JPH05508549A - 新規な酵素固定化形態としての架橋結合された結晶の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な酵素固定化形態としての架橋結合された結晶の使用関連出願 本出願は１９９０年８月３日に出願されそして「新規な酵素固定化形としての架 橋結合された結晶の使用」という名称のＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７１５６２ ．２８０の一部継続出願である。Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７１５６２，２８０の教示 はここでは参考として記しておく。

発明の背景 酵素はファインケミカルおよび特殊化学品の規模および研究室規模の経済的製用 の工業用触媒として（ジ式−ンズ（Ｊｏｎｅｓ）、　Ｊ　、　Ｂ、、テトラヘド ロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、４２　：　３３５１−３４０３　（１９８６ ））　、食品の製造用に（ザ・ｙクス（Ｚａｋｓ）他、トレンズ・イン・バイオ テクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６　：　 ２７２−２７５　（１９８８）　）、並びに有機化合物の合成用手段として（オ ン（ｌｏｎｇ）、　Ｃ，−Ｈ，、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４４　：　 １１４５−１１５２　（１９８９）　、ＣＨＥＭＴＲＡＣＴＳ−Ｏｒｇ、Ｃｈｅ ｔ、３　：　９１−１１１　（１９９０）　：リバノフ（Ｋ）、ｆｂａｎｏｖ） 。

Ａ、Ｍ、、　Ａｃｅ、　Ｃｈｅｔ　Ｒｅｓ、、２３　：１１４−１２０　（１９ ９０））使用されている。

酵素であるニトリルヒドラターゼを使用するアクリルアミドの大規模製造で示さ れている如く（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｖａ）、　Ｔ、およびヤマダ（Ｙａｍａ ｄａ）、　Ｈ，、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎａｌｎｇｙ）、７　：１５３−１５８　（１９８９））　、酵 素を基にした製造はそうでないと使用できないような化学的中間生故物の大規模 製造に内在する環境汚染問題を相当減少させる。

酵素は臨床的、工業的および他の目的の種々の物質を検出するためのバイオセン サー用途でも使用されている（ホール（Ｈａｌｌ）、　Ｅ、、「バイオセンサー ズ（Ｂｉｏｓｅｎｓａｏｒｓ）Ｊ　、オーブン・ユニバーシティ・プレス（１９ ９０））。臨床的分野では、酵素は例えば血液透析および血液濾過の如き体外治 療において使用されており、そこでは酵素が血液から廃棄物および毒性物質を選 択的に除去している（クライン（＋（１ｅｉｎ）、　Ｍ、およびランガー（Ｌａ ｎｇｅｒ）、　Ｒ，、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４　：１７９−１３５　（１９８６））、酵 素は広範囲の反応型に対する触媒として穏やかな温度においてそして基質を特異 的且つ立体選択的に用いて有効に作用するため、酵素はこれらの分野で使用され ている。それにもかかわらず、工業的および研究室用の化学的方法において用途 が限定されている可溶性酵素触媒の使用に伴われる欠点がある（アキャｖ　（Ａ ｋｉｙａｓａ）他、ＣＢＥＭＴＥＣＨ１６２７−６３４（１９８８））。

酵素が正常に機能する水性媒体中で使用される時でさえ、酵素は多くの工業的お よび研究室用触媒と比べて高価であり且つ比較的不安定である。一般的に実施さ れている比較的経済的に有利な化学反応の多くは水性媒体とは非相容性であり、 そこでは例えば基質および生成物はしばしば不溶性であるかまたは不安定であり 、そしてそこでは加水分解がかなり競合する。さらに、供給原料中での生成物お よび未反応基質からの可溶性酵素触媒の回収ではＷＩＮで且つ費用のかかる分離 技術の適用が必要である。最後に、酵素は冷蔵（４℃〜−８０℃〜液体Ｎ２温度 ）または水性媒体中での適当なイオン強度、ｐＨなどにたよらずにそれらの活性 および機能保全性を商業的に妥当な期間（数カ月ないし数年間）にゎたり保有し ているような方法で貯蔵することは困難である。

酵素固定化方法により、多くの場合、これらの欠点が回避される。固定化は酵素 触媒の安定性を改良しそして工業的および研究室用の化学的方法の苛酷な溶媒環 境および極端な温度特性におけるそれらの機能保全性を守ることができる（ハー トマイエル（■ａｒｔ■ｅｉｅｒ）、　Ｗ、、トレンズ・イン・バイオテクノロ ジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３　：１４９−１ ５３　（１９８５）’）。連続流方法をカラム中で固定化された酵素粒子を用い て操作することができ、例えばそこでは可溶性供給原料が粒子上を通過しそして 徐々に生成物に転化される。

ここで使用されている酵素固定化という語は肉眼的（１，０−Ｉｍｍ）粒子に対 する結合、該粒子のカプセル化、または該粒子中での集塊化による酵素触媒の不 溶性化を称している。

酵素固定化方法の多数の有用な論文が文献中に発表されている（マウ７　（Ｍａ ｕｇｈ）、　Ｔ、　Ｈ，、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３　：　４７４ −４７６　（１９８４Ｌｌ−ランバー（Ｔｒａ■ｐｅｒ）、　Ｊ、、トレンズ・ イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）、３　：　４５−５０　（１９８５））。

マウフは酵素の固定化に関する５種の一般的方式を記載している。これらには、 固体担体（例えばイオン−交換樹脂）上の吸着、担体（Ｎえばイオン−交換樹脂 、多孔性セラミックまたはガラス球）に対する共有結合、重合体状ゲル中での捕 獲、カプセル化、および可溶性蛋白質を不規則的且つ不定的方法で二官能性試薬 と架橋結合させることによる該蛋白質の沈澱が包含される。さらに、高水準で希 望する酵素活性を示す細胞全体（一般的には死んでおりそして透過性にされてい る）を固定化することもできる（ｆＰＩＪえば、ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ） 、　Ｔ、およびヤマダ（Ｙａｍａｄａ）。

Ｈ，、）Ｌ／：／ズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７　：１５３−１５８　（１９８９）　）。

これらの固定化工程のそれぞれはそれ自身の利点および限界を有しており、そし て誰もどれが最適であるかまたは有力であるか考察することはできない。それら のほとんどでは、酵素触媒が究極的には化学反応器中に存在している物質の合計 量の小部分だけに相当している。それ自体では、固定化された媒体の塊は不活性 なしばしば高価な担体物質から製造されいる。それらの全てにおいて、酵素触媒 分子同士のおよび／またはそれと担体物質との固定化相互反応は不規則的且つ不 定的である傾向がある。その結果として、これらの相互反応は酵素触媒分子にあ る程度の増加された安定性を与えるが、それらの相対的な非−特異性および不規 則性のまた、それの安定化は最適以下のもので且つ不規則的になっている。多（ の場合、酵素触媒の活性部位への到達は不適切に規定されたままである。さらに 、上記の固定化方法は貯蔵および冷蔵に関する問題の処理に失敗している。酵素 の構造的および機能的保全性に危険を与えずに一方または他方の選択溶媒と交換 される際に従来法で固定化された酵素を一般的に処理することはできない。実用 的見地からは、担体粒子に対する連結された範囲を除くと従来法で固定化された 酵素は可溶性酵素と非常に似ており、そして変性に対する敏感性および苛酷な環 境下での機能の損失をそれらと共有している。一般的には、固定化方法は観察さ れた酵素で触媒作用を受ける反応速度を溶液中で得られるものと比べて減少させ る。これはほとんどが、基質の内部拡散の制限および固定化された酵素粒子内の 生成物の外部拡散の結果である（クインチｇ　（Ｑｕｉｎｃｈｏ）、　Ｆ、　Ａ 、およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、　Ｆ、Ｍ、、バイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５　：４０６２−４０７６　（１９６７））、固 定化された酵素粒子中での不活性担体の必然的な存在が固定化された酵素粒子と 酵素触媒の活性部位との間の平均自由通路を増加させており、従ってこれらの拡 散問題を悪化させる。固定化された細胞を処理する時には、細胞壁および膜が基 質および生成物に対して何らかの方法で透過性にされていても、拡散問題は特に ひどい。さらに汚染性酵素活性、代謝産物、および細胞中に含まれている毒素の 程度、並びに苛酷な溶媒中での細胞の安定性または極端な温度操作環境にも関連 するであろう。工業的触媒としての酵素の使用を促進させる際には、特に大規模 で有用であると示されているなら、現存する方法の制限を避ける改良された固定 化技術が役立つであろう（ダニエルス（Ｄａｎｉｅｌｓ）、　Ｍ、　Ｊ　、、メ ソッズ・イン・エンチモロジー（ｌｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ）、１３６　：　３７１−３７９　（１９本発明は、酵素の結晶を製造しそし て一般的には生じた結晶を二官能性試薬の使用により架橋結合することによる酵 素の固定化方法、この方法により製造された架橋結合され固定化された酵素結晶 （ＣＬＥＣ類またはＣＬＩＥＣ類と称されている）、固定化された酵素の貯蔵、 取り扱いおよび処理性質を改良する手段としてのＣＬＥＣ類の凍結乾燥、並びに ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組により触媒作用を受ける反応による希望する生成 物の製造方法に関するものである。

本発明の方法では、酵素触媒がその中で構造的にまたは機能的に安定性であるよ うな水溶液または有機溶媒を含有している水溶液から小さい（１０”ｍｍ）蛋白 質結晶を成長させる。好適態様では、結晶を次に例えばグルタルアルデヒドの如 き二官能性試薬を用いて架橋結合する。この架橋結合が結晶を構成している個別 酵素触媒分子間の結晶格子接触を安定化させる。この安定化が付与される結果と して、架橋結合され固定化された酵素結晶は高温、極端なｐＨおよび苛酷な水性 、有機性もしくはほぼ無水の媒体中、またはこれらの混合された条件下で機能す ることができる。すなわち、本発明のＣＬＥＣは、対応する結晶化されておらず 架橋結合されていない天然の酵素または従来法で固定化された酵素触媒の機能保 全性とは非相容性である環境下で、機能することができる。

さらに、この方法により製造されるＣＬＥＣ類は凍結乾燥を受けて凍結乾燥され たＣＬＥＣが製造され、それはこの凍結乾燥形で非冷蔵温度（室温）で長期間に わたり貯蔵することができそして非晶質懸濁液を生成せずに且つ最少の変性危険 性で選択された水性、有機性、または混合された水性−有機性溶媒中で容易に再 構築することができる。

本発明はまた、本方法により製造されたＣＬＥＣ類並びに例えば偏光性有機分子 、ペプチド類、炭水化物類、脂質類、または他の化学種の如き選択された物質の 研究室用および大規模な工業用製造におけるそれらの使用にも関するものである 。現在では、典型的にはこれらは、結晶化されておらず架橋結合されていない天 然の酵素触媒の機能保全性と非相容性である苛酷な条件（例えば、水性、有機性 もしくはほぼ無水の溶媒、混合された水性／有機性溶媒、または高温）を必要と する従来の化学的方法により、製造されている。これまでに提唱されているＣＬ ＥＣ技術に触媒活性を有する他の高分子を加えることもできる。これらには触媒 性抗体（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、　Ｒ，Ａ、、ペンコヴイック（Ｂｅｎｋｏ ｖｉｃ）、　Ｓ、　Ｊ　。

およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、　Ｐ、　Ｇ、、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）、２５２　：　６５９−６６７　（１９９１））および触媒性ポリヌクレオ チド類（セラシュ（Ｃｅｃｈ）、　Ｔ、　Ｒ，、セル（Ｃｅｌｌ）、６４　：　 ６６７−６６９　（１９９１）　、セランダー（Ｃｅｌａｎｄｅｒ）、　Ｄ、　 Ｗ、およびセラシュ（Ｃｅｃｈ）、　Ｔ、　Ｒ，、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）、２５１　：　４０１−４０７　（１９９１）　）が包含されるであろう。

本発明はまた、本発明のＣＬＥＣにより触媒作用を受ける反応による選択された 生成物の製造方法にも関するものである。

本発明の方法および実施の第−例では、酵素サーモリシンである亜鉛メタロプロ テアーゼを使用してジペプチジル人工甘味料であるアスパルターメの偏光性先駆 体を合成した。酵素サーそりシンを４５％のジメチルスルホキシド、および５５ ％の１．４Ｍ酢酸カルシウム、０．０５Ｍカコジル酸ナトリウムからなるｐＨ６ ，５の出発水溶液から結晶化させた。

生じた結晶をグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、サーモリシンＣＬＥＣ を生成した。次にサーモリシンＣＬＥＣを、それが製造された結晶化水溶液から 、基質類であるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−アスバルチン酸（Ｚ− Ｌ−Ａｓｐ）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ ）を含有している酢酸エチルの溶液中に移した。次にサーモリシンＣＬＥＣを使 用して、２種の基質類の縮合反応に触媒作用を与えて、人工甘味料であるアスパ ルターメのジペプチジル先駆体であるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ− アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｚ−Ｌ−Ａｓ　ｐ−Ｌ− Ｐｈ　ｅ−ＯＭｅ）を合成した。多くの既知の技術（例えば、リンデベルグ（Ｌ ｉｎｄｅｂｅｒｇ）、　Ｇ、　、ジャーナル・オブ・ケミカル・エジュケーショ ン（Ｊ、　Ｃｈｅ■Ｅｄ、）、６４　：　ｔ０６２−１０６４　（１９８７）） を使用して、合成されたジペプチジル先駆体中のし一アスバルチン酸をベンジル オキシカルボニル（Ｚ−）基の除去により保護基を除いてアスパラターメ（Ｌ− Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）を製造することができる。

本発明の方法および実施の第二例では、酵素サーモリシンを使用してサーモリシ ンＣＬＥＣ類を製造した。サーモリシンＣＬＥＣ１ｉの活性オよび安定性を、有 機溶媒の存在下での培養後および外因性プロテアーゼの存在下での培養後に、最 適条件下並びに極端なｐＨおよび温度の条件下で、可溶性サーモリシンのものと 比較した。

