segundos) Altura máxima (normalizada) Porcentaje de compleción
0 1,000
30 0,727 27,3%
60 0,857 14,3%
120 0,940 6,0%
180 0,797 20,3%
Síntesis de Z-Asp-Phe-OMe en una solución cuasi-anhidra
Se agregaron 5 ml de una suspensión de CLEC de termolisina a un reactor discontinuo de agitación continua incubado a 37ºC. Después de la centrifugación y la decantación del sobrenadante, se agregó una mezcla de reacción orgánica cuasianhidra a los CLEC. Esta solución se preparó mezclando 80 mg de Z-L-Asp y 240 mg de L-Phe-OMe en 1 ml de acetato de etilo al 99% y 1% de agua. Se tomaron muestras para ser analizadas por HPLC. La Tabla 7 muestra la altura máxima de la HPLC del pico del sustrato Z-L-Asp después del tiempo de reacción indicado, normalizado a 1 en el tiempo t=0. Dado que el Z-L-Asp es un limitante de la velocidad en esta reacción, medir su disminución equivale a medir la aparición del producto Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Nakanishi et al. Biotechnology 3: 459-464 (1985)). La Tabla Nº 7 también incluye la altura máxima normalizada del sustrato limitante Z-L-Asp que resta, y una estimación del grado de compleción de la reacción. En este caso la reacción alcanzó aproximadamente 70% de compleción dentro de los primeros 30 segundos y se estancó en ese punto. Estos resultados también coinciden con las observaciones de Nakanishi et al. (Biotechnology 3: 459-464 (1985)) con termolisina inmovilizada por medios convencionales en una mezcla de reacción cuasi-anhidra y se atribuyen a la inhibición de la enzima del producto.
TABLA 7
Tiempo de reacción (segundos) Altura máxima (normalizada) Porcentaje de compleción
0 1,000
30 0,323 67,7%
60 0,314 68,6%
120 0,305 69,5%
180 0,272 72,8%
Ejemplo 2 Cristalización, reticulación y liofilización de termolisina y evaluación de las características del producto resultante Cristalización de termolisina
Se disolvió termolisina (Diawa Kasei K.K., Japón) en acetato de calcio 10 Mm (Sigma), pH=10,0 hasta llegar a una concentración de 10% (peso/volumen). El pH de la solución se mantuvo en 10,0 por titulación con NaOH 2 M. Una vez completada la solubilización, la solución de proteína se tituló hasta llegar a pH 8,0 con HCl 2 M. Se agregó acetato de calcio sólido hasta alcanzar 1,2 M. A continuación se agregó dimetilsulfóxido (Sigma) hasta alcanzar 30%. La proteína se concentró hasta llegar a 100 mg/ml mediante ultrafiltración en una celda con agitación Amicon (membrana 10.000 MWCO). La enzima concentrada se repartió en porciones alícuotas y se almacenó a -70ºC. La termolisina se cristalizó mediante la adición de 9 volúmenes de agua desmineralizada a 1 volumen de solución de proteína concentrada
(100 mg/ml). La solución se sometió a agitación vorticial durante un período de tiempo breve y se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente. Los cristales se lavaron con 10 volúmenes de acetato de calcio 10 mM pH 7,0 y se recuperaron mediante centrifugación a baja velocidad (10 minutos a 1.500 x G, centrífuga Beckman GPR).
La adición rápida de agua a una solución de termolisina concentrada (100 mg/ml) induce a la formación de cristales que se hacen visibles con amplificación baja en el espacio de los diez minutos. El tamaño del cristal depende reproduciblemente de la concentración final de proteína. La proporción de tres volmúmenes de agua a un volumen de concentrado de termolisina (100 mg/ml) producirá varillas hexagonales de calidad difractaria de rayos X de 0,5 mm de longitud que corresponden a los cristales descritos anteriormente por Colman et al. (Colman, P.M., Jansonius, J.N. y Matthews, B.W., J. Mol. Biol. 70: 701-724 (1972)), según se confirmó a través de un análisis de difracción. La adición de diez volúmenes de agua a uno de los concentrados de proteína reduce la longitud de los cristales resultantes a 0,5 mm. Estos microcristales son preferibles en aplicaciones de CLEC, ya que tienden a minimizar los problemas de difusión relacionados con el tamaño del cristal (véase, por ejemplo, Quiocho, F.A. y Richards, F.M. Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). Dentro de una tanda dada de proteína, el tamaño del cristal se mantuvo siempre uniforme. (Se utilizaron cristales de 0,05 - 0,10 mm de longitud en este estudio para facilitar el pipetado preciso de las suspensiones cristalinas.) Los barridos del densitómetro SDS-PAGE mostraron una purificación seis veces mayor de la enzima en cristalización, con lo cual se incrementa significativamente la actividad específica de los CLEC. La cristalización provocó una reducción del 20% de la actividad total de la proteína de CLEC en comparación con la termolisina soluble, cuando fue analizada por fraccionamiento subcelular espectrofotométrico del sustrato dipéptido de la furil-acriloil-glicil-L-leucina-amida (FAGLA), según se describe a continuación.
Reticulación de cristales de termolisina
Los cristales de termolisina se reticularon durante 3 horas a temperatura ambiente en una solución de glutaraldehído al 12,5% (Sigma), DMSO al 5% y Tris 50 mM pH 6,5. Los cristales reticulados se lavaron 3 veces en agua desmineralizada y se recuperaron por centrifugación a baja velocidad, según se describe con respecto a la cristalización de termolisina. La reticulación química de cristales de enzimas estabiliza la red cristalina y las moléculas enzimáticas constitutivas en el cristal de manera suficiente como para permitir el uso práctico de los CLEC en entornos que, de lo contrario, serían incompatibles con la función enzimática. No se encontró diferencia mensurable en la actividad enzimática entre los cristales reticulados y los no reticulados cuando se analizaron (espectrofotométricamente) mediante la vigilancia de la escisión subcelular del sustrato dipéptido FAGLA (descrito a continuación). Por otra parte, la reticulación estabiliza los CLEC hasta el punto que pueden ser liofilizados, reteniendo la actividad enzimática entera al reconstituirse en disolventes acuosos, orgánicos y acuosos/orgánicos mixtos, según se muestra en la Figura 1 y la Tabla 8. Si bien la cristalización provocó una disminución del 30% en la actividad específica de la proteína de CLEC en comparación con la termolisina soluble, la reticulación y liofilización de los CLEC no disminuyó aun más la actividad específica.
