SK283185B6 - Zosietené kryštály proteínov, zariadenie ich obsahujúce a ich použitie - Google Patents

Zosietené kryštály proteínov, zariadenie ich obsahujúce a ich použitie Download PDF

Info

Publication number
SK283185B6
SK283185B6 SK59-93A SK5993A SK283185B6 SK 283185 B6 SK283185 B6 SK 283185B6 SK 5993 A SK5993 A SK 5993A SK 283185 B6 SK283185 B6 SK 283185B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
enzyme
protein
crystal
cross
clec
Prior art date
Application number
SK59-93A
Other languages
English (en)
Other versions
SK5993A3 (en
Inventor
Manuel A. Navia
Clair Nancy L. St.
Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals Incorporated
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharmaceuticals Incorporated filed Critical Vertex Pharmaceuticals Incorporated
Publication of SK5993A3 publication Critical patent/SK5993A3/sk
Publication of SK283185B6 publication Critical patent/SK283185B6/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C12Q1/003—Functionalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Piezo-Electric Or Mechanical Vibrators, Or Delay Or Filter Circuits (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Sú opísané zosietené kryštály proteínu, charakterizované takou rezistenciou proti exogénnej proteolýze, že si kryštály proteínu uchovávajú aspoň 91 % svojej pôvodnej aktivity po inkubácii po dobu 3 hodín v prítomnosti PronaseTM v koncentrácii, vyvolávajúcej u rozpustného proteínu stratu aspoň 94 % svojej pôvodnej aktivity, alebo majú od 50 do 90 % katalytickej aktivity rozpustného proteínu, alebo majú polčas aktivity, ktorý je väčší než 100 krát ako u rozpustného proteínu, alebo majú takú stabilitu v zmesnom, objemovo 50 % vodno-organickom rozpúšťadle, že si zosietené kryštály proteínu uchovávajú aspoň 40 % svojej pôvodnej aktivity po inkubácii v uvedenom rozpúšťadle po dobu aspoň 1 hodiny, alebo majú zlepšený profil aktivity pH v porovnaní s rozpustnou nezosietenou formou proteínu, alebo majú väčšiu stabilitu pri teplote od 55 do 65 °C ako rozpustná nezosietená forma proteínu. Tiež sa opisuje zariadenie ich obsahujúce a ich použitie.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka zosietených kryštálov proteínov, zahrnujúcich kryštály enzýmov a zariadenia s ich použitím. Zo širšieho hľadiska sa vynález týka spôsobu imobilizácie enzýmov do zosietených kryštálov, zosietených kryštálov imobilizovaných enzýmov (cross-linked immobilized enzýme crystals, CLEC alebo CLIEC), lyofilizácie CLEC na zlepšenie ich vlastností pri skladovaní a manipulácii a spôsobu výroby produktov reakciou, katalyzovanou Cl ,EC.
Doterajší stav techniky
Enzýmy sa používajú ako priemyselné katalyzátory na ekonomickú výrobu jemných a špeciálnych chemikálii vo veľkom a laboratórnom meradle (Jones, J. B., Tetrahedron 42: 3351 - 3403 (1986)), na výrobu potravín (Zaks a d., Trends in Biotechnology 6: 272-275 (1988)) a ako prostriedky na syntézu organických zlúčenín (Wong, C. - H., Science 244: 1145-1152 (1989); CHEMTRACTS-Org. Chem. 3: 91 - 111 (1990); Klibanov, A. M., Acc. Chem. Res. 23: 114- 120(1990)).
Výroba na báze enzýmov môže významne znížiť znečisťujúcu záťaž životného prostredia, vyplývajúcu z veľkovýroby inak nepoužiteľných chemických medziproduktov, ako preukázala veľkovýroba akrylamidov s použitím enzýmov nitrilhydratázy (Nagasawa, T. a Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153158 (1989)).
Enzýmy sa ďalej používajú v biosenzorových aplikáciách na detekciu rôznych látok, zaujímavých z klinického, priemyselného alebo iného hľadiska (Halí, E., „Biosenzors“, Open Univerzity Press (1990)). V klinickej oblasti je možno enzýmy používať v extrakorporálnej terapii, napríklad v hemodialýze a hemofiltrácii, kde enzýmy selektívne odstraňujú z krvi odpadové a toxické látky (Klein, M. a Langer, R., Trends in Biotechnology 4: 179 - 135 (1986)). Enzýmy sa v týchto oblastiach používajú preto, že účinne pôsobia ako katalyzátory v širokom rozsahu typov reakcií, pri miernych teplotách a so špecifickosťou proti substrátu a stereoselektivitou. Predsa len existujú nevýhody, spojené s použitím rozpustných enzýmových katalyzátorov, ktoré limitujú ich použitie v laboratórnych a priemyselných chemických procesoch (Akiyama a d., CHEMTECH 624 - 634 (1988)).
Enzýmy sú v porovnaní s väčšinou priemyselných a laboratórnych katalyzátorov nákladné a relatívne nestabilné, a to i pri použití vo vodných prostrediach, kde enzýmy bežne fungujú. Početné ekonomicky zaujímavejšie chemické reakcie, vykonávané v bežnej praxi, sú inkompatibilné s vodným prostredím, kde sú napríklad substráty a produkty často nerozpustné alebo nestabilné a kde môže v značnom rozsahu súčasne dochádzať k hydrolýze. Okrem toho odstránenie rozpustného enzýmového katalyzátora z produktu a nezreagovaného substrátu zo suroviny vyžaduje často použitie zložitých a nákladných separačných metód. Navyše je ťažké enzýmy uchovávať spôsobom, ktorý by zachovával ich aktivitu a funkčnú integritu, po komerčne primeraný čas (mesiace až roky), pretože to zvyčajne vyžaduje chladenie (4 až -80 °C až teploty kvapalného dusíka), alebo uchovávanie vo vodných rozpúšťadlách a vhodnej iónovej sile, pH a pod.
Metódy imobilizácie enzýmov v mnohých prípadoch tieto nevýhody odstraňujú. Imobilizácia môže zvýšiť stabilitu enzýmových katalyzátorov a chrániť ich funkčnú integritu v nepriaznivom prostredí rozpúšťadla a v extrémnych teplotách, charakteristických pre priemyselné a laboratórne chemické procesy (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149 - 153 (1985)). Procesy s kontinuálnym prietokom je možno vykonávať napríklad s časticami imobilizovaného enzýmu v kolónach, kde cez tieto častice prúdi rozpustná surovina a prechádza postupne v produkt.
V tomto texte sa pod imobilizáciou enzýmov rozumie insolubilizácia enzýmového katalyzátora naviazaním na makroskopické (lO'mm) častice alebo enkapsulácia alebo agregácia do nich.
V literatúre sa objavilo mnoho užitočných prehľadov metód imobilizácie enzýmov (Maugh, T. H., Science 223: 474 - 476 (1984); Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45 - 50 (1985)). Maugh opisuje päť všeobecných prístupov k imobilizácii enzýmov. Zahrnujú adsorpciu na pevné nosiče (ako iónomeničové výmenné živice); kovalentnú väzbu k nosičom (ako sú iónomeničové živice, porézna keramika alebo sklenené guľôčky); zachytenie v polymémych géloch; enkapsuláciu; zrážanie rozpustných proteínov sieťovaním bifunkčnými činidlami náhodným a nedefinovaným spôsobom. Okrem toho možno imobilizovať celé bunky (zvyčajne neživé a permeabilné), ktoré majú vysokú úroveň požadovanej enzýmovej aktivity (napríklad Nagasawa, T. a Yamada, H., Trends in Biotechnology 7:153 - 158 (1989)).
Každý z týchto imobilizačných postupov má svoje výhody a svoje obmedzenia a žiadny nemožno považovať za optimálny alebo prevažujúci. Vo väčšine z nich enzýmový katalyzátor na konci predstavuje len malý zlomok celkového objemu hmoty, prítomnej v chemickom reaktore. Prevažná časť imobilizovaného prostredia je preto tvorená inertným, ale často nákladným materiálom nosiča, Imobilizačné interakcie molekúl enzýmového katalyzátora medzi sebou navzájom a s materiálom nosiča majú vo všetkých týchto postupoch tendenciu k náhodnosti a nedefinovateľnosti. Napriek tomu, že teda tieto interakcie dodávajú molekulám enzýmového katalyzátora určitú zvýšenú stabilitu, je táto stabilizácia v dôsledku ich relatívnej nešpecifickosti a nepravidelnosti len suboptimálna a nepravidelná. Vo väčšine prípadov zostáva nedostatočne definovaný prístup k aktívnemu miestu enzýmového katalyzátora. Opísané imobilizačné metódy okrem toho neriešia problémy spojené so skladovaním a chladením. Navyše s bežnými imobilizovanými enzýmami všeobecne nie je možno manipulovať, napríklad ich prevádzať do ľubovoľne zvoleného rozpúšťadla, bez ohrozenia štruktúrnej a funkčnej integrity enzýmu. Prakticky preto, s výnimkou väzby k časticiam nosiča sa bežne imobilizované enzýmy silno podobajú rozpustným enzýmom a zdieľajú s nimi náchylnosť na denaturáciu a stratu funkcie v nepriaznivom prostredí. Všeobecne vedú imobilizačné metódy ku zníženiu rýchlosti reakcií katalyzovaných enzýmov oproti reakciám v roztoku. V prevažnej miere je to dôsledok obmedzenia, ktoré má difúzia substrátu dovnútra častice imobilizovaného enzýmu a difúzia produktu von z nej (Quiocho, F. A., a Richards, F. M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)). Potrebná prítomnosť inertného nosiča v časticiach imobilizovaného enzýmu podporuje strednú voľnú dráhu medzi rozpúšťadlom mimo časticu imobilizovaného enzýmu a aktívnym miestom enzýmového katalyzátora, a tak tieto problémy difúzia zhoršuje. V prípade imobilizovaných buniek je problém difúzie zvlášť ťažký, a to aj vtedy, ak je nejakým spôsobom zvýšená permeabilita bunkových stien a membrán pre substrát a produkt. Okrem toho je treba vziať do úvahy množstvo kontaminujúcich enzymatických aktivít, metabolitov a toxínov, nachádzajúcich sa v bunkách, a stabilitu buniek v podmienkach nepriaznivých rozpúšťadiel alebo extrémnych teplôt. Rozšírenie použitia enzýmov ako priemyselných katalyzátorov by pomohla zdokonalená metóda imobilizá cie, ktorá by nemala obmedzenie, vyskytujúce sa v doterajších metódach, najmä pokiaľ by sa preukázala vhodná vo veľkom meradle (Daniels, M, J., Methods in Enzymology 136: 371 -379(1987)).
Podstata vynálezu
Predmetom tohto vynálezu je zosietený kryštál proteínu s multifunkčným zosieťujúcim činidlom, kde zosietený kryštál proteínu je zvolený zo súboru pozostávajúceho zo
a) zosietených kryštálov proteínu, majúcich rezistenciu proti exogénnej protcolýzc, pričom tieto zosietené kryštály proteínu uchovávajú aspoň 91 % svojej pôvodnej aktivity po inkubácii počas 3 hodín v prítomnosti Pronase™ v koncentrácii, vyvolávajúcej pri rozpustnej nezosietenej formy proteínu, ktorá jc kryštalizovaná za vzniku kryštálov tohto proteínu, ktorý je zosieťovaný, za rovnakých podmienok stratu aspoň 94 % svojej pôvodnej aktivity,
b) zosietených kryštálov proteínu, majúcich od 50 do 90 % katalytickej aktivity rozpustnej nezosietenej formy proteínu, ktorá je kryštalizovaná za vzniku týchto kryštálov proteínu, ktoré sú zosieťované,
c) zosietených kryštálov proteínu, majúcich polčas aktivity, ktorý'je väčší než 100-krát ako pri rozpustnej nezosietenej forme proteínu, ktorá je kryštalizovaná na formu takých kryštálov proteínu, ktoré sú zosietené,
d) zosietených kryštálov proteínu, majúcich takú stabilitu v zmesovom, objemovo 50 % vodno-organickom rozpúšťadle, že si zosietené kryštály proteínu uchovávajú aspoň 40 % svojej pôvodnej aktivity po inkubácii v uvedenom rozpúšťadle počas aspoň 1 hodiny,
e) zosietených kryštálov proteínu, majúcich zlepšený profil aktivity pH v porovnaní s rozpustnou nezosietenou formou proteínu, ktorá je kryštalizovaná na formu uvedených kryštálov proteínu, ktoré sú zosietené,
í) zosietených kryštálov proteínu, majúcich väčšiu stabilitu pri teplote od 55 do 65 °C ako rozpustná nezosietená forma proteínu, ktorá je kryštalizovaná za vzniku uvedených kryštálov proteínu, ktoré sú zosietené.
Predmetom tohto vynálezu je tiež zariadenie, ktoré obsahuje zosietený kryštál enzýmu a zachytávacie zariadenie na tento zosietený kryštál enzýmu, pričom zachytávacie zariadenie je tvorené poréznym materiálom alebo trubicou, kde zachytávacie zariadenie umožňuje kontakt medzi zosieteným kryštálom enzýmu a substrátom, na ktorom enzým pôsobí, prítomným v tekutine.
Predmetom tohto vynálezu je ďalej použitie uvedeného zariadenia na detekciu stanovovanej zložky v tekutine a použitie zosieteného kryštálu proteínu na prípravu produktu.
Ďalej sa podrobnejšie opisuje predmet vynálezu, jeho výhodné uskutočnenia a riešenia súvisiace s prítomným vynálezom v širších súvislostiach.
Spôsob imobilizácie enzýmu spočíva vo vytvorení kryštálov enzýmov a prípadne všeobecne v ich zosietení pomocou bifunkčného činidla. Podľa navrhnutého riešenia sa pestujú malé (10'1 mm) kryštály proteínov z vodných roztokov alebo z vodných roztokov, obsahujúcich organické rozpúšťadlá, v ktorých je enzýmový katalyzátor štruktúrne a funkčne stabilný. Vo výhodnom uskutočnení sa potom kryštály sieťujú bifunkčným činidlom, ako je glutaraldehyd. Týmto sieťovaním dochádza v kryštálovej mriežke ku stabilizácii kontaktov medzi jednotlivými molekulami enzýmového katalyzátora, tvoriacimi kryštál. Vplyvom tejto ďalšej stabilizácie môžu zosietené kryštály imobilizovaných enzýmov (CLEC) pôsobiť pri zvýšených teplotách, za extrémnych hodnôt pH a v nepriaznivých podmienkach vodných, organických alebo temer bezvodých prostredí, vrátane ich zmesí. CLEC podľa vynálezu teda môžu pôsobiť v prostrediach, inkompatibilných s funkčnou integritou zodpovedajúcich nekryštalizovaných, nezosieťovaných, natívnych enzýmov alebo bežných imobilizovaných enzýmových katalyzátorov.
Zosietené kryštály imobilizovaných enzýmov (CLEC), získané týmto spôsobom, jc ďalej možné podrobiť lyofilizácii za vzniku lyofilizovaných CLEC, ktoré je možné v tejto lyofilizovanej forme dlhodobo skladovať bez chladenia (pri teplote miestnosti) a ktoré je možné ľahko rekonštituovať vo zvolených vodných, organických alebo zmiešaných vodno-organických rozpúšťadlách bez nebezpečia vzniku amorfných suspenzií a s minimálnym rizikom denaturácie.
Zosietené kryštály imobilizovaných enzýmov (CLEC), vyrobené spôsobom podľa vynálezu, nachádzajú použitie pri laboratórnej a priemyselnej výrobe vybraných látok, ako sú chirálne organické molekuly, peptidy, cukry (uhľohydráty), lipidy alebo ďalšie typy chemických látok. Tieto látky sa v súčasnej dobe vyrábajú obvyklými metódami, ktoré môžu vyžadovať nepriaznivé podmienky (napríklad vodné, organické alebo temer bezvodé rozpúšťadlá, zmiešané vodno-organické rozpúšťadlá alebo zvýšené teploty), ktoré sú inkompatibilné s funkčnou integritou nekryštalizovaného nezosieteného natívneho enzýmového katalyzátora. Do navrhovanej technológie CLEC je možné rovnako zahrnúť ďalšie makromolekuly s katalytickou účinnosťou. Príkladom môžu byť katalytické protilátky (Lerner, R.A., Benkovic, S. J., a Schultz, P. G., Science 252: 659 - 667 (1991)) a katalytické polynukleotidy (Cech, T.R., Celí 64: 667 - 669 (1991); Celander, D.W. aCzech, T.R., Science 251: 401 až 407(1991)).
Spôsob výroby zvoleného produktu zahŕňa reakciu, katalyzovanú zosietenými kryštálmi imobilizovaných enzýmov podľa vynálezu.
Ako príklad realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým termolyzín, metalloproteáza zinku, použitý na syntézu chirálneho prekurzoru dipeptidylového umelého sladidla aspartamu. Enzým termolyzín bol vykryštalizovaný z počiatočného vodného roztoku 45 % dimetylsulfoxidu a 55 % 1,4M acetátu vápenatého a0,05M kakodylátu sodného s pH 6,5. Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom za vzniku CLEC termolyzínu. CLEC termolyzínu potom boli prenesené z vodného kryštalizačného roztoku, v ktorom boli získané, do roztoku etylacetátu obsahujúceho substráty N-(benzyloxykarbonyl)-L-asparágovú kyselinu (Z-L-Asp) a metylester L-fenylalanínu (L-Phe-OMe). CLEC termolyzínu potom boli použité na kalalýze kondenzačnej reakcie oboch substrátov na metylester N-(benzyloxykarbonyl) -L-aspartyl-L-fenylalaninu (Z-L-Asp-L-Phe-OMe), ktorý je dipeptidylovým prekurzorom umelého sladidla aspartamu. Syntetizovaný dipeptidylový prekurzor môže byť zbavený chrániacej benzyloxykarbonylovej skupiny (Z-) L-asparágovej kyseliny akokoľvek známou metódou (pozri napríklad Lindeberg, G., J. Chem. Ed. 64: 1062 až 1064 (1987)) za vzniku aspartamu (L-Asp-L-Phe-OMe).
Ako druhý príklad realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým termolyzín použitý na výrobu CLEC termolyzínu. Aktivita a stabilita CLEC termolyzínu boli porovnané s rozpustným termolyzínom za optimálnych podmienok a za podmienok extrémneho pH a teploty s nasledujúcou inkubáciou v prítomnosti organických rozpúšťadiel a potom inkubáciou v prítomnosti exogénnej proteázy.
Enzým termolyzín bol vykryštalizovaný z roztoku 1,2M acetátu vápenatého a 30 % dimetylsulfoxidu s pH 8,0.
Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom v koncentrácií 12,5 % za vzniku CLEC termolyzínu. CLEC termolyzinu potom boli lyofllizované štandardným postupom (Cooper, T. G., The Tools of Biochemistrv, str. 379 až 380 (John Wiley & Sons, NY (1977)) za vzniku lyofilizovaných CLEC enzýmu termolyzínu. Tieto lyofllizované CLEC potom boli transformované priamo do rôznych zvolených vodných, organických a zmiešaných vodno-organických rozpúšťadiel bez nutnosti procesov výmeny rozpúšťadiel, bez tvorby amorfných suspenzií a s minimálnym rizikom denaturácie. Ako neobmedzujúce príklady takýchto rozpúšťadiel môžeme uviesť acetonitril, dioxán, acetón atetrahydrofurán. Po inkubácii bola spektrofotometricky meraná aktivita štepením dipeptidického substrátu FAGLA (furylakryloyl-glycyl-L-leucín-amid).
Ako tretí príklad realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým elastáza (pankreatický enzým) z ošípaných vykryštalizovaný z vodového roztoku 5,5 mg/ml proteínu v O,1M acetáte sodného s pH 5,0 pri teplote miestnosti (Sawyer, L. a d., J. Mol. Biol. 118: 137 - 208). Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom s koncentráciou 5 % za vzniku CLEC elastázy. CLEC elastázy boli lyofllizované rovnako ako v druhom príklade.
Ako štvrtý príklad realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým esteráza (bravčová pečeň) vykryštalizovaný z vodného roztoku 15 mg/ml proteínu v 0,25M acetáte vápenatom s pH 5,6 pri teplote miestnosti. Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom s koncentráciou 12,5 % za vzniku CLEC esterázy. CLEC esterázy boli lyofllizované rovnako ako v druhom príklade.
V piatom príklade realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým lipáza (Geotrichum candidum) vykryštalizovaný z vodného roztoku 20 mg/ml proteínu v 50 mM Tris s pH 7 pri teplote miestnosti. Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom v koncentrácii 12,5 % za vzniku CLEC lipázy. CLEC lipázy boli lyofllizované rovnako ako v druhom príklade.
V šiestom príklade realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým lyzozým (bielok slepačieho vajca) vykryštalizovaný z vodového roztoku 40 mg/ml proteínu v 40 mM pufre na báze acetátu sodného, obsahujúceho 5 % chloridu sodného s pH 7,4 pri teplote miestnosti (Blake, C. C. F. a d., Náture 196: 1173 (1962)). Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom s koncentráciou 20 % za vzniku CLEC lyzozýmu. CLEC lyzozýmu boli lyofllizované rovnako ako v druhom príklade.
V siedmom príklade realizácie spôsobu podľa vynálezu bol enzým asparagináza (Escherichia coli) vykryštalizovaný z vodového roztoku 25 mg/ml proteínu v 50 mM acetáte sodnom a 33 % etanolu s pH 5,0 pri 4 °C. Kryštalizácia je modifikáciou postupu, opísaného Grabnerom a d. [ patent US 3 664 926] (1972)).Získané kryštály boli zosieťované glutaraldehydom s koncentráciou 7,5 % za vzniku CLEC asparaginázy. CLEC asparaginázy boli lyofllizované rovnako ako v druhom príklade.
Ďalšie enzýmy, ktoré môžeme imobilizovať podobným spôsobom a použiť ich na katalýzu príslušných reakcií, zahrnujú luciferázu a ureázu. I iné enzýmy, napríklad uvedené v tabuľkách 11 až 5, je taktiež možné vykryštalizovať a zosieťovať spôsobom podľa vynálezu na požadovanej CLEC, ktoré potom môžu byť použité na kytalyzovanie reakcií, vedúcich k výrobe zvolených produktov, alebo ku katalyzovaniu reakcií, ktoré sú medzistupňom (t. j. jedným z radu reakcií) vo výrobe zvolených produktov. Je uznávanou skutočnosťou, že sieťovanie pomáha stabilizácii väčšiny kryštálov, ale vo všetkých prípadoch nie je ani nutné, ani žiaduce. Niektoré kryštalické enzýmy si uchovávajú funkčnú a štruktúrnu integritu v nepriaznivom prostredí i bez sieťovania. I keď je zosieťovanie výhodným vyhotovením vynálezu, nie je vždy nutné na získanie kryštálu enzýmu, vhodného pre spôsob podľa vynálezu.
CLEC majú niektoré kľúčové vlastnosti, ktoré prinášajú významné výhody oproti bežným doteraz používaným metódam imobilizácie enzýmov. CLEC nevyžadujú zvláštnu štruktúru inertného nosiča. Neprítomnosť inertného nosiča zlepšuje difúzne charakteristiky substrátu a produktu vnútri CLEC a umožňuje v kryštáli koncentráciu enzýmu, blízkej teoretickej medzi pakingu pre molekuly tejto veľkosti. Veľké koncentrácie enzýmu môžu viesť k významným prevádzkovým úsporám v dôsledku zvýšenej efektívnej aktivity daného objemu katalyzátora, skrátenie kontaktnej doby substrátu s enzýmom a celkovej redukcii veľkosti zariadenia a kapitálových nákladov (Daniels, M. J., Methods in Enzymol. 136: 371 - 379 (1987)). Rovnorodosť v celom objeme kryštálu a zvýšená stabilita enzýmu, vytvárajúceho CLEC, vytvára nové možnosti použitia enzýmovej katalýzy za náročných podmienok, ako sú zvýšené teploty a vodové, organické alebo takmer bezvodé rozpúšťadlá a ich zmesi. Obmedzený prístup rozpúšťadla a pravidelné proteínové prostredie v kryštálovej mriežke by navyše pri CLEC oproti bežným systémom imobilizovaných enzýmov mali viesť k zlepšeniu retencií kovového iónu a kofaktora.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 graficky znázorňuje výsledky stanovenia enzymatickej aktivity rozpustného termolyzínu a CLEC termolyzínu.
Obr. 2 graficky znázorňuje výsledky porovnania závislosti od pH rozpustného termolyzínu a CLEC termolyzínu.
Obr. 3 graficky znázorňuje meranie aktivity rozpustného a kryštalického termolyzínu po inkubácii pri 65 °C.
Obr. 4 graficky znázorňuje výsledky stanovenia odolnosti rozpustného termolyzínu a CLEC termolyzínu proti exogénnej proteolytickej degradácii.
Obr. 5 graficky znázorňuje výsledky stanovenia enzymatickej aktivity rozpustnej elastázy a zodpovedajúcich CLEC elastázy.
Obr. 6 graficky znázorňuje odolnosť rozpustnej elastázy a zodpovedajúcich CLEC elastázy oproti exogénnej proteolytickej degradácii.
Obr. 7 graficky znázorňuje výsledky stanovenia enzymatickej aktivity rozpustnej esterázy a zodpovedajúcich CLEC esterázy.
Obr. 8 graficky znázorňuje odolnosť rozpustnej esterázy a zodpovedajúcich CLEC esterázy oproti exogénnej proteolytickej degradácii.
Obr. 9 graficky znázorňuje výsledky stanovenia enzymatickej aktivity rozpustnej lipázy a zodpovedajúcich CLEC lipázy.
Obr. 10 graficky znázorňuje výsledky stanovenia enzymatickej aktivity rozpustného lyzozýmu a zodpovedajúcich CLEC lyzozýmu.
Obr. 11 graficky znázorňuje výsledky stanovenia enzymatickej aktivity rozpustnej asparaginázy a zodpovedajúcich CLEC asparaginázy.
Jednoduchý všeobecný postup, ktorý zaisťuje stabilitu a funkciu pre daný enzým alebo sústavu enzýmov za podmienok, zaujímavých pre syntetického chemika a veľmi náročných pre enzýmy s použitím doterajších metód, je veľmi žiaduci. Na tento účel môžeme použiť zosieťované kryštály imobilizovaných enzýmov (označovaných CLEC alebo
CLIĽC) podľa vynálezu. Stabilizácia kryštálovej mriežky a stavebného enzýmového katalyzátora v kryštáli zosieťovanou reakciou umožňuje použitie CLEC v prostrediach, zahrnujúcich vodové, organické alebo takmer bezvodé rozpúšťadlá, zmesi týchto rozpúšťadiel, extrémne pH a zvýšené teploty, ktoré sú pri použití doterajších metód inkompatibilné s funkciou enzýmu. Stabilizácia kryštálovej mriežky v CLEC navyše umožňuje lyoftlizáciu CLEC štandardnými metódami. Lyofilizované CLEC môžu byť skladované po komerčne zaujímavý čas (mesiace až roky) bez nutnosti chladenia a uľahčujú rýchle a nekomplikované použitie CLEC pri procesoch v priemyselnom i laboratórnom meradle malým pridávaním zvolených rozpúšťadiel bez nutnosti ich výmeny medzi jednotlivými stupňami procesu. CLEC sú taktiež veľmi odolné proti rozkladu exogénnymi proteázami. Spôsob podľa vynálezu umožňuje použitie univerzálnych enzýmových katalyzátorov v tradičných priemyselných chemických procesoch, rovnako ako v laboratórnej syntéze nových zlúčenín pre výskum.
I keď zosieťovanie prispieva k stabilite kryštalického enzýmu, nie je vo všetkých prípadoch potrebné ani žiaduce. Niektoré kryštalizované enzýmy si uchovávajú íúnkčnú a štruktúrnu integritu v náročných podmienkach i bez zosieťovania. Výhodné vyhotovenie vedenia vynálezu zahrnuje zosieťovanie kryštalického enzýmu a je podrobnejšie opísané ďalej. Je však treba vziať do úvahy, že v niektorých uskutočneniach je možné použiť kryštalizované enzýmy, ktoré neboli nasledovne zosieťované.
Pravidelné interakcie medzi molekulami enzýmu v kryštálovej mriežke CLEC majú za následok dobre definované póry obmedzenej veľkosti, vedúce k enzýmovým molekulám vnútri telesa CLEC. V dôsledku toho do telesa častíc CLEC nepreniknú substráty väčšie ako je dostupná veľkosť pórov.
V dôsledku obmedzenej veľkosti pórov by mnoho enzymatických reakcii, zaujímavých z komerčného a akademického hľadiska a používajúcich substráty väčšie ako je veľkosť pórov CLEC, bolo mimo rozsah tohto vynálezu. Patrí sem väčšina reakcií, používajúcich veľké polyméry, ako sú proteíny, polynukleotidy, polysacharidy a ďalšie organické polyméry, kde počet polymémych podjednotiek zväčšuje polymér tak, že presahuje veľkosť pórov v kryštáli CLEC. V takých prípadoch však ešte môže katalýza prebiehať na povrchu CLEC.
Spôsob imobilizácie zvoleného proteínu, hlavne enzýmu, spočíva vo vykryštalizovaní a zosietení proteínu, pričom sa získa zosietený kryštál imobilizovaného enzýmu (CLEC), ktorý môže byť použitý na katalýzu produkcie zvoleného produktu, ako je peptid, uhľohydrát, lipid alebo chirálna organická molekula. Vynález sa rovnako týka takto získaných CLEC a spôsobu výroby zvoleného produktu pomocou reakcie, katalyzovanej CLEC, alebo stupňa, katalyzovancho CLEC, v slede reakcií. Podľa jedného uskutočnenia bol dipeptidylový prekurzor aspartamu vyrobený kondenzačnou reakciou, katalyzovanou zosieteným imobilizovaným termolyzínom, pripraveným spôsobom podľa vynálezu. Podľa ďalšieho uskutočnenia bol indikátorový substrát FAGLA rozštiepený za vzniku kolorimetrického produktu, ktorého prítomnosť indikuje enzymatickú aktivitu v CLEC termolyzínu. Hydrolýza FAGLA bola použitá ako modelová reakcia na znázornenie odolnosti CLEC termolyzínu v rôznych prostrediach, ktorá by bežne bola inkompatibilná s aktivitou tohto enzýmu.
V ďalších uskutočneniach vynálezu boli enzýmy elastáza, lipáza, asparagináza a lyzozým použité na štiepenie rôznych uvedených látok, ako je p-nitrofenylacetát (esteráza a lipáza), sukcinyl-(ala)3-p-nitroanilid (elastáza, 4-me tyllumbelliferyl-N-acetylchitriosid (lyzozým) a NADH (asparagináza).
Spôsobom podľa vynálezu môže odborník predpis na výrobu určitého požadovaného produktu prispôsobiť použitiu reakcie, katalyzovanej imobilizovaným enzýmom. Príslušný enzým po vykryštalizovaní z vhodného roztoku môžeme zosieťovať glutaraldehydom alebo iným vhodným bifunkčným činidlom v kryštalizačnom roztoku za vzniku CLEC daného enzýmu. Potom môžeme CLEC zvoleného enzýmu lyofilizovať postupom podľa príkladu 2.
Použitie CLEC poskytuje oproti doterajším enzymaticky katalyzovaným postupom niekoľko výhod. Napríklad zosieťovaná kryštálová matrica v CLEC poskytuje sama o sebe nosič. Enzýmový katalyzátor nie je nutné viazať na nákladné nosné guľôčky, sklo, gély alebo fólie ako pri doterajších metódach imobilizácie. V dôsledku toho je koncentrácia enzýmu v CLEC blízka teoretickej medzi pakingu, ktorou je možno dosiahnuť pri molekulách danú veľkosť, a silno prevyšuje hustoty, dosiahnuteľné i v koncentrovaných roztokoch. Celý CLEC je tvorený aktívnym enzýmom (a nie inaktívnym nosičom), a preto by malo byť minimalizované zníženie rýchlosti reakcie enzýmu v súvislosti s difúziou, zvyčajne pozorovanej pri bežne imobilizovaných enzýmov oproti enzýmom v roztoku, pretože stredná voľná dráha pre substrát a produkt medzi aktívnym enzýmom a voľným rozpúšťadlom je pri CLEC značne skrátená (v porovnaní s časticami bežného nosiča imobilizovaného enzýmu). Táto vysoká hustota proteínu je veľmi užitočná v aplikáciách, ako sú biosenzory, analytické a iné aplikácie, vyžadujúce veľké množstvo proteínu v malom objeme. V priemyselných procesoch vedie vysoká účinnosť a kompaktnosť CLEC k značným prevádzkovým úsporám v dôsledku zvýšenia efektívnej aktivity daného objemu katalyzátora, a umožňuje tak zmenšenie veľkosti zariadenia i zníženie kapitálových nákladov (Daniels, M. J., Methods in Enzymol. 136: 371 - 379 (1987)). CLEC sú relatívne monodisperzné a ich makroskopická veľkosť a tvar reflektuje charakteristiku prirodzeného rastu kryštálu jednotlivého katalyzátora. Náhrada doterajších enzýmových médií, imobilizovaných na nosiči, by nemala byť ťažká, pretože obidva systémy sú porovnateľné čo do veľkosti a tvaru a obidva sa podobne izolujú zo suroviny rôznymi jednoduchými metódami, vrátene základných ekonomicky nenáročných operácií, ako je filtrácia, odstreďovanie, dekantácia rozpúšťadla a pod.
Použitie lyofilizovaných CLEC okrem toho umožňuje rutinnú manipuláciu s týmito materiálmi pred použitím a ich skladovanie (uchovávanie za sucha za teploty miestnosti bez chladenia po dlhý čas). Lyofilizované CLEC umožňujú ďalej rutinnú formuláciu priamym prídavkom požadovaných rozpúšťadiel a substrátov bez časové náročných procesov výmeny rozpúšťadiel alebo tvorby amorfných suspenzií. Lyofilizovaná forma CLEC rozširuje všeobecnú použiteľnosť enzýmov ako katalyzátorov na širšie spektrum enzýmov a podmienok ich pôsobenia.
Ďalšou výhodou CLEC je skutočnosť, že zosieťovanie kryštalizovaného enzýmu stabilizuje a spevňuje kryštálovú mriežku a molekuly stavebného enzýmu tak mechanicky, ako chemicky. Preto môže byť CLEC jediným prostriedkom na dosiahnutie významných koncentrácií aktívneho enzýmového katalyzátora v nepriaznivých podmienkach vodových organických a takmer bezvodých rozpúšťadiel alebo vo vodovo-organických zmesiach rozpúšťadiel. Použitie enzýmov ako katalyzátorov v organických syntézach je doposiaľ obmedzené ich tendenciou k denaturácii v prítomnosti nevodových rozpúšťadiel, a najmä v zmesiach vodových a nevodových rozpúšťadiel (Klibanov, A. M.,
Trends in Biochemical Science 14: 141 - 144 (1989)). Pri CLEC je reštrikcia konformačnej mobility, vedúca k stabilite, skôr ako praktickou neprítomnosťou vody v médiu spôsobená intermolekulámymi kontaktmi a priečnymi väzbami medzi molekulami stavebného enzýmu, tvoriacimi kryštálovú mriežku. V dôsledku toho môžu enzýmy, formulované ako CLEC, tolerovať intermediáme koncentrácie vody, čo doteraz nebolo možné (pozri tabuľka 12). V komerčných aplikáciách umožňujú vodovo-organické rozpúšťadlové zmesi ovplyvňovanie tvorby produktu s využitím relatívnych rozpustnosti produktu a substrátov. I vo vodovom prostredí sú enzýmové katalyzátory, či už imobilizované alebo rozpustné, vystavené v chemickom reaktore mechanickým silám, ktoré môžu viesť k denaturácii a skráteniu polovičného času existencie. Chemické priečne väzby v CLEC poskytujú potrebnú mechanickú pevnosť (Quiocho a Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833 až 839 (1964)), vedúcu k dlhšej životnosti enzýmového katalyzátora v reaktore.
Treťou výhodou CLEC je skutočnosť, že v dôsledku svojho kryštalického charakteru môžu byť v celom objeme zosieťovaného kryštálu uniformné. Kryštalické enzýmy podľa vynálezu rastú a sú sieťované vo vodovom prostredí, a preto zostáva usporiadanie molekúl v kryštálovej mriežke uniformné a pravidelné. Táto uniformita je udržovaná intramolekulárnymi kontaktmi a chemickými priečnymi väzbami medzi molekulami enzýmu, tvoriacimi kryštálovú mriežku, i po prenesení do iného vodového, organického alebo takmer bezvodého média alebo do zmiešaného vodovo-alkoholického rozpúšťadla. Vo všetkých týchto rozpúšťadlách si molekuly enzýmov zachovávajú jednotnú vzdialenosť medzi sebou navzájom, a tvoria tak v CLEC dobre definované stabilné póry, ktoré uľahčujú prístup substrátu k enzýmovému katalyzátoru i odstránenie produktu. Uniformita enzymatickej aktivity je rozhodujúca v priemyselných, liečebných a analytických aplikáciách, kde je prvoradá reprodukovateľnosť a konzistentnosť.