酵素サーモリシンを１．２Ｍ酢酸カルシウムおよび３０％ジメチルスルホキシド のｐＨ８，０の溶液から結晶化させた。生じた結晶を１２．５％の濃度のグルタ ルアルデヒドを用いて架橋結合して、サーそりシンＣＬＥＣを生成した。次にサ ーモリシンＣＬＥＣを標準的工程（クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、　Ｔ、　Ｇ、、 ザ・ツールズ・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈｅ　Ｔｏｏｌｓ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３７９−３８０頁（ジコーン・ウィリー・アンド・サン ズ、ニューヨーク（１９７７））により凍結乾燥して、サーそりシンの凍結乾燥 された酵素ＣＬＥＣを生成した。次に凍結乾燥されたＣＬＥＣを、溶媒交換工程 の介在なしに、非晶質懸濁液を生成せずに、且つ最少の変性危険性で、選択され た収率の水性、有機性、および混合された水性／有機性溶媒中に直接移す。これ らの溶媒には、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、およびテトラヒドロフ ランが包含されるが、他のものであってもよい。培養後に、活性を分光計的にジ ペプチド基質ＦＡＧＬＡ　（フリールアクリロイル−グリシル−し−ロイシンア ミド）の切断により評価した。

本発明の方法および実施の第三例では、酵素エラスターゼ（豚の膵臓）を５．５ ｍｇ／ｍｌの蛋白質の０．１Ｍ酢酸ナトリウム中のｐＨ５，０の水溶液から室温 において結晶化させた（ソーヤ−（Ｓａｗｙｅｒ）、　Ｌ、他、ジャーナル・オ ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　ｌ１ｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１１８： １．３７−２０８）。生じた結晶を５％の濃度のグルタルアルデヒドを用いて架 橋結合して、エラスターゼＣＬＥＣを生成した。エラスターゼＣＬＥＣを実施例 ２中に紀されている如くして凍結乾燥した。

本発明の方法および実施の第四例ではそしてここに開示されている如く、酵素エ ステラーゼ（豚の肝臓）を１５ｍｇ／ｍ１の蛋白質の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム 中のｐＨ５，６の水溶液から室温において結晶化させた。生じた結晶を１２．５ ％のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、エステラーゼＣＬＥＣを生成し た。エステラーゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如（して凍結乾燥した。

本発明の方法および実施の第五例ではそしてここに開示されている如く、酵素リ パーゼ（ジオトリクム・カンジズム）を２０ｒｎｇ／ｍｌの蛋白質の５０ｍＭ） リス中のｐＨ７の水溶液から室温において結晶化させた。生じた結晶を１２，５ ％のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、リパーゼＣＬＥＣを生成した。

リパーゼＣＬＥＣを実施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。

本発明の方法および実施の第六例では、酵素リゾデーム（鶏卵白）を４０ｍｇ／ ｍＩの蛋白質の５％塩化すｌ・リウム含有４０ｒｎＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の ｐＨ７，４の水溶液から室温において結晶化させた（ブレーキ（Ｂｌａｋｅ）、 　Ｃ，Ｃ，Ｆ、他、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、１９６：１１７３（１９６ ２））０生じた結晶を２０％の濃度のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して 、リゾチームＣＬＥＣを生成した。リゾチームＣＬＥＣを実施例２中に記されて いる如（して凍結乾燥した。

本発明の方法および実施の第七例では、酵素アスパラギナーゼ（大腸菌）を２５ ｍｇ／ｍｌの蛋白質の５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび３３％エタノール中のｐＨ ５，０の水溶液から４℃において結晶化させた。結晶化はゲラブナ−（Ｇｒａｂ ｎｅｒ）他により記されている工程の変法であった［米国特許３，６６４．９２ ６　（１９７２）］。ここで開示されている如くして、生じた結晶を７．５％の 濃度のグルタルアルデヒドを用いて架橋結合して、アスパラギナーゼＣＬＥＣを 生成した。アスパラギナーゼＣＬ　Ｅ　Ｃを実施例２中に記されている如（して 凍結乾燥した。

同様な方法で固定化しそして適切な反応に触媒作用を与えるために使用すること のできる他の酵素には、ルシフェラーゼおよびウレアーゼが包含される。例えば 表１−５に挙げられているものの如き他の酵素を本方法を用いて結晶化しそして 架橋結合して希望するＣＬＥＣを製造することもでき、それを選択された生成物 を製造する反応に触媒作用を与えるためまたは選択された生成物の製造における 中間段階（すなわち一連の反応の一段階）である反応に触媒作用を与えるために 使用することができる。架橋結合は結晶の大部分を安定化させるのに役立つが全 ての場合に必要であったりまたは望ましいとは限らないということを認識すべき である。ある種の結晶性酵素は架橋結合なしでも苛酷な環境下で機能的および構 造的保全性を保有している。好適態様では結晶は架橋結合されているが、本方法 で有用な酵素結晶を製造するために架橋結合は必ずしも常に必要なものではない 。

ＣＬＥＣ類は現在使用されている従来の酵素固定化方法と比べて相当な利点を与 えるいくつかの重要な特徴を有している。不活性担体なしということにより、Ｃ ＬＥＣ類内の基質および生成物の拡散性質が改良され、そしてそのような寸法の 分子に関する理論的充填限度に近い結晶内での酵素濃度を与えることとなろう。

高い酵素濃度は、一定容量の触媒の有効活性の増加、酵素との基質接触時間の短 縮、並びにプラント寸法および容積費用の全体的減少により、相当な操作上の経 済性をもたらすことができる（ダニエルズ（Ｄａｒ＋１ｅｌｓ）、　Ｍ、　Ｊ　 、、メソッズ・イン・エンライモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌ、　）、１３６　：　３７１−３７９　（１９８７））。ＣＬＥＣ類中の成分 酵素の結晶容量および安定性増加に関する均一性により、例えば高温、および水 性、有機性またはほぼ無水の溶媒、並びにこれらの混合物の如き苛酷な条件下で の酵素触媒の使用に関する新しい機会が生まれる。さらに、制限された溶媒入手 性および結晶格子中に内在する規則的な蛋白質環境が、従来法で固定化された酵 素系と比べて改良された金属イオンおよびＣＬＥＣ類に関する補助因子保有性を もたらすはずである。

図面の簡単な記載 図１は可溶性およびサーモリシンＣＬＥＣの酵素活性の評価の結果のグラフ表示 である。

図２はサーモリシンＣＬＥＣおよび可溶性サーモリシンのｐＨ依存性の比較の結 果のグラフ表示である。

図３は６５℃における培養後の可溶性および結晶性サーモリシンの活性の測定値 のグラフ表示である。

図４は外因性蛋白分解劣化に対する可溶性およびサーモリシンＣＬＥＣの耐性の 評価の結果のグラフ表示である。

図５は可溶性エラスターゼおよび対応するエラスターゼＣＬＥＣに関する酵素活 性の評価の結果のグラフ表示である。

図６は外因性蛋白分解劣化に対する可溶性エラスターゼおよび対応するエラスタ ーゼＣＬＥＣの耐性のグラフ表示である。

図７は可溶性エステラーゼおよび対応するエステラーゼＣＬＥＣに関する酵素活 性の評価の結果のグラフ表示である。

図８は外因性蛋白分解劣化に対する可溶性エステラーゼおよび対応するエステラ ーゼＣＬＥＣの耐性のグラフ表示である。

図９は可溶性リパーゼおよび対応するリパーゼＣＬＥＣに関する酵素活性の評価 の結果のグラフ表示である。

図１０は可溶性リゾチームおよび対応するりゾチームＣＬＥＣに関する酵素活性 の評価の結果のグラフ表示である。

図１１は可溶性アスパラギナーゼおよび対応するアスパラギナーゼＣＬＥＣに関 する酵素活性の評価の結果のグラフ表示である。

発明の詳細な記載 合成化学者にとって興味があり且つ現在利用できる方法を用いて酵素と共に使用 するには苛酷すぎる条件下で一定の酵素または酵素組に関する安定性および機能 を保証するような簡単な一般的工程は非常に有用であろう。ここに開示されてい るような架橋結合され固定化された酵素結晶（ＣＬＥＣ類またはＣＬＩＥＣ類と 称されている）をこの目的用に使用することができる。架橋結合反応による結晶 格子および結晶内の成分酵素触媒の安定化により、現在利用できる方法を用いる 際には酵素機能と非相容性である水性、有機性またはほぼ無水の溶媒、これらの 溶媒の混合物、極端なｐＨおよび高温などの環境下でＣＬＥＣ類を使用すること ができる。さらに、ＣＬＥＣ類中での結晶格子の安定化により標準的方法による ＣＬＥＣ類の凍結乾燥も可能になる。凍結乾燥されたＣＬＥＣ類は冷蔵せずに商 業的に魅力のある期間（数カ月ないし数年間）にわたり貯蔵することができ、溶 媒交換方法の介在なしに選択された溶媒の単なる添加により工業用および研究室 規模の方法におけるＣＬＥＣ類の急速且つ簡単な利用を促進させることができる 。ＣＬＥＣ類はまた、外因性蛋白分解による消化に対しても高度に耐性である。

本発明の方法は主流の工業化学方法並びに研究用の新規化合物の研究室合成にお ける多様な酵素触媒の使用を促進させる。

架橋結合は結晶性酵素の安定性に寄与するが、全ての場合に必要であったりまた は望ましいものでもない。ある種の結晶化された酵素は架橋結合なしでも苛酷な 環境下で機能的および構造的保全性を保有している。

本発明の好適態様は結晶酵素の架橋結合を含んでおり、そして以下の章に詳細に 記されている。しかしながら、後で架橋結合されない結晶化された酵素を本発明 のある態様で使用できるということを理解すべきである。

ＣＬＥＣの結晶酵素中の成分酵素分子間の規則的相互作用がＣＬＥＣの本体内の 酵素分子に通じる限定された寸法の良く規定された孔を生じる。その結果、利用 できる孔寸法より大きい基質はＣＬＥＣ粒子の本体を透過しない。

限定された孔寸法のために、ＣＬＥＣ類の孔寸法より大きい基質を含む商業的お よび学術的に興味のある多（の酵素反応は本発明の範囲を越えている。これには 例えば蛋白質、ポリヌクレオチド類、多糖類、および他の有機重合体の如き大き い重合体を含むほとんどの反応が包括されており、そこでは多数の重合体側単位 はＣＬＥＣ内の結晶孔寸法より大きい重合体を製造するようなものであろう。し かしながら、そのような場合には触媒作用をＣＬＥＣ表面上で行うことができる 。

本発明は、選択された蛋白質、特に酵素、を結晶化しそして架橋結合して、例え ばペプチド、炭水化物、脂質または偏光性有機分子の如ぎ選択された生成物の製 造に触媒作用を与えるために使用できる架橋結合され固定化された酵素結晶（Ｃ ＬＥＣ）を生じることによる、選択された蛋白質、特に酵素、の固定化方法であ る。本発明はさらにそのようなＣＬＥＣ類およびＣＬＥＣで触媒作用を受ける反 応または一連の反応中のＣＬＥＣで触媒作用を受ける段階による選択された生成 物の製造方法にも関するものである。本発明の一態様では、本方法により製造さ れた架橋結合され固定化されたサーモリシンにより触媒作用を受ける縮合反応に おいてアスパルターメのジペプチジル先駆体が製造された。本発明の他の態様で は、指示側基質ＦＡＧＬＡを切断してそれの存在がサーモリシンＣＬＥＣ中の酵 素活性を指示するような比色計生成物を製造する。

ＦＡＧＬＡ加水分解をモデル反応として使用して、通常では酵素活性と非相容性 であろう多くの環境下でのサーそりシンＣＬＥＣの強さを示す。

本発明の他の態様では、酵素類であるエラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、 アスパラギナーゼ、およびリゾチームを使用して、例えば酢酸ｐ−ニトロフェニ ル（エステラーゼおよびリパーゼ）、スクシニル−（ａｌａ）３−ｐ−ニトロア ニリド（エラスターゼ）、４−メチルアンベリフエリルＮ−アセチル−チドリオ シド（リゾチーム）およびＮＡＤＨ（アスパラギナーゼ）の如き種々の指定基質 を切断する。

本発明の方法により、当技術の専門家は固定された酵素により触媒作用を受ける 反応により希望する生成物を製造するための処方を応用することができる。適当 な溶液から結晶化される時には当該酵素をグルタルアルデヒドまたは他の適当な 二官能性試薬を用いて結晶化溶液中で架橋結合して該酵素のＣＬＥＣを製造する ことができる。次に、選択された酵素のＣＬＥＣを実施例２に記されている如く して凍結乾燥することができる。

ＣＬＥＣの使用が現在利用できる酵素で触媒作用を受ける方法と比べて提供でき るいくつかの利点がある。例えば、ＣＬＥＣ中の架橋結合された結晶マトリック スはそれ自身で担体を供する。現在利用できる工程か方法におけるような高価な 担体であるビーズ、ガラス、ゲル、またはフィルムは酵素触媒を固定させるため に必要ではない。その結果、ＣＬＥＣ中の酵素の濃度は一定寸法の分子に関して 達成できる理論的充填限度近くとなり、濃縮溶液中で得られる濃度を大きく越え る。全体的ＣＬＥＣは活性酵素（および不活性でない担体）からなっており、従 って溶液中の酵素に関して従来法で固定された酵素で一般的に観察される酵素反 応速度の拡散−関連性減少が最少になるはずであり、その理由は活性酵素および 遊離溶媒の間の基質および生成物に関する平均自由通路が（従来法で固定された 酵素担体粒子と比べて）大きく短縮されるからである。

これらの高い蛋白質密度は、大量の蛋白質を小容量で必要とするバイオセンサー 、分析および他の用途において特に有用である。工業的方法では、ＣＬＥＣ類の 優れた性能および高密度性が一定容量の触媒の有効活性を増加させ、それにより プラント寸法並びに資本費用の減少を可能にすることにより、相当な操作上の経 済性がもたらされる（ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ）、　Ｍ、　Ｊ　、、メソッ ズ・イン・エンツィモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌ、　）、 １３６　：　３７１−３９　（１９８７））、ＣＬＥＣ類は相対的に単分散性で あり、肉眼的寸法および形が個々の酵素触媒の天然結晶成長特徴を反映している 。現存している担体で固定化された酵素媒体を、ＣＬＥＣ類で置換することは困 難でないはずであり、その理由は両方の系は寸法および形において匹敵しており そして両者とも例えば濾過、遠心、溶媒の傾斜、および他の方法の如き基本的に 経済的な操作を含む簡単な方法により供給原料から同様に回収できるためである 。

さらに、凍結乾燥されたＣＬＥＣ類の使用により、使用前のこれらの物質の日常 的な取り扱いおよび貯蔵が可能になる（冷蔵せずに室温において長期間にわたり 乾燥貯蔵）。凍結乾燥されたＣＬＥＣ類は、当該溶媒および基質の直接的添加に より、時間のかかる溶媒交換方法なしに非晶質懸濁液が生成することなく、日常 的な調合を可能にする。凍結乾燥されたＣＬＥＣ形により、触媒としての酵素の 一般的利用がより広い分野の酵素および機能的条件に拡大される。