TABLA 8
Actividad de la termolisina
Absorbancia 345 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
1 0,0 0,314 0,315
2 1,0 0,272 0,271
3 3,0 0,235 0,218
4 5,0 0,204 0,198
5 10,0 0,184 0,185
6 15,0 0,183 0,184
Actividad enzimática de termolisina soluble y termolisina de CLEC
Se analizó la actividad catalítica de termolisina soluble y termolisina de CLEC (Feder, J. y Schuck, J.M., Biochemistry 9: 2784-2791 (1970)) mediante hidrolisis del sustrato dipéptido bloqueado de la furilacriloil-glicil-L-leucina-amida (FAGLA) (Schweizerhall). La escisión del enlace amida fue medida espectrofotométricamente por una disminución en la absorbancia a 345 nm. La concentración inicial de enzima fue 10^{-7} M por barrido densitométrico y determinación de proteína mediante el método de Bradford (Pharmacia LKB UltroScan XL) de geles SDSS-PAGE teñidos con Coomassie. La enzima de CLEC se define como cristales de termolisina reticulados liofilizados reconstituidos. La enzima soluble se define como termolisina concentrada a 100 mg/ml. Se agregó enzima a un volumen de reacción de 5 ml que contenía sustrato. Se separaron las porciones alícuotas de la mezcla de reacción en los tiempos indicados y se midió la absorbancia a 345 nm. La termolisina de CLEC fue separada de la mezcla de reacción mediante centrifugación breve (Beckman, microcentrífuga E) antes de tomar lectura de la absorbancia. La absorbancia se ajustó a una ecuación de velocidad de pseudo primer grado y se calculó la kcat/km dividiendo el valor ajustado por la concentración de enzima (Multifit 2.0 Ajuste de curva para el ordenador Apple Macintosh; Day Computing P.O. Box 327, Milton, Cambridge CB4 6WL, U.K. (1990)).
Dependencia de pH y estabilidad
Se compararon el pH óptimo y la estabilidad de la enzima con los de los CLEC de termolisina mediante escisión del sustrato dipéptido FAGLA. Los resultados se muestran en la Figura 2 y la Tabla 9. Las formas de la enzima tanto soluble como cristalina presentan una actividad máxima a pH 7. La termolisina de CLEC y la soluble también presentaron una actividad similar en el intervalo ácido, y el perfil de pH de forma acampanada generado por la enzima soluble coincidió con los datos publicados (Feder, J. y Schuck, J.M., Biochemistry 9: 2784-2791 (1970)). No obstante, en el intervalo de pH alcalino la enzima cristalina mantiene una actividad máxima, a pH 10, mientras que la enzima soluble presenta actividad del 75% a pH 8,5 y sólo del 25% a pH 9. A pH 9,5 la enzima soluble resulta completamente inactiva.
TABLA 9
Curva de pH de termolisina
% de actividad máxima
PH CLEC Enzima soluble
1 5,0 10,250 5,170
2 5,5 9,750 6,070
3 6,0 52,500 39,100
4 6,5 85,000 74,610
5 7,0 97,500 100,000
6 7,5 100,000 98,650
7 8,0 97,500 82,920
8 8,5 95,000 71,910
9 9,0 96,250 24,720
10 9,5 95,000 0,000
11 10,0 90,000 0,000
Estabilidad a temperatura elevada
Es posible alcanzar velocidades de reacción más altas y tiempos de difusión menores para sustratos y productos haciendo funcionar un proceso químico determinado a una temperatura más elevada, en donde por lo general se produce la limitación de la estabilidad de temperatura de sustratos y productos. No obstante, en la catálisis basada en enzimas la pérdida de actividad enzimática normalmente establece el límite práctico de la temperatura a la cual se puede ejecutar un proceso. La estabilidad adicional alcanzada en los CLEC permite la actividad enzimática a temperaturas mucho más elevadas de las toleradas en la enzima soluble.
La estabilidad mejorada a temperaturas más bajas simplifica el almacenamiento de rutina a largo plazo de los catalizadores de CLEC. Por ejemplo, fue necesario almacenar soluciones concentradas (> 50 mg/ml) de termolisina soluble a -80ºC para retener una actividad máxima específica. A temperatura ambiente, la actividad por lo general se perdió en el espacio de un día. En cambio, los CLEC de termolisina rehidratada podrían almacenarse en forma rutinaria durante meses a temperatura ambiente sin que ocurra una pérdida aparente de actividad. Los CLEC de termolisina liofilizados no reconstituidos parecen ser viables en forma indefinida.
Se demostraron la estabilidad térmica y la resistencia a la autolisis en CLEC de termolisina después de incubación a 65ºC durante cinco días consecutivos (Figura 3 y Tabla 10). Los CLEC de termolisina retuvieron la actividad máxima al cabo de cinco días de incubación a temperatura elevada. En cambio, la termolisina soluble perdió el 50% de su actividad inicial sólo al cabo de 2 horas de incubación y mostró actividad insignificante después de 24 horas de incubación a 65ºC.
TABLA 10
Estabilidad térmica de la termolisina a 65ºC % de actividad máxima
Tiempo (días) CLEC Enzima soluble
1 0,000 100,000 100,000
2 0,041 70,000
3 0,083 96,000 50,000
4 0,164 32,000
5 0,246 17,000
6 0,410 97,0 10,000
7 1,000 101,0 2,000
8 2,000 97,0
9 3,000 94,0
10 4,000 96,0
11 5,000 92,0
La actividad de la termolisina soluble y termolisina de CLEC se midió después de incubación a 65ºC. La termolisina soluble se incubó en acetato de calcio 10 mM, Tris 50 mM a pH 7,0 en un baño de agua a 65ºC. El volumen de reacción fue 500 \mul. La concentración de proteína final fue 10 mg/ml. Se separaron porciones alícuotas a las 0, 1, 2, 4, 6, 10 y 18 horas. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE y escisión por FAGLA a temperatura ambiente según se describe anteriormente. Para los CLEC de termolisina, también se incubó una suspensión cristalina de 250 \mul en acetato de calcio 10 mM y Tris 50 mM en un baño de agua a 65ºC. La actividad se analizó a las 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 y 120 horas mediante escisión por FAGLA.
Resistencia a proteolisis exógena
También se llevó a cabo la evaluación de la resistencia del CLEC de termolisina a la acción de una proteasa exógena. El análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida de docecilsulfato de sodio) sugiere que las enzimas comerciales pueden contener un porcentaje sustancial de agentes contaminantes, algunos de los cuales podrían ejercer actividad proteolítica contra las principales especies de enzimas solubles. Teniendo en cuenta el empaquetamiento de moléculas enzimáticas en una red cristalina, se podría asumir que las moléculas enzimáticas interiores de un CLEC estarían protegidas contra la proteolisis. Para comprobar esta posibilidad se incubaron los CLEC de termolisina y una preparación de enzima soluble en presencia de la proteasa estreptococal Pronase®, una proteasa no específica capaz de digerir la mayoría de las proteínas para liberar aminoácidos (Catálogo Calbiochem 1990; LaJolla, CA).