Štvrtou výhodou použitia CLEC je predĺžený prevádzkový a skladovací polovičný čas existencie. Je známe, že mriežkové interakcie, i v neprítomnosti zosieťovania, stabilizujú proteíny v dôsledku obmedzenia konformačných stupňov voľnosti, nutných na denaturáciu proteínu. Pri CLEC sú mriežkové interakcie po fixácii chemickými priečnymi väzbami veľmi dôležité na zamedzenie denaturácie, najmä v zmesiach vodových a nevodových rozpúšťadiel (Klibanov, A. M., Trends in Biochemical Sciences 14: 141 - 144 (1989). Enzýmy, ktoré sú v kryštalickom stave počas mesiacov alebo rokov, si bežne uchovávajú vysoké percento katalytickej účinnosti. Zosieťované kryštály imobilizovaných enzýmov, uchovávané v bezvodých rozpúšťadlách, sú mimo toho ďalej chránené proti mikrobiálnej kontaminácii a poškodeniu, ktoré je vážnym problémom pri uchovávaní veľkých množstiev proteínov vo vodovom prostredí, bohatom na živiny. V prípade lyofilizovaných CLEC sa imobilizovaný enzým uchováva v neprítomnosti rozpúšťadla. To, spolu so stabilizáciou, spôsobenou zosieťovaním, umožňuje dlhodobé skladovanie bez chladenia.
Piata výhoda použitia CLEC spočíva vo zvýšenej tepelnej stabilite v dôsledku stabilizácie kryštálovej mriežky zosieťovaním. Pri vykonávaní reakcií počas vyššej teploty ako pri bežných metódach sa zvýši reakčná rýchlosť požadovaných chemických reakcií tak termodynamicky, ako zväčšením rýchlosti difúzie do kryštálovej mriežky CLEC a von z nej. Kombinácia týchto účinkov predstavuje značné zvýšenie efektívnosti reakcie, pretože dochádza k maximalizácii produktivity daného množstva enzýmového katalyzátora, ktorý je všeobecne najnákladnejšou zložkou reakč ného procesu (Daniels, M. J., Methods in Enzymol. 136: 371 až 379 (1987)). Tepelná stabilita CLEC je pozoruhodná, pretože väčšina enzýmových systémov vyžaduje mierne reakčné podmienky. CLEC sú stabilizované rovnako proti denaturácii prechodným zvýšením teploty počas skladovania.
Poslednou výhodou použitia CLEC sú póry pravidelnej veľkosti a tvaru, vytvorené medzi jednotlivými molekulami enzýmu v kryštálovej mriežke. Z toho vyplývajúci obmedzený prístup rozpúšťadla značne zvyšuje charakteristiky retencie kovového iónu alebo kofaktora v porovnaní s bežne imobilizovanými enzýmami a enzýmami v roztoku. Táto vlastnosť CLEC umožňuje použitie ekonomicky výhodnejších kontinuálnych procesov v situáciách (pozri napríklad Oyama a d., Methods in Enzymol. 136: 503 - 516 (1987)), kde by inak enzým bol inaktivovaný únikom kovového iónu alebo kofaktora. Napríklad je známe, že pri syntéze dipeptidylového prekurzora aspartamu Z-L-Asp-L-Phe-OMe, sprostredkovanej termolyzínom, stráca bežne imobilizovaný enzým pri kontinuálnych procesoch v kolóne katalytickú aktivitu sčasti vplyvom úniku iónov vápnika, nevyhnutných pre termolyzínovú aktivitu. V praxi tento únik iónov vápnika vyvolalo používanie menej účinných diskontinuálnych procesov (Nakanishi a d., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985)). K úniku dochádza, ak vznikajú komplexy iónov vápnika so substrátom Z-L-Asp konkurenčne s prirodzenými väzbovými miestami vápnika na povrchu enzýmu, pričom dochádza k úbytku katalytickej aktivity. Vysoká hustota enzýmu a zodpovedajúcim spôsobom obmedzený objem, prístupný pre rozpúšťadlo v medzipriestoroch CLEC, bráni tvorbe konkurenčných komplexov L-Asp-Ca++, zodpovedných za únik kovového iónu.
Príprava CLEC - kryštalizácia enzýmu
Spôsobom podľa vynálezu sa zosieťované kryštály imobilizovaných enzýmov (CLEC) pripravia takto:
Kryštály enzýmu sa získajú kontrolovaným zrážaním proteínu z vodového roztoku alebo z vodového roztoku, obsahujúceho organické rozpúšťadlá. Kontrolované podmienky zahrnujú napríklad rýchlosť odparovania rozpúšťadla, prítomnosť vhodných kosolutov, purfov, pH a teplotu. Súhrnný prehľad rôznych faktorov, ovplyvňujúcich kryštalizáciu proteínov, bol publikovaný McPhersonom (Methods Enzymol. 114: 112 (1985)). Tak McPherson, ako Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51 - 59 (1988)) zostavili obsiahly výpočet všetkých proteínov a nukleových kyselín, ktorých kryštalizácia bola opísaná, a podmienok, ktoré k ich kryštalizácii viedli. Kompendium kryštálov a návodov na kryštalizáciu, rovnako ako depozitár koordinát vyriešených kryštálových štruktúr proteínov a nukleových kyselín, je uvedený v Protein Data Bank (Bemstein a d., J. Mol. Biol.l 12: 535 - 542 (1977)) v Brookhaven National Laboratory. Tieto údaje môžeme ako prvý krok pri tvorbe príslušného CLEC použiť na stanovenie podmienok, potrebných na kryštalizáciu daného proteínu alebo enzýmu, ktorý už bol kryštalizovaný, a ako pomôcku pri formulácii kryštalizačnej stratégie pre proteíny, ktoré ešte kryštalizované neboli. Okrem toho je možno použiť inteligentnej rešerčnej stratégie pokusu a omylu (pozri napríklad Carter C. W. Jr. a Carter C. W., J. Biol. Chem.254: 12219 - 12223 (1979)), ktorá vo väčšine prípadov umožňuje nájsť vhodné kryštalizačné podmienky pre väčšinu proteínov, zahrnujúcich uvedené proteíny, ale neobmedzujúce sa na ne, pokiaľ je pri nich možné zaistiť prijateľný stupeň čistoty. Požadovaný stupeň čistoty sa môže pri rôznych proteínov značne líšiť. Napríklad v prípade lyzozýmu bol enzým kryštalizovaný priamo zo svojho nečisteného zdroja-bielku slepačieho vajca (Gilliland, G. L., J. Crystal Growth 90: 51 - 59 (1988)).
Na použitie ako CLEC v prevedení spôsobu podľa vynálezu sa nevyžadujú jednotlivé veľké kryštály, ktoré sú nutné na analýzu rôntgcnovou difrakciou, môžu byť dokonca nežiaduce vzhľadom na difúzne problémy súvisiacich s veľkosťou kryštálu. Spŕšky mikrokryštálov (t. j. kryštály veľkosti rádovo 10'1 mm/prierez) sú pre CLEC vhodné a sú často pozorované, ale zriedka zaznamenané v literatúre, týkajúcej sa rôntgenovej kryštalografie. Mikrokryštály sú na realizáciu vynálezu veľmi vhodné, lebo môžu minimalizovať problémy s difúziou (pozri napríklad Quiocho, F. A., a Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062 až 4076 (1967)).
Všeobecne sa kryštály získavajú kombináciou príslušného proteínu s vhodným vodovým rozpúšťadlom alebo vodovým rozpúšťadlom, obsahujúcim vhodné zrážadlá, ako sú soli alebo organické látky. Rozpúšťadlo sa s proteínom kombinuje pri teplote, experimentálne stanovenej ako vhodnej na vyvolanie kryštalizácie a na zachovanie stability a aktivity proteínu. Rozpúšťadlo môže prípadne zahrnovať kosoluty, ako sú dvojmocné kationty, kofaktory alebo chaotropy, rovnako ako pufre na kontrolu pH. Potreba kosolutov a ich koncentrácia sa na uľahčenie kryštalizácie stanovuje experimentálne. V priemyselnom meradle mô žeme kontrolované zrážanie, vedúce ku kryštalizácii, najlepšie uskutočňovať jednoduchým zmiešaním proteínu zrážadla, kosolutov a prípadne pufŕov v diskontinuálnom procese. Je možno rovnako použiť alternatívnej laboratórnej metódy kryštalizácie, ako je dialýza alebo difúzia pár. McPherson (Methods Enzymol.114: 112 (1985)) a Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51 - 59 (1988)) uvádzajú v svojich prehľadoch literatúry o kryštalizácii obsiahle výpočty vhodných podmienok. Príležitostne môže inkompatibilita medzi sieťovadlom a kryštalizačným prostredím vyžadovať prenesenie kryštálov do vhodnejšieho rozpúšťadlového systému.
Početné proteíny, ktorých kryštalizačné podmienky už boli opísané v literatúre, majú značný potenciál ako praktické enzýmové katalyzátory v priemyselných a laboratórnych chemických procesoch a formulujú sa priamo ako CLEC spôsobom podľa vynálezu. V tabuľke 1 sú uvedené príklady enzýmov, ktoré už boli kryštalizované. Je potrebné upozorniť, že podmienky, uvedené vo väčšine týchto odkazov, boli optimalizované na účely rastu veľkých kryštálov, vhodných pre difrakčnú metódu, často s veľkým úsilím. V niektorých prípadoch bude teda potrebná určitá úprava podmienok na menšie kryštály, používané pri tvorbe CLEC.
Tabuľka 1
Enzým Makrobiologický alebo biologický zdroj Odkazy
alkohol dehydrogenáza konská pečeň Eklund et al.,J.Mol. Biol.146: 561-587 (1981)
alkohol oxidáza Pichia pastoris Boys et al.,J.Mol. Biol.208: 211-212 (1989) Tykarska et al., J. Proteín Chem.9: 83-86 (1990)
aldoláza králičí sval Eagles et al.,J.Mol. Biol.45: 533-544
(fruktóza-bis-fosfát) (1969) Heidmer et al., Science 171: 677-680 (1971)
teľací sval Goryunov et al., Biofizika 14: 1116-1117 (1969)
ľudský sval Millar et al.,Trans. Roy.Soc.Lond.B293: 209-214 (1981)
Drosophila melano- Brenner et al.,
gaster J.Biol.Chem.257: 11747-11749 (1982)
aldoláza (PKDG) Pseudomonas putida Vandlen et al., J.Biol.Chem.248: 2251-2253 (1973)
alkalická fosfatáza Escherichia coli Sowadski et al., J.Mol.Biol.150: 245-272 (1981)
asparagináza Erwinia carotova Escherichia coli Escherichia coli Proteus vulgaris North et al.,Náture 224: 594-595 (1969) Epp et al.,Eur.J. Biochem.20: 432-437 (1971) Yonei et al.,J.Mol. Biol.110: 179-186 (1977) Tetsuya et al.,J. Biol.Chem.248: 7620-7621 (1972)
karbonát-dehydranáza ľudský erytrocyt (C) ľudský erytrocyt (B) hovädzí erytrocyt Kannan et al.,J.Mol. Biol.12: 740-760 (1965) Kannan et al.,J.Mol. Biol.63: 601-604 (1972) Carlsson et al.J. Mol.Biol.80: 373-375 (1973)
kataláza konský erytrocit Micrococcus luteus Penicillium vitale hovädzia pečeň Glauser et al.,Acta Cryst.21: 175-177 (1966) Márie et al.,J.Mol. Biol.129: 675-676 (1979) Vainshtein et al., Acta Cryst.A37: C29 (1981) Eventoff et.al.,J. Mol.Biol.103: 799-801 (1976)
kreatin kináza hovädzie srdce králičí sval Gilliland et al.,J. Mol.Biol.170: 791-793 (1983) McPherson,J.Mol. Biol.81: 83-86(1973)
glutamináza Actenobacter glutanimasificans Pseudomonas 7Ά Wlodawer et al.,J. Mol.Biol.99: 295-299 (1975) Wlodawer et al.,J. Mol.Biol.112: 515-519 (1977)
glukózooxidáza Aspergillus niger Kalisz et al.,J.Mol. Biol.213: 207-209 (1990)
β-laktamázy Staphylococcus aureus Bacillus cereus Moult et al.,Biochem J.225: 167-176(1985) Sutton et al., Biochem J.248: 181-188 (1987)
laktát dehydrogenáza ošípaná kurča Hackert et al.,J. Mol.Biol.78: 665-673 (1973) Pickles et al.,J. Mol.Biol.9: 598-600 (1964)
žralok čiernobieloškvrnitý Bacillus stearothermophilus Adams et al.,J.Mol. Biol.41: 159-188 (1969) Schar et.al.,J.Mol. Biol.154: 349-353 (1982)
lipáza Geotrichum candidum konský pankreas Mucor meihei ľudský pankreas Hata et al.,J. Biochem.86: 1821-1827 (1979) Lombardo et al.,J. Mol.Biol.205: 259-261 (1989) Brady et al.,Náture 343: 767-770 (1990) Winkler et al.,Náture 343: 771-774 (1990)
luciferáza svätojánska muška Green,A.A.,et al., Biochem.Biophys. Acta.20: 170 (1956)
luciferáza Vibrio harveyi Swanson et al.,J. Biol.Chem.260: 1287- -1289 (1985)
nitril hydratáza Brevibacterium R 312 P.chlorophasis B23 Nagasawa et al. , Biochem.Biophys.Res . Coitimun. 139: 1305-1312 (1986) Nagasawa et al.,Eur. J.Biochem.162: 691-698 (1987)
peroxidáza chren koreň chrenu (typ E4) japonská reďkvička Braithwaite et al., J.Mol.Biol.106: 229-230 (1976) Aibara et al.,J. Biochem.90: 489-496 (1981) Morita.Acta Cryst. A28: S52 (1979)
peroxidáza (chlond.) Caldaromyces fumago Rubín et al.,J.Biol. Chem.257: 7768-7769 (1982)
peroxidáza (cytochrom) Sarchomyces cerevisae Poulos et al.,J. Biol.Chem.253: 3730- -3735 (1978)
peroxidáza(gluthation) hovädzie erytrocyty Ladenstein et al.,J. Mol.Biol.104: 877-882 (1979)
subtilizín Bacillus subtilis (Novo) Bacillus amyloliquefaciens (BPN) Bacillus subtilis (Carlsberg) Drenth et al.,J.Mol. Biol.28: 543-544 (1967) Wright et al.,Náture 221: 235-242 (1969) Petsko et al.,J.Mol. Biol.106: 453-456 (1976)
superoxid dismutas hovädzie špenát Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli Bacillus stearothermophillus Pseudomonas ovalis Richardson et al.,J. Biol.Chem.247: 6368-6369 (1972) Morita et al.,J.Mol. Biol.86: 685-685 (1974) Beem et al.,J.Mol. Biol.105:327-332 (1976) Bridgen et al.,J. Mol.Biol.105: 333-335 (1976) Yamakura et al.,J. Biol.Chem.251: 4792-4793 (1976)
termolyzín Bacillus thermoproteolytieus Matthews et al.,Náture New Biol.238: 37-41 (1972)
ureáza samčí bôb Sumner,J.B.,J.Biol. Chem.69: 435 (1926)
xylóza izomeráza Streptomyces rubiginosus Arthobacter B 3728 Streptomyces olivochromogenes Streptomyces violaceoniger Actinoplanes missouriensis Carrell et al.,J. Biol.Chem.259: 3230-3236 (1984) Akins et al.,Biochym Biophys Acta 874: 375-377 (1986) Farber et al.,Protein Engineering I: 459-466 (1987) Glasfeld et al.,J. Biol.Chem.263: 14612-14613 (1988) Rey et al.,Proteins: Strúc.Func.Genet.4: 165-172 (1988)
Príprava CLEC - sieťovacie reakcie
Po vypestovaní kryštálov na vhodnom médiu ich môžeme zosieťovať. Sieťovaním dôjde k stabilizácií kryštálovej mriežky vytvorením kovalentných väzieb medzi molekulami stavebného enzýmu v kryštáli. To umožňuje prenos do iného reakčného prostredia, ktoré by inak mohlo byť inkompatibilné s existenciou kryštálovej mriežky alebo dokonca s existenciou intaktného nedenaturovaného proteínu. Sieťovanie môžeme vykonať pomocou celého radu bifunkčných činidiel, ale v praxi sa zvyčajne volí jednoduchý a nenákladný glutaraldehyd, (Reprezentačný výpočet ďalších dostupných sieťovadiel môžeme nájsť napríklad v katalógu Pierce Chemical Company na rok 1990.)
Sieťovanie glutaraldehydom vytvára silné kovalentné väzby medzi zvyškami aminokyseliny lyzínu primáme vnútri molekúl enzýmu, tvoriacich kryštál, a medzi nimi v kryštálovej mriežke. Sieťovacie interakcie bránia molekulám stavebného enzýmu v návrate do roztoku, a tak účinne insolubilizujú alebo imobilizujú molekuly enzýmu do mikrokryštalických (ideálne 10“' mm) častíc. Makroskopické imobilizované insolubilizované kryštály je potom možné ľahko oddeliť zo suroviny, obsahujúcej produkt a nezreagovaný substrát, jednoduchými postupmi, ako je filtrácia, dekantácia a ďalšie. Môžu byť rovnako použité v kontinuálnych procesoch v kolónach, plnených CLEC, kde majú zdokonalené charakteristiky retencie kofaktora a kovového iónu.
Spôsobom podľa vynálezu sa získavajú CLEC pre použitie ako enzýmové katalyzátory v existujúcich i nových prostrediach. Lepšia stabilita CLEC, spôsobená sieťovacou reakciou, umožňuje preniesť CLEC do rozpúšťadla (napríklad vo vodových, organických alebo takmer bezvodých rozpúšťadiel alebo ich zmesí), v ktorom by inak boli inkompatibilné, a prevádzať operáciu v chemickom reaktore za zvýšenej teploty' alebo extrémnych hodnôt pH. S makroskopickými časticami katalyzátora CLEC je tiež možné ľahko manipulovať, čo umožňuje ich oddelenie zo suroviny jednoduchými metódami, ako je filtrácia, odstredenie alebo dekantácia rozpúšťadla. Ďalej ich môžeme používať v plnených kolónach pri kontinuálnych procesoch.
Príprava CLEC - lyofilizácie
Suspenzia jedného objemu zosieťovaných kryštálov termolyzínu v desiatich objemoch demineralizovanej vody s pH 7,0 bola Iyofllizovaná cez noc v lyofilizátore VirTis model # 24. Lyofilizované kryštály sa skladovali pri teplote miestnosti alebo pri 4 °C, na čo sa vykonala rekonätitúcia prídavkom desiatich objemov zvoleného rozpúšťadla priamo na kryštály, odobraté zo skladu. Pre pokusy so štiepením FAGLA boli rehydratované kryštály rekonštituované v purfe na báze lOmM acetátu vápenatého s pH 7,0. Rekonštituované lyofilizované CLEC boli odborne skladované pri teplote miestnosti. Naproti tomu rozpustný enzým vyžadoval na uchovanie špecifické aktivity v čase dlhšom ako týž deň skladovania pri -70 °C. Tento postup bol použitý pre všetky enzýmy, opísané v príkladoch.