ＣＬＥＣの第二の利点は、結晶化された酵素の架橋結合が安定化しそして結晶格 子および成分酵素分子を機械的および化学的に強化する。その結果、ＣＬＥＣは 苛酷な水性、有機性、はぼ無水の溶媒中での、または水性−有機性溶媒混合物中 での活性酵素触媒の相当な濃度を得るための唯一の手段となるであろう。有機合 成における触媒としての酵素の使用は、非水性溶媒の存在下でのそして特に水性 および非水性溶媒の混合物中でのそれらの変性傾向により妨害されていた（リバ ノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）。

Ａ、Ｍ、、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンセス（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉ ｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）、１４　：１４１−１４４　（１ ９８９））、ＣＬＥＣ類では、安定性をもたらす構造的移動度の制限は媒体中で 水がほぼ存在しないということよりむしろ分子内接触および結晶格子を構成して いる成分酵素分子間の架橋結合により供されている。その結果、中間ノ水濃度は これまでは可能でなかったようなＣＬＥＣ類として調合された時には酵素により 耐性がある（表１２参照）。商業的用途では、生成物および基質の相対的溶解度 を利用することにより、水性−有機性溶媒混合物が生成物生成の処理を可能にす る。水性媒体中でさえ、固定化されたかまたは可溶性である酵素触媒は化学反応 器中で機械的力を受け、それが変性および短縮された半減期をもたらすことがあ る。ＣＬ　Ｅ　Ｃ内の化学的な架橋結合が必要な機械的強度を与え（クインチＨ （Ｑｕｉｎｃｈｏ）およびリチャーズ（Ｒｉｅｈａｒｄｓ）、プロシーディンゲ ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス・オブ・ザ・ユナイ テッド・ステー７・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、（ＵＳ＾））、５２　：　８３３−８３９　（１９６４））　、それが酵素 触媒に関する反応器寿命の増加をもたらす。

ＣＬＥＣの第三の利点は、それの結晶性質の結果としてＣＬＥＣが架橋結合され た結晶容量全体にわたり均一性を得られることである。ここに記載されている結 晶性酵素は水性環境下で成長しそして架橋結合されており、従って結晶格子内の 分子の配列は均一で且つ規則的のままである。この均一性は、他の水性、有機性 もしくはほぼ無水の媒体、または混合された水性／有機性溶媒中で交換される時 でさえも、分子内接触および結晶格子を構成している酵素分子の間の化学的架橋 結合により保たれている。これらの溶媒の全ての中で、酵素分子は互いに均一な 距離を保っており、ＣＬＥＣ類内に良く規定された安定な孔を形成しており、基 質の酵素触媒への到達並びに生成物の除去を促進させる。酵素活性の均一性は、 再現性および一貫性が至上であるような工業的、医学的および分析的用途におい て必須なものである。

ＣＬＥＣを使用する第四の利点はそれが操作および貯蔵半減期の増加を示すこと である。架橋結合なしでさえも、格子相互作用は、一部は蛋白質変性に必要な構 造的自由度の制限により、蛋白質を安定化させることが知られている。ＣＬＥＣ 類では、化学的架橋結合により固定される時には格子の相互作用は水性および非 水性溶媒の混合物中で変性を防止する際に特に重要である（リバノフ（Ｋｌｉｂ ａｎｏｖ）、　Ａ、　Ｍ、、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンセス（ Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）、１４　：１ ４１−１４４　（１９８９））。数カ月または数年間にわたり結晶状態のままで ある酵素は日常的に高い百分率でそれらの触媒活性を保有している。無水溶媒中 に貯蔵された架橋結合され固定化された酵素結晶は栄養分に富んだ水性環境下で 大量の蛋白質を貯蔵する際の重要な問題である微細物汚染および損傷からもさら に保護されるであろう。凍結乾燥されたＣＬＥＣの場合には、固定化された酵素 は溶媒の不存在下で貯蔵される。従って、架橋結合により得られる安定化のため に冷蔵せずに長期間にわたり貯蔵することが可能になる。

ＣＬＥＣの使用の第五の利点は、架橋結合が結晶格子を安定化させる結果として 温度安定性の増加を示すことである。従来法で使用されるものより高い温度にお いて反応を実施すると、熱力学的におよびＣＬＥＣ類の結晶格子の内外での拡散 速度が増加することの両者により、当該化学反応に関する反応速度が増加するで あろう。これらの組み合わせ効果は、一般的に反応方法の最も高価な成分である 一定量の酵素触媒の生産性を最大にするために、反応効率における主要改良点で ある（ダニエルズ（Ｄａｎｉｅｌｓ）、　Ｍ、　Ｊ　、、メソッズ・イン・エン ライモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　）、１３６　：　３７ １−３９　（１９８７））ａはとんどの酵素系が穏やかな反応条件を必要とする ため、ＣＬＥＣ類により示される温度安定性は顕著なことである。ＣＬＥＣは貯 蔵中の一時的高温による変性に対しても安定化されるであろう。

ＣＬＥＣ使用の最後の利点は、規則的寸法および形の孔が基礎的な結晶格子中の 個々の酵素分子間で創造されることである。この制限された溶媒到達性が従来法 で固定された酵素および溶液中の酵素と比べて金属イオンまたはＣＬＥＣの補助 因子保有特性を大きく促進させている。ＣＬＥＣのこの性質により、状況に応じ て経済的に優れている連続流方法（例えば、オヤマ（Ｏｙａ■ａ）他、メソッズ ・イン・エンライモロジ−（ｌｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、 １３６　５０３−５１６　（１９８７）’）が使用可能になり、そこでは酵素は そうでないと金属イオンまたは補助因子の浸出により不活性化されるであろう。

例えば、ジベブチジルアスパルターメ先駆体のサーモリシン介在合成においては 、従来法で固定化された酵素Ｚ−Ｌ−Ａｓ　ｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅは連続流カ ラム方法では一部はサーモリシンに関して必須であるカルシウムイオンの浸出に より触媒活性を失うことが知られている。実際に、カルシウムイオンの進出のた めに比較的効率の良くないバッチ方法が必然的に使用されている（ナカニシ（Ｎ ａｋａｎｉｓｈｉ）他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、 ３　：　４５９−４６４　（１９８５））。酵素の表面上の天然カルシウム結合 部位と競合して基質Ｚ−Ｌ−Ａｓｐを用いてカルシウムイオン複合体が製造され る時には浸出が起きて、触媒活性が失われる。高密度の酵素およびＣＬＥＣ類の 格子内の溶媒に対する到達可能な対応する限定された容量が、金属イオン浸出に 起因する競合するＬ−Ａｓｐ−Ｃａ−複合体の生成を促進させる。

本発明の方法では、架橋結合され固定化された酵素結晶（すなわちＣＬＥＣ）は 下記の如くして製造された。

酵素結晶を水溶液または有機溶媒を含有している水溶液からの蛋白質の調節沈澱 により成長させた。調節される条件には、例えば、溶媒の蒸発速度、適当な補助 溶質および緩衝液の存在、並びにｐＨおよび温度が包含される。蛋白質の結晶化 に影響を与える種々の因子の包括的論文はマツクファーゾン（ｌｌｃＰｈｅｒｓ ｏｎ）により発表されているメソッズ・イン・エンライモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、１１４：１１２　（１９８５））。

さらに、マツクファーゾン（蓋ｃＰｈｅｒｓｏｎ）およびギリランド（Ｇｉｌｌ ｉｌａｎｄ）の両者（ジャーナル・オブ・クリスタル・プロウス（Ｊ、　Ｃｒｙ ｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ）、９０：５ｌ−５９）は結晶化されると報告されてい る全ての蛋白質類および核酸類の包括的リスト並びにそれらの結晶化をもたらす 条件を編纂している。結晶および結晶化方法の概略並びに溶解された蛋白質およ び核酸結晶構造の配位陳列はプロティン・データ・バンク（バーンスタイン（Ｂ ｅｒｎｓｔｅｉｎ）他、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１１２　：　５３５−５４２　（１９７７））　によ りプルックハーヴエン・ナショナル・ラボラトリ−に保有されている。そのよう な参考文献を使用して適当なＣＬＥＣの生成の発端としてこれまでに結晶化され ている一定の蛋白質または酵素の結晶化に必要な条件を決めることができ、そし てこれまでにない蛋白質に関する結晶化戦略の構築に指針を与えることができる 。一方、知的な試行錯誤研究戦略（例えば、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）、　Ｃ， Ｗ、　Ｊ　ｒ、およびカーター（Ｃａｒｔｅｒ）、　Ｃ，Ｗ、、ザ・ジャ−ナル ・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ■、）、２ ５４　：１２２１９−１２２２３　（１９７９）は多くの場合に、許容可能な純 度水準が得られるとしたら、以上で論じられているものを含むがそれらに限定さ れないようなほとんどの蛋白質に関して適している結晶化条件を与えることがで きる。要求される純度水準は蛋白頁毎に大きく変動することがあり得る。例えば 、リゾチームの場合には、酵素はそれの未精製源である鶏卵白から直接結晶化す ることができる（グリランド（Ｇｌｌｉｌａｎｄ）、　Ｇ、　Ｌ、、ジャーナル ・オブ・クリスタル・グロウス（Ｊ、　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ）、９０ ：５１−５９　（１９８８）’）。

本発明の方法におけるＣＬＥＣ類としての使用のためには、Ｘ−線回折分析用に 必要な大きい単独結晶は必要ではなく、そして実際にはそれは結晶寸法に関する 拡散問題のために望ましくないこともある。微結晶性シャワー（すなわち寸法／ 断面で１０−１ｍｍの桁の結晶）がＣＬＥＣ類用に適しておりそしてしばしば観 察されているが、Ｘ−線結晶図文献中にはめったに報告されていない。微結晶は 本発明の方法において拡散関連問題を最少にするために非常に有用である（例え ば、クインチョ（Ｑｕｉｎｃｈｏ）、　Ｆ、　Ａ、およびリチャーズ（Ｒｉｃｈ ａｒｄｓ）、　Ｆ、　Ｍ、、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、５　：　４０６２−４０７６　（１９６７））。

一般的には、結晶化しようとする蛋白質を適当な水性溶媒または例えば塩類もし くは有機物類の如き適当な沈澱剤を含有している適当な水性溶媒と組み合わせる ことにより結晶が製造される。結晶化の導入用に適しており且つ蛋白質安定性お よび活性の維持にとって許容可能であると実験的に決められた温度において溶媒 を蛋白質と組み合わせる。溶媒は任意に補助溶質、例えば二価カチオン、補助因 子またはチャオドローブ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）、並びにｐＨを調節するため の緩衝液種を含むこともできる。補助溶質およびそれらの濃度に関する条件は結 晶化を促進させるために実験的に決められる。工業的規模の方法では、結晶化を もたらす調節沈澱は蛋白質、沈澱剤、補助溶質、および任意の緩衝液の簡単な組 み合わせによりバッチ方法で最良に行うことができる。例えば透析または蒸気拡 散の如き別の研究室用結晶化方法を応用することもできる。マツクファーゾン（ ｌｃＰｈｅｒｓｏｎ）　（メソッズ・イン・エンライモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、１１４　：１１２　（１９８５））およびギリランド （Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）　（ジャーナル・オブ・クリスタル・グロウス（Ｊ、　 Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ）、９０　：　５１−５９　（１９８８））は結 晶化文献の彼らの論文中に適切な条件の包括的リストを含んでいる。場合によっ ては、架橋結合試薬および結晶化媒体の間の非相容性のために結晶をさらに適切 な溶媒系中に交換する必要があるかもしれない。

結晶化条件が文献中にすでに記されているような多くの蛋白質は工業的および研 究室用化学方法における実際的な酵素触媒としてかなりの将来性を有しており、 そして本発明の方法でＣＬＥＣ類として直接調合される。表１はこれまでに結晶 化されている酵素の試料である。これらの参考文献のほとんどに報告されている 条件はしばしば大きな労力を要する大きい拡散性質結晶の成長用に最適化されて いるということに注意すること。ＣＬＥＣ類の製造において使用される比較的小 さい結晶用に条件をある程度調節することがある場合には必要であろう。

表１ 酵素　微生物または　参考文献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）−７ルコ−ル　馬の肝臓　Ｅｋｌｕｎ ｄ他、Ｊ、　１ｌｏ１．Ｂｉｏｌ、　１４６：５６１デヒドロゲナーゼ　−５８ ７（１９８１）・アルコール　ビチア・バストリスＢｏｙｓ他、Ｊ、　１ｌｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、　２０８：２１１−オキシダーゼ　２１２（１９８９） Ｔｙｋａｒｓｋａ他、Ｊ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｈｅｗ。

９：８３−８６（１９９０） 、アルドラーゼ　兎の筋肉　Ｅａｇｌｅｓ他、Ｊ、　ＭａＬ　Ｂｉｏｌ、　４５ ：５３３−（フルクトース−５４４（１９６９） ビスホスフェート）　Ｈｅｉｄｍｅｒ他、５ｃｉｅｎｃｅ　１７１：６７７−子 牛の筋肉　Ｇｏｒｙｕｎｏｖ他、Ｂｉｏｆｉｚｉｋａ　１４：人間の筋肉　１１ ｉ１１ａｒ他、Ｔｒａｎｓ、　Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｌａｎｄ。

Ｂ２９３＝２０９−２１４（１９８１）ドロソフィラ−Ｂｒｅｎｎｅｒ他、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔｘ、　２５７：−フルクトース　’／ニードモナス・Ｖ ａｎｄｌｅｎ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４ｇ：（ＰＫＤＧ）　ビュ チダ　２２５１−２２５３（１９７３）酵素　微生物または　ｔ′″″′寸献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）・アルカリ性　大腸菌　Ｓｏｗａｄｓ ｋｉ他、Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５０：ホスファターゼ　２４５−２ ７２（１９８１）・アスパラギナーゼエルウィニア・Ｎｏｒｔｈ他、Ｎａｔｕｒ ｅ　２２４：５９４−５９５カロトーバ　（１９６９） 大腸菌　Ｅｐｐ他、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ−、２０：４３２−大腸菌　 Ｙｏｎｅｉ他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１０：１７９−プロテウス−Ｔ ｅｔｓｕｙａ他、Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｔ　２４８：ブルガリス　７６２０ −７６２１（１９７２）・カーボニック　人間赤血球（Ｃ）　Ｋａｎｎａｎ他、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１２ニア４０−アンヒドラーゼ　７６０（１９６５） 人間赤血球（Ｂ）　Ｋａｎｎａｎ他、Ｊ、恥り、　Ｂｉｏｌ、　６３＋６０１− 牛の赤血球　Ｃａｒｌｓｓｏｎ他、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　８０　：酵素　 微生物または　参考文献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）・カタラーゼ　馬の赤血球　Ｇｌａｕ ｓｅｒ他、Ａｅｔａ　Ｃｒｙｓｔ、　２１　：ミクロコツカス−Ｍａｒｉｅ他、 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１２９：６７５−ルテウス　６７６（１９７９） ベニシリニウム−Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎ他、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ。