Se incubaron termolisina soluble y termolisina de CLEC en Tris 50 mM a pH 7,5a 40ºC en presencia de la proteasa Pronase® (Calbiochem). La relación Pronase® a termolisina fue 1/40. Para inhibir la autolisis de termolisina y prevenir la destrucción proteolítica de la pronasa por parte de la termolisina, se agregó EDTA a la reacción de enzima soluble hasta alcanzar una concentración final de 100 mM (EDTA inhibe la actividad de la termolisina pero no la de la Pronase®. En los tiempos indicados se separaron porciones alícuotas de la mezcla de la reacción y se analizó la actividad espectrofotométricamente a través de la escisión de los sustratos dipéptidos FAGLA. Para contrarrestar la inhibición de la termolisina debido a la presencia de EDTA, el análisis espectrofotométrico de la actividad de la enzima soluble se llevó a cabo en tampón acetato de calcio 0,5 M a pH 7,0 y la concentración de la enzima se duplicó. La enzima cristalina reticulada se analizó según se describe anteriormente.
Según se observa en la Figura 4 y en la Tabla 11, la termolisina soluble se degradó rápidamente y perdió toda la actividad al cabo de 90 minutos de incubación. En cambio, la actividad del CLEC de termolisina no se vio afectada por cuatro días de incubación en presencia de proteasa. Esta cuasi-impermeabilidad a la proteolisis resulta particularmente interesante en aplicaciones de diagnóstico de biosensor en donde se puede buscar un CLEC apropiado para actuar en presencia de un cóctel desconocido de enzimas proteolíticas naturalmente presentes.
TABLA 11
Resistencia a la proteasa
Tiempo (días) % de actividad máxima Tiempo (minutos)
CLEC Enzima soluble
1 0,000 100,0 100,0 0,000
2 0,003 25,0 5,000
3 0,010 17,5 15,000
4 0,021 9,5 30,000
5 0,042 98,0 3,0 60,000
6 0,063 1,0 90,000
7 0,084 101,0 0,0
8 1,000 97,0
9 2,000 99,0
10 3,000 98,0
11 4,000 96,0
Estabilidad en presencia de disolvente orgánico
Para que las enzimas ganen aceptación ideal como catalizadores industriales viables, deben ser capaces de funcionar sin una intervención excesiva en el entorno práctico de los procesos de fabricación. En particular, esto último incluiría el uso de disolventes acuosos y orgánicos polares y no polares y sus mezclas. En las aplicaciones comerciales las mezclas de disolventes acuosos-orgánicos permiten manipular la formación del producto aprovechando las solubilidades relativas de productos y sustratos.
\newpage
La termolisina soluble y los CLEC de termolisina presentaron diferencias acusadas de estabilidad en presencia de disolventes orgánicos. (Tabla 12). Las concentraciones de enzimas solubles que podían ser incubadas en disolvente orgánico fueron limitadas a un máximo de 10 mg/ml. Las concentraciones mayores que este valor dieron como resultado la precipitación instantánea de la termolisina al agregarse disolvente orgánico. En cambio, las concentraciones de CLEC de termolisina fueron limitadas únicamente por el volumen ocupado por los cristales. La termolisina soluble retuvo la mayor actividad (75%) después de la incubación en acetona y la menor (36%) en tetrahidrofurano. Al cabo de una hora de incubación en presencia de acetonitrilo o dioxano, la enzima soluble perdió aproximadamente el 50% de su actividad inicial. La termolisina de CLEC retuvo más del 95% de la actividad máxima después de la incubación con todos los compuestos orgánicos analizados.
TABLA 12
% de actividad máxima
Enzima soluble CLEC
Acetonitrilo 42 102
Dioxano 66 97
Acetona 75 99
THF* 36 96
* Tetrahidrofurano
Estabilidad en disolventes orgánicos
Los CLEC de termolisina o las preparaciones de termolisina soluble se incubaron en soluciones al 50% (volumen/volumen) de los disolventes orgánicos indicados. Se dispusieron 100\mul de una suspensión de CLEC de termolisina (10 mg/ml) en Tris 10 mM a pH 7 en un frasco de vidrio de 0,9 g. Se agregó un volumen igual del disolvente orgánico indicado y la mezcla se sometió a agitación vorticial breve. Se diluyeron 20 \mul de termolisina soluble
(100 mg/ml) en 80 \mul de tampón Tris 0,015 M a pH 7,0 en un frasco de vidrio de 0,9 g. A continuación se añadió a la solución de proteína un volumen de 100 \mul de disolvente orgánico y se sometió a agitación vorticial breve. Se incubaron las enzimas soluble y de CLEC en presencia del disolvente orgánico durante una hora a 40ºC. Después de la incubación se analizó la actividad enzimática mediante escisión del sustrato dipéptido FAGLA según se describió anteriormente.
Se cree que las concentraciones bajas de agua no favorecen el despliegue de estados intermedios en el proceso hacia la desnaturalización de la enzima. En los CLEC esta restricción de movilidad conformacional se ofrece mediante los contactos intermoleculares y las reticulaciones entre las moléculas enzimáticas constitutivas que componen la red cristalina y no mediante la cuasi-ausencia de agua en el medio. Como resultado, las concentraciones intermedias de agua-disolvente orgánico son fácilmente toleradas por las enzimas cuando se formulan como CLEC, lo cual no había sido anteriormente observado con enzimas (véase la Tabla 12). Este descubrimiento introduce áreas completamente nuevas de química de síntesis para ser explotadas utilizando catálisis enzimática.
Sin embargo, incluso en disolventes orgánicos cuasi-anhidros el uso regular de enzimas se ha visto obstaculizado por su tendencia a formar suspensiones mal definidas que presentan coagulación y otros problemas de aglutinación. Esta propiedad hace que estas preparaciones resulten inherentemente poco atractivas para procesos industriales a gran escala. En cambio, los CLEC y las enzimas constitutivas dentro de la red cristalina permanecen monodispersos en todos los disolventes mencionados.
Comparación con otros métodos de inmovilización
Han aparecido varias reseñas útiles en la bibliografía sobre métodos de inmovilización de enzimas (Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984); Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45-50 (1985)). En esta bibliografía, la enzima siempre representa una pequeña fracción del volumen total de la partícula inmovilizada, cuya masa es un material portador inerte. El portador aumenta el recorrido libre medio entre el exterior disolvente de la partícula enzimática inmovilizada y los sitios activos de la enzima, con lo cual se exacerban los problemas de difusión (Quiocho, F.A., y Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)).