Syntéza prekurzora aspartamu pomocou CLEC termolyzínu
Spôsob podľa vynálezu, ktorým sa vyrábajú zosieťované kryštály enzýmov, je ďalej opísaný podrobnejšie a je objasnený na príkladoch výroby zosieťovaných kryštálov imobilizovaného enzýmu termolyzínu na použitie pri výrobe dipeptidylového prekurzora aspartamu v etylacetáte, ktorý je takmer bezvodým organickým rozpúšťadlom. Termolyzín, protein, ktorý bol kryštalizovaný a jeho štruktúra bola vyriešená s rozlíšením 1,6 A (Holmes a Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623 - 639 (1982)), je jediným príkladom enzýmu použiteľného spôsobom podľa vynálezu vo forme CLEC. Termolyzín sa používa pri výrobe umelého sladidla aspartamu (Isowwa a p., patent US 4 436 925 (1984), Lindeberg, J. Chem. Ed. 64: 1062 - 1064 (1987); Nakanishi a d., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985); Oyama a d., Methods in Enzymol. 136: 503 - 516 (1987)). V súčasnosti sa zdá, že väčšina aspartamu sa vyrába bežným prístupom syntetickej chémie, i keď použitie konvenčné imobilizovaného termolyzínu v takmer bezvodom prostredí poskytlo povzbudzujúce výsledky (Oyama a d., J. Org. Chem. 46: 5242 - 5244 (1981); Nakanishi a d., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985). Zdokonalenie enzymatického prístupu k výrobe aspartamu, aké napríklad umožňuje spôsob podľa vynálezu, by zvýšilo jeho konkurenčnú schopnosť proti doposiaľ používanej metóde tak čo do jej pohodlnosti, ako nákladov (Oyama a d., Methods in Enzymol. 136: 503 až 516 (1987)).
Hodnotenie CLEC termolyzínu
Spôsob podľa vynálezu bol použitý taktiež k výrobe CLEC termolyzínu, ktoré boli hodnotené z hľadiska závislosti a stability proti pH, stability pri zvýšenej teplote, odolnosti proti exogénnej proteolýze a stability v prítomnosti organického rozpúšťadla. CLEC termolyzínu boli porovnané s rozpustným termolyzínom, opísaným podrobne v príklade 2 a na obr. 1 až 4. Výsledky hodnotenia sú tieto:
1. Pokiaľ ide o závislosť a stabilitu proti pH, majú obidve formy maximálnu aktivitu pri pH 7 a podobnú aktivitu v kyslej oblasti. V oblasti alkalického pH si CLEC udržujú maximálnu aktivitu do pH 10; rozpustný termolyzín má pri pH 8,5 75 % aktivity, pri pH 9 len 25 % aktivity a pri pH 9,5 je celkom inaktívny.
2. Dodatočná stabilizácia, ku ktorej dochádza pri CLEC, spôsobuje enzymatickú aktivitu pri vyšších teplotách ako je to možné pri rozpustnom termolyzíne. Zvýšená stabilizácia CLEC termolyzínu pri nižších teplotách uľahčuje oproti rozpustnému enzýmu jednoduchšie skladovanie. Pri CLEC termolyzínu, ktoré si podržali maximálnu aktivitu po 5 dňoch inkubácie pri 65 °C, sa prejavila rovnako tepelná stabilita a odolnosť oproti autolýze. Oproti tomuto rozpustný termolyzín stratil po 2 h inkubácie 50 % pôvodnej aktivity a po 24 h inkubácie pri 65 °C preukazoval zanedbateľnú aktivitu.
3. Enzymatická aktivita termolyzínových CLEC nebola ovplyvnená štvordennou inkubáciou v prítomnosti silnej streptokokovej proteázy PronaseR. Naproti tomu rozpustný termolyzín bol rýchle degradovaný a stratil všetku aktivitu po 90 min. inkubácie.
4. Termolyzínové CLEC a rozpustný termolyzín preukázali značne odlišnú stabilitu v prítomnosti organických rozpúšťadiel, ako je zrejmé z tabuľky 12. Termolyzínové CLEC si po inkubácii všetkými hodnotenými organickými rozpúšťadlami podržali viac ako 95 % maximálnej aktivity.
Tieto vlastnosti termolyzínových CLEC a CLEC iných enzýmov ich robí zvlášť žiaducimi vzhľadom na ich jednoduchšie skladovanie, väčšiu stabilitu a menšiu schopnosť inaktivácie alebo degradácie ako majú zodpovedajúce rozpustné enzýmy.
Hodnotenie CLEC elastázy
Spôsob podľa vynálezu bol ďalej použitý na výrobu CLEC elastázy, pri ktorých bola hodnotená aktivita a odolnosť proti exogénnej proteolýze. Elastázové CLEC boli porovnávané s rozpustnou elastázou, ako je podrobne opísané v príklade 3 a na obr. 5 a 6. Výsledky hodnotenia demonštrovali tieto skutočnosti:
L Elastázové CLEC si v porovnaní s rozpustným enzýmom uchovávajú približne 50 % aktivitu.
2. Rozpustná elastáza bola rýchlo degradovaná proteázou. Aktivita rozpustnej elastázy sa po 10 min., inkubácie v prítomnosti proteázy znížila na 50 % pôvodnej hodnoty. Po 1 h inkubácie stratil rozpustný enzým viac ako 90 % pôvodnej aktivity. Naproti tomu enzymatická aktivita elastázových CLEC nebola inkubáciou proteázy ovplyvnená.
Hodnotenie CLEC esterázy
Spôsob podľa vynálezu bol ďalej použitý na výrobu CLEC esterázy, pri ktorých bola hodnotená aktivita a odolnosť proti exogénnej proteolýze. Esterázové CLEC boli porovnané s rozpustnou esterázou, ako je podrobne opísané v príklade 4 a na obr. 7 a 8. Výsledky hodnotenia demonštrovali tieto skutočnosti:
1. Esterázové CLEC si v porovnaní s rozpustným enzýmom uchovávajú približne 50 % aktivitu.
2. Rozpustná esteráza bola veľmi náchylná na proteolytickú degradáciu. Po 10 min. inkubácie v prítomnosti proteázy sa aktivita rozpustnej esterázy znížila na 50 % pôvodnej aktivity. Po 1 h inkubácie stratil rozpustný enzým viac ako 90 % pôvodnej aktivity. Naproti tomu enzymatická aktivita esterázových CLEC nebola inkubáciou proteázy ovplyvnená.
Hodnotenie CLEC lipázy
Spôsob podľa vynálezu bol ďalej použitý na výrobu CLEC lipázy, pri ktorých bola hodnotená aktivita. Lipázové CLEC boli porovnané s rozpustnou lipázou, ako je podrobne prevedené v príklade 5 a na obr. 9. Výsledky hodnotenia demonštrovali, že lipázové CLEC si v porovnaní s rozpustným enzýmom uchovávajú približne 90 % aktivitu.
Hodnotenie CLEC lyzozýmu
Spôsob podľa vynálezu bol ďalej použitý na výrobu CLEC lyzozýmu, pri ktorých bola hodnotená aktivita a odolnosť proti exogénnej proteolýze. Lyzozýmové CLEC boli porovnané s rozpustným lyzozýmom, ako je podrobne opísané v príklade 6 a na obr. 10. Výsledky hodnotenia demonštrovali, že lyzozýmové CLEC si v porovnaní s rozpustným enzýmom uchovávajú približne 50 % aktivitu.
Hodnotenie CLEC asparaginázy
Spôsob podľa vynálezu bol ďalej použitý na výrobu CLEC asparaginázy, pri ktorých bola hodnotená aktivita. Asparaginázové CLEC boli porovnané s rozpustnou asparaginázou, ako je podrobne opísané v príklade 7 a na obr. 11. Výsledky hodnotenia demonštrovali, že asparaginázové CLEC si v porovnaní s rozpustným enzýmom uchovávajú približne 77 % aktivitu.
Všeobecná použiteľnosť CLEC
CLEC podľa vynálezu predstavujú novú technológiu so širokým využitím vo viacerých oblastiach, vrátane syntéz v priemyselnom meradle, laboratórnych nástrojov, biosenzorov a aplikácii v medicíne. Príklady rôznych systémov s použitím konvenčné imobilizovaných enzýmov sú uvedené v tabuľkách 2 až 5. Odborník je schopný navrhnúť ich adaptáciu a adaptáciu podobných systémov na technológií
CLEC podľa vynálezu. K bližšiemu objasneniu sú v každej z uvedených kategórií podrobnejšie uvedené konkrétne príklady.
V tabuľke 2 sú uvedené príklady použitia konvenčné imobilizovaných enzýmov v priemyselných procesoch, ktoré možno ľahko prispôsobiť technológií CLEC podľa vynálezu.
Tabuľka 2
Enzým Výroba alebo aplikácia Substráty Odkazy
termolyzín prekurzor-asparta- mu Z-Asp,L-Phe-OMe Oyama et al. , J.Org.Chem.46: 5242-5244 (1981) Nakanishi et al.,Trends in Biotechnology 3: 459-464 (1985)
subtilizín aspartam L-Asp-L-Phe,OMe Davino,A.A.,US Patent 4293648 (1981)
lipáza náhradka kakaového tuku palmové oleje Harwood,J., Trends in Biochemical Sciences 14: 125-126 (1989) Macrae,A.R.,J. Am.Oil Chem. Soc.60:291-294 (1983)
nitril-hydratáza nitrilázy,amidáza akrylamid akrylonitril Nagasawa,T.and Yamada,H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)
aminoacyláza ( z húb) aminoacidesteráza subtilizín amidázy hydantionázy špec.dehydrogenázy aminopeptidáza tranzamináza štiepenie aminokyselín N-acyl-D,L aminokyseliny, estery, D,L aminokyselín amidy D,L aminokys. hydantoíny a-hydroxykarboxylové kys. Schmidt-Kastner,G.& Egerer P.in Biotechnology vol 6a: 387-421 (1984) and references therein. Fusse,M.C., Methods in Enzymologyl36: 463 (1987)
aminoacid dehydrogenáza + formát dehydrogenáza výroba aminokysel. všeobecne výroba aminokysel. keto a hydroxy kys. Fusee,M.C., Methods in Enzymologyl36: 463 (1987)
L-aspartáza L-aspartate 4 -dekarboxyláza aspartáza+L-as- partát-4 dekarboxyláza ACL-hydroláza L-ACT hydroláza L-asparágová kys. L-alanín L-lyzín L-cystein L-izoleucín L-metionín fumarát (fumarová kys.) L-asparágová kyselina amonium fumarát D,L a amino ekaprolaktam(ACL) DL-2amino2tiazo1in-4karboxylová kys. Rozzell,J.D., Methods in Enzymologyl36: 479 (1987) Enzymes in Industry, Ed Gerhartz.W.,VCH Press 1990
lyáza L-tryptofán syntetáza L-fenylalanín L-tryptofán L-valín cinnamát indol,L-serín
fumaráza hydantoináza L-jablčná kys. D n carbamoyl p-hydroxy-fenyl glycín fumarát 5p-hydroxyhydantoín
lipázy, esterázy štiepenie racemátov steroselektivnou syntézou synt.chémia Jones,J.B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1988) Butt,S.and Roberts,S.M.,Natural Product Reports 489-503 (1986),and references cited therein for a more comprehensive review of this area
fumaráza 1-jablčná kyselina fumarová kysel. Chibata et al. Methods in Enzymologyl36; 455 (1987)
laktáza, β-galaktozidáza syntéza disacharidu gala tosyl-N-acetyl gala tozamin laktóza & N-acetyl galaktózaamín Larsson et al., Methods in Enzymologyl36: 230 (1987)
lipáza,esteráza L-mentol zmes 4 izomérov Fukui,S.,Tanaka,A.,Methods in Enzymology 136:293 (1987)
amidázy D-valin (medziprodukt pyretroid insekticíd fluvinát) amid D,Laminokyseliny Schmidt-Kastner,G.& Egerer P.in Biotechnclogy vol 6a: 387-421 (1984) and references therein
lipáza (Candida cylindricea) R(+)fenoxypropión (herbicíd) 2-chlóropropiónové kys. Biocatalysts in Organic Syntheses eds Tramper,van de Plaš & Linko, Proceedings of Internátional Symposium in Netherlands 1985
lipázy,esterázy, aldorázy,amidázy proteázy,peptidázy lipáza z droždia org.synt.peptidov monoglyceridu 2(p-chlórofenoxy)propión herbicíd štiepenie racemického esteru Jones,J.B., Tetrahedron42: 3351-3403 (1988) Butt,S.and Roberts,S.M.,Natural Product Reports 489— -503 (1986),and references cited therein for a more comprehensive review of this area Pfitzner et al.,Methods in Enzymology 136: 342 (1987)
striktodín synte- táza výroba alkaloidov striktozidin Enz Eng 6: 291 (1982) Enz Eng 8: 155
penicilín acyláza penicilín amidáza 6-amino penicilínany a 7-ADCA penicilín G a V
hydroxysteroid dehydrogenázy steroid trans. Carrea et al., Methods in Enzymology 136: 150 (1987)
5fosfodiesteráza nukleázy 5-ribinukleotid Keller et al., Methods in Enzymology 136: 517 (1987)
esteráza prekurzory β-laktámu (chirálne monoestery,monoalkylester β-aminoglutarovej kyseliny) zodpovedájúce liestery Japanese patent application: 82-159, 493 (1981) Biseibutsu Company
1 i pá z y β-blokátory Kloosterman,M. et al.,Trends in Biotechnology 6: 251256 (1988)
Výroba akrylamidu technológiou CLEC
Ďalej je opísané jedno použitie spôsobu podľa vynálezu - adaptácie výroby akrylamidu z imobilizovaných buniek s nadprodukciou enzýmu nitrilhydratázy (Nagasawa, T. a Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153 - 158 (1989)) na opísanej technológii CLEC.
Výroba významnej chemickej komodity akrylamidu v priemyselnom meradle bola opísaná Yamadom so spolu14 pracovníkmi (Nagasawa, T. a Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153 - 158 (1989)). Ročne tisíc ton akrylamidu je vyrábaných v chemických reaktoroch, plnených zachytenými bunkami, vybranými ako nadproducenti enzýmu nitrilhydratázy. Bolo rovnako opísané čistenie a kryštalizácia nitrilhydratázy z dvoch zdrojov, Brevibacterium R312 (Nagasawa a d., Biochem. Biophs. Res. Commun. 139: 1305 - 1312 (1986)) a P. chlororaphis B23 (Nagasawa a d., Eur. J. Biochem. 162: 691 - 698 (1987)). Podľa vynálezu môžu byť tieto kryštalické enzýmy imobilizované zosieťovaním glutaraldehydom alebo iným vhodným sieťovadlom počas vzniku CLEC. Nitrilhydratázové CLEC je potom možné použiť v bežnom reaktore namiesto bežne používaných zachytených buniek. Úprava tohto postupu pre technológiu CLEC vedie k okamžitým výhodám. Patrí k nim redukcia veľkosti zariadenia, lepšie presadenie v dôsledku zvýšenej aktivity na jednotku objemu, vyplývajúcej z vyššej koncentrácie enzýmu v CLEC, väčšia rýchlosť difúzie substrátu a produktu, zníženie nežiaducej kontaminácie a vedľajších reakcii, vyplývajúcich z vyššej čistoty CLEC a znížená citlivosť proti mikrobiálnej kontaminácii v neprítomnosti buniek. Sú však k dispozícií aj ďalšie výhody, ktoré sa dostavujú len v prípade metód na báze CLEC. K nim patri prevádzka pri vyššej teplote, zvyšujúca reakčnú rýchlosť, možnosť prevádzania vo vodových, organických a takmer bezvodých rozpúšťadlách vedúca k optimalizácií reakcie produkcie akrylamidu, a lepšia polovičná doba životnosti v prevádzke a skladovanie v dôsledku vyššej chemickej a mechanickej stability CLEC, zrejme v nekonvenčných rozpúšťadlách.
Medicinálna aplikácia technológie CLEC - mimotelové liečenie
Spôsob podľa vynálezu a príslušne zvolený CLEC alebo súpravu CLEC je rovnako možné použiť v medicíne. CLEC alebo súpravu CLEC môžeme použiť napríklad na oddelenie zložky tekutiny, ako je krv, zvyčajne premenou tejto zložky, t. j. ich prevedením na látku, ktorá nie je pre jednotlivca škodlivá alebo ktorá môže byť odstránená zvyčajnými telesnými pochodmi (napríklad detoxikáciou, degradáciou v pečeni alebo vylúčením v obličkách). V tejto aplikácii sa vhodne zvolený CLEC alebo súprava CLEC uvedie do styku s telesnou tekutinou, obsahujúcou zložku, ktorá musí byť premenená, alebo účastníka (produkt alebo substrát) rekcie, ktorej sa zúčastní táto zložka, na ktorú pôsobí enzým v CLEC. Takto je enzým schopný pôsobiť na zložku, ktorá musí byť premenená, alebo na inú látku, ktorá je produktom reakcie, ktorej sa zložka, ktorá musí byť premenená, zúčastní. V dôsledku aktivity enzýmu dochádza k priamej premene zložky, ktorá musí byť odstránená, alebo k premene produktu reakcie, ktorej sa zložka zúčastňuje (čo znemožňuje ďalšie pokračovanie reakcie). Dá sa to uskutočniť pomocou mimotelového zariadenia, ktoré zahrnuje vhodne zvolený CLEC alebo súpravu CLEC a zadržovacie zariadenie vyrobené z materiálu, ako je porézny materiál, na ktorom je zadržovaný CLEC, alebo trubica, v ktorej jc CLEC prítomný, ktoré umožňuje kontakt medzi samotnou zložkou alebo látkou v tekutine, ktorá je produktom reakcie, ktorej sa zúčastňuje zložka, ktorá musí byť premenená.
Túto aplikáciu je ďalej možné vykonávať vsunutím príslušného CLEC do vhodnej časti tela, ako je peritoneum alebo lymfatická uzlina, kde by CLEC mal prístup k telesným tekutinám. Toto vsunutie môžeme vykonávať chirurgicky alebo injekciami suspenzie CLEC. Priama injekcia CLEC do krvného toku sa vzhľadom na nebezpečic embólie neprejavuje ako vhodná.
Použite príslušných CLEC v tejto oblasti môže byť alternatívou genetických metód pri terapii enzýmov pri korekcii vrodených chýb, ako je fenylketonúria.
Tabuľka 3 vysvetľuje niektoré medicinálne aplikácie, v ktorých je možné použiť CLEC. Vo väčšine týchto prípadov je mimotelová liečba doteraz v štádiu výskumu, ale prínos CLEC môže umožniť liečbu v oblastiach, kde doteraz alternatívna liečba neexistovala.