ヴイタレ　Ａ３７：Ｃ２９（１９８１）牛の肝臓　Ｅｖｅｎｔｏｆｆ他、Ｊ］ｏ １．　Ｂｉｏｌ、　１０３ニア９９−８０１（１９７６） ・クレアチン　牛の心臓　Ｇ１１ｌｆｌａｎｄ他Ｊ、Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１ ７０：キナーゼ　７９１−７９３（１９８３）兎の筋肉　１［ｃＰｈｅｒｓｏｎ 、　Ｊ、］［ｏ１．．Ｂｉｏ１．８１：キナーゼ　８３−８６（１９７３） ・グルタミナーゼ　アクテノバクター−ｆｌ、ｏｄａｗｅｒ他、Ｊ、）ｌｏｔ、 　Ｂｉｏｌ、　９９：グルタニマシフィ　２９５−２９９（１９７５）カンス シュードモナス７Ａ　Ｗｌｏｄａｗｅｒ他、Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１ １２：・グルコース　アスペルギルス−ＩＫａｌｉｓｚ他、Ｊ、　１ｌｏ１．　 Ｒｉｏｌ、　２１３＋酵素　微生物または　参考文献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）・β−ラクタマーゼ類黄色葡萄球菌　 Ｍｏａ１ｔ他、Ｂｉｏｅｈｅｍ　Ｊ、　２２５：１６７−バシラス−５ｕｔｔｏ ｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　２４８：１８１−セラウス　１８８（１９８７） 、ラケート　豚　Ｈａｃｋｅｒｔ他、Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　７８：デヒ ドロゲナーゼ　６６５−６７３（１９７３）鶏　Ｐｉｃｋｌｅｓ他、Ｊ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、　９：ツノザメ　Ａｄａｍｓ他、Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　 ４１：バシラス・ステア　５ｃｈａｒ他、Ｊ、　ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１５４ 　：ロサーモフィラス　３４９−３５３（１９８２）・リパーゼ　ジオトリラム ・１ｌａｔａ他、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　８６　：１８２１−カンジズム　１８ ２７（１９７９） 馬の膵臓　Ｌｏ＋ａｂａｒｄｏ他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２０５　：ム コール・Ｂｒａｄｙ他、Ｎａｔｕｒｅ　３４３ニア６アー７７０メイハイ　（１ ９９０） 人間の膵臓　Ｗｉｎｋｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ　３４３ニア７１−７７４酵素　 微生物または　参考文献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）・ルシフェラーゼ　ホタル　Ｇｒｅｅ ｎ、　Ａ、＾、他、ＢｉｏｅｈｅｔＢｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　２０：　１７ ０（１９５６）・ルシフェラーゼ　ビブリオ−Ｓｗａｎｓｏｎ他、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０：ハルベイ　１２８７−１２８９（１９８５）・ニト リル　ブレビバクテリ　Ｎａｇａｓａｗａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ。

ヒドラターゼ　ラムＲ３１２Ｒｅｓ、　Ｃｏ■■ｕｎ、　１３９　：１３０５− １３１２Ｐ、クロロラフイス　Ｎａｇａｓａｖａ他、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

Ｂ２３　１６２：６９１−６９８（１９８７）・ベロキシダーゼ　セイヨウワサ ビ　Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉａｌ。

１０６：２２９−２３０（１９７６） セイヨウワサビ　＾１ｂａｒａ他、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　９０：４８９− の根（タイプＥ４）　４９６（１９８１）二ホンハツカ　Ｍｏｒｉｔａ、Ａｃｔ ａ　Ｃｒｙｓｔ、＾２８＋Ｓ５２ダイコン　（１９７９） ・ベルオキシダーゼ力ルダロミセス・Ｒｕｂｉｎ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２５７：（クロライド）　フマゴ　７７６ｇ−７７６９（１９８２）・ベ ルオキシダーゼサルコマイシス−Ｐｏｕｌｏｓ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２５３：酵素　微生物または　参考文献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）・ペルオキシダーゼ牛の赤血球　Ｌａ ｄｅｎｓｔｅｉｎ他、Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ。

（グルタチオン）　１０４：８７７−８８２（１９７９）・スブチリシン　枯草 菌（ノボ）　Ｄｒｅｎｔｈ他、Ｊ］ｏ１．Ｂｉｏｌ、　２８　：ハシルス・アミ ｏ　ｆｒｉｇｈｔ他、Ｎａｔｕｒｅ　２２１：２３５−２４２リクフアシエンス 　（１９６９） （ＢＰＮ’　） 枯草菌　Ｐｅ５ｋｏ他、Ｊ、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ−１０６＝（カルスベルブ ）　４５３−４５６（１９７６）・スーパーオキシド牛　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ 他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｗ。

ジスムターゼ　２４７：６３６８−６３６９（１９７２）ホウレンソウ　１ｌｏ ｒｉｔａ他、Ｊ、夏ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　８６：サブ力ロミセス・Ｂｅｅ曽他、 Ｊ、璽ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１０５：セルビシアエ　３２７−３３２（１９７６ ）バシルス・ステア　Ｂｒｉｄｇｅｎ他、Ｊ、璽ｏ１．　Ｒｉａｌ、　１０５＋ ロサーモフイルス　３３３−３３５（１９７６）シュードモナス−ＹＢｓ＋ａｋ ｕｒａ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

酵素　微生物または　参考文献 生物学的源　（その中の引用文献も含む）・サーモリシン　パシラス・サーモ　 Ｍａｔｔｈｅｗｓ他、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ。

プロテオリチクス　２３８：３７−４１（１９７２）・ウレアーゼ　ジ＋ツクビ ーン　Ｓｕｍｎｅｒ、　Ｊ、　Ｂ、　、　Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ。

６９：４３５（１９２６） ・キシロースストレブトマイセ　Ｃａｒｒｅｌｌ他、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｗ 、　２５９：イソメラーゼ　ス・ルビギノスス　３２３０−３２３６（１９８４ ）アルスロバクタ−５ｋｉｎｓ他、ＢｉｏｃｈｙｔＢｉｏｐｈｙｓ　ＡｃｔａＢ ３７２８　８７４：３７５−３７７（１９８６）ストレブトマイセ　Ｆａｒｂｅ ｒ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇス・オリボクロモ　１　：　４ ５９−４６６（１９８７）ゲンス ストレブトマイセ　Ｇｌａｓｆｅｌｄ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６ ３ニス・ビオラセオニ　１４６１２−１４６１３（１９８８）ゲル アクチノプラネス・Ｒｅｙ他、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃ、　Ｆｕｎｃ。

ミズーリエンシス　Ｇｅｎｅｔ、　４：１６５−１７２（１９８８）ＣＥＬＣ類 の製造−架橋結合反応 結晶が適当な媒体中で成長したら、それらを架橋結合することができる。結晶中 での成分酵素分子間に共有結合を加えることにより、架橋結合が結晶格子を安定 化させる。これにより、そうでないなら結晶格子の存在とまたは内接非変性蛋白 質の存在とも非相容性であるかもしれない別の反応環境に酵素を移すことができ る。架橋結合は多種の二官能性試薬により達成できるが、実際には簡単で安価な グルタルアルデヒドが選択試薬となっている。（他の入手可能な架橋結合試薬の 代表的リストに関しては、ピアース・ケミカル・カンパニーの１９９０カタログ を参照することができる）。

グルタルアルデヒドを用いる架橋結合が、結晶を構成している結晶格子中の酵素 分子内でおよび該分子間で主としてリシンアミノ酸残基の間で強力な共有結合を 形成する。架橋結合相互作用は結晶中の成分酵素分子が溶液中に戻るのを防止し ており、酵素分子を微結晶性（理想的には１０”ｍｍ）粒子に有効に不溶性化ま たは固定化する。次に固定化され不溶性化された肉眼的結晶を生成物および未反 応の基質を含有している供給原料から例えば濾過、傾斜などの如き簡単な工程に より容易に分離することができる。それらはＣＬＥＣ充填カラム中で連続流方法 で使用することもでき、そこではそれらは強化された補助因子および金属イオン 保有性質を示している。

本発明の方法により、現存する環境下および新規な環境下での酵素触媒としての 使用のためのＣＬＥＣ類が得られる。架橋結合反応により生じたＣＬＥＣ類の安 定性強化により、そうでなければ非相容性である溶媒（例えば、水性、有機性も しくはほぼ無水の溶媒、またはこれらの混合物）中にＣＬＥＣを移すことができ 、そして化学反応器操作を高温で極端なｐＨにおいて行うことができる。肉眼的 なＣＬＥＣ触媒粒子は容易に処理することもでき、例えば濾過、遠心、または溶 媒の傾斜の如き簡単な方法により供給原料から回収することができる。さらに、 これらは充填カラム中で連続流方法で使用することができる。

ＣＬＥＣ類の製造−凍結乾燥 １容量の架橋結合されたサーモリシン結晶の１０容量の脱イオン水中のｐＨ７， ０の懸濁液をヴルチスモデル＃２４凍結乾燥器を使用して一夜凍結乾燥した。凍 結乾燥された結晶を再構築前に室温または４℃において貯蔵し、該再構築は１０ 容量の選択された溶媒を貯蔵から採取された結晶上に加えることにより行われた 。再−水和された結晶をｐＨ７゜０の１０ｍＭ酢酸カルシウムａｖｉ液中でＦＡ ＧＳＡ切断実験用に再構築した。再構築された凍結乾燥ＣＬＥＣ類を日常的に室 温において貯蔵した。それとは対照的に、可溶性酵素は１週間以上にわたり特異 的活性を保つためには一７０℃における貯蔵を必要とした。この処方はここに含 まれている例示中に記されている酵素の全てに関して使用された。

サーモリシンＣＬＥＣを用いるアスパルターメ先駆体の合成架橋結合された結晶 酵素を製造するための本発明の方法が以下に記載されており、そしてそれはほぼ 無水の有機溶媒である酢酸エチル中でのアスパルターメのジペプチジル先駆体の 製造において使用するためのサーモリシンの架橋結合され固定化された酵素結晶 の製造により例示されている。結晶化されそしてそれの構造が１．６Ａ分解能に おいて解明されている蛋白質であるサーモリシン（ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）お よびマチユース（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ オロジー（Ｊ、　Ｎ。

１、　Ｂｉｏｌ、）、１６０　：　６２３−６３９　（１９８２））が、本方法 でＣＬＥＣとして使用できる酵素の一例である。サーモリシンは人工甘味料アス パルターメの製造において使用されている（イソワ（Ｉｓｏｗａ）他、米国特許 番号４．４３６，９２５　（１９８４）　、リンデベルグ（Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ ）、ジャーナル・オブ・ケミカル・エジュケーション（Ｊ、Ｃｈｅｔ　Ｅｄ、） 、６４：１０６２−４　（１９８７ン、ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）他、バ イオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３　：　４５９−４６４　 （１９８５）　、オヤマ（Ｏｙａｍａ）他、メソッズ・イン・エンツイモロジ− （Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｒ＋　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、１３６　：　５０３−５１ ６　（１９８７））。現時点では、はとんどのアスパルターメは従来の合成化学 方式により製造されているようであるが、はぼ無水の媒体中での従来法で固定化 されたサーモリシンの使用が奨励されるような結果を生じている（オヤマ（Ｏｙ ａｍａ）他、ザ・ジャーナル・オブ・ザ・オーガニック・ケミストリイ（Ｊ、　 Ｏｒｇ、　Ｃｈｅ■、）、４６　：　５２４２−５２４４　（１９８１）　、ナ カニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ）、３　：　４５９−４６４　（１９８５））、本方法の使用により可能 になるようなアスパルターメ製造の酵素方式における改良によって、該方式は簡 便性および価格の両者に関して現在使用されている方法と匹敵するであろう（オ ヤマ（Ｏｙａｍａ）他、メソツズ・イン・エンツィモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、１３６　：　５０３−５１６　（１９８７））。

サーモリシンＣＬＥＣ類の評価 本発明の方法を使用してサーモリシンＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらのｐ Ｈ依存性および安定性、高温安定性、外因性蛋白分解に対する耐性および有機溶 媒の存在下での安定性に関して評価した。実施例２および図１−４に詳細に記さ れている如く、サーモリシンＣＬＥＣ類を可溶性サーモリシンと比較した。評価 の結果は以下のことを示していた。

１、ｐＨ依存性および安定性に関すると、両方の形がｐＨ７において最大活性を 示しておりそして酸性範囲では同様な活性を示した。アルカリ性ｐＨ範囲では、 ＣＬＥＣはｐＨ１０まで最大活性を示しており、可溶性サーモリシンはｐＨ８， ５では７５％の活性を、ｐＨ８゜５では２５％の活性を有しており、そしてｐＨ ９，５では完全に不活性であった。

２、ＣＬＥＣ類中で達成された追加安定性により、可溶性サーモリシンを用いて 可能な温度より高い温度における酵素活性が生じる。比較的低温におけるＣＬＥ Ｃサーそりシンの強化された安定性により、可溶性酵素より貯蔵が簡単になる。

サーモリシンＣＬＥＣ類に関しては熱安定性および自己融解に対する耐性も示さ れ、それは６５℃における５日間の培養後に最大活性を保有していた。それとは 対照的に、可溶性サーモリシンは２日間の培養後にそれの初期活性の５０％を損 失し、そして６５℃における２４時間後にはほとんど活性を示さなかった。

３、サーモリシンＣＬＥＣ類の酵素活性は強力なストレプトコツカル・プロテア ーゼであるプロテアーゼゝの存在下での４日間の培養により影響を受けなかった 。それとは対照的に、可溶性サーモリシンは急速に劣化し、そして９０分の培養 後に全ての活性を失った。