En un CLEC, la matriz de un cristal reticulado se soporta a sí misma, con lo cual el portador se vuelve innecesario. Como resultado, la concentración de enzima en un CLEC es cercana al límite teórico de empaquetamiento que puede alcanzarse en moléculas de determinado tamaño, excediéndose en gran medida las densidades alcanzables incluso en soluciones concentradas. El CLEC entero consiste en una enzima activa y, por ende, la reducción relacionada con la difusión de las velocidades de reacción enzimática generalmente observadas con enzimas inmovilizadas por medios convencionales es minimizada en comparación con las enzimas en solución (véase la Figura 1), ya que el recorrido libre medio para sustrato y producto entre la enzima activa y el disolvente libre será mucho más corto para los CLEC (en comparación con las partículas portadoras de enzimas inmovilizadas por medios convencionales). Cabe destacar que la enzima constitutiva en los CLEC es intrínsecamente monodispersa y puede recuperarse mediante manipulaciones simples de las partículas de CLEC, tales como filtración, centrifugación o decantación de disolvente.
Ejemplo 3 Cristalización, reticulado y liofilización de elastasa y evaluación de las características del producto resultante Cristalización de elastasa
Se disolvió elastasa pancreática porcina liofilizada (Serva) en acetato sódico 0,1 M a pH 5,0 con una concentración de 5 mg/ml (peso/volumen) a temperatura ambiente. Se visualizaron cristales de elastasa con forma de varillas dentro del primer minuto de la solvatación completa de la proteína. La solución de cristalización se transfirió a 4ºC y se completó la cristalización durante la noche. Los cristales se recuperaron a través de centrifugación según se describió anteriormente.
Reticulación de cristales de elastasa
Se agregó un volumen de 200 \mul de cristales de elastasa a 1,3 ml de solución de glutaraldehído al 5,77% y acetato sódico 1,5 M a pH 5,0. Los cristales se reticularon durante una hora con agitación leve (placa de agitación). Después de la reticulación los cristales se lavaron con tres volúmenes de 15 ml de Tris 0,2M a pH 8,0. El CLEC de elastasa fue liofilizado según se describe en el Ejemplo 2.
Actividad enzimática de elastasa soluble y elastasa de CLEC
La actividad catalítica de la elastasa soluble y elastasa de CLEC se analizó espectrofotométricamente midiendo la hidrolisis del sustrato succinil-(Ala)_{3}-p-nitroanilida (Bachem) [Bieth, et al. Biochem. Med 11: 350-357 (1974)] (Tabla 13, Figura 5). Se vigiló la escisión aumentando la absorbancia a 410 nm. La concentración inicial del sustrato fue
2 x 10^{-4}. La concentración de la enzima fue 2,8 x 10^{-7}M. Se agregó enzima de CLEC o soluble a un volumen de reacción de 5 ml que contenía sustrato en Tris 0,2 M a pH 8,0. Según se describió anteriormente, la enzima de CLEC se separó de la mezcla de la reacción antes de medir la absorbancia.
TABLA 13
Actividad de la elastasa
Absorbancia 400 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
1 0,0 0,000 0,000
2 0,5 0,103 0,205
3 1,0 0,195 0,390
4 2,0 0,366 0,672
5 3,0 0,523 0,923
6 4,0 0,657 1,098
7 5,0 0,780 1,227
8 6,0 0,888 1,326
9 7,0 0,974 1,393
10 10,0 1,170 1,512
11 15,0 1,365 1,586
Resistencia a proteolisis exógena
También se llevó a cabo la evaluación de la resistencia del CLEC de elastasa a la acción de la proteasa bajo condiciones idénticas a las descritas para la termolisina (Ejemplo 2). La actividad de la enzima soluble y la enzima de CLEC después de la incubación con proteasa fue analizada mediante hidrolisis del sustrato nitroanilida según se describe anteriormente (Tabla 14 y Figura 6).
TABLA 14
Resistencia de la elastasa a la proteolisis
% de actividad máxima
Tiempo CLEC Enzima soluble
1 0,0 100,0 100,0
2 10,0 53,0
3 20,0 32,0
4 30,0 101,0 18,0
5 45,0 11,0
6 60,0 102,0 8,0
7 120,0 101,0 3,0
8 180,0 103,0 2,0
Ejemplo 4 Cristalización, reticulación y liofilización de esterasa y evaluación de las características del producto resultante Cristalización de esterasa
Según se describe en la presente memoria, se disolvieron 30 mg/ml de suspensión de sulfato de amonio de esterasa de hígado porcino (Fluka) en acetato de calcio 0,25 M a pH 5,6 a temperatura ambiente. Los cristales de esterasa se hicieron visibles al cabo de algunos minutos después de la adición de la solución de acetato de calcio. La solución de cristalización se dejó reposar a temperatura ambiente y la cristalización se completó durante la noche. Los cristales se recuperaron mediante centrifugación según se describe en el Ejemplo 2.
Reticulación de cristales de esterasa
Según se describe en la presente memoria, se agregó un volumen de 300 \mul de cristales de esterasa a una solución de 5 ml de glutaraldehído al 12,5% y acetato sódico 0,5 M a pH 5,5. Los cristales se reticularon durante una hora con agitación leve (placa de agitación). Después de la reticulación, los cristales se lavaron con tres volúmenes de 15 ml de acetato de calcio 0,5M a pH 6,3. El CLEC de esterasa fue liofilizado según se describe previamente en el Ejemplo 2.
Actividad enzimática de esterasa soluble y esterasa de CLEC
La actividad catalítica de la esterasa soluble y esterasa de CLEC se analizó espectrofotométricamente vigilando la hidrolisis del sustrato acetato de p-nitrofenilo (Fluka) (Tabla 15, Figura 7). Se vigiló la escisión aumentando la absorbancia a 400 nm. La concentración inicial del sustrato fue 0,001%. La concentración de la enzima fue 1 x 10^{-8}M. Se agregó enzima de CLEC o soluble a un volumen de reacción de 5 ml que contenía sustrato en 0,25M de acetato de calcio a pH 6,3. Según se describió anteriormente en el Ejemplo 2, la enzima de CLEC se separó de la mezcla de reacción mediante centrifugación antes de medir la absorbancia.