Tabuľka 3
Použ.enzým Odstránenie Choroba/Liečba Odkazy
asparagináza asparagín leukémia odstránenie asparaginu poškodí leukemické bunky,ktoré nemôžu vyrábať asparagín; normálne bunky môžu asparagín vyrábať Klein,M,,Langer R.,Trends in Biotechnologyí: 179-185 (1986) Chang,T.M.s., Methods in Enzymology 137: 444-457 (1987)
heparináza heparín deheparinízácia hemofúznych pacientov napr.dialýza Langer,R.,et al Science 217: 261-263 (1982)
bilirubin oxidáza bilirubin novorodenecká žltačka Lavín,A., et al. Science 230: 543-545 (1985)
karboxypeptidáza chemoterapia Pitt,A.M,zet al Appl.Biochem. Biotechnol. 8: 55-68 (1983)
tyrozináza aróm, arainokys. zlyhanie pečene s patologickým zvýšením aminokyselín Chang,T.M.S., Sem.Liver Dis. Ser.6: 148 (1986)
fenylalanín amónium lyáza fenylalanín fenylketenúria a zlyhanie pečene Ambrus,C.M., et al.,J.Pharm.s Exp.Ther.224: 598-602 (1983)
multienzýmový systém,ureáza glutamátdehydrogenáza, glukóza dehydrogenáza & tranzamináza močovina (prevedená glutámcvou kyselinou a ďalšie aminokyseliny cez amoniak) detoxifikácia pacientov s chronickým renálnym zlyhaním Chang.T.M.S., Methods in Enzymology 137: 444-457 (1987) Chang,T.M.S., Enzýme Eng 5: 225 (1980)
argináza arginin dedičná hyperargininémia Kanalas,J.J.et al.,Biochem.Med 27: 46-55 (1982)
glutamátdehydrogenáza amoniak amoniak zlyhanie pečene Maugh,T.H., Science 223: 474-476 (1984)
Konkrétnou aplikáciou spôsobu podľa vynálezu je heperínlyazový systém na deheparinizáciu krvi (Bernstain a d., Methods in Enzymology 137: 515 - 529 (1987)), opísaný ďalej.
Všetky mimotelové zariadenia, cez ktoré preteká krv, ako je dialýza obličiek, kontinuálna arteriovenózna hemofiltrácia alebo mimotelové membránové okysličovače, vyžadujú na zamedzenie zrážania krvi heparinizáciu pacienta. Heparinizácia však vedie ku krvácavým komplikáciám a ohrozuje pacienta. Tieto problémy rastú s predlžujúcim sa časom perfúzie, napríklad pri membránovom okysličovači, a môžu vyvolať vážne krvácanie. Po mimotelovej terapii môžeme heparín z krvi odstrániť použitím zariadenia s heparinázou na výtoku z mimotelového zariadenia, ktoré odstráni všetok heparín z krvi, vrátený do tela pacienta, a tak odstrániť súčasne problémy heparinizácie.
Publikované výsledky výskumu (Langcr a d., Science 217: 261 - 263 (1982), Bemstein a d., Methods in Enzymology 137: 515 - 529 (1987)) sa detailne zaoberajú problémami súvisiacimi s konvenčné imobilizovanými enzýmami, používanými v mimotelových zariadeniach. Hlavný problém spočíva v tom, že konvenčná imobilizácia má za následok nízke uchovanie aktivity enzýmu na jednotku objemu, a vyžaduje tak k potrebnej heparinizácii veľký objem imobilizovaného enzýmu. Tento objem je príliš veľký k praktickému použitiu pri ľudských pacientov. Naproti tomu vysoké zachovanie aktivity na jednotku objemu pri CLEC v dôsledku neprítomnosti inertného nosiča tento nedostatok odstraňuje a ponúka praktické riešenie deheparinizácie pri zosieťovanom kryštáli. Tento kryštál je lepší ako menej stabilné bežne imobilizované enzýmy, pretože má zníženú imunitnú odpoveď vplyvom úniku enzýmu. Tepelná stabilita CLEC bráni enzým pred denaturáciou vplyvom prechodných teplôt počas skladovania, je pravdepodobné, že si CLEC udržuje vysokú aktivitu i pri skladovaní pri teplote miestnosti. CLEC sú okrem toho v dôsledku svojej dlhšej prevádzkovej a skladovacej životnosti lacnejšie a pohodlnejšie použiteľné ako ich konvenčné imobilizované náprotivky.
Ďalšia aplikácia technológie CLEC, biosenzory
CLEC alebo súpravu CLEC môžeme použiť ako komponent senzora, nazývanú biosenzor, vhodnú na detekciu a/alebo kvantitatívne stanovenie určitej látky v tekutine, napríklad telesnej tekutine (ako je krv alebo moč), chemických a laboratórnych reakčných médiách, organických médiách, vode, kultivačných médiách a nápojoch. V niektorých prípadoch môže byť dotyčnou tekutinou plyn, ako je v analyzátore dychu na alkohol (Barzana, E., Klibanov, A., a Karell, M., NASA Tech Briefs 13: 104 (1989)). V tejto aplikácii sa vhodne zvolený CLEC alebo súprava CLEC uvedie do kontaktu s analyzovanou tekutinou. Hľadaná látka sa môže merať priamo (napríklad hladina krvnej glukózy) alebo nepriamo (napríklad detekciou alebo stanovením látky, ktorá je reakčnou zložkou (produkt alebo substrát) pri reakcii, ktorej sa hľadaná látka zúčastňuje). V každom prípade je CLEC schopný pôsobiť na hľadanú látku alebo látku, ktorá je zložkou reakcie, ktorej sa hľadaná látka rovnako zúčastňuje. Aktivita enzýmu vyvoláva detekovateľnú zmenu (napríklad zmenu pH, produkciu svetla, zmenu elektrického potenciálu), ktorá je detekovaná a/alebo určovaná vhodným detekčným zariadením (napríklad pH elektródou, svetelným alebo tepelným senzorom, zariadením na meranie elektrickej zmeny) (Janata, J. a d., Anál. Chem. 62: 33R až 44R (1990)). Môžeme použiť akékoľvek zariadenie, vhodné na detekciu zmeny, vyplývajúcej z enzýmovo katalyzovanej metódy. Biosenzor podľa vynálezu zahŕňa CLEC alebo súpravu CLEC a zachycovacie zariadenie pre CLEC, ktoré umožňuje kontakt medzi CLEC a hľadanou látkou alebo látkou v tekutine, ktorá je zložkou reakcie, ktorej sa hľadaná látka zúčastňuje.
Tabuľka 4 vysvetľuje niektoré biosenzorové aplikácie v ktorých môžeme použiť CLEC. V súčasnosti sa v týchto aplikáciách používajú imobilizované enzýmy, tie však trpia nízkou stabilitou, nízkou hustotou enzýmu, krátkou životnosťou a nereprodukovateľnosťou. Tieto príklady môžeme ľahko prispôsobiť technológii CLEC podľa vynálezu.
Tabuľka 4
Enzým Detekcia Aplikácia Odkazy
glukóza oxi- glukóza diabetika Daniles,B.,Mossbach,
dáza K.,Methods in Enzymology 137: 4-7 (1987) Halí,E „Biosensors“ Open University Press (1990) Taylor,R.,Proceed. Biotechnology Conference 1989; 275-287 Anthony et al., „Biosensors,Fundamentals and Applications“,Oxford University Press (1987)
kreatín, deimináza kreatín funkcia obličiek Tabata,M. et al., Anál.Biochem. 134: 44 (1983)
ureáza močovina funkcia obličiek Hsuie,G.H et al.,Polym.Mater.Sci.Eng. 57: 825-829 (1987) Kobos,et al.,Anal. Chem. 60: 1996-1998 (1988)
laktát oxidáza & dehydrogenáza laktát klinické aplikácie Blaedel,W.J. & Jenkins,R.A.,Anál.Chem. 48 (8) : 1240 (1976) Sagaguchi,Y.,et al., J.Appl.Biochem 3: 32 (1981)
glukóza-6-pyruvát dehydrogenáza Glukóza6-fosfát, sacharóza a ATP diabetiká a ďalšie ibid as glucose oxidase
alkohol dehydrogenáza, alkohol oxidáza etanol a iné alkoholy,octová, mravčia kyselina analyzátory dychu a priemyselné aplikácie Romette,J.L.et al., Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987) HO,M.H.,Methods in Enzymology 137: 271-288 (1987)
β-fruktozi- dáza sacharóza priemyselné aplikácie Romette,J.L.et al., Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987)
cholesterol oxidáza cholesterol cholesterové testy Satoh,I.,Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987)
kataláza cholesterol, močová kyselina aterosklerotiká a ďalšie Satoh,I.,Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987)
karboxypeptidáza metotrexát rakovina ibid as glucose oxidase
karbonátdehydratáza oxid uhličitý priemyselné laboratórne ekologické ibid as glucose oxidase
L-amino acid aminokyselina lekárske ibid as glucose oxi-
oxidáza β-laktamáza penicilináza penicilín priemyselné lekárske dase Anzai et al.,Bull. Chem.Soc.Jpn. 60: 4133-4137 (1988)
alk.fosfatá- za fosfát monitoring metabolitov ibid as glucose oxidase
nitrát/nitrid reduktáza nitráty a nitridy monitoring metabolitov a potravín ibid as glucose oxidase
arylsulfatáza sulfát monitoring metabolitov ibid as glucose oxidase
sukcinát dehydrogenáza sukcinát priemyselné ibid as glucose oxidase
bakteriál. luciferáza FMNH2 a spojené reakcie detekcia 10'18 FMNH2 meraním emisie fotónov Wannlund J.,et al., „Luminescent assays: Perspectives in endocrinology and clinical chemistry“; Eds Serio,M. and Pazzagli,M. 1: 125 (1982) Kurkijarvi et al., Methods in Enzymology 137: 171-181 (1987)
luciferáza sv.mušky ATP a spojené reakcie detekcia 1012 ATP meraním emisie fotónov Kurkijarvi et al., Methods in Enzymology 137: 171-181 (1987) Murachi et al.,Methods in Enzymology 137: 260-271 (1989)
Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu, aplikovaného na analýzu vzoriek v biosenzore, je zvlášť žiaduce získať čo najväčší detekovateľný signál z čo najmenšieho množstva substrátu a katalyzátora. V tomto ohľade je technológia CLEC podľa vynálezu zvlášť atraktívna, pretože dosahuje najvyššiu možnú koncentráciu enzýmového katalyzátora v danom objeme.
Často bolo vynaložené značné úsilie na napojenie danej koncovej enzymatickej syntézy, buď priamo, alebo cez vhodný medziprodukt, na výrobu svetla pomocou enzýmov, ako je luciferáza (Kurkijarvi a d., Methods in Enzymol. 137: 171 - 181 (1988)). Dôvodom tohto postupu je využitie jedinečnej senzitivity a účinnosti zariadenia na detekciu fotónov, ktoré umožňuje detekciu fentomolámych koncentrácii enzýmových reakčných produktov za príslušných podmienok. Podľa tohto princípu sa navrhli biosenzorové systémy s použitím konvenčné imobilizovaných enzýmov na detekciu rôznych substrátov, zaujímavých z klinického a iného hľadiska. Reakcie produkujúce svetlo boli napojené na skúšobné reakcie na detekciu substrátov, ako je okrem iného D-glukóza, L-laktát, L-glutamát a etanol, v extrémne nízkych koncentráciách.
Vzhľadom na technológiu podľa vynálezu bola zaznamenaná kryštalizácia enzýmu luciferázy z Vibrio harveyii (Swanson a d., J. Biol. Chem. 260: 1287 - 1289 (1985)). Kryštály tejto luciferázy môžeme zosieťovať glutaraldehydom alebo iným vhodným činidlom počas vzniku luciferázového CLEC. Na použitie v biosenzoroch a v analytike poskytujú CLEC luciferázy početné výhody oproti konvenčné imobilizovanému enzýmu. V CLEC je celý objem luciferázového CLEC tvorený enzýmom, emitujúcim svetlo. V konvenčné imobilizovanom systéme je však až 95 % celkového objemu obsadené materiálom „inertného“ nosiča, ktorý veľmi pravdepodobne funguje ako absorbent svetla, emitovaného enzýmom. Zvýšená stabilita CLEC okrem toho uľahčuje skladovanie pri teplote miestnosti a ďalej umožňuje nové senzorové aplikácie v nepriaznivých prostrediach a pri zvýšených teplotách.
Ďalšie aplikácie technológie CLEC - laboratórne reakcie
CLEC môžeme použiť na reakcie v laboratóriách v malých kolónach alebo v diskontinuálnych procesoch, pomocou ktorých je možné vykonávať laboratórne reakcie. Niektoré hrubé kategórie sú naznačené v tabuľke 5.
Tabuľka 5
Enzým Reakčný typ Odkazy
lipáza,fosfolipá- Zä stereoselektívne syntézy, esterifikácia, transesterifikácia,aminolýza,laktonizácia,polykondenzácia, acylácia,oximolýza a štepenie racemických zmesí Zaks,A. 4 Klibanov,A.M. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82: 3192-3196 (1985) Klibanov,A.M.Acc.Chem.Res 23: 114-120 (1990) and references therein Wong,C.H.,Chemtracts- Organics Chemistry 3: 91-111 (1990) and references therein
esteráza stereoselektívne syntézy a štiepenie Kobayashi et al.,Tetrahedron Letters Voľ 25, #24: 2557-2560 (1984) Schneider et al.,Agnew. Chem.Int.Ed.Engl.23 (#1): 64-68 (1984)
tyrozináza oxidácia fenolov na chinóny Kazandjian,R.Z and Klibanov, A. M. J.Am.Chem.Soc. 110: 584-589 (1986)
proteázy,subtilizín stereoselektívna acylácia uhlohydrátov Riva et al.,J.Am.Chem. Soc.110: 584-589 (1988)
oxidáza selektívna oxidácia uhľovodíkov KÍibanov,A.M.Acc.Chem.Re s 23: 114-120 (1990) and references therein
iné enzýmy nevyžadujúce co-faktory izomerázy,lyázy, aldolázy, glykozyltransferázy, glykozidázy stereoselektívne syntézy Wong,C.H.,Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91-111 (1990) and references therein
iné enzýmy nevyžadujúce ďalšie co-faktory flavoenzýmy,pyridoxal fosfát enzýmy,metalloenzýmy stereoselektívne syntézy Wong,C.H.,Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91-111 (1990) and references therein
enzýmy vyžadujúce co-faktorytkinázy (ATP),oxidoreduktázy (NAD/P),metyltransferázy (SAM), CoA-vyžadujúce enzýmy sulfurázy (PAPS) stereoselektívne syntézy Wong,C.H.,Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91-111 (1990) and references therein
Schneider a d. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 (č. 1): 64 až 68 (1984)) opisuje použitie enzýmov v organických syntézach. Esteráza bravčovej pečene bola použitá pri transformácii mezo-esteru na chirálny mono-ester vo vodovom fosfátovom pufre.
Výhody reakcií, katalyzovaných CLEC, na laboratórne použitie sú trojaké. Po prvé si CLEC uchovávajú vysokú aktivitu v nepriaznivých prostrediach (napríklad vo vodových, organických, takmer bezvodých rozpúšťadlách a ich zmesiach a počas vysokých teplôt), aké sú typické pre pokusné laboratórne chemické syntézy. Po druhé majú CLEC vysokú prevádzkovú a skladovaciu stabilitu, ktorá je vhodná na prerušované laboratórne experimenty. Po tretie ich aktivita na jednotku objemu umožňuje skrátenie reakčného času a vyžaduje menšie objemy enzýmu (na jednotku aktivity). Výhody, ktoré CLEC ponúkajú oproti voľným alebo imobilizovaným enzýmom, tak poskytujú organickým chemikom alternatívny vysoko selektívny syntetický nástroj.
Vo všetkých opísaných prípadoch, ale nielen v nich, môže odborník pomocou spôsobu podľa vynálezu prispôsobiť proces s použitím konvenčné imobilizovaného enzýmového katalyzátora použitím CLEC príslušného enzýmu. CLEC môžu nielen nahradzovať konvenčné imobilizované enzýmy, ale môžu sa použiť i v transformáciách, sprostredkovanými bunkami. Vynález je objasnený príkladmi realizácie, ktoré však nie sú obmedzujúce.
Príklady usktuočnenia vynálezu
Príklad 1
Kryštalizácia a sieťovanie termolyzínu na syntézu prekurzora aspartámu Z-Asp-Phe-OMe
Kryštalizácia
250 mg termolyzínu z Bacillus thermoproteolyticus sa zakúpilo v Boehringer-Mannheim GmbH a rozpustilo v 4 ml 45 %dimetylsulfoxide (DMSO) a 55 % l,40M acetáte vápenatom a 0,50M kakodyláte sodnom s pH 6,5. Tieto počiatočné podmienky boli podobné ako u Matthewse a d. na výrobu termolyzínových kryštálov vo vhodnej kvalite pre difrakciu (pozri napríklad Holmes a Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623 - 639 (1982)). Roztok proteínu bol potom v mikrokoncentrátore Centricon 10 zahustený na 1 ml. Mikrokryštály boli v dobrom výťažku získané postupom prudkej kryštalizácie, spočívajúcej v tom, že do obidvoch opísaných roztokov termolyzínu v DMSO sa rýchlo vstrieklo 1 ml vody alebo 1,40 M acetátu sodného a 0,50 M kakodylátu s pH 6,5. Týmto procesom sa získa spŕška hexagonálnych mikrokryštálov približne rovnakých rozmerov (približne s dĺžkou 101).
Sieťovanie mikrokryštálov termolyzínu
Postup, použitý v tomto príklade realizácie spôsobu podľa vynálezu, je úpravou postupu, opísaného Nakanishim a d. (Biotechnology 3: 459 - 464 (1985)), pri ktorom sa najprv termolyzin adsorbuje na guľôčkový nosič, vytvorený iónomeničovou živicou Amberlite XAD-7, a potom sa imobilizuje sieťovaním glutaraldehydom (Quiocho a Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833 - 839 (1964)). Získané mikrokryštály termolyzínu boli odstredené a pelletované a supernatant bol dekantovaný. K mikrokryštálom sa potom pridalo 5 ml 17,5 % technického glutaraldehydu v 2,5 % DMSO, 0,05 M acetátu vápenatého a 0,025 M kakodylátu sodného s pH 6,5. Zmes bola za mierneho miešania 4 h inkubovaná pri 37 °C. Sieťovacia reakcia sa zastavila opakovaným premývaním kryštálov 10 ml alikvotnými dielmi vody na odstránenie glutaraldehydového roztoku. Premyté zosieťované kryštály termolyzínu tvoria termolyzínové CLEC, ďalej použité ako katalyzátor.
Syntéza Z-Asp-Phe-OMe vo vodnom roztoku ml suspenzií termolyzínových CLEC sa pridalo do kontinuálneho zmiešavacieho reaktora, inkubovaného pri 37 °C.
Po odstredení a dekantácii supematantu sa ku CLEC pridala vodná reakčná zmes. Tento roztok sa pripravil zmiešaním 80 mg Z-L-Asp a 80 mg L-Phe-OMe-HCl v 1 ml vody s prídavkom kyseliny octovej do pH 7,0. Odobrali sa vzorky na analýzu HPLC. Tabuľka 6 ukazuje výšku piku substrátu Z-L-Asp v HPLC po uvedenom čase reakcie, normalizovanú na hodnotu 1 na čas t=0. Vzhľadom na to, že Z-L-Asp je zložka, obmedzujúca rýchlosť tejto reakcie, je meranie jej úbytku ekvivalentné k meraniu tvorby produktu Z-L-Asp-L
-Phe-OMe (Nakanishi a d., Biotechnology 3:459 - 464 (1985)). Tabuľka 6 zahrnuje rovnako výšku normalizovaného piku zostalého limitujúceho substrátu Z-L-Asp a odhad stupňa ukončenia reakcie. Je zrejmé, že reakcia prebehla počas prvých 30 s z asi 20 % a tu mala prestoj. Tieto výsledky súhlasia s pozorovaním Nakanishiho a d. (Biotechnology 3: 459 až 464 (1985)), ak sa použije, ako je uvedené, konvenčné imobilizovaný termolyzin vo vodnej reakčnej zmesi, a dajú sa pripočítať na vrub obmedzenej rozpustnosti Z-L-Asp-L-Phe-OMe ako produktu vo vode.