４、サーモリシンＣＬＥＣ類および可溶性サーモリシンは表１２に示されている 如く有機溶媒の存在下では著しく異なる安定性を示した。評価された全ての有機 溶媒を用いた培養後に、サーモリシンＣＬＥＣ類は９５％以上の最大活性を保有 していた。

サーモリシンＣＬＥＣ類および他の酵素ＣＬＥＣ類のこれらの特徴によって、そ れらは対応する可溶性酵素より容易に貯蔵され、より安定性でありそして容易に 不活性化または劣化されないため、それらは特に有用となる。

エラスターゼＣＬＥＣ類の評価 本発明の方法を使用してエラスターゼＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活 性および外因性蛋白分解に対する耐性に関して評価した。実施例３並びに図５お よび６に詳細に記されている如くして、エラスターゼＣＬＥＣ類を可溶性エラス ターゼと比較した。評価の結果は以下のことを示していた。

１、エラスターゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約５０％の活性を保有してい た。

２、可溶性エラスターゼはプロテアーゼにより急速に劣化された。可溶性エラス ターゼの活性はプロテアーゼの存在下での１０分間の培養後に初期活性の５０％ まで減少した。１時間の培養後に可溶性酵素はそれの初期活性の９０％以上を損 失していた。それとは対照的に、エラスターゼＣＬＥＣの酵素活性はプロテアー ゼを用いる培養により影響を受けな本発明の方法を使用してエステラーゼＣＬＥ Ｃ類を製造し、それらをそれらの活性および外因性蛋白分解に対する耐性に関し て評価した。実施例４並びに図７および８に詳細に記されている如くして、エス テラーゼＣＬＥＣ類を可溶性エステラーゼと比較した。評価の結果は以下のこと を示していた。

１、エステラーゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約５０％の活性を保有してい た。

２、可溶性エステラーゼは蛋白分解劣化に対して高度に敏感性であった。

可溶性エステラーゼの活性はプロテアーゼの存在下での１０分間の培養後に初期 活性の５０％まで減少した。１時間の培養後に可溶性酵素はそれの初期活性の９ ０％以上を損失していた。それとは対照的に、エステラーゼＣＬＥＣの酵素活性 はプロテアーゼを用いる培養により影響を受木発明の方法を使用してリパーゼＣ ＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性に関して評価した。実施例５並びに図 ９に詳細に記されている如くして、リパーゼＣＬＥＣ類を可溶性リパーゼと比較 した。評価の結果は、リパーゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約９０％の活性 を保有していたことを示していた。

リゾチームＣＬＥＣ類の評価 本発明の方法を使用してリゾチームＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれらの活性 および外因性蛋白分解に対する耐性に関して評価した。実施例６並びに図１０に 詳細に記されている如（して、リゾチームＣＬＥＣ類を可溶性リゾチームと比較 した。評価の結果は、リゾチームＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約５０％の活 性を保有していたことを示していた。

アスパラギナーゼＣＬＥＣ類の評価 本発明の方法を使用してアスパラギナーゼＣＬＥＣ類を製造し、それらをそれら の活性に関して評価した。実施例７並びに図１１に詳細に記されている如くして 、アスパラギナーゼＣＬＥＣ類を可溶性アスパラギナーゼと比較した。評価の結 果は、下記のアスパラギナーゼＣＬＥＣ類は可溶性酵素と比べて約７７％の活性 を保有していたことを示していた。

ＣＬＥＣ類の一般的用途 ここに開示されている如く、ＣＬＥＣ類は工業的規模の合成、研究室用手段、バ イオセンサー、および医学的用途を含むがそれらに限定されるものではない多く の分野において広（使用される新規な技術となる。

従来法で固定化された酵素方法を用いる種々の系の実行例は下表２−５に示され ている。当技術の専門家はこれらの系および同様な系を本出願に開示されている ＣＬＥＣ技術に応用することができるはずである。これを説明するために、挙げ られている範−のそれぞわから個別例がさらに詳細に論じられている。

下表２には工業的方法で従来法で固定された酵素を使用する例が挙げられており 、それらの例はここに開示されているＣＬＥＣ技術に容易に応用することができ る。

表２ 酵素　製造または用途　基質　参考文献（引用文献も含む） ・サーモリシン　・アスパラターメ　２−＾ｓｐ、　Ｏｙａ＊ａ他、Ｉ、　Ｏｒ ｇ、Ｃｈｅｔ先駆体　Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ　４６：５２４２−５２４４（１９８ １）Ｎａｋａｎｉｓｈｉ他、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：４５９−４６４（１９８５） ・スブチリシン　・アスパラターメ　Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｄａｖｉｎｏ、 ＾、Ａ、、米国０１１ｅ　特許４２９３６４８（１９８１）・リパーゼ　−ｒｒ ア脂肪　椰子源　Ｈａｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　、　Ｔｒｅｎｄｓ代用品　ｉｎ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　１４：１２５− １２ｌ２５−１２６ （１９８９）、＾、　Ｒ，、Ｊ、　Ａｔ０ｉｌ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ。

６０：２９１−２９４（１９８３） ・ニトリル　・アクリルアミド　アクリロ　Ｎａｇａｓａｗａ、　Ｔ、およびヒ ドラターゼ、　ニトリル　Ｙａｔａａｄａ、　Ｈ，、Ｔｒｅｎｄｓニトリラーゼ 類、　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙアミダーゼ　７：１５３−１５８（１ ９８９）酵素　製造または用途　基質　参考文献（引用文献も含む） ・アミノアシラ　・アミノ酸分解　Ｎ−アシル−Ｄ、Ｌ　５ｃｈｓ＋１ｄｔ−Ｋ ａｓｔｎｅｒ、Ｇ。

−ゼ（菌・カビ）　アミノ酸類　＆　Ｅｇｅｒｅｒ、　Ｐ、　ｉｎ・アミノ酸ニ ス　Ｄ、Ｌアミノ酸類Ｂｆｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙテラーゼ　のエステル類　ｖ ｏｌ　６ａ：３８７−４２トスブチリシン　Ｄルアミノ酸類（１９８４）および その・アミダーゼ類　のアミド類　中の参考文献・ヒダントイン　ヒダントイン 類 −ゼ類　ａ−ヒドロキシ　Ｆｕｓｅｅ、　Ｍ、　Ｃ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ−特異的 デヒト　カルボン酸類　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：ロゲナーゼ類　 ４６３（１９８７） ・アミノアシラ ダーゼ　Ｆｕｓｅｅ、　Ｍ、　Ｃ０，１ｌｅｔｈｏｄｓ−拳トランスアミ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ　１３６：ダーゼ　４６３（１９８７） ・アミノ酸デヒ　・アミノ酸製造：　ケトまたはドロゲナーゼ十一般的　ヒドロ キシ　Ｒｏｚｚｅｌｌ、　Ｊ、　Ｄ、　。

ホルメートデヒ　酸＠　１ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎドロケナーゼ　−アミノ酸製造 ：　Ｅｎｚｙ＋ｓｏｌｏｇｙ　１３６：・Ｌ−アスパルタ　特異的　フマレート ／　４７９（１９８７）−ゼ　Ｌアスパルチン酸　フマル酸 酵素　製造または用途　基質　参考文献（引用文献も含む） ルーアスバルテ　Ｌ−アラニン　Ｌ−アスパル　Ｅｎｚｙ■ｅｓ　ｉｎ−トイ− デカル　チン酸、　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ；Ｅｄポキシラーゼ　フマル酸アン　Ｇｅ ｒｈａｒｔＺ、　Ｗ、　。

アスパラダーゼ　モニウム　ＶＣＨＰｒｅｓｓ　１９９０＋Ｌアスパルテ ート４デカルボ キシレート　Ｌ−リシン　Ｄ、　Ｌ−ａアミノ・＾ＣＬヒドロラ　ｅ−カブロラ ク ーゼ　タム（ＡＣＬ） ・Ｌ−ＡＣＴヒドロ　Ｌ−システィン　ＤＬ−２アミノ２ラーゼ　チアゾリン４ Ｌ−イソロイシン　カルボン酸 Ｌ−メチオニン ・リアーゼ　し−フェニル　シンナメート・Ｌ−）リブト　アラニン ファンシン　Ｌ−）リプトファンインドール。

セターゼ　し−セリン Ｌ−バリン ・フマラーゼ　し−リンゴ酸　フマレート酵素　製造または用途　基質　参考文 献・ヒダントイ　Ｄｎカルバモイル　５ｐ−ヒドロキシナーゼ　ｐ−ヒドロキシ ル−ヒダントインフェニルグリシン ・リパーゼ類、　・立体選択的合成　合成化学　Ｊｏｎｅｓ、　Ｊ、　Ｂ、　。

エステラーゼ類によるラセミ体類　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４２：の分解　３ ３５１−３４０３（１９８８）Ｂｕｔｔ、　Ｓ、および Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｓ、　Ｍ、。

Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ　４８９−５０３ （１９８６）、およびこの 分野のより包括的 見地のためのその ・フマラーゼ　−Ｌ−リンゴ酸　フマル酸　Ｃｈｉｂａｔａ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：酵素　製造または用途　基質　参考文献 （引用文献も含む） ・ラクターゼ、　・例えばガラクト　ラクトース　Ｌａｒｓｓｏｎ他、麗ｅｔｈ ｏｄｓβ−ガラクトシ　シル−Ｎ−アセチル　およびＮ−ア　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ　１３６：ダーゼ　ガラクトサミン　セチルガラ　２３０Ｃ１９８７ ）の如き二糖類合成りトサミン ・リパーゼ、−Ｌ−メンタール　４異性体混合物Ｆｕｋｕｉ、　Ｓ、　、　Ｔａ ｎａｋａ、＾。

エステラーゼ　１ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ）：ｎｚｙｓｏｌｏｇｙ　１３６： ・アミダーゼ類　・ドパリン　Ｄルアミノ酸　Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒ 、　Ｇ。

（ビレスオイド　アミド　＆　Ｅｇｅｒｅ、　Ｐ、　ｉｎｎ殺昆虫ラフルビ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏＪ　ｏｇｙネート用の　ｖｏｌ　６ａ：３８７−４２１中間生 成物）　（１９８４）およびその酵素　製造または用途　基質　参考文献（引用 文献も含む） ・リパーゼ　−Ｊ？（＋）２フエノキシ２クロロプロ　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ ｓ　ｉｎ（カンジダシリ　−プロピオン酸類　ピオン酸類　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ ｙｎｔｈｅｓｅｓンドリセア）　ｅｄｓ　Ｔｒａｍｐｅｒ、　ｖａｎｄｅ　Ｐｌ ａｓ　＆　Ｌｉｎｋｏ； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓ＋ｐｏｓｉｕｍ　１ｎ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　１９８５ ・リパーゼ類、　・有機合成　Ｊｏｎｅｓ、　Ｊ、　Ｂ、。

エステラーゼ類、単糖類　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４２：アミダーゼ類、　ペ プチド類　３３５１−３４０３（１９８８）アルドラーゼ類、　Ｂｕｔｔ、　Ｓ 、および・プロテアーゼ類、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｓ、　Ｍ、。

ペプチダーゼ類、　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ・酵母リパーゼ　・２（ｐ −クロロ　ラセミ体　Ｒｅｐｏｒｔｓ　４８９−５０３フエノキシ）　エステル の　（１９８６）、およびこのプロピオン酸二　分割　分野のより包括的除草剤 　見地のためのその ＃素　製造または用途　基質　参考文献（引用文献も含む） ・ストリクトジ　・アルカロイド　Ｐｆｉｔｚｎｅｒ他、ンシンセダーゼ製造、 例えば　１ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎストリクトシジンＥｎｚｙＩ＋ｏｌｏｇｙ　１ ３６：・ペリシリン　・６−アミツベニシ　ペニシリン　Ｅｎｚ　Ｅｎｇ　６： ２９１（１９８２）アシラーゼ　ラニン酸および　ＧまたはＶ　Ｅｎｚ　Ｅｎｇ 　８：１５５・ペニシリン　７−＾ＤＣＡ アミダーゼ ・ヒドロキシ　・ステロイド　Ｃａｒｒｅａ他、１ｌｅｔｈｏｄｓステロイド　 転換　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：デヒドロゲ　１５０（１９８７） カーゼ類 ・５′ホスホジエ・５′リポヌクレオ　１ｉｖｅｌｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓス テラーゼ、チド類　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：ヌクレアーゼ類　５ １７（１９８７） 酵素　製造または用途　基質　参考文献（引用文献も含む）゛ ・エステラーゼ　・β−ラクタム　対応する　日本特許出願：先駆体（偏光性　 ジエステル類　８２−１５９．４９３（１９８１）モノエステル類、　Ｂ１５ｅ ｉｂｕｔｓｕ　Ｃｏｍｐａｎｙ例えばβアミノ グルタル酸モノ エステル） ・リパーゼ類　・β−遮断剤　Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎ、　Ｍ他、Ｔｒｅｎｄｓ 　ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：２５１−２５６（１９８８） ＣＬＥＣ技術を用いるアクリルアミドの製造下記のものは本発明の方法の一使用 の記載である二ニトリルヒドラターゼ酵素を過剰製造する固定化された細胞から のアクリルアミド製造（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）、　Ｔ、およびヤマダ（ Ｙａｓａｄａ）、　Ｈ，、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ 　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７　：１５３−１５８　（１９８９） ）のこれまでにここに開示されているＣＬＥＣ技術への応用である。

重要な必需化学物質であるアクリルアミドはヤマダおよび共同研究者により記載 されている（ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）、　Ｔ−およびヤマダ（Ｙａｍａｄ ａ）。

Ｈ８、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ）、７：１５３−１５８　（１９８９））。酵素ニトリルヒド ラターゼの過剰製造剤として選択される捕獲された細胞が充填されている化学反 応器中で毎年数キロトンのアクリルアミドが製造されている。ニトリルヒドラタ ーゼは２種類の源であるプレヴイバクテリウムＲ３１２（ナガサヮ（Ｎａｇａｓ ａｗａ）他、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ ケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｍｕｎ、） 、１３９：１３０５−１３１２　（１９８６）およびＰ、クロロラフイスＢ２３ （ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）他、ユーロピアン・ジャーナル−オブ・バイオ ケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ（）、１６２：６９１−６９８　 （１９８７）から精製されそして結晶化されたことも報告されている。ここに開 示されている如（、グルタルアルデヒドまたは他の適当な架橋結合試薬を用いて 架橋結合してＣＬＥＣを製造することにより、これらの結晶性酵素はそれぞれ固 定化される。次にニトリルヒドラターゼＣＬＥＣＩＩを最近使用されている捕獲 された細胞の代わりに従来の反応器で使用することができる。