TABLA 15
Actividad de la esterasa
Absorbancia 400 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
1 0,0 0,000 0,000
2 0,5 0,770 0,252
3 1,0 0,128 0,297
4 2,0 0,208 0,337
5 3,0 0,260 0,346
6 5,0 0,324 0,353
TABLA 15 (continuación)
Actividad de la esterasa
Absorbancia 400 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
7 7,0 0,353 0,359
8 10,0 0,369 0,368
Resistencia a proteolisis exógena
También se llevó a cabo la evaluación de la resistencia del CLEC de esterasa a la acción de la proteasa bajo condiciones idénticas a las descritas para la termolisina (Ejemplo 2). La actividad de la enzima soluble y de CLEC después de la incubación con proteasa fue analizada mediante hidrolisis del sustrato acetato de p-nitrofenilo según se describe anteriormente (Tabla 15 y Figura 8).
TABLA 16
Resistencia de la esterasa a la proteolisis
% de actividad máxima
Tiempo (minutos) CLEC Enzimas soluble
1 0,0 100,0 100,0
2 10,0 68,0
3 20,0 47,0
4 30,0 99,0 25,0
5 45,0 20,0
6 60,0 97,0 16,0
7 120,0 94,0 10,0
8 180,0 91,0 6,0
Ejemplo 5 Cristalización, reticulación y liofilización de lipasa y evaluación de las características del producto resultante Cristalización de lipasa
Según se describe en la presente memoria, se cristalizó la enzima lipasa (Geotrichum candidum) mediante difusión de vapor a partir de una solución acuosa de 20 mg/ml de proteínas en Tris 50 mM a pH=7 con sulfato de amonio al 8%. Se hicieron visibles cristales bipiramidales al cabo de 20 a 30 días de incubación a temperatura ambiente. Los cristales se recuperaron mediante centrifugación según se describe anteriormente en el Ejemplo 2.
Reticulación de cristales de lipasa
Según se describe en la presente memoria, se agregaron cristales de lipasa a una solución de glutaraldehído al 12,5% y Tris 50 mM a pH 5,6. Los cristales se reticularon durante una hora. Después de la reticulación, los cristales se lavaron con tres volúmenes de 15 ml de Tris 50 mM a pH 7,0. El CLEC de lipasa fue liofilizado según se describe previamente en el Ejemplo 2.
Actividad enzimática de lipasa soluble y lipasa de CLEC
La actividad catalítica de la lipasa soluble y lipasa de CLEC se analizó espectrofotométricamente vigilando la hidrolisis del sustrato acetato de p-nitrofenilo (Tabla 17, Figura 9). Se vigiló la escisión aumentando la absorbancia a 400 nm. La concentración inicial del sustrato fue 0,005%. La concentración de la enzima fue 1,5 x 10^{-8} M. Se agregó enzima de CLEC o soluble a un volumen de reacción de 5 ml que contenía sustrato en Tris 0,2 M a pH 7,0 a temperatura ambiente. Según se describió anteriormente en el Ejemplo 2, la enzima de CLEC se separó de la mezcla de la reacción mediante centrifugación antes de medir la absorbancia.
TABLA 17
Actividad de la lipasa
Absorbancia 400 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
1 0,0 0,000 0,000
2 1,0 0,013 0,021
3 5,0 0,094 0,116
4 10,0 0,164 0,186
5 15,0 0,248 0,258
6 30,0 0,346 0,357
7 45,0 0,407 0,420
8 60,0 0,461 0,459
9 90,0 0,497 0,502
Ejemplo 6 Cristalización, reticulación y liofilización de lisozima y evaluación de las características del producto resultante Cristalización de lisozima
Siguiendo el método de Blake, C.C.F. et al., Nature 196: 1173 (1962), se disolvieron 200 mg de lisozima de clara de huevo de gallina liofilizada (Boehringer Mannheim) en 2,5 ml de tampón acetato sódico 0,04 M a pH 4,7 a temperatura ambiente. Después de la solvatación de la proteína, se agregaron gota a gota y con agitación 2,5 ml de cloruro de sodio al 10% a la solución de lisozima. La solución de cristalización se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente y la cristalización se completó en cuarenta y ocho horas. Los cristales se recuperaron mediante centrifugación según se describe anteriormente en el Ejemplo 2.
Reticulación de cristales de lisozima
Según se describe en la presente memoria, se agregó un volumen de 500 \mul de cristales de lisozima a 10 ml de glutaraldehído al 24% y Tris 50 mM a pH 5,6 con cloruro de sodio al 20%. Los cristales se reticularon durante 20 minutos con agitación leve (placa de agitación). Después de la reticulación, los cristales se lavaron con tres volúmenes de 50 ml de acetato de calcio 20 mM y cloruro de potasio 50 mM a pH 5,3. El CLEC de lisozima fue liofilizado según se describe previamente en el Ejemplo 2.
Actividad enzimática de lisozima soluble y lisozima de CLEC
La actividad catalítica de la lisozima soluble y lisozima de CLEC se analizó midiendo la velocidad de hidrolisis del sustrato 4-metilumbeliferil-N-acetil-quitriosida (Fluka) (Yang, Y. y Hamaguchi, K. J. Biochem. 8: 1003-1014 (1980)) (Tabla 18, Figura 10). Se siguió fluorimétricamente la liberación de 4-metilumbeliferona (Modelo LS-50 de Perkin Elmer). La concentración inicial del sustrato fue 1,42 x 10^{-3}. La concentración de la enzima fue 3 x 10^{-7}M. Se agregó enzima de CLEC o soluble a un volumen de reacción de 2 ml que contenía sustrato en acetato de calcio 20 mM y cloruro de potasio 50 mM a pH 5,3 a 42ºC. La cantidad de 4-metilumbeliferona se determinó fluorimétricamente midiendo las intensidades de fluorescencia a 450 nm con excitación a 360 nm. El ancho de la abertura tanto para la excitación como para la emisión fue de 10 mm. Según se describió anteriormente en el Ejemplo 2, la enzima de CLEC se separó de la mezcla de la reacción mediante centrifugación antes de medir la fluorescencia.
TABLA 18
Actividad de la lisozima
Fluorescencia
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
1 0,000 0,000 0,000
2 10,000 4,400 18,900
3 30,000 10,500 29,400
TABLA 18 (continuación)
Actividad de la lisozima
Fluorescencia
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
4 60,000 27,500 44,800
5 90,000 33,800 51,700
6 120,000 45,900 59,800
Ejemplo 7 Cristalización, reticulación y liofilización de asparaginasa y evaluación de las características del producto resultante Cristalización de asparaginasa
Como una modificación al procedimiento descrito por Grabner et al. [Patente de los Estados Unidos 3.664.926 (1972)], se disolvieron 25 ml de asparaginasa liofilizada (Worthington) en 500 \mul de tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 7,2. La solución se enfrió a 4ºC y el pH fue ajustado en 5,0 con ácido acético 1 M. A continuación se agregó gota a gota etanol frío (-20ºC) a la solución de asparaginasa hasta alcanzar una concentración final de 33%. La solución se incubó a 4ºC. La cristalización se completó en cuarenta y ocho horas. Los cristales se recuperaron mediante centrifugación según se describe anteriormente.