Tabuľka 6
reakčný čas (s) výška piku (normalizovaná) stupeň prebehnutia reakcie
0 1,000
30 0,727 27,3 %
60 0,857 14,3%
120 0,940 6,0 %
180 0,797 20,3 %
Syntéza Z-Asp-Phe-OMe v takmer bezvodnom roztoku ml suspenzie termolyzínových CLEC sa pridalo do kontinuálneho zmiešavacieho reaktora, inkubovaného pri 37 °C.
Po odstredení a dekantácii supematantu sa ku CLEC pridala takmer bezvodá organická reakčná zmes. Tento roztok sa pripravil zmiešaním 80 mg Z-L-Asp a 240 mg L-Phe-OMe v 1 ml 99 % etylacetátu a 1 % vody. Odobrali sa vzorky na analýzu HPLC. Tabuľka 7 ukazuje výšku piku substrátu Z-L-Asp v HPLC po uvedenom čase reakcie, normalizovanú na hodnotu 1 na čas t=0. Vzhľadom na to, že Z-L-Asp je zložka, obmedzujúca rýchlosť tejto reakcie, je meranie jej úbytku ekvivalentné k meraniu tvorby produktu Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Nakanishi a d., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985)). Tabuľka 7 zahrnuje rovnako výšku normalizovaného piku zostalého limitujúceho substrátu Z-L-Asp a odhad stupňa ukončenia reakcie. V tomto prípade reakcia prebehla počas prvých 30 s do asi 70 % a tu mala prestoj. Tieto výsledky rovnako súhlasia s pozorovaním Nakanishiho a d. (Biotechnology 3: 459 - 464 (1985)), pre konvenčné imobilizovaný termolyzin v takmer bezvodej reakčnej zmesi, a dajú sa pripočítať na vrub inhibícii enzýmu produktom.
Tabuľka 7
reakčný čas (s) výška piku (normalizovaná) stupeň prebehnutia reakcie
0 1,000
30 0,323 67,7 %
60 0,314 68,6 %
120 0,305 69,5 %
180 0,272 72,8 %
Príklad 2
Kryštalizácia, sieťovanie a lyoíilizácia termolyzínu a hodnotenie vlastností získaného produktu
Kryštalizácia termolyzínu
Termolyzin (Diawa Kase K. K., Japonsko) bol rozpustený v 10 mM acetáte vápenatom (Sigma) s pH 10,0 v koncentrácii 10 % (hmotnosť/objem). Titráciou 2 M hydroxidom sodným sa pH roztoku udržiavalo na 10,0. Po úplnom rozpustení bol roztok proteínu titrovaný 2 M kyselinou chlorovodíkovou do pH 8,0. Pridal sa pevný acetát vápenatý do koncentrácie 1,2 M. Potom sa pridal dimetylsulfoxid (Sigma) do koncentrácie 30 %. Proteín bol ultrafiltráciou v zmiešava cej cele Amicon (membrána 10 000 MWCO) zahustený na 100 mg/ml. Zahustený enzým bol rozdelený na alikvotné diely a skladovaný pri -70 °C. Termolyzín bol vykryštalizovaný prídavkom 9 objemov demineralizovanej vody k 1 objemu zahusteného roztoku proteínu (100 mg/ml). Roztok sa krátko premiešal a nechal štát cez noc pri teplote miestnosti. Kryštály sa premyli 10 objemami 10 mM acetátu vápenatého s pH 7,0 a izolovali nízkorýchlostným odstredením (10 min. pri 1500 x G, odstredivky Beckman GPR).
Rýchly prídavok vody k zahustenému (100 mg/ml) roztoku termolyzínu vyvoláva tvorbu kryštálov, ktoré začnú byť viditeľné pri slabom zväčšení po 10 min. Veľkosť kryštálov reprodukovateľné závisí od konečnej koncentrácie proteínu. Z troch objemov vody a jedného objemu koncentrátu termolyzínu (100 mg/ml) vzniknú hexagonálne tyčinky s dĺžkou 0,5 mm v kvalite, zodpovedajúcej rontgenovej difrakcii, ktoré zodpovedajú kryštálom, opisným skôr Colmanom a d. (Colman, P. M., Jansonius, J. N., a Mathews, B. W., J. Mol. Biol. 70: 701 - 724 (1972)), ako sme potvrdili difrakčnou analýzou. Pridaním desiatich objemov vody na jeden objem proteínového koncentrátu sa dĺžka výsledných kryštálov zmenší na 0,05 mm. Tieto mikrokryštály sú preferované v aplikáciách CLEC, pretože pri nich dochádza k minimálnym difúznym problémom, súvisiacich s veľkosťou kryštálu (pozri napríklad Quiocho, F. A., a Richards, F. M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)). V danej šarži proteínu bola veľkosť kryštálov konzistentne jednotná. (V tejto štúdii sa použili kryštály dlhé 0,05 až 0,10 mm na uľahčenie presného pipetovania kryštalických suspenzií.) Densitometrický záznam SDS-PAGE ukazuje šesťnásobné čistenie enzýmu pri kryštalizácii, významne zvyšujúcu špecifickú aktivitu CLEC. Kryštalizáciou dôjde k 20 % poklesu celkovej aktivity CLEC proteínu oproti rozpustnému termolyzínu, merané spektrofotometrickým štiepením dipeptidického substrátu fúrylalkryloyl-glycyl-L-leucínamidu (FAGLA), opísaným ďalej.
Sieťovanie kryštálov termolyzínu
Kryštály termolyzínu sa sieťovali 3 h pri teplote miestnosti v roztoku 12,5 % glutaraldehydu (Sigma), 5 % DMSO a 50 mM Tris s pH 6,5. Zosieťované kryštály, sa premyli trikrát demineralizovanou vodou a izolovali nízkorýchlostným odstredením, ako je opísané v postupe kryštalizácie termolyzínu. Chemické zosieťovanie enzýmov stabilizuje kryštálovú mriežku a molekuly stavebného enzýmu v kryštáli v dostatočnej miere, umožňujúcej praktické použitie CLEC v prostrediach, ktoré sú inak inkompatibilné s funkciou enzýmu. Nezistil sa merateľne rozdiel v enzymatickej aktivite medzi zosieťovanými a nezosieťovanými kryštálmi, merané (spektrofotometricky) sledovaním štiepenia dipeptidického substrátu FAGLA (opísaným ďalej). Zosieťovanie navyše stabilizuje CLEC do takej miery, že sa môžu lyofilizovať a udržia si po rekonštrukcii vo vodných, organických a zmiešaných vodno-organických rozpúšťadlách plnú enzymatickú aktivitu, ako je zrejmé z obr. 1 a tabuľky 8. I keď kryštalzáciou dôjde k 30 % poklesu špecifickej aktivity CLEC proteínu v porovnaní s rozpustným termolyzínom, zosieťovanie a lyofilizácia špecifickú aktivitu ďalej neznížili.
Tabuľka 8 - aktivita termolyzínu
absorbancia 345 nm
čas (min.) CLEC rozpustný enzým
1 0,0 0,314 0,315
2 LO 0,272 0,271
3 3,0 0,235 0,218
4 5,0 0,204 0,198
5 10,0 0,184 0,185
6 15,0 0,183 0,184
Enzymatická aktivita rozpustného termolyzínu a CLEC termolyzínu
Katalytická aktivita rozpustného a CLEC termolyzínu sa zisťovala (Fcder.J. a SchuckJ.M., Biochemistry 9: 2784 až 2791 (1970)) hydrolýzou blokovaného dipeptidového substrátu fúrylakryloyl-glycyl-L-leucínamidu (FAGLA) (Schweizerhall). Štiepenie amidickej väzby sa meralo spektrofotometricky poklesom absorbancie pri 345 nm. Počiatočná koncentrácia enzýmu bola 10’7 M stanovená proteínom podľa Bradforda a densitometrickým meraním (UltoScan XL Pharmacia LKB) zafarbených gélov SDS-PAGE Coomassie. Enzýmové CLEC sú definované ako rekonštituované lyofilizované zosieťované termolyzínové kryštály. Rozpustný enzým je definovaný ako termolyzín zahustený na 100 mg/ml. Enzým sa pridával k 5 ml objemu reakčnej zmesi, obsahujúcej substrát. V uvedených časoch sa odoberali alikvótne diely reakčnej zmesi a merala sa absorbácia pri 345 nm. Pred meraním absorbácie sa termolyzínové CLEC z reakčnej zmesi oddelili krátkym odstredením (mikrocentrifúga E Beckman). Absorbácia sa extrapolovala do rovnice rýchlosti pseudo-prvého poriadku a kcat/Km sa vypočítalo vydelením takto získanej hodnoty koncentráciou enzýmu (Multifit 2.0 Curve Fitting for the Apple Macintosh Computer, Day Computmg, P.O. Box 327, Milton, Cambridge CB4 6WL, UK (1990)).
Závislosť a stabilita proti pH
Optimálne pH a stabilita rozpustného enzýmu sa porovnávala s tertnolyzínovými CLEC pri štiepení dipeptidického substrátu FAGLA. Výsledky sú uvedené na obr. 2 a v tabuľke 9. Tak rozpustná, ako kryštalická forma enzýmu má maximálnu aktivitu pri pH 7. CLEC i rozpustný termolyzín preukázali taktiež podobnú aktivitu v kyslej oblasti a zvonovitý profil pH, vytvorený rozpustným enzýmom, je zhodný s publikovanými údajmi (Fedr, J. a Schuck, J. M., Biochemistry 9: 2784 - 2791 (1970)). V alkalickej oblasti pH si však kryštalický enzým uchováva maximálnu aktivitu do pH 10, zatiaľ čo rozpustný enzým má pri pH 8,5 75 % aktivitu a pri pH 9 len 25 % aktivitu. Pri pH 9,5 je rozpustný enzým celkom inaktívny.
Tabuľka 9 - krivka pH termolyzínu
% maximálnej aktivity
pH CLEC rozpustný enzým
1 5,0 10,250 5,170
2 5,5 9,750 6,070
3 6,0 52,500 39,100
4 6,5 85,00 74,610
5 7,0 97,500 100,000
6 7,5 100,000 98,650
7 8,0 97,500 82,920
8 8,5 95,000 71,910
9 9,0 96,250 24,720
10 9,5 95,000 0,000
11 10,0 90,000 0,000
Stabilita pri zvýšenej teplote
Vyššie reakcie rýchlosti a nižšie difúzne časy sa môžu pri substrátoch a produktoch dosiahnuť uskutočnením danej chemickej reakcie počas vyšších teplôt, kde však zvyčajne existuje obmedzenie, pokiaľ ide o tepelnú stabilitu substrátov a produktov, V enzýmovej katalýze je však teplota, pri ktorej možno proces vykonávať, často prakticky obmedzená stratou enzymatickej aktivity. Dodatočná stabilizácia, ku ktorej dochádza pri CLEC, umožňuje enzýmatickú aktivitu počas oveľa vyšších teplôt ako pri rozpustnom enzýme.
Zvýšená stabilita pri nižšších teplotách zjednodušuje rutinné dlhodobé skladovanie katalyzátorov vo forme CLEC. Napríklad koncentrované (> 50 mg/ml) roztoky rozpustného termolyzínu boli potrebné k zachovaniu maximálnej špecifickej aktivity uchovávať pri -80 °C. Pri teplote miestnosti obvykle došlo k strate aktivity počas jedného dňa. Naproti tomu rehydratované termolyzínové CLEC môžeme rutinne skladovať pri teplote miesnosti bez viditeľného úbytku aktivity počas celých mesiacov. Nerekonštituované lyofilizované CLEC termolyzínu sa zdajú, že majú neobmedzenú životnosť.
Tepelná stabilita a odolnosť proti autolýze sa pri termolyzínových CLEC demonštrovali po inkubácii pri 65 °C po piatich po sebe nasledujúcich dňoch (obr. 3 tabuľka 10). Termolyzínové CLEC si po piatich dňoch inkubácie pri zvýšenej teplote zachovali maximálnu aktivitu. Naproti tomu rozpustný termolyzín stratil 50 % pôvodnej aktivity už po dvoch hodinách inkubácie a po 24 h inkubácie pri 65 °C preukázal zanedbateľnú aktivitu.
Tabuľka 10 - tepelná stabilita termolyzínu pri 65 °C
% maximálnej aktivity
čas (dni) CLEC rozpustný enzým
1 0,000 100,000 100,000
2 0,041 70,000
3 0,083 96,00 50,000
4 0,164 32,000
5 0,246 17,000
6 0,410 97,0 10,000
7 1,000 101,0 2,000
8 2,000 97,0
9 3,000 94,0
10 4,000 96,0
11 5,000 92,0
Aktivita rozpustného termolyzínu a termolyzinových CLEC bola meraná po inkubácii pri 65 °C. Rozpustný termolyzín bol inkubovaný v 10 mM acetáte vápenatom, 50 mM Tris s pH 7,0 vo vodnom kúpeli so 65 °C. Objem reakčnej zmesi bol 500 μΐ. Konečná koncentrácia proteínu bola 10 mg/ml. Alikvotné diely boli odoberané po 0, 1, 2, 4, 6, 10 a 18 h. Vzorky boli hodnotené opísaným postupom na SDS-PAGE a štiepením FAGLA pri teplote miestnosti. V prípade termolyzinových CLEC sa 250 μΐ suspenzie kryštálov v 10 mM acetáte vápenatom a 50 mM Tris rovnako inkubovalo vo vodnom kúpeli pri 65 °C. Aktivita bola hodnotená po 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 a 100 h štiepenia FAGLA.
Odolnosť proti exogénnej proteolýze
Rovnako sa vyhodnotila odolnosť termolyzinových CLEC proti pôsobeniu exogénnej proteázy. Analýza SDS-PAGE (elektroforéza polyakrylamidového gélu s naviazaným dodecylsulfátom sodným) ukazuje, že komerčné enzýmy môžu obsahovať značné percento nečistôt, z ktorých niektoré môžu proti hlavnému rozpustnému enzýmu pôsobiť proteolyticky. Pri danom pakingu enzýmových molekúl v kryštálovej mriežke bolo by možné usudzovať, že vnú torné enzýmové molekuly v CLEC budú proti proteolýze chránené. K otestovaniu tejto možnosti boli prípravky termolyzínových CLEC a rozpusteného termolyzínu inkubované v prítomnosti streptokokovej proteázy PronascR, čo je nešpecifická proteáza, schopná digerovať väčšinu proteínu počas uvoľnenia aminokyselín (katalóg Clabiochem 1990, La Jolla, CA, USA).
Rozpustný termolyzín aj CLEC boli inkubované v 50 mM Tris s pH 7,5 pri 40 °C v prítomnosti proteázy PronaseR (Calbiochem). Pomer Pronase* k termolyzínu bol 1/40. K inhibícii autolýzy termolyzínu a zamedzenie proteolytickej deštrukcii pronázy termolyzinom sa k reakčnej zmesi rozpustného enzýmu pridala EDTA do konečnej koncentrácie 100 mM (EDTA inhibuje aktivitu termolyzínu, ale nie pronázy). V uvedených časových intervaloch sa z reakčnej zmesi odoberali alikvotné diely a merala sa aktivita spektrofotometricky štiepením dipeptidických substrátov FAGLA. K obmedzeniu inhibície termolyzínu v dôsledku prítomnosti EDTA sa spektrofotometrické meranie aktivity rozpustného enzýmu uskutočnilo v pufre s 0,5 M acetátu vápenatého s pH 7,0 a koncentrácia enzýmu bola dvojnásobne zvýšená. Zosieťovaný kryštalický enzým bol hodnotený za opísaných podmienok.
Ako je zrejmé z obr. 4 a tabuľky 11, rozpustný termolyzín rýchlo degradoval a po 90 min. inkubácie stratil všetku aktivitu. Naproti tomu aktivita termolyzinových CLEC nebola štyrmi dňami inkubácie za prítomnosti pronázy oplyvnená. Táto takmer absolútna odolnosť proti proteolýze je zvlášť zaujímavá v biosenzorových aplikáciách, kde by sa dalo spoľahnúť na aktivitu vhodného CLEC aj v neznámej zmesi prirodzene sa vyskytujúcich proteolytických enzýmov.
Tabuľka 11 - odolnosť proti proteáze
% maximálnej aktivity
čas (dni) CLEC rozp. enzým. čas (min.)
1 0,000 100,0 100,0 0,000
2 0,003 25,0 5,000
3 0,010 17,5 15,000
4 0,021 9,5 30,000
5 0,042 98,0 3,0 60,000
6 0,063 1,0 90,000
7 0,084 101,0 0,0
8 1,000 97,0
9 2,000 99,0
10 3,000 98,0
11 4,000 96,0
Rozpustnosť v prítomnosti organického rozpúšťadla
Aby mali enzýmy ideálnu použiteľnosť ako priemyselné katalyzátory, musia byť schopné pôsobiť bez dodatočnej intervencie v praktickom prostredí výrobných procesov. To zahrnuje použitie najmä vodných, polárnych a nepolárnych organických rozpúšťadiel a ich zmesí. V komerčných aplikáciách umožňujú vodno-organické zmesi rozpúšťadiel manipuláciu tvorby produktu s využitím relatívnych rozpustností a substrátov.
Rozpustný termolyzín a termolyzínové CLEC mali výrazne odlišnú stabilitu v prítomnosti organických rozpúšťadiel (tabuľka 12). Koncentrácie rozpustného enzýmu, ktoré bolo možné inkubovať v organických rozpúšťadlách boli obmedzené na maximálne 10 mg/ml. Koncentrácie vyššie ako táto hodnota by vyvolali okamžité zrážanie termolyzínu pri pridaní organického rozpúšťadla. Naproti tomu koncentrácie termolyzinových CLEC boli obmedzené len objemom obsadeným kryštálmi. Rozpustný termolyzín si udržal najvy ššiu aktivitu (75 %) po inkubácii v acetóne a najnižšiu (36 %) v tetradehydrofuráne. Po 1 h inkubácie v prítomnosti acetonitrilu alebo dioxánu stratil rozpustný enzým približne 50 % pôvodnej aktivity. Termolyzfn vo forme CLEC si po inkubácii vo všetkých vyskúšaných organických rozpúšťadlách zachoval viac než 95 % maximálnej aktivity.