この方法をＣＬＥＣ技術に応用すると、直ちに利点をもたらす。これらには、Ｃ ＬＥＣ類中中の比較的高い酵素濃度に内在する単位容量当たりの強化された活性 から生じるプラント寸法の減少および生産量の改良、並びに基質および生成物拡 散速度の改良、比較的高純度のＣＬＥＣ＠から生じる望ましくない汚染および副 反応の減少、並びに細胞の不存在下での微生物汚染に対する敏感性の減少が包含 される。さらに、ＣＬＥＣを基にした方法にとってのみ得られる他の利点もある 。これらの利点には、反応速度を改良するための比較的高温における操作、アク リルアミド製造反応の最適化を可能にする水性、有機性およびほぼ無水の溶媒中 での操作性、並びに特に従来法の溶媒中でのＣＬＥＣ類の比較的高い化学的およ び機械的安定性から生じる操作および貯蔵における半減期の増加が包含される。

ＣＬＥＣ技術の医学的用途一体外処置 本発明の方法および適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を医学的用 途用に使用することもできる。例えば、ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を例えば 血液の如き流体の一成分を一般的には該成分を変更させそしてそこでそれを患者 にとって有害でない物質または正常な身体的工程により（例えば、解毒すなわち 肝臓中での劣化により、腎臓を通しての排泄により）除去できるような物質に転 化させることにより除去するために使用できる。この用途では、適当に選択され たＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を、変更しようとする成分を含有している体液 またはＣＬＥＣ類中の酵素がそこで作用する成分が関与する反応の反応物（生成 物もしくは基質）と接触させる。その結果、酵素は変更しようとする成分にまた は変更しようとする成分が関与する反応の生成物である他の基質と作用すること ができる。酵素の活性が除去しようとする成分の直接的変更または成分が関与す る反応の生成物の変更をもたらし、（その結果、反応の連続性を不可能にする） 。これは、適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組および例えばその上 にＣＬＥＣが保有されているような多孔性物質またはＣＬＥＣが内部に存在する ことのできる管の如き物質から製造されている残りの手段を含んでいる体外装置 の使用により行うことができ、それにより成分自身または変更しようとする成分 が関与する反応の生成物である流体中の基質の間の接触が可能になる。

これは、例えば腹膜またはリンパ節の如き適当な身体部分中への適当なＣＬＥＣ の挿入によっても達成され、そこではＣＬＥＣが体液に到達するであろう。この 挿入は外科的にまたはＣＬＥＣスラリーの挿入により行うことができるであろう 。高い代謝産物の危険性を仮定すると、血液流中へのＣＬＥＣの直接的挿入は適 切でないであろう。

この分野での適当なＣＬＥＣ類の使用は、例えばフェニルケトン尿症の如き自然 欠如を補正するための酵素置換療法における普遍的方法の代用として作用する。

表３は、ＣＬＥＣ類を使用することのできる医学的用途の一部を示している。こ れらの場合の大部分に関しては、体外処置は依然として研究段階であるが、ＣＬ ＥＣ類が与える利点がこれまでは代用処置がなかった分野における新規な治療法 を与えることができるであろう。

表３ 使用された酵素　除去物　処置された疾病　参考文献／患者 ・アスパラギ　・アスバ　・白血病（重要な　Ｋｌｅｉｎ、　Ｍ、　、　Ｌａｎ ｇｅｒ、　Ｒｏ。

−ゼ　ラギン　癌養分である　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ アスパラギンの　４：１７９−１８５（１９８６）および除去は白血球を　その 中の参考文献 損傷させ、それはＣｈａｎｇ、　Ｔ」、　Ｓ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ必須アミノ 酸　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋＊ｏｌｏｇｙ　１３７：であるアスパラ　４４７−４５７ （１９８７）およびギンを製造でき　その中の参考文献 ず、正常細胞は アスパラギンを 製造できるため この処置により 影響を受けない） ・ヘバニナーゼ　・ヘパリン・例えば腎臓透析Ｌａｎｇｅｒ、　Ｒ，他、５ｃｉ ｅｎｃｅの如き血液潅流　２１７　：　２６１−２６３（１９８２）患者用の説 ヘパ リン化 ・ビリルビン　・ピリル　・偽腎黄痘Ｌａｖｉｎ、　Ａ、他、５ｃｉｅｎｃｅオ キシダーゼ　ビン　２３（１５４３−５４５（１９８５）　’　−使用された酵 素　除去物　処置された疾病　参考文献／患者 ・カルボキシ　・メトトレ・化学療法　Ｐｉｔｔ、Ａ、１１．他、Ａｐｐｌ。

ペプチダーゼ　キセート　患者　Ｂｉｏｃｈｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

８：５５−６８（１９８３） ・チロシナーゼ　・芳香族ア・アミノ酸類の　Ｃｈａｎｇ、　Ｔ、■、Ｓ、、Ｓ ｅ■、Ｌｉｖｅｒミノ酸類　病理学的上昇を　Ｄｉｓ、　Ｓｅｒ、　６：　１４ ８（１９８６）示す肝臓不全 ・フェニルアラニ・フェニル・フェニルケト　Ａ■ｂｒｕｓ、　Ｃ，璽、他、ン アンモニウム　アラニン　尿症および　Ｊ、　Ｐｈａｒｔ　＆　ＥＸり、　Ｔｈ ｅｒ。

リアーゼ　肝臓不全　２２４：５９ｇ〜６０２（１９８３）・ウラーゼ、グル　 ・尿素（ア　・急性腎臓不全　Ｃｈａｎｇ、　Ｔ、　Ｗ、Ｓ、　、　’Ｍｅｔｈ ｏｄｓタメートデヒド　ンモニア　患者用の解毒　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＊ｏｌｏｇｙ 　１３７：ロゲナーゼ、を介して　４４４−４５７（１９８７）およびグルコー ス、グルタミ　その中の参考文献デヒドロゲナー　ン酸および　Ｃｈａｎｇ、　 Ｔ、　１．　Ｓ、　、　Ｅｎｚｙｍｅゼおよびトラン　他のアミノ　Ｅｎｇ　５ ：２２５（１９８０）スアミナーゼを　酸類に転化 含む複数−された） 酵素系 使用された酵素　除去物　処置された疾病　参考文献／患者 ・アルギナーゼ　・アルキ　・家族性過アル　Ｋａｎａｌａｓ、　Ｊ、　Ｊ、他 、ニア　キニン症　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｍｅｄ、　２７　：　４６−５５・クルタ メート・アンモ・肝臓不全　Ｍａｕｇｈ、　Ｔ」、　、　５ｃｉｅｒ＋ｃｅデヒ ドオゲナ　ニア　２２３：４７４−４７６（１９８６）−ゼおよび アンモニア 本方法の特別な用途は血液ヘパリン除去用のヘパリンリアーゼ系であり（ベルン ステイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）他、メソブズ・イン・エンライモロジ−（ｌｌ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１３７：５１５−５２９　（１ ９８７））、それは以下で論じられている。

血液が潅流されている全ての体外装置、例えば腎臓透析、連続的な動静脈血液濾 過または体外膜酸素供給器、は凝血を避けるために患者のヘパリン化を必要とす る。しかしながら、患者のヘパリン化は出血合併症を引き起こしそして人間安全 性に対する脅威を残している。これらの問題は例えば膜酸素供給器では潅流時間 が増加するにつれて増加し、そして重大出血を引き起こすことがある。体外療法 後に、体外装置の流出部のところでヘバリナーゼ装置を使用することによりヘパ リンを血液から除去することができ、該装置は患者に戻される血液から全てのヘ パリンを除去しそしてその結果として現在のヘパリン化の問題点を避ける。

発表された研究（ランゲル（Ｌａｎｇｅｒ）他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、２１７　：　２６１−２６３　（１９８２）　、ベルンステイン（Ｂｅｒｎｓ ｔｅｉｎ）他、メソッズ・イン・エンライモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１３７：５１５−５２９　（１９８７）’）は、体外装 置中で使用されている従来法で固定化された酵素により生じた問題点を詳記して いる。原則的問題は、従来法の固定化が単位容量当たりの酵素活性の低い保有性 を生じるため必要なヘパリン化を行うために大量の固定化された酵素を必要とす ることである。この量は人間において実際的に使用するには多すぎるものである 。しかしながら、不活性担体がないことによるＣＬＥＣ中の単位容量当たりの高 い活性の保有性によりこの問題が回避されそして人間のヘパリン化除去に対する 実用的な解決法を与える。ＣＬＥＣの安定性増加が架橋結合された結晶からの酵 素の解離を減少させるであろう。酵素切断から生じる免疫応答が減じられるため 、これは比較的不安定な従来法で固定された酵素より優れている。ＣＬＥＣ温度 安定性が貯蔵中の一時的高温による酵素の変性を防止し、室温で貯蔵した時でさ えＣＬＥＣは高い活性を保有するようである。さらに、ＣＬＥＣはそれらの比較 的長い操作および貯蔵寿命のためにそれらの従来法で固定化された相手より安価 であり且つ使用し易い。

ＣＬＥＣ技術の別の用途：バイオセンサー例えば体液（例えば、血液、尿）、化 学的および研究室用反応媒体、有機媒体、水、培養媒体並びに飲料の如き流体中 での当該分析物を検出および／または定量化するために有用なバイオセンサーと 称されているセンサーの一成分として、ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を使用す ることができる。ある場合には、当該流体はアルコール呼吸分析器中の如（気体 であることができる（バルザナ（Ｂａｒｚａｎａ）、　Ｅ、、リバノフ（Ｋｌｉ ｂａｎｏｖ）、Ａ、およびカレル（Ｋａｒｅｌｌ）、　Ｍ、、ナサ・テクニカル ・ブリーフズ（ＮＡＳＡＴｅｃｈ　Ｂｒ１ｅｆｓ）、１３　：１０４　（１９８ ９））、この用途では、適当に選択されたＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類の組を当該 分析物に関して分析しようとする流体と接触させる。当該分析物は直接的に（例 えば、血液グルコース水準）または間接的に（例えば当該分析物が関与する反応 における反応物（生成物もしくは基質）である物質を検出もしくは定量化するこ とにより）測定することができる。各場合とも、ＣＬＥＣは分析物または分析物 も関与する反応における反応物である物質に作用することができる。酵素の活性 が検出可能な変化（例えばｐＨにおける変化、発光、発熱、電位における変化） を生じ、それは適当な検出手段（ＮえばｐＨ電極、光または熱感知装置、電気的 変化を測定するための手段）により検出および／または定量化される（ジャナタ （Ｊａｎａｔａ）、　Ｊ　、他、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ、　 Ｃｈｅｗ、）、６２：３３Ｒ−４４Ｒ（１９９０））。

酵素で触媒作用を受ける方法から生じる変化を検出するために使用できる手段を 用いることができる。本発明のバイオセンサーには、ＣＬＥＣまたはＣＬＥＣ類 の組並びにＣＬＥＣ（［）と当該分析物または当該分析物が関与する反応におけ る反応物である流体中での基質との間の接触を可能にさせるＣＬＥＣ用の保有手 段が包含されている。

表４は、ＣＬＥＣを内部で使用することができるバイオセンサー用途の一部を示 している。現在固定化されている酵素がこれらの用途において使用されているが 、低い安定性、低い酵素密度、短い寿命および再現性欠如を被っている。これら の例をここで開示されているＣＬＥＣ技術に容易に応用することができる。

表４ 使用された酵素　検出物　用途　参考文献・グルコース・グルコース　・糖尿病 　・Ｄａｎｉｅｌｅｓ、　Ｂ、　、　ｌ１ｏｓｓｂａｃｈ、　Ｋ。

オキシダーゼ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１３７：４−７（ １９８７酵素 −Ｈａ１１．Ｅ　″阻ｏｓｅｎｓｏｒｓ″０ｐｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐ ｒｅｓｓ−Ｔａｙｌｅｒ、　Ｒ−、Ｐｒｏｃｅｅｄ。

Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ１９８９．２７５−２８７ ・＾ｎｔｈｏｎｙ他、　”Ｂｉｏｓｎｓｏｒｓ。

Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、　０ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓ ｓ（１９８７）・クレアチニン　・クレアチニン・腎臓機能　・Ｔａｂａｔａ、 　Ｉ他、　Ａｎａｌ。

デイミナーゼ　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１３４：４４（１９８３）・ウレアーゼ　・尿 素　・腎臓機能　・Ｈｓｕｉｅ、　Ｇ、　Ｈ他、　Ｐｏ１ｙｔ菖ａｔｅｒ、Ｓｃ ｉ、Ｅｎｇ、５７： １１：ｏｂｏｓ他、　Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ。

使用された酵素　検出物　用途　参考文献・ラクテート　・ラクテート　・臨床 用途　−Ｂｌａｄｅｌ、　Ｗ、　Ｊ、　＆　Ｊｅｎｋｉｎｓ。

オキシダーゼ　Ｒ，Ａ、　、＾ｎａ１．　Ｃｈｅ（４８（８）　：および　１２ ４０（１９７６） デヒドロゲナーゼ　−５ｏｇａｇｕｃｈｉ、　Ｙ、他、Ｊ、＾ｐｐｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　３：３２（１９８１）・グルコース−６−・グルコース−６・ 糖尿病　・グルコースオキシダーゼピルベート　−ホスフエート、および　と同 一デヒドロゲカ　スクロース　他の医学用−ゼ　およびＡＴＰ ・アルコール　・エタノール　・ブレサラ　・Ｆ１ｏ■ｅｔｔｅ、　Ｊ、　Ｌ、 他。

デヒドロゲナ　および他の　イザー　蓋ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ−ゼ、アルコールアルコール類、および　１３７：２１７−２２５（１９８ ７）オキシダーゼ　酢酸、蟻酸　工業用途　４ｏ、　ＩＩ」、　、　１ｌｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｉｏｌｏｇｙ　１３７：２７１−２８８・β−フルクト　 ・スクロース　・工業用途　・Ｒｏｓｅｔｔｅ、　Ｊ、　Ｌ、他。