Reticulación de cristales de asparaginasa
Según se describe en la presente memoria, se reticularon cristales de asparaginasa en una solución de glutaraldehído al 7,5% en tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 5,6. Después de la reticulación, los cristales se lavaron con cinco volúmenes de 15 ml de Tris 50 mM a pH 7,0. Los CLEC de asparaginasa fueron liofilizados según se describe en el Ejemplo 2.
Actividad enzimática de asparaginasa soluble y asparaginasa de CLEC
La actividad catalítica de la asparaginasa soluble y asparaginasa de CLEC se analizó espectrofotométricamente midiendo la evolución del ion amonio en la reacción enzimática acoplada descrita a continuación (todos los reactivos se adquirieron de Boehringer Mannheim) (Tabla 19 y Figura 11).
L-asparagina - -asparaginasa- - \rightarrow asparato + NH_{4} + NH_{4} + + NADH + \alpha cetoglutarato - -glutamato-deshidrogenasa- - \rightarrow ácido glutámico + NAI
La oxidación de NADH se midió disminuyendo la absorbancia a 340 nm. La concentración inicial de NADH fue 1,4 mg/ml. La concentración de asparagina fue 10^{-3}M. La concentración de alfa cetoglutarato fue 10^{-4}M. La concentración de glutamato-deshidrogenasa fue 10^{-7}M. La concentración de asparaginasa fue 2,3 x 10^{-8}M. Según se describió anteriormente en el Ejemplo 2, la enzima de CLEC se separó de la mezcla de la reacción mediante centrifugación antes de medir la absorbancia.
TABLA 19
Actividad de la asparaginasa
Absorbancia 340 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
1 0,0 1,000 1,000
2 1,0 0,867 0,825
3 3,0 0,739 0,684
4 5,0 0,603 0,538
5 10,0 0,502 0,406
6 15,0 0,449 0,338
TABLA 19 (continuación)
Actividad de la asparaginasa
Absorbancia 340 nm
Tiempo (minutos) CLEC Enzima soluble
7 30,0 0,328 0,199
8 45,0 0,211 0,187

Claims (24)

1. Un método para preparar un cristal de enzima reticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado una resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo compuesto por enzimas piroxidal-fosfato, metaloenzimas, enzimas que requieren CoA y sulfurasas (PAPS), que comprende la cristalización de la enzima seguida de la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
2. Un método para preparar un cristal de enzima relticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado una resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo compuesto por termolisina, nitrilasa, aminociclasa e hidantoinasa, que comprende la cristalización de la enzima seguida por la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
3. El método según la reivindicación 2, en el cual dicha enzima es termolisina.
4. Un método para preparar un cristal de enzima reticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado una resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo que se compone de elastasa, aminopeptidasa, asparaginasa, glutaminasa, arginasa, ureasa, fosfatasa alcalina, lipasa, preferentemente fosfolipasa,\beta-lactamasa, ACL hidrolasa, L-ACT hidrolasa, arisulfatasa, glicosidasa, preferentemente \beta-galactosidasa y \beta- fructosidasa, penicilina acilasa, amidasa, preferentemente penicilina amidasa, aminoácido esterasa, 5'-fosfodiesterasa, nucleasa y creatina deiminasa, que comprende la cristalización de la enzima seguida por la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
5. El método según la reivindicación 4, en la cual dicha enzima es elastasa.
6. El método según la reivindicación 4, en la cual dicha enzima es asparaginasa.
7. El método según la reivindicación 4, en la cual dicha enzima es lipasa
8. Un método para preparar un cristal de enzima reticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado una resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo que se compone de aminoácido deshidrogenasa, formato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, glutamato deshidrogenasa, hidroxiesteroide deshidrogenasa, glutamato deshidrogenasa, hidroxiesteroide deshidrogenasa, glucosa-6-piruvato deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa, glucosa deshidrogenasa, catalasa, superóxido dismutasa, peroxidasa, luciferasa, tirosinasa, flavoenzima, nitrato/nitrilo-reductasa, oxido-reductasa (NAD/P), oxidasa y liasa, que comprende la cristalización de la enzima seguida por la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
9. El método según la reivindicación 8, en el cual la oxidasa mencionada es alcohol oxidasa, glucosa oxidasa, bilirrubina oxidasa, lactato oxidasa, colesterol oxidasa o L-amino oxidasa y/o dicha liasa es aldolasa, L-aspartato
4-descarboxilasa, fenilalanina-amonio-liasa, anhidrasa carbónica, nitrilo hidratasa, L-aspartasa, fumarasa o heparinasa.
10. Un método para preparar un cristal de enzima reticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado una resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo que se compone de quinasa (ATP), preferentemente creatina quinasa, transaminasa, glicosil transferasa y metil transferasa (SAM), que comprende la cristalización de la enzima seguida por la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
11. Un método para preparar un cristal de enzima reticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado una resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo que se compone de L-triptófano sintetasa y estrictosidina sintetasa, que comprende la cristalización de la enzima seguida por la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
12. Un método para preparar un cristal de enzima reticulado con un agente de reticulación multifuncional, teniendo dicho cristal de enzima reticulado resistencia a la proteolisis de Pronase® exógena, en el cual dicha enzima es esterasa, que comprende la cristalización de la enzima seguida por la reticulación de la red cristalina con un reactivo multifuncional.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual dicho cristal es un microcristal que tiene una sección transversal de aproximadamente 10^{-1} mm.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 ó 12, dicho cristal de enzima reticulado retiene por lo menos 91% de su actividad inicial después de la incubación durante tres horas en presencia de una concentración de Pronase® que causa la forma no reticulada soluble de la enzima que se cristaliza para formar dicho cristal de enzima que se reticula para retener como máximo el 6% de su actividad inicial bajo las mismas condiciones, en el cual dicha enzima se selecciona de un grupo que se compone de esterasa, elastasa y termolisina.
15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el cual el reticulante es glutaraldehído.
16. Un dispositivo que comprende un cristal de enzima reticulado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y medios de retención para dicho cristal de enzima reticulado, dichos medios de retención se componen de un material que permite el contacto entre dicho cristal de enzima reticulado y un sustrato sobre el cual actúa la enzima, estando presente el sustrato en un fluido.