Tabuľka 12
% maximálnej aktivity
rozpustný enzým CLEC
acetonitril 42 102
dioxán 66 97
acetón 75 99
tetrahydrofúrán 36 96
Stabilita v organických rozpúšťadlách
Termolyzinové CLEC alebo rozpustné termolyzinové preparáty boli inkubované v 50 % (objem/objem) roztokoch uvedených organických rozpúšťadiel. 100 pl suspenzie termolyzínových CLEC (10 mg/ml) v 10 mM Tris s pH 7 sa umiestnilo do sklenenej fľaštičky s objemom 1,776 cm3. Pridal sa rovnaký objem uvedeného organického rozpúšťadla a zmes sa krátko premiešala. 20 μΐ rozpustného termolyzínu (100 mg/ml) sa v sklenenej fľaštičke s objemom 1,776 cm3 zriedilo 80 μΐ 0,015 M Tris s pH 7,0. K roztoku proteínu sa potom pridalo 100 μΐ organického rozpúšťadla a zmes sa krátko premiešala. CLEC i rozpustný enzým sa inkubovali v prítomnosti organického rozpúšťadla pri 40 °C 1 h. Po inkubácii sa zisťovala enzymatická aktivita opísaným štiepením dipeptidického substrátu FAGLA.
Nízka koncentrácia vody nie je priaznivá na rozvinutie intermediámych štádií na ceste k denaturácii enzýmu. Pri CLEC je obmedzenie konformačnej mobility spôsobené skôr intermolekulárnymi kontaktami a priečnymi väzbami medzi molekulami enzýmu, vytvárajúcimi kryštál, ako takmer úplnou neprítomnosťou vody v médiu. V dôsledku toho sú enzýmami, formulovanými ako CLEC, ľahko tolerované intermediárne koncentrácie voda - organické rozpúšťadlo, čo sa doposiaľ pri enzýmoch nepozorovalo (pozri tabuľka 12). Tento objem otvára možnosti využitia enzýmovej katalýzy v celých nových oblastiach syntetickej chémie.
I v takmer bezvodých organických rozpúšťadlách sa však rutinné použitie enzýmov znemožňovalo ich tendenciou k tvorbe ťažko definovaných suspenzii, podliehajúcich zhlukovaniu a iným agregačným problémom. Táto vlastnosť robí tieto preparáty úplne neatraktívnymi pre priemyselné procesy vo veľkom meradle. Naproti tomu CLEC a stavebné enzýmy v kryštálovej mriežke zostávajú vo všetkých týchto rozpúšťadlách monodisperzné.
Porovnanie s inými metódami imobilizácie
V literatúre sa objavilo mnoho užitočných prehľadov metódou imobilizácie enzýmov (Maugh, T. H., Science 223: 474 - 476 (1984), Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45 - 50 (1985)). Enzým v nich vždy predstavuje malý zlomok celkového objemu imobilizovanej častice, ktorej väčšinu tvorí materiál inertného nosiča. Nosič zväčšuje strednú voľnú dráhu medzi rozpúšťadlom zvonku častice imobilizovaného enzýmu a aktívnymi miestami enzýmu, a tak zhoršuje difúzne problémy (Quiocho, F. A. a Richards, F. M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)).
V CLEC vytvára zosieťovaná kryštálová matrica svoj vlastný nosič, ďalší zvláštny nosič tak nie je nutný. V dôsledku toho je koncentrácia enzýmu v CLEC blízka teoretickej medzi pakingu, ktorá sa môže dosiahnuť pri molekulách danej veľkosti a silne prevyšuje hustotu, doposiaľ dosahovanej i v koncentrovaných roztokoch. Celý CLEC je tvorený aktívnym enzýmom, a preto je znížená na minimum redukcia rýchlosti enzymatickej reakcie v dôsledku difúzie, obvykle pozorovanej pri konvenčné imobilizovaných enzýmoch oproti enzýmom v roztoku (pozri obr. 1), pretože voľná dráha pre substrát a produkt medzi aktívnym enzýmom a voľným rozpúšťadlom je pri CLEC silno skrátená (v porovnaní s časticami konvenčné imobilizovaného enzýmu na nosiči). Významné je, že stavebný enzým CLEC je vnútorne monodisperzný a môže sa izolovať jednoduchou manipuláciou častíc CLEC, ako je filtrácia, odstredenie alebo dekantácia rozpúšťadla.
Príklad 3
Kryštalizácia, sieťovanie a lyofilizácia elastázy a hodnotenie vlastností získaného produktu
Kryštalizácia elastázy
Lyofilizovaná elastáza bravčového pankreasu (Serva) sa pri teplote miestnosti rozpúšťala v koncentrácii 5 mg/ml v 0,1 M acetáte sodnom s pH 5,0. Po 1 min. po úplnom rozpustení proteínu boli viditeľné tyčinkovité kryštály elastázy. Kryštalizačný roztok sa ochladil na 4 °C a kryštalizácia sa dokončila cez noc. Kryštály sa izolovali odstredením, ako je opísané.
Sieťovanie kryštálov
200 μΐ kryštálov elastázy sa pridalo k 1,3 ml roztoku 5,77 % glutaraldehydu a 1,5 M acetátu sodného s pH 5,0. Kryštály sa sieťovali 1 h za mierneho miešania (stir plate). Po zosieťovaní sa kryštály premyli tromi objemami po 15 ml 0,2 M Tris s pH 8,0. Elastázové CLEC sa lyofilizovali postupom uvedeným v príklade 2.
Enzymatická aktivita rozpustnej elastázy a CLEC elastázy
Katalytická aktivita rozpustnej elastázy a CLEC elastázy sa zisťovala spektrofotometricky meraním hydrolýzy substrátu sukcinyl-(Ala)3-p-nitroanilidu (Bachem) (Bieth a d., Biochem.Med. 11: 350 - 357 (1974)) (tabuľka 13, obr. 5). Štiepenie sa monitorovalo stúpajúcou absorbanciou pri 410 nm. Počiatočná koncentrácia substrátu bola 2.104. Koncentrácia enzýmu bola 2,8.10'7 M. CLEC alebo rozpustný enzým sa pridal k 5 ml objemu reakčnej zmesi obsahujúcej substrát v 0,2 M Tris s pH 8,0. Pred meraním absorbancie bol enzým CLEC z reakčnej zmesi odstránený, ako je uvedené.
Tabuľka 13 - aktivita elastázy
absorbancia 400 nm
čas (min.) CLEC rozpustný enzým
1 0,0 0,000 0,000
2 0,5 0,103 0,205
3 1,0 0,195 0,390
4 2,0 0,366 0,672
5 3,0 0,523 0,923
6 4,0 0,657 1,098
7 5,0 0,780 1,227
8 6,0 0,888 1,326
9 7,0 0,974 1,393
10 10,0 1,170 1,512
11 15,0 1,365 1,586
Odolnosť proti exogénnej proteolýze
Hodnotenie odolnosti CLEC elastázy proti pôsobeniu proteázy sa vykonalo za rovnakých podmienok ako je v prípade termolyzínu (príklad 2). Aktivita rozpustného enzýmu a CLEC enzýmu po inkubácii s proteázou bola hodnotená pomocou hydrolýzy nitroanilídového substrátu opísaným postupom (tabuľka 14 a obr. 6).
Tabuľka 14 - odolnosť elastázy proti proteolýze
% maximálnej aktivity
čas CLEC rozpustný enzým
1 0,0 100,0 100,0
2 10,0 53,0
3 20,0 32,0
4 30,0 101,0 18,0
5 45,0 11,0
6 60,0 102,0 8,0
7 120,0 101,0 3,0
8 180,0 103,0 2,0
Príklad 4
Kryštalizácia, sieťovanie a lyofilizácia esterázy a hodnotenie vlastností získaného produktu
Kryštalizácia esterázy
Suspenzia esterázy z bravčovej pečene (Fluka) a sulfátu amónneho 30 mg/ml bola pri teplote miestnosti rozpustená v 0,25 M acetáte vápenatom s pH 5,6. Kryštály esterázy boli viditeľné niekoľko minút po pridaní acetátového roztoku. Kryštalizačný roztok sa nechal stáť pri teplote miestnosti a kryštalizácia sa dokončila cez noc. Kryštály sa oddelili odstredením, ako je opísané v príklade 2.
Sieťovanie esterázových kryštálov
300 μΐ esterázových kryštálov sa pridalo k 5 ml roztoku 12,5 % glutaraldehydu a 0,5 M acetátu sodného s pH 5,5. Sieťovanie kryštálov prebiehalo za mierneho miešania (stir plate) 1 h. Po zosieťovaní sa kryštály premyli tromi objemami po 15 ml 0,5 M acetátu vápenatého s pH 6,3. Esterázové CLEC sa lyofilizovali postupom podľa príkladu 2.
Enzymatická aktivita rozpustnej esterázy a CLEC esterázy
Katalytická aktivita rozpustnej esterázy a CLEC esterázy sa hodnotila spektrofotometricky monitorovaním hydrolýzy substrátu p-nitrofenylacetátu (Fluka) (tabuľka 15 a obr. 7). Štiepenie sa monotorovalo stúpajúcou absorbanciou pri 400 nm. Počiatočná koncentrácia substrátu bola 0,001 %. Koncentrácia enzýmu bola 1.10-8 M. CLEC alebo rozpustný enzým sa pridal k 5 ml reakčnej zmesi, obsahujúcej substrát v 0,25 M acetáte vápenatého s pH 6,3. Ako je uvedené v príklade 2, pred meraním absorbancie sa z reakčnej zmesi odstredením odstránil CLEC enzým.
Tabuľka 15 - aktivita esterázy
absorbancia pri 400 nm
čas (min.) CLEC rozpustný ezným
1 0,0 0,000 0,000
2 0,5 0,770 0,252
3 1,0 0,128 0,297
4 2,0 0,208 0,337
5 3,0 0,260 0,346
6 5,0 0,324 0,353
7 7,0 0,353 0,359
8 10,0 0,369 0,368
Odolnosť proti exogénnej proteolýze
Hodnotenie odolnosti CLEC esterázy proti pôsobeniu proteázy sa vykonalo za rovnakých podmienok ako v prípade termolyzínu (príklad 2). Aktivita rozpustného enzýmu a CLEC po inkubácii s proteázou sa zisťovala hydrolýzou substrátu p-nitrofenylacetátu opísaným spôsobom (tabuľka 16 a obr. 8).
Tabuľka 16 - odolnosť esterázy proti proteolýze
% maximálnej aktivity
čas (min.) CLEC rozpustný enzým
1 0,0 100,0 100,0
2 10,0 68,0
3 20,0 47,0
4 30,0 99,0 25,0
5 45,0 20,0
6 60,0 97,0 16,0
7 120,0 94,0 10,0
8 180,0 91,0 6,0
Príklad 5
Kryštalizácia, sieťovanie a lyofilizácia lipázy a hodnotenie vlastností získaného produktu
Kryštalizácia lipázy
Enzým lipáza (Geotrichum candium) sa kryštalizoval difúziou pár z vodného roztoku 20 mg/ml proteínu v 50 mM Tris s pH 7, obsahujúcom 8 % sulfátu anónneho. Bipyramidálne kryštály boli viditeľné po 20 až 30 dňoch po inkubácii pri teplote miestnosti. Kryštály sa oddelili odstredením, ako je opísané v príklade 2.
Sieťovanie lipázových kryštálov
Lipázovc kryštály sa pridali k roztoku 12,5 % glutaraldehydu a 50 nM Tris s pH 5,6. Kryštály boli sieťované 1 h. Po zosieťovaní sa kryštály premyli tromi objemami po 15 ml 50 mM Tris s pH 7,0. Lipázové CLEC sa lyofilizovali postupom uvedeným v príklade 2.
Enzymatická aktivita rozpustnej lipázy a CLEC lipázy
Katalytická aktivita rozpustnej lipázy a CLEC lipázy sa skúmala spektrofotometricky monitorovaním hydrolýzy substrátu p-nitrofenylacetátu (tabuľka 17 a obr. 9). Štiepenie sa monitorovalo stúpajúcou absorbanciou pri 400 nm. Počiatočná koncentrácia substrátu bola 0,005 %. Koncentrácia enzýmu bola 1,5.10'8 M. C1EC alebo rozpustný enzým sa pridal k 5 ml reakčnej zmesi, obsahujúcej substrát v 0,2 M Tris s pH 7,0, pri teplote miestnosti. Ako je opísané v príklade 2, bol enzým CLEC pred meraním absorbancie z reakčnej zmesi oddelený odstredením.
Tabuľka 17 - aktivita lipázy
absorbancia 400 nm
čas (min.) CLEC rozpustný enzým
1 0,0 0,000 0,000
2 1,0 0,013 0,021
3 5,0 0,094 0,116
4 10,0 0,164 0,186
5 15,0 0,248 0,258
6 30,0 0,346 0,357
7 45,0 0,407 0,420
8 60,0 0,461 0,459
9 90,0 0,497 0,502
Príklad 6
Kryštalizácia, sieťovanie a lyofilizácia lyzozýmu a hodnotenie vlastností získaného produktu
Kryštalizácia lyzozýmu
Metódou podľa Blakea,C. C. F a d., Náture 196: 1173 (1962), sa 200 mg lyofilizovaného lyzozýmu bielka slepačieho vajca (Boehringer Mannheim) pri teplote miestnosti rozpúšťalo v 2,5 ml 0,04 M perte na báze acetátu sodného s pH 4,7. Po zozpustení proteínu sa k roztoku lyzozýmu po kvapkách počas miešania pridalo 2,5 ml 10 % chloridu sodného. Kryštalizačný roztok sa nechal stáť cez noc pri teplote miestnosti a kryštalizácia sa dokončila za 48 h. Kryštály sa oddelili odstredením, ako je opísané v príklade 2.
Sieťovanie kryštálov lyzozýmu
500 μΐ kryštálov lyzozýmu sa pridalo k 10 ml 24 % glutaraldehydu a 50 mM Tris s pH 5,6, obsahujúcemu 20 % chloridu sodnému. Kryštály sa sieťovali 20 min. za mierneho miešania (stir plate). Po zosieťovaní sa kryštály premyli tromi objemami po 50 ml 20 mM acetátu sodného a 50 mM chloridu draselného s pH 5,3. CLEC lyzozýmu sa lyofilizovali postupom podľa príkladu 2.
Enzymatická aktivita rozpustného lyzozýmu a CLEC lyzozýmu
Katalytická aktivita rozpustného lyzozýmu a CLEC lyzozýmu sa skúmala meraním rýchlosti hydrolýzy substrátu 4-metyllumbelliferyl-N-acetylchitriosidu (Fluka) (Yang,Y. a Hamaguchi, K., J. Biochem. 8: 1003 - 1014 (1980) (tabuľka 18 a obr. 10). Uvoľňovanie 4-metyllumbelliferonu sa sledovalo fluorimetricky (Perkin Elmer model LS-50). Počiatočná koncentrácia enzýmu bola 3.10-7. CLEC alebo rozpustný enzým sa pri 42 °C pridal k 2 ml reakčnej zmesi, obsahujúcej substrát v 20 mM acetáte vápenatom a 50 mM chloride draselnom s pH 5,3. Množstvo 4-metyllumbellifcronu sa stanovilo fluorimetricky meraním intenzít fluorescencie pri 450 nm s existenciou pri 360 nm. Šírka štrbiny pre exitáciu i emisiu bola 10 mm. CLEC enzým sa pred meraním fluorescencie z reakčnej zmesi oddelil odstredením podobne ako v príklade 2.
Tabuľka 18 - aktivita lyzozýmu
fluorescencia
čas (min.) CLEC rozpustný enzým
1 0,000 0,000 0,000
2 10,000 4,400 18,900
3 30,000 10,500 29,400
4 60,000 27,500 44,800
5 90,000 33,800 51,700
6 120,000 45,900 59,800
Príklad 7
Kryštalizácia, sieťovanie a lyofilizácia asparaginázy a hodnotenie vlastností získaného produktu
Kryštalizácia asparaginázy
Modifikovaným postupom podľa Grabnera a d. (patent US 3.664.926 (1972)) sa 25 mg lyofilizovanej asparaginázy (Worthington) rozpustilo v 500 μΐ purfe na báze 50 mM fosfátu sodného s pH 7,2. Roztok sa ochladil na 4 °C a pH upravilo na 5,0 1 M kyseliny octovej. Potom sa k roztoku asparaginázy pridal po kvapkách chladný (-20 °C) etanol do konečnej koncentrácie 33 %. Roztok sa inkuboval pri 4 °C. Kryštalizácia sa dokončila po 48 h. Kryštály sa oddelili odstredením ako predtým.
Sieťovanie asparaginázovách kryštálov
Asparaginázové kryštály sa sieťovali v roztoku 7,5 % glutaraldehydu v purfe na báze 50 mM fosfátu sodného s pH 5,6. Po zosieťovaní sa kryštály premyli piatimi objemami po 15 ml 50 mM Tris s pH 7,0. Asparaginázové CLEC sa lyofilizovali postupom podľa príkladu 2.
Enzymatická aktivita rozpustnej asparaginázy a CLEC asparaginázy
Katalytická aktivita rozpustnej asparaginázy a CLEC asparaginázy sa zosieťovala spektrofotometrický meraním vývinu amónneho iónu pri kondenzačnej enzymatickej reakcii (všetky reakčné zložky boli zakúpené v Boehringer Mannheim) (tabuľka 19 a obr. 11):
asparagináza
L-asparagín--------------------------> aspartát + NH4 +
NH4 + + NADH + a-ketoglutarát------------------->
glutamátdehydrogenáza
----------------------> glutámová kyselina + NAD+
Oxidácia NADH sa merala klesajúcou absorbanciou pri 340 nM. Počiatočná koncentrácia NADH bola 1,4 mg/ml. Koncentrácia asparagínu bola 10’3 M. Koncentrácia a-ketoglutarátu bola 10-4 M. Koncentrácia glutamátdehydrogenázy bola 10-7 M. Koncentrácia asparaginázy bola 2,3.10-8 M. Pred meraním absorbancie bol CLEC enzým podobne ako v príklade 2 z reakčnej zmesi oddelený odstredením.
Tabuľka 19 - aktivita asparaginázy
aborbancia 340 nm
čas (min.) CLEC rozpustný enzým
1 0,0 1,000 1,000
2 1,0 0,867 0,825
3 3,0 0,739 0,684
4 5,0 0,603 0,538
5 10,0 0,502 0,406
6 15,0 0,449 0,338
7 30,0 0,328 0,199
8 45,0 0,211 0,187

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Proteínový kryštál zosietený viacfunkčným zosieťovacím činidlom, ktorý je I) odolný proti exogénnej proteolýze tak, že uvedený zosietený proteínový kryštál si udržiava aspoň 91 % svojej stability, ktorá je meraná prostredníctvom degradácie, po inkubácii počas 3 hodín v prítomnosti prípravku Pronase™ v koncentrácii, ktorá spôsobuje stratu aspoň 94 % stability rozpustnej nezosietenej formy proteínu, ktorý' je kryštalizovaný na vytvorenie uvedeného zosieťovaného proteínového kryštálu, pričom uvedená stabilita je meraná prostredníctvom degradácie za zhodných podmienok, alebo II) je odolný proti exogénnej proteolýze tak, že uvedený zosietený proteínový kryštál si udržuje aspoň 91 % svojej počiatočnej aktivity, po inkubácii počas 3 hodín v prítomnosti koncentrácie prípravku Pronase™, ktorá spôsobuje stratu aspoň 94 % aktivity rozpustnej nezosietenej formy proteínu, ktorý je kryštalizovaný na vytvorenie uvedeného zosieťovaného proteínového kryštálu, za zhodných podmienok.