シダーゼ　１ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａｏｌｏｇｙ１３７：２１７−２ ２５（１９８７） ・コレステロール・コレステロ　・コレステ　・５ａｔｏｈ、　１．、　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎオキシダーゼ　−ル　ロール　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ　１３７： ２１７−２２５使用された酵素　検出物　用途　参考文献・カタラーゼ　・尿酸 、コレス　・アテロ−・５ａｔｏｈ、　１．　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎチロー ル　ム性動脈　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３７：２１７−２２５硬化症　（１９ ８７） ・カルボキシ　・メトトレキ　・癌　・グルコースオキシダーゼペプチダーゼ　 セード　と同一 ・カーボニック　・二酸化炭素　・工業用、　・グルコースオキシダーゼアンヒ ドラーゼ　研究室用　と同一 ルーアミノ酸　・アミノ酸類　・医学用　・グルコースオキシダーゼオキシダー ゼ　および　と同一 工業用 ・β−ラクタメーゼ・ペニシリン　・医学用　・Ａｎｚａｉ他、　Ｂｕｌｌ、Ｃ ｈｅ鵬。

ゝ０シリナーゼ　シにＪｐｎ、　６０：４１３３−４１３７・アルカリ性　・ホ スフェート・代謝監視　・グルコースオキシダーゼホスファターゼ　と同一 使用された酵素　検出物　用途　参考文献・ナイトレート／　・ナイトレート・ 代謝　・グルコースオキシダーゼナイトライド　類および　および　と同一リダ クターゼ　ナイトライド類食品監視・アリール　・サルフェート・代謝監視　・ グルコースオキジダーゼスルファダーゼ　と同一 ・スクシネート　・スクシネート・工業用　・グルコースオキシダーゼデヒドロ ゲナーゼ　と同一 ・バクテリア性　ＦＭＮＨ，および　・光子放出　−Ｋｕｒｋｉｊａｒｖｉ他、 夏ｅｔｈｏｄｓルシフェラーゼ　結合反応　の測定に　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ　１３７：ヨル１０−”　１７１−１８１（１９８７）モル量の　−Ｍｕｒ ａｃｈｉ他、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＡＴＰの検出　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１ ３７：２６０−２７１バイオセンサー中で試料の分析用に実施される如き本発明 の方法においては、最少可能量の基質および触媒から最大可能量の検出可能な信 号を生じることが特に望ましい。これに関すると、ここに開示されているＣＬＥ Ｃ技術は一定容量で最高の可能な酵素触媒濃度を得るたので、該技術は特に魅力 的である。

究極的な当該酵素反応を直接的にまたは適当な中間生成物を介してルシフェラー ゼのような酵素による発光と組み合わせるために、しばしば相当な努力がなされ ている（カーキジャルヴイ（Ｋｕｒｋｉｊａｒｖｉ）他、メソッズｌ’ンーエン ’フイモ０ジー（ｌｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、１３７：１ ７１−１８１　（１９８８））。これは光子検出装置の非平行感度および効率と いう利点を得るために行われており、それにより適当な条件下での酵素反応生成 物のフェムトモル濃度の検出が可能になる。この原則により、従来法で固定化さ れた酵素を用いるバイオセンサー系が設計されており臨床的および他の関心のあ る種々の基質を検出する。発光反応はとりわけＤ−グルコース、Ｌ−ラクトース 、Ｌ−グルタメートおよびエタノールのような基質を検出する評価反応と極端に 低い濃度で組み合わせられる。

この用途に関すると、ヴイブリオ・ハルヴ工ヴイイからのルシフェラーゼ酵素が 結晶化されたと報告されている（スワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ）他、ザ・ジャー ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーＵ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ■、）、 ２６０　：１２８７−１２８９　（１９８５））。このルシフェラーゼの結晶を グルタルアルデヒドまたは他の適当な試薬を用いて架橋結合してルシフェラーゼ のＣＬＥＣを生成することができる。バイオセンサーおよび分析用途用には、ル シフェラーゼのＣＬＥＣは従来法で固定化された酵素より多くの利点を与える。

ＣＬＥＣでは、ルシフェラーゼＣＬＥＣの全容量は発光性酵素からなっている。

しかしながら、従来法で固定化された酵素系では、合計容量の９５％程度が「不 活性な」担体物質により占められており、それは酵素により発生した光の吸収剤 として機能するようである。さらに、ＣＬＥＣ類の安定性増加が室温における貯 蔵を促進させるはずであり、そして苛酷な環境および高温における新しい感知用 途が可能になる。

ＣＬＥＣ技術の別の用途−研究室用反応ＣＬＥＣｇｉは小カラムまたはバッチ方 法での研究室用試薬として使用することもでき、それらは研究室用反応を行うた めに使用できる。広い範躊の反応の一部を表５に示す。

表５ 使用された酵素　触媒作用を受ける反応型　参考文献・リパーゼ類、　・立体選 択的合成：エステ　−Ｚａｋｓ、　Ａ、＆に１ｉｂａｎｏｖ、　Ａ、　Ｍ。

ホスホリパーゼ類　ル化、エステル交換、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　 Ｓｅｔ、　ＵＳＡ。

アミノ分解、ラクトン化、８２：３１９２−３１９６（１９８５）重縮合、アク リル化、　４１ｉｂａｎｏｖ、　Ａ、　Ｍ、　Ａｃｅ。

オキシモリシスおよび　Ｃｈｅｔ　Ｒｅｓ、　２３：１１４−１２０ラセミ体混 合物の分割　（１９９０）およびその中の参考文献 −ｌｏｎｇ、　Ｃ，Ｈ，、Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｓ−Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　３：９ｌ−１１１（１９９０）および その中の参考文献 ・エステラーゼ類　・立体選択的合成および　・Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他。

分割　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒｓＶｏ１２５劃２４：２５５７− ２５６０一５ｃｈｎｅｉｄｅｒ他。

Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｗ、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ。

使用された酵素　触媒作用を受ける反応型　参考文献・チロシナーゼ　・キノン 類を製造する　・Ｋａｚａｎｄｊｉａｎ、　Ｒ，Ｚおよびためのフェノール類の 　Ｈｉｂａｎｏｖ、　Ａ、　Ｍ。

酸化　Ｊ、＾ｍ、ｃｈｅ＋ｓ、ｓｏｃ　１１０：プロテアーゼ類、　・炭水化物 類の立体　・Ｒｉｖａ他例えばスブチリ　選択的アシル化　Ｊ、＾ｍ、Ｃｈｅｗ 、Ｓａｃ　１１０ニシン　５８４−５８９（１９８８） ・オキシダーゼ類　・炭化水素類の選択的　・［１ｉｂａｎｏｖ、　Ａ」、　Ａ ｃｅ。

酸化Ｃｈｅｗ、Ｒｅｓ、２３：１１４−１２０（１９９０）およびその中の 参考文献 ・補助因子を必要　・立体選択的合成：　−１ｏｎｇ、　Ｃ，Ｈ，、Ｃｈｅｍｔ ｒａｃｔｓトシナイ他の酵素：　−Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３： イソメラーゼ類、　９ｌ−１１１（１９９０）およびリアーゼ類、　その中の参 考文献 アルドラーゼ類、 グリコシルトランス フェラーゼ類、 グリコシダーゼ類 使用された酵素　触媒作用を受ける反応型　参考文献・追加補助因子を　・立体 選択的合成：　−ｌｏｎｇ、　Ｃ，Ｈ，、Ｃｈｅｓｔｒａｃｔｓ必要としない他 の　−Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３：酵素：フラボエン９ｌ−１１ １（１９９ｏ）オヨヒザイム類、ピリド　その中の参考文献 キサルホスフエート ・補助因子を必要　・立体選択的合成：　−１ｏｎｇ、　Ｃ，Ｈ，、Ｃｈｅｓｔ ｒａｃｔｓとする酵素：　−Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３：１−− セ類（ＡＴＰ）、　９ｌ−１１１（１９９０）およびオキシドレダクタ　その中 の参考文献 −ゼ類（ＮＡＤ／Ｐ）、 メチルトランス フェラーゼ類Ｃ５ＡＭ）、 ω＾−ノー必要酵素 類ルフェラーゼ（ＰＡＰＳ） シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）他（アンゲヴアンドテ・ヘミイ・インター ナショナル・エディッション・イン・イングリコシュ（Ａｎｇｅｖ、　Ｃｈｅ曽 、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、）、２３　（Ｎｏ、１）：　６４−６８　（ １９８４））はどのようにして酵素を有機合成において使用できるかを示してい る。豚の肝臓エステラーゼを水性燐酸塩緩衝液中で偏光性モノ−エステルへのメ ソ−エステル交換において使用した。

研究室用途用のＣＬＥＣで触媒作用を受ける反応の利点は３種ある。

第一に、ＣＬＥＣは研究室用の化学的合成実験の典型である苛酷な環境（例えば 、水性、有機性、はぼ無水の溶媒およびこれらの混合物、並びに高温）下で高い 活性を保有している。第二に、ＣＬＥＣは高い操作および貯蔵安定性を示してお り、それは間欠的な研究室用実験に適している。第三に、単位容量当たりのそれ らの高い活性が比較的短い反応時間を可能にしそして（活性単位当たり）少量の 酵素を必要とする。従って、ＣＬＥＣが遊離または固定化された酵素に対して供 する利点が有機化学者に別の高度に選択的な合成手段を与えるものである。

これらの上記の場合の全てにおけるがこれらに限定されるものではないが、本発 明の方法を当技術の専門家が応用して従来法で固定化された酵素触媒を使用する 方法を適当な酵素のＣＬＥＣの使用に転換させることができる。ＣＬＥＣ類は従 来法で固定化された酵素を置換することができるだけでな（、細胞介在転換にお いても使用することができる。本発明を次に下記の実施例により説明するが、そ れらは何ら限定しようとするものではない。

実施例１ アスパルターメ先駆体であるＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成用のす２５０ｍ ｇのバシラス・サーモプロテオリチクスからのサーモリシンをベーリンゲルーマ ンハイムＧｍｂＨから購入し、そして４ｍｌの４５％ジメチルスルホキシド（Ｄ ＭＳＯ）および５５％の１゜４０Ｍ酢酸カルシウム、０．５０Ｍカコジル酸ナト リウム中にｐＨ６，５において溶解させた。これらの出発条件は回折等級サーモ リシン結晶の製造に関してマチウス（ｌｌａｔｔｈｅｗｓ）他により記されてい るものと同様であった（例えば、ホルメス（Ｈｏｌ■ｅｓ）およびマチウス（ｌ ［ａｔｔｈｅｗｓ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　 １ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１６０　：６２３−６３９　（１９８２）参照）。

次にセントリコン１０マイクロ−コンセントレータ−中で蛋白質溶液を１ｍｌの 濃縮した。ここで今開示されている断熱蒸発晶出方法により良好な収率の微結晶 が得られ、該方法では１．ｍｌの水、または１．４０Ｍ酢酸カルシウム、０．５ ０Ｍカコジル酸ナトリウムをｐＨ６，５において上記の各サーモリシンーＤＭＳ Ｏ溶液中に急速注入した。はぼ均一寸法（長さが約ＩＱ−′ｒｒ＋ｍ）の六角形 の微結晶シャワーが生じた。

サーモリシン微結晶の架橋結合 本発明の方法のこの特定例で使用される処方はナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ） 他（バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４ 　（１９８５））により記されているものの応用であり、その処方ではサーモリ シンを最初にイオン−交換樹脂アンベルライトＸＡＤ−７からなる担体ビーズ上 に吸着させ、モしてグルタルアルデヒドを用いて架橋結合させることにより固定 化した（クイチｇ　（Ｑｕｉｃｈｏ）およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、 プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アサデミ−・オブ・サイエンセス ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、（ｔＪｓＡ））、５２　：　８３３−８３９　（１９ ６４））。この例示では、上記で得られたサーモリシンの微結晶を遠心し、粒状 化し、そして上澄み液を廃棄した。次に５ｒｎｌの２，５％ＤＭＳＯ中の１７． ５％工業用等級グルタルアルデヒド、０．０５Ｍ酢酸カルシウムおよび０．０２ ５Ｍカコジル酸ナトリウムをｐＨ６，５において微結晶に加えた。混合物を静か に撹拌しながら３７℃において４時間培養した。

結晶を１０ｍ１部分の水で繰り返し洗浄してグルタルアルデヒド溶液を除去する ことにより、架橋結合反応を停止させた。洗浄された架橋結合されたサーモリシ ン結晶は以下で触媒として使用されるサーモリシンＣＬＥＣを構成していた。

水溶液中でのＺ−Ａｓ　−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成５ｍｌのサーモリシンＣＬＥＣ 懸濁液を３７℃において培養されている連続的に撹拌されているバッチ反応器に 加えた。遠心および上澄み液の傾斜後に、水性反応混合物をＣＬＥＣに加えた。

この溶液は、ｌ　ｍ　１の水中の８０ｍｇのＺ−Ｌ−Ａｓｐおよび８０ｍｇのＬ −Ｐｂｅ−ＯＭｅ−ＨＣｌを７．０のｐＨを得るために加えられた酢酸と混合す ることにより、製造された。ＨＰＬＣによる分析用に試料を採取した。下表６は 、時間１＝０において１に規格化されている指定反応時間後のＺ−Ｌ−Ａｓｐ基 質ピークのＨＰＬＣビーク高さを示している。Ｚ−Ｌ−Ａｓｐはこの反応におい ては速度限定性であるため、それの消耗量の測定値が生成物であるＺ−Ｌ−Ａｓ ｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの測定値である（ナカニシ他ミバイオテクノロジー（Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３　：　４５９−４６４　（１９８５）’）。表６は 、残存している限定用Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ基質の規格化されたピーク高さおよび反応 の完了度の推定値も示している。

反応は最初の３０秒間以内に約２０％の完了度まで進行しそしてそこで平らにな ることが明白である。これらの結果は上記の水性反応混合物中で従来法で固定化 されたサーモリシンを使用した時にはナカニシ他の観察と一致しており（バイオ テクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３　：　４５９＝４６４（１９ ８５））　、そしてそれは水中でのＺ−Ｌ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈ　ｅ−ＯＭｅ生成物 の微溶性に寄与している。

表６ 反応時間（秒）　ピーク高さく規格化された）　％完了度０１．０００ ３０　０．７２７　２７．３％ ６０　０．８５７　１４．３％ １２０　０、９４０　６．０％ １８０　０．７９７　２０．３％ はぼ無水の溶液中でのＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成５ｍｌのサーモリシン ＣＬＥＣ懸濁液を３７℃において培養されている連続的に撹拌されているバッチ 反応器に加えた。遠心および上澄み液の傾斜後に、はぼ無水の有機反応混合物を ＣＬＥＣに加えた。この溶液は、１ｍｌの水中の８０ｍｇのＺ−Ｌ−Ａｓｐおよ び８（）ｍｇのＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを９９％の酢酸エチルおよび１％の水と混合 することにより、製造された。ＨＰＬＣによる分析用に試料を採取した。下表７ は、時間１＝０において１に規格化されている指定反応時間後のＺ−Ｌ−Ａｓｐ 基質ピークのＨＰＬＣビーク高さを示している。