17. Un biosensor para detectar un analito de interés en un fluido, que comprende:
a)
un cristal de enzima reticulado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el cual la enzima presente actúa sobre el analito de interés o sobre un reaccionante en una reacción en la cual participa el analito de interés; y
b)
medios de retención para dicho cristal de enzima reticulado, consistiendo los medios de retención en un material que permite el contacto entre dicho cristal de enzima reticulado y un fluido, conteniendo dicho fluido (1) el analito sobre el cual actúa la enzima o bien (2) un reaccionante en una reacción en la cual participa el analito.
18. El biosensor según la reivindicación 17, comprendiendo el biosensor, además, medios de detección.
19. El uso de un biosensor según las reivindicaciones 17 ó 18 para detectar un analito de interés en un fluido, en el cual dicho analito de interés se selecciona del grupo que se compone de glucosa, creatinina, urea, lactato, glucosa-6- fosfato, sacarosa, ATP, etanol, ácido acétido, ácido fórmico, colesterol, ácido úrico, metotrexato, dióxido de carbono, aminoácidos, fosfatos, penicilinas, nitratos, nitritos, sulfatos y succinato.
20. El biosensor según la reivindicación 17, en el cual dicho cristal de enzima reticulado es cristal de luciferasa, en el cual la luciferasa actúa sobre el analito de interés o sobre un producto de una reacción en la cual participa el analito de interés, y dichos medios de retención se componen de un material que permite el contacto entre dicho cristal de luciferasa reticulado y un fluido, conteniendo dicho fluido (1) el analito sobre el cual actúa la luciferasa o bien (2) el producto de una reacción en la cual participa el analito.
21. Un dispositivo extracorpóreo para uso en alterar un componente de un fluido, que comprende:
a)
un cristal de enzima reticulado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el cual la enzima presente actúa sobre el componente o sobre un reaccionante en una reacción en la cual participa el componente; y
b)
medios de retención para dicho cristal de enzima reticulado, consistiendo dichos medios de retención en un material que permite el contacto entre dicho cristal de enzima reticulado y un fluido, conteniendo dicho fluido (1) el componente sobre el cual actúa la enzima o bien (2) el producto de una reacción en la cual participa el componente.
22. El uso de un dispositivo extracorpóreo según la reivindicación 21 para alterar un componente de un fluido, en el cual dicho componente se selecciona de un grupo que se compone de asparagina, heparina, bilirrubina, metotrexato, aminoácidos, urea y amoníaco.
23. Un dispositivo para uso en producir un producto seleccionado, que comprende una enzima en forma de un cristal de enzima reticulado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y medios de retención para dicho cristal de enzima reticulado.
24. Un método para producir aspartamo, que comprende las etapas de:
a)
combinar dos péptidos y un cristal de termolisina reticulado según la reivindicación 2; teniendo el primer péptido la formula Z-L-Asp y teniendo el segundo péptido la fórmula L-Phe-OMe, bajo condiciones apropiadas para la condensación de los dos péptidos mediante la acción de dicho cristal de termolisina reticulado, con lo cual se produce un dipéptido parcialmente protegido de la fórmula Z-L-Asp-L-Phe-OMe, en la cual Z representa un grupo benciloxicarbonilo y
b)
separar dicho grupo benciloxicarbonilo de dicho dipéptido, produciendo con ello aspartamo.
ES91914256T 1990-08-03 1991-07-30 Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas. Expired - Lifetime ES2199933T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56228090A 1990-08-03 1990-08-03
US562280 1990-08-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2199933T3 true ES2199933T3 (es) 2004-03-01

Family

ID=24245600

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98105856T Expired - Lifetime ES2263187T3 (es) 1990-08-03 1991-07-30 Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas.
ES91914256T Expired - Lifetime ES2199933T3 (es) 1990-08-03 1991-07-30 Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98105856T Expired - Lifetime ES2263187T3 (es) 1990-08-03 1991-07-30 Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas.

Country Status (25)

Country Link
EP (2) EP0550450B1 (es)
JP (2) JPH05508549A (es)
AT (2) ATE240391T1 (es)
AU (1) AU662104B2 (es)
BR (1) BR9106732A (es)
CA (1) CA2087730C (es)
CZ (1) CZ12393A3 (es)
DE (2) DE69133521T2 (es)
DK (2) DK0861888T3 (es)
ES (2) ES2263187T3 (es)
FI (1) FI120099B (es)
HU (2) HUT65904A (es)
IE (1) IE912767A1 (es)
IL (1) IL99046A (es)
LT (1) LT3366B (es)
LV (1) LV10304B (es)
MD (1) MD1592B2 (es)
NO (1) NO930360L (es)
PT (1) PT98564B (es)
RU (1) RU2124052C1 (es)
SG (1) SG70966A1 (es)
SK (1) SK283185B6 (es)
TJ (1) TJ210R3 (es)
UA (1) UA27035C2 (es)
WO (1) WO1992002617A1 (es)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932212A (en) * 1996-05-24 1999-08-03 Altus Biologics, Inc. Crosslinked protein crystal formulations and their use as catalysts in organic solvents
WO1998013119A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Altus Biologics Inc. Crosslinked protein crystals as universal separation media
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
ATE397013T1 (de) 1997-09-05 2008-06-15 Altus Pharmaceuticals Inc Kohlenhydrat-vernetzte glykoproteinkristalle
US6500933B1 (en) 1997-09-05 2002-12-31 Altus Biologics Inc. Methods of preparing carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
US6979561B1 (en) 1998-10-09 2005-12-27 Gilead Sciences, Inc. Non-homogeneous systems for the resolution of enantiomeric mixtures
GB9823334D0 (en) 1998-10-23 1998-12-23 Darwin Discovery Ltd Enzyme coupling
EP1372703A2 (en) * 2001-02-16 2004-01-02 Ibex Technologies Matrix stabilized enzyme crystals and methods of use
US7241272B2 (en) 2001-11-13 2007-07-10 Baxter International Inc. Method and composition for removing uremic toxins in dialysis processes
DK1699921T3 (da) * 2004-01-01 2010-02-01 Council Scient Ind Res Fremgangsmåde til fremstilling af tværbundne proteinkrystaller
DE602005009677D1 (de) 2004-03-22 2008-10-23 Solvay Pharm Gmbh Orale pharmazeutische zusammensetzungen von produkten mit lipase, insbesondere von pankreatin, mit tensiden
ES2352086T3 (es) 2004-10-14 2011-02-15 Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. Composiciones que contienen lipasa, proteasa y amilasa para el tratamiento de la insuficiencia pancreática.