  2. 2. Zosietený proteínový kryštál podľa nároku 1, v ktorom molárny pomer protein:Pronase™je 1:40.
  3. 3. Proteínový kryštál zosietený viacfunkčným zosieťovacím činidlom, ktorý má vyššiu stabilitu pri teplote prekračujúcej teplotu miestnosti v porovnaní s rozpustnou nezosietenou formou proteínu, ktorý je kryštalizovaný na vytvorenie uvedeného proteínového kryštálu, ktorý je zosietený.
  4. 4. Zosietený proteínový kryštál podľa nároku 3, v ktorom uvedená teplota je aspoň 55 °C.
  5. 5. Zosietený proteínový kryštál podľa nároku 3, kde uvedená teplota je aspoň 65 °C.
  6. 6. Enzýmový kryštál zosietený viacfunkčným zosieťovacím činidlom, ktorý má aspoň 50 % katalytickej aktivity rozpustnej nezosietenej formy enzýmu, ktorý je kryštalizovaný na vytvorenie uvedeného zosieťovaného enzýmového kryštálu.
  7. 7. Zosietený kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 6, ktorý je mikrokryštálom.
  8. 8. Zosietený kryštál podľa nároku 7, ktorý má priečny prierez 101 mm.
  9. 9. Zosietený kryštál podľa nároku 7, ktorý má priečny prierez menej ako 10'1 mm.
  10. 10. Zosietený kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 9, ktorý je v lyofilizovanej forme.
  11. 11. Zosietený proteínový kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 5, v ktorom uvedeným proteínom je enzým.
  12. 12. Zosietený proteínový kryštál podľa nároku 11, v ktorom je uvedený enzým zvolený zo skupiny pozostávajúcej z termolyzínu, elastázy, asparaginázy, lyzozýmu, esterázy, lipázy a ureázy.
  13. 13. Zosietený enzýmový kryštál podľa nároku 6, v ktorom uvedený enzým je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z termolyzínu, elastázy, asparaginázy, lyzozýmu, esterázy, lipázy a ureázy.
  14. 14. Spôsob výroby zvoleného produktu s použitím proteínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky: a) kombinovanie aspoň jedného substrátu a aspoň jedného proteínu, ktorý na substrát pôsobí, pričom uvedeným proteínom je zosietený proteínový kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 5 a b) udržovanie kombinácie vytvorenej v kroku a) za podmienok, ktoré umožňujú uvedenému proteínu pôsobiť na substrát, za vzniku zvoleného produktu.
  15. 15. Spôsob výroby zvoleného produktu katalyzovaný enzýmom, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky: a) kombinovanie aspoň jedného substrátu a aspoň jedného proteínu, ktorý na substrát pôsobí, pričom uvedeným proteínom je zosietený enzýmový kryštál podľa niektorého z nárokov 6, 11,12 alebo 13 a b) udržovanie kombinácie vytvorenej v kroku a) za podmienok, ktoré umožňujú uvedenému proteínu pôsobiť na substrát, za vzniku zvoleného produktu.
  16. 16. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený produkt sa zvolí zo súboru pozostávajúceho z peptidov, uhľovodíkov a lipidov.
  17. 17. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že podmienky v kroku b) zahŕňajú hodnotu pH medzi 5 a 10.
  18. 18. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že uvedeným substrátom je organický polymér.
  19. 19. Spôsob výroby aspartámu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky: a) kombinovanie dvoch peptidov a zosieteného kryštálu termolyzínu podľa nároku 12 alebo 13, pričom prvý peptid má vzorec Z-L-Asp a druhý peptid má vzorec L-Phe-OMe, za podmienok vhodných na kondenzáciu dvoch peptidov prostredníctvom pôsobenia uvedeného zosieteného kryštálu termolyzínu, za vzniku čiastočne chráneného dipeptidu vzorca Z-L-Asp-L-Phe-OMe, v ktorom Z predstavuje benzyloxykarbonylovú skupinu a b) odstránenie uvedenej benzyloxykarbonylovej skupiny z uvedeného dipeptidu, za vzniku aspartámu.
  20. 20. Zariadenie, vyznačujúce sa tým, že zahŕňa zosietený proteínový kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 5 alebo zosietený enzýmový kryštál podľa niektorého z nárokov 6, 11, 12 alebo 13, a zadržovací prostriedok pre uvedený zosietený proteínový alebo enzýmový kryštál, pričom uvedený zadržovací prostriedok pozostáva z materiálu, ktorý umožňuje kontakt medzi uvedeným zosieteným proteínovým alebo enzýmovým kryštálom a substrátom, na ktorý pôsobí proteín alebo enzým, pričom substrát je prítomný v kvapaline.
  21. 21. Biosenzor na detekciu analytu v kvapaline, vyznačujúci sa tým, že obsahuje: a) zosietený proteínový kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 5 alebo zosietený enzýmový kryštál podľa niektorého z nárokov 6, 11,12 alebo 13, v ktorom tento proteín alebo enzým pôsobí na sledovaný analyt alebo na reagens v reakcii, ktorej sa zúčastní sledovaný analyt a b) zadržovací prostriedok pre uvedený zosietený proteínový alebo enzýmový kryštál, pričom zadržovací prostriedok pozostáva z materiálu, ktorý umožňuje kontakt medzi uvedeným zosieteným proteínovým alebo enzýmovým kryštálom a kvapalinou, pričom uvedená kvapalina obsahuje buď 1. analyt, na ktorý pôsobí proteín, alebo enzým, alebo 2. reagens pre reakciu, ktorej sa analyt zúčastní.
  22. 22. Biosenzor podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa prostriedok na detekciu aktivity uvedeného proteínu alebo enzýmu na uvedený analyt alebo reagens.
  23. 23. Biosenzor podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedený zosietený proteínový alebo enzýmový kryštál je kryštál luciferázy, v ktorom luciferáza pôsobí na sledovaný analyt alebo na produkt reakcie, ktorej sa sledovaný analyt zúčastňuje, pričom uvedený zadržovací prostriedok pozostáva z materiálu, ktorý umožňuje kontakt medzi uvedeným zosieteným kryštálom luciferázy a kvapalinou, pričom uvedená kvapalina obsahuje buď 1. analyt, na ktorý luciferáza pôsobí, alebo 2. produkt reakcie, ktorej sa analyt zúčastňuje.
  24. 24. Spôsob detekcie sledovaného analytu v kvapaline, zahŕňajúci použitie biosenzora podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že sledovaný analyt je zvolený zo súboru pozostávajúceho z glukózy, kreatinínu, močoviny, laktátu, glukóza-6-fosfátu, sacharózy, ATP, etanolu, kyseliny octovej, kyseliny mravčej, cholesterolu, kyseliny močovej, metotrexátu, oxidu uhličitého, aminokyselín, fosfátov, penicilínov, dusičnanov, dusitanov, síranov a sukcinátu.
  25. 25. Mimotelové zariadenie na použitie na zmenu zložky kvapaliny, vyznačujúce sa tým, že obsahuje: a) zosietený proteínový kryštál podľa niektorého z nárokov 1 až 5 alebo zosietený enzýmový kryštál podľa niektorého z nárokov 5, 11, 12 alebo 13, v ktorom prítomný proteín alebo enzým pôsobí na zložku alebo na reagens pri reakcii, ktorej sa zložka zúčastní a b) zadržovací prostriedok pre uvedený zosietený proteínový alebo enzýmový kryštál, pričom zadržovací prostriedok pozostáva z materiálu, ktorý umožňuje kontakt medzi uvedeným zosieteným proteínovým alebo enzýmovým kryštálom a kvapalinou, pričom uvedená kvapalina obsahuje buď 1. zložku, na ktorú pôsobí proteín, alebo enzým, alebo 2. produkt reakcie, ktorej sa zúčastní uvedená zložka.
  26. 26. Spôsob zmeny zložky kvapaliny, kde uvedená zložka sa zvoli zo súboru zahŕňajúceho asparagín, heparín, bilirubín, metotrexat, aminokyseliny, močovinu a amoniak, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok kontaktovania uvedenej kvapaliny s mimotelovým zariadením podľa nároku 25, v čase dostatočnom na umožnenie zadržania zosieteného proteínového kryštálu alebo zosieteného enzýmového kryštálu v tomto zariadení na účinok na 1. uvedenú zložku kvapaliny alebo 2. produkt reakcie, ktorej sa zúčastní uvedená zložka.
  27. 27. Spôsob zmeny zložky kvapaliny, kde uvedená zložka sa zvolí zo súboru zahŕňajúceho asparagín, heparín, bilirubín, metotrexát, aminokyseliny, močovinu a amoniak, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok kontaktovania uvedenej kvapaliny so zariadením podľa nároku 20, v čase dostatočnom na umožnenie zadržania zosieteného proteínového kryštálu alebo zosieteného enzýmového kryštálu v tomto zariadení na účinok na uvedený substrát, ktorý je uvedenou zložkou kvapaliny.
SK59-93A 1990-08-03 1991-07-30 Zosietené kryštály proteínov, zariadenie ich obsahujúce a ich použitie SK283185B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56228090A 1990-08-03 1990-08-03
PCT/US1991/005415 WO1992002617A1 (en) 1990-08-03 1991-07-30 Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK5993A3 SK5993A3 (en) 1993-07-07
SK283185B6 true SK283185B6 (sk) 2003-03-04

Family

ID=24245600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK59-93A SK283185B6 (sk) 1990-08-03 1991-07-30 Zosietené kryštály proteínov, zariadenie ich obsahujúce a ich použitie

Country Status (26)

Country Link
EP (2) EP0861888B1 (sk)
JP (2) JPH05508549A (sk)
AT (2) ATE240391T1 (sk)
AU (1) AU662104B2 (sk)
BR (1) BR9106732A (sk)
CA (1) CA2087730C (sk)
CZ (1) CZ12393A3 (sk)
DE (2) DE69133258T2 (sk)
DK (2) DK0861888T3 (sk)
ES (2) ES2263187T3 (sk)
FI (1) FI120099B (sk)
HK (2) HK1012411A1 (sk)
HU (2) HUT65904A (sk)
IE (1) IE912767A1 (sk)
IL (1) IL99046A (sk)
LT (1) LT3366B (sk)
LV (1) LV10304B (sk)
MD (1) MD1592B2 (sk)
NO (1) NO930360L (sk)
PT (1) PT98564B (sk)
RU (1) RU2124052C1 (sk)
SG (1) SG70966A1 (sk)
SK (1) SK283185B6 (sk)
TJ (1) TJ210R3 (sk)
UA (1) UA27035C2 (sk)
WO (1) WO1992002617A1 (sk)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932212A (en) * 1996-05-24 1999-08-03 Altus Biologics, Inc. Crosslinked protein crystal formulations and their use as catalysts in organic solvents
AU4738197A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Altus Biologics Inc. Crosslinked protein crystals as universal separation media
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
ATE397013T1 (de) 1997-09-05 2008-06-15 Altus Pharmaceuticals Inc Kohlenhydrat-vernetzte glykoproteinkristalle
US6500933B1 (en) 1997-09-05 2002-12-31 Altus Biologics Inc. Methods of preparing carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
US6979561B1 (en) 1998-10-09 2005-12-27 Gilead Sciences, Inc. Non-homogeneous systems for the resolution of enantiomeric mixtures
GB9823334D0 (en) 1998-10-23 1998-12-23 Darwin Discovery Ltd Enzyme coupling
US20020182201A1 (en) * 2001-02-16 2002-12-05 Guiyi Zhang-Sun Matrix stabilized enzyme crystals and methods of use
US7241272B2 (en) 2001-11-13 2007-07-10 Baxter International Inc. Method and composition for removing uremic toxins in dialysis processes
DK1699921T3 (da) * 2004-01-01 2010-02-01 Council Scient Ind Res Fremgangsmåde til fremstilling af tværbundne proteinkrystaller
ES2314646T3 (es) 2004-03-22 2009-03-16 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Composiciones farmaceuticas por via de productos que contienen lipasa , en particular de pancreatina, que contienen tensioactivos.
EP1809320B1 (en) 2004-10-14 2010-07-21 Altus Pharmaceuticals Inc. Compositions containing lipase; protease and amylase for treating pancreatic insufficiency
RU2413532C2 (ru) 2005-07-29 2011-03-10 Зольвай Фармасьютиклз Гмбх Способ получения стерилизованного порошкообразного панкреатина
US11266607B2 (en) 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US9198871B2 (en) 2005-08-15 2015-12-01 Abbott Products Gmbh Delayed release pancreatin compositions
US10072256B2 (en) 2006-05-22 2018-09-11 Abbott Products Gmbh Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample
JP5248676B2 (ja) 2009-05-22 2013-07-31 サンヨー食品株式会社 不斉酸化反応を有する蛋白質複合体およびその製造方法
EP2478005B1 (en) 2009-09-15 2014-11-12 Ajinomoto Althea, Inc. Protein a crystals and cross-linked crystals and methods of use thereof
WO2012026493A1 (ja) * 2010-08-26 2012-03-01 アイシン精機株式会社 酵素結晶固定化電極及び酵素結晶固定化電極の製造方法、並びに酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池及びバイオセンサー
DK3003358T3 (da) * 2013-06-07 2021-06-21 Allena Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og anordninger til dialyse
WO2016126970A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Abbvie Inc. Pharmaceutical compositions and methods of use thereof to treat pancreatic enzyme insufficiency
DK3638293T3 (da) * 2017-06-15 2023-11-06 Univ Chicago Sammensætninger til behandling af cancer
WO2023194615A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Need4Health B.V. Method for determining insulin dosage

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3664926A (en) 1970-02-26 1972-05-23 Merck & Co Inc Crystallization of l-asparaginase
DE2801238C2 (de) 1977-01-27 1986-06-05 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern
US4373023A (en) * 1980-10-14 1983-02-08 Massachusetts Institute Of Technology Process for neutralizing heparin
DE3381980D1 (de) * 1982-04-23 1990-12-13 Wako Pure Chem Ind Ltd Verfahren zur halbsynthese von menschlichem insulin und dazu zu verwendende alkalische protease.
US4411996A (en) * 1982-06-30 1983-10-25 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
WO1985003247A1 (en) * 1984-01-20 1985-08-01 Eye Products Limited Partnership Method for cleaning contact lenses
FR2566798B1 (fr) * 1984-06-27 1986-12-12 Centre Nat Rech Scient Membrane porteuse de la luciferase pour le dosage de l'atp et son procede de production
US4650758A (en) * 1984-09-21 1987-03-17 Cetus Corporation Stabilization of enzymes useful in the production of glucosone and other enzymatic processes
JPS6317691A (ja) * 1986-07-09 1988-01-25 Agency Of Ind Science & Technol アスパルテ−ム製造用固定化酵素
FI85285C (fi) * 1988-05-13 1992-03-25 Stabra Ag Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2199933T3 (es) 2004-03-01
MD1592B2 (ro) 2001-01-31
HK1012411A1 (en) 1999-07-30
LV10304A (lv) 1994-10-20
LT3366B (en) 1995-07-25
DK0550450T3 (da) 2003-09-08
HU9300275D0 (en) 1993-04-28
LV10304B (en) 1995-06-20
CA2087730C (en) 1999-07-20
FI930454A (fi) 1993-02-02
FI930454A0 (fi) 1993-02-02
NO930360L (no) 1993-04-02
JP2004000230A (ja) 2004-01-08
IL99046A0 (en) 1992-07-15
WO1992002617A1 (en) 1992-02-20
ATE323158T1 (de) 2006-04-15
EP0550450B1 (en) 2003-05-14
HK1023362A1 (en) 2000-09-08
RU2124052C1 (ru) 1998-12-27
ES2263187T3 (es) 2006-12-01
FI120099B (fi) 2009-06-30
IL99046A (en) 1998-09-24
IE20040113A1 (en) 2004-05-05
EP0861888B1 (en) 2006-04-12
SK5993A3 (en) 1993-07-07
DE69133258D1 (de) 2003-06-18
HUT65904A (en) 1994-07-28
EP0550450A1 (en) 1993-07-14
SG70966A1 (en) 2000-03-21
DE69133521D1 (de) 2006-05-24
AU8315491A (en) 1992-03-02
NO930360D0 (no) 1993-02-02
CA2087730A1 (en) 1992-02-04
BR9106732A (pt) 1993-08-17
JPH05508549A (ja) 1993-12-02
TJ210R3 (en) 1998-11-14
ATE240391T1 (de) 2003-05-15
PT98564B (pt) 1999-01-29
PT98564A (pt) 1992-06-30
DE69133521T2 (de) 2006-12-07
DK0861888T3 (da) 2006-08-14
LTIP1077A (en) 1995-04-25
AU662104B2 (en) 1995-08-24
EP0861888A1 (en) 1998-09-02
DE69133258T2 (de) 2004-03-18
UA27035C2 (uk) 2000-02-28
HU211521A9 (en) 1995-11-28
CZ12393A3 (en) 1993-10-13
IE912767A1 (en) 1992-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5618710A (en) Crosslinked enzyme crystals
EP0550450B1 (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
IE83874B1 (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
Spiekerman et al. Leucostoma peptidase A: a metalloprotease from snake venom
US5801022A (en) Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin
Everse et al. Immobilized enzymes in biochemical analysis
Rai et al. Production of D-amino acids using immobilized D-hydantoinase from lentil, Lens esculenta, seeds
NZ264042A (en) Crosslinked crystalline immobilized protein, biosensor containing the crosslinked protein crystal
IE85134B1 (en) Use of Crosslinked Crystals as a Novel Form of Enzyme Immobilization
FR2495619A1 (fr) Procede de preparation de proteines semi-synthetiques par alteration chimique d'un substrat specifique
Roy et al. α-Chymotrypsin shows higher activity in water as well as organic solvents after three phase partitioning
Chen et al. The effects of N‐thiophosphoryl amino acids on the activity of green crab (Scylla Serrata) alkaline phosphatase
Fatibello-Filho et al. Enzyme electrode for the determination of aspartate
CA2442524A1 (en) Matrix stabilized enzyme crystals and methods of use
Inada et al. Fibrin membrane endowed with biological function VI. Immobilization of multienzymes of urea cycle
Hagiwara et al. Fibrin membrane endowed with biological function VII. An approach to an artificial liver; Conversion of ammonia to urea invitro
KR100392779B1 (ko) 고정화 아미노펩티다제를 이용한천연형 재조합단백질의 제조방법
Sabina A Simplified Method for Determination of Amino Acid Amidases in Tissue Cultures.
SK70898A3 (sk) Spôsob prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu
LIU ISOLATION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20110730