RU2413532C2 (ru) 2005-07-29 2011-03-10 Зольвай Фармасьютиклз Гмбх Способ получения стерилизованного порошкообразного панкреатина
US9198871B2 (en) 2005-08-15 2015-12-01 Abbott Products Gmbh Delayed release pancreatin compositions
US11266607B2 (en) 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US10072256B2 (en) 2006-05-22 2018-09-11 Abbott Products Gmbh Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample
JP5248676B2 (ja) 2009-05-22 2013-07-31 サンヨー食品株式会社 不斉酸化反応を有する蛋白質複合体およびその製造方法
DK2478005T3 (en) * 2009-09-15 2015-02-16 Ajinomoto Althea Inc Protein a crystals and cross bound crystals and methods of use thereof
US9303255B2 (en) 2010-08-26 2016-04-05 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Electrode having enzyme crystals immobilized thereon, method for producing electrode having enzyme crystals immobilized thereon, and biological fuel cell and biosensor provided with electrode having enzyme crystals immobilized thereon
EP3003358B1 (en) * 2013-06-07 2021-03-24 Allena Pharmaceuticals Inc. Compositions and devices for dialysis
WO2016126970A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Abbvie Inc. Pharmaceutical compositions and methods of use thereof to treat pancreatic enzyme insufficiency
US12564623B2 (en) 2017-06-15 2026-03-03 The University Of Chicago Methods and compositions for treating cancer
IL300080A (en) 2020-08-18 2023-03-01 Onchilles Pharma Inc Processed porcine pancreatic elastase proteins
JP7148016B2 (ja) * 2020-10-19 2022-10-05 不二製油株式会社 酵素固定化用担体及びそれを用いた固定化酵素
EP4504961A1 (en) * 2022-04-07 2025-02-12 Need4Health B.V. Method for determining insulin dosage

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3664926A (en) 1970-02-26 1972-05-23 Merck & Co Inc Crystallization of l-asparaginase
DE2801238C2 (de) 1977-01-27 1986-06-05 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern
US4373023A (en) * 1980-10-14 1983-02-08 Massachusetts Institute Of Technology Process for neutralizing heparin
EP0367302A3 (en) * 1982-04-23 1991-06-19 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Process for semi-synthesis of human insulin, water-soluble cross-linked achromobacter protease i for use therein and a process for preparing the same
US4411996A (en) * 1982-06-30 1983-10-25 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
AU3889685A (en) * 1984-01-20 1985-08-09 Eye Products Ltd. Partnership Method for cleaning contact lenses
FR2566798B1 (fr) * 1984-06-27 1986-12-12 Centre Nat Rech Scient Membrane porteuse de la luciferase pour le dosage de l'atp et son procede de production
US4650758A (en) * 1984-09-21 1987-03-17 Cetus Corporation Stabilization of enzymes useful in the production of glucosone and other enzymatic processes
JPS6317691A (ja) * 1986-07-09 1988-01-25 Agency Of Ind Science & Technol アスパルテ−ム製造用固定化酵素
FI85285C (fi) * 1988-05-13 1992-03-25 Stabra Ag Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.
US5010006A (en) * 1988-08-11 1991-04-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The National Research Council Of Canada Lipase immdoilized by cross-linking with inert protein for glyceride synthesis

Also Published As

Publication number Publication date
LV10304A (lv) 1994-10-20
EP0550450A1 (en) 1993-07-14
MD1592B2 (ro) 2001-01-31
IL99046A0 (en) 1992-07-15
SG70966A1 (en) 2000-03-21
CA2087730C (en) 1999-07-20
JP2004000230A (ja) 2004-01-08
LT3366B (en) 1995-07-25
DK0861888T3 (da) 2006-08-14
UA27035C2 (uk) 2000-02-28
HK1012411A1 (en) 1999-07-30
IE912767A1 (en) 1992-02-12
FI930454L (fi) 1993-02-02
FI930454A0 (fi) 1993-02-02
BR9106732A (pt) 1993-08-17
LTIP1077A (en) 1995-04-25
RU2124052C1 (ru) 1998-12-27
AU662104B2 (en) 1995-08-24
DE69133521T2 (de) 2006-12-07
DE69133258T2 (de) 2004-03-18
FI120099B (fi) 2009-06-30
DE69133521D1 (de) 2006-05-24
JPH05508549A (ja) 1993-12-02
PT98564A (pt) 1992-06-30
ATE323158T1 (de) 2006-04-15
WO1992002617A1 (en) 1992-02-20
CZ12393A3 (en) 1993-10-13
IE20040113A1 (en) 2004-05-05
EP0550450B1 (en) 2003-05-14
HU9300275D0 (en) 1993-04-28
AU8315491A (en) 1992-03-02
TJ210R3 (en) 1998-11-14
EP0861888B1 (en) 2006-04-12
HK1023362A1 (en) 2000-09-08
SK283185B6 (sk) 2003-03-04
DE69133258D1 (de) 2003-06-18
CA2087730A1 (en) 1992-02-04
DK0550450T3 (da) 2003-09-08
EP0861888A1 (en) 1998-09-02
HUT65904A (en) 1994-07-28
HU211521A9 (en) 1995-11-28
ES2263187T3 (es) 2006-12-01
LV10304B (en) 1995-06-20
NO930360D0 (no) 1993-02-02
ATE240391T1 (de) 2003-05-15
PT98564B (pt) 1999-01-29
NO930360L (no) 1993-04-02
IL99046A (en) 1998-09-24
SK5993A3 (en) 1993-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2199933T3 (es) Uso de cristales reticulados como una nueva forma de inmovilizacion de enzimas.
US5849296A (en) Crosslinked protein crystals
IE83874B1 (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
Louwrier et al. On the issue of interfacial activation of lipase in nonaqueous media
US5801022A (en) Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin
Huang et al. Effect of metal binding and posttranslational lysine carboxylation on the activity of recombinant hydantoinase
Guilbault Immobilized enzymes as analytical reagents
NZ264042A (en) Crosslinked crystalline immobilized protein, biosensor containing the crosslinked protein crystal
HK1012411B (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
HK1023362B (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
IE85134B1 (en) Use of Crosslinked Crystals as a Novel Form of Enzyme Immobilization
Fatibello-Filho et al. Enzyme electrode for the determination of aspartate
Fernández-Lorente et al. Engineering of Enzymes via Immobili-zation and Post-Immobilization Techniques: Preparation of Enzyme Derivatives with Improved Stability in Organic Media
Chibber et al. Immobilized human plasmins: preparation and enzymatic properties
Correia et al. The Effect of Organic Solvents and Other Parameters on Trypsin-Catalyzed Hydrolysis of Nα [alpha]-Benzoyl-arginine-p-nitroanilide. A Project-Oriented Biochemical Experiment
LIU ISOLATION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE
Whitesides LARGE-SCALEORGANICSYNTHESIS USING CELL FREE ENZYMES
Sabina A Simplified Method for Determination of Amino Acid Amidases in Tissue Cultures.