Ｚ−Ｌ−Ａｓｐはこの反応においては速度限定性であるため、それの消耗量の測 定値が生成物であるＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの測定値である（ナカニシ 他、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：４５９−４６４ 　（１９８５））、表７は、残存しテイル限定用Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ基質の規格化さ れたピーク高さおよび反応の完了度の推定値も示している。この場合には、反応 は最初の３０秒間以内に約７０％の完了度まで進行しそしてそこで平らになるこ とが明白である。これらの結果は上記のほぼ無水の反応混合物中で従来法で固定 化されたサーモリシンを使用した時にはナカニシ他の観察と一致しており（ノク イオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３　：　４５９−４６４　 （１９８５））　、そしてそれは酵素の生成物抑制に寄与している。

表７ 反応時間（秒）　ピーク高さく規格化された）　％完了度０　１．０００ ３０　０、３２３　６７．７％ ６０　０、３１４　６８．６％ １２０　０．３０５　６９．５％ １８０　０．２７２　７２．８％ サーモリシン（ダイワ・カセイに、に、、日本）をｐＨ１０゜０の１０ｍＭ酢酸 カルシウム（シグマ）中に溶解させて１０％（重量／容量）の濃度とした。溶液 のｐＨを２ＭＮａＯＨを用いる滴定により１０．０に保った。完全な溶解後に、 蛋白質溶液を２ＭＨＣｌを用いてｐＨ８，０まで滴定した。酢酸カルシウムナト リウムを１．２Ｍとなるまで加えた。

次にジメチルスルホキシド（シグマ）を３０％まで加えた。アミコン撹拌細胞（ １０，０００ＭＷＣＯ膜）中での限外濾過により、蛋白質を１００ｒｎｇ／ｍｌ ｌこ濃縮した。濃縮された酵素を分割しそして一７０℃において貯蔵した。１容 量の濃縮された（１００ｍｇ／ｍｌ）蛋白質溶液に９容量の脱イオン水に添加す ることにより、サーモリシンを結晶化させた。溶液を簡単に撹拌し、そして室温 に一夜放置した。結晶を１０容量のｐ）１７．０の１０Ｍｍ酢酸カルシウムで洗 浄し、そして低速遠心（１０分、１５００ＸＧ、ベックマンＧＰＲセントリフユ ージ）により回収した。

サーモリシンの濃縮（１００ｍｇ／ｍ１）溶液に対する水の急速添加が結晶の生 成を誘発させ、それは低い倍率下で１０分以内に見え始めた。

結晶寸法は最終的な蛋白質濃度に再現可能式に依存していた。１容量のサーモリ シン濃縮物（１００ｍｇ／ｍｌ）に対する３容量の水が０．５ｍｍ長さのＸ−線 回折等級の六角形の棒を生成し、それはコルマン（Ｃｏｌｍａｎ）他（コルマン 、Ｐ、Ｍ、、ジャンソニウス（Ｊａｎｓｏｎｉｕｓ）、　Ｊ　、　Ｎ、およびマ チウス（ｉ［ａｔｔｅｗｓ）、　Ｂ、Ｗ、、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ バイオロジー（Ｊ、　ｌ１ｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、７０　：　７０１−７２４　 （１９７２））により以前に記されており我々が回折分析により確認した結晶に 対応していた。

１容量の蛋白質濃縮物に対する１０容量の水の添加は生じる結晶の長さを０．０ ５ｍｍだけ減少させた。これらの微結晶は結晶寸法に関する拡散問題を最少にさ せるという傾向があるため、それらはＣＬＥＣ用途において好適である。一定バ ッチの蛋白質内では、結晶寸法は常に均一であった。（結晶性懸濁液の正確なピ ペット添加を促進させるために長さが０．０５−０．１０ｍｍの結晶がこの研究 で使用された。）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの密度計走査は、結晶化に関する酵素の６倍 の精製を示し、ＣＬＥＣの特異的活性を相当増加させた。下記の如きジペプチド 基質フリールアクリロイル−グリシル−し−ロイシン−アミド（ＦＡＧＬＡ）の 分光計的切断により評価する時には、結晶化は可溶性サーモリシンと比べてＣＬ ＥＣ蛋白質の合計活性において２０％の減少をもたらした。

サーモリシン結晶の架橋結合 サーモリシン結晶を室温で１２．５％のグルタルアルデヒド（シグマ）、５％の ＤＭＳＯおよび５０ｍＭ）リスのｐＨ６，５の溶液中で３時間にわたり架橋結合 した。架橋結合された結晶を脱イオン水中で３回洗浄し、そしてサーモリシンの 結晶化に関して記されている如き低速遠心により回収した。酵素結晶の化学的架 橋結合は結晶格子および結晶中の成分酵素分子を充分に安定化させて、そうでな いなら酵素機能と非相容性である環境中でのＣＬＥＣの実際的な使用を可能にし た。ジペプチド基質ＦＡＧＬＡ　（以下に記されている）の切断を監視すること により（分光計的に）評価した時には、架橋結合された結晶および架橋結合され ていない結晶の間には酵素活性において測定可能な差はなかった。さらに、架橋 結合はＣＬＥＣをそれらを凍結乾燥可能な点まで安定化させ、図１および表８に 示されている如く水性、有機性、および混合された水性−有機性溶媒中での再構 築で完全な酵素活性の保有を示していた。結晶化はＣＬＥＣ蛋白質の特異的活性 において可溶性サーモリシンと比べての３０％の減少を生じたが、ＣＬＥＣの架 橋結合および凍結乾燥はそれ以上特異的活性を減少させなかつた。

表８−サーモリシン活性 吸収３４５ｎｍ 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性サーモリシン１　０．０　０．３１４　０．３１５ ２　１．０　０．２７２　０．２７１ ３　３．０　０．２３５　０．２１８ ４　５．０　０．２０４　０．１９８ ５　１０．０　０．１８４　０．１８５６　１５．０　０．１８３　０．１８４ 可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンの酵素活性遮蔽されたジペプチド基質フリー ルアクリロイル−グリシル−し−ロイシン−アミド（ＦＡＧＬＡ）（シュヴアイ ツエルハール）の加水分解により可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンの触媒活性 を評価した（フェーダ−（Ｆｅｄｅｒ）、　Ｊ　、およびシュツク（Ｓｃｈｕｃ ｋ）、　Ｊ　、　Ｍ、、バイオケミストリー　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ９　：　２７８４−２７９１　（１９７０））、アミド結合の切断は分光計的に ３４５ｎｍにおける吸収減少により測定された。

ブラッドフォード蛋白質測定およびクーマツシー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの密 度計走査（ファーマシアＬＫＢウルトロスカンＸＬ）による初期酵素濃度は１０ −ＴＭであった。ＣＬＥＣ酵素は再構築された凍結乾燥された架橋結合されたサ ーモリシン結晶であると定義されていた。可溶性酵素は１００ｍｇ／ｍ１に濃縮 されたサーモリシンとして定義されていた。酵素を５ｍｌの反応容量含有基質に 加えた。反応混合物の一部を指定時間に除去し、モして３４５ｎｍにおける吸収 を測定した。ＣＬＥＣサーモリシンを反応混合物から吸収の読み取り前に短時間 の遠心（ベックマン、マイクロセントリフユージＥ）により分離した。吸収は疑 似第−桁速度式に合致しており、そして合致した値を酵素濃度により割算するこ とによりｋｃａｔ／Ｋｍを計算した（アップル・マンキントラシュ・コンピュー ター用のマルチフィツト２．０カーブ・フィッティング（ｌｌｕｌｔｉｆｉｔ　 ２．ＯＣｕｒｖｅ　Ｆｉｔｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｐｐｌｅ　１ｌａｃｉ ｎｔｏｓｈ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、英国、ケンブリッジＣＢ４６ＷＬ、ディ・コ ンピユーテイングＰ、０゜ボックス３２７）。

ｐＨ依存性および安定性 可溶性酵素のｐＨ最適性および安定性をジペプチド基質ＦＡＧＬＡの切断による サーモリシンＣＬＥＣのものと比較した。結果を図２および表９に示した。可溶 性および結晶性酵素の両者がｐＨ７において最大活性を示した。ＣＬＥＣおよび 可溶性サーモリシンは酸性範囲においても同様な活性を示しており、そして可溶 性酵素により生じたベル形ｐＨ輪郭は発表されているデータと一致した（フェー ダ−（Ｆｅｄｅｒ）、　Ｊ　、およびシュツク（Ｓｃｈｕｃｋ）、　Ｊ　、　Ｍ 、、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９：２７８４−２７９ １　（１９７０）’）。しかしながら、アルカリ性ｐＨ範囲では、結晶性酵素は ｐＨ１０まで最大活性を保ったが、可溶性酵素はｐＨ８，５において７５％活性 を有しておりそしてｐＨ９においては２５％だけの活性を有していた。ｐＨ９， ５において、可溶性酵素は完全に不活性でありだ。

表９−サーモリシンｐＨ曲線 ％最大活性 ｐｉ−ｔ　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　５．０　１０．２５０　５．１７０２　５．５　９．７５０　６．０７０ ３　６．０　５２．５００　３９．１００４　６．５　８５．０００　７４．６ １０５　７．０　９７．５００　１００．０００６　７．５　１００．０００　 ９８．６５０７　８．０　９７．５００　８２．９２０８　８．５　９５．００ ０　７１．９１０９　９．０　９６．２５０　２４．７２０１０　９．５　９５ ．０００　０．０００１１　１０．０　９０．０００　０．０００高温における 安定性 あるものは比較的高温において一定の化学的工程を操作することにより比較的高 い反応速度並びに基質および生成物に関する比較的低い拡散時間を得ることがで きたが、あるものは基質および生成物の温度安定性により一般的に限定されてい た。しかしながら、酵素を基にした触媒作用においては工程を実施できる温度に 呈するための実際的な限度を設定することはしばしば酵素活性の損失となる。Ｃ ＬＥＣにおいて得られる追加安定性により、可溶性酵素に関して可能であるもの よりはるかに高い温度における酵素活性が可能になった。

比較的低い温度における強化された安定性がＣＬＥＣ触媒の日常的な長期間貯蔵 を簡単にした。例えば、最大の特異的活性を保有するためには可溶性サーモリシ ンの濃縮０５０ｍｇ／ｍｌ）溶液を貯蔵することが必要であった。室温において は、活性は普通は１日以内で失われた。

それとは対照的に、再水和されたサーモリシンＣＬＥＣは室温において活性の明 白な損失なしに数カ月間日常的に貯蔵することができた。サーモリシンの再構築 されていない凍結乾燥されたＣＬＥＣは無期限に成長可能に見えた。

熱安定性および自己融解に対する耐性は連続５日間にわたる６５℃における培養 後のサーモリシンＣＬＥＣ中で示された（図３および表１０）。

サーモリシンＣＬＥＣは高温における５日間の培養後に最大活性を保有していた 。それとは対照的に、可溶性サーモリシンは２日間だけの培養後にそれの初期活 性の５０％を失い、そして６５℃における２４時間の培養後にはわずかな活性だ けを示していた。

表１０−６５℃におけるサーモリシン熱安定性％最大活性 時間（日）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０００　１００．０００　１００．０００２　０．０４１　７０．００ ０ ３　０．０８３　９６．０００　５０．０００４　０．１６４　３２．０００ ５　０．２４６　１７．０００ ６０゜４１０　９７．０　１０．０００７　１．０００　１０１．０　２．００ ０８　２．０００　９７．０ ９　３．０００　９４．０ １０　４．０００　９６．０ １１　５．０００　９２．０ 可溶性およびＣＬＥＣサーモリシンの活性を６５℃における培養後に測定した。

可溶性サーモリシンを１９ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ７，０の５０ｍＭ）リス中 で６５℃の水浴中で培養した。反応容量は５００μｌであった。最終的蛋白質濃 度は１０ｍｇ／ｍ１であった。部分試料を０，１．２．４．６．１０および１８ 時間の時点で除去した。試料を上記の如く室温における５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび ＦＡＧＬＡ切断により評価した。サーモリシンＣＬＥＣに関しては、１９ｍＭ酢 酸カルシウムおよび５０ｍＭ）リス中の２５０μＩの結晶懸濁液も６５℃の水浴 中で培養した。活性を０．１．６．２４．４８．７２．９６および１２０時間の 時点でＦＡＧＬＡ切断により評価した。

外因性蛋白分解に対する耐性 外因性プロテアーゼの作用に対するサーモリシンＣＬＥＣの耐性の評価も行った 。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳 動）分析は、商業用酵素が相当な百分率の不純物を含有している可能性があり、 それらの一部は主要な可溶性酵素種に対して蛋白分解活性を有するかもしれない ことを示唆していた。結晶格子中の酵素分子の充填と仮定すると、ＣＬＥＣ中の 内部酵素分子は蛋白分解から保護されるであろうと思われる。この可能性を試験 するために、サーそりシンＣＬＥＣおよび可溶性酵素調合物をほとんどの蛋白質 を消化させて遊離アミノ酸類にさせることのできる非特異的プロテアーゼである ストレプトコツカル・プロテアーゼ、プロテアーゼ８の存在下で培養した（カル ビオケミエ９９０カタログ、ラジョッラ、カリフォルニア）。

可溶性およびＣＬＥＣサーそりシンをｐＨ７，５の５０ｍＭ）リス中で４０℃に おいてプロテアーゼであるプロテアーゼｌ′（カルビオケミ）の存在下で培養し た。プロテアーゼ０対サーモリシンの比は１／４０であった。サーモリシンの自 己融解を抑制しそしてサーモリシンによるプロテアーゼの蛋白分解的破壊を防止 するために、ＥＤＴＡを可溶性酵素反応に加えて１００ｍＭの最終的濃度とした （ＥＤＴＡはサーモリシン活性を抑制するがプロテアーゼ８は抑制しない）。指 定時開に、部分試料を反応混合物から除去し、そして活性を分光計的にジペプチ ド基質ＦＡＧＬＡの切断により評価した。ＥＤＴＡの存在によるサーモリシン抑 制を相殺するために、可溶性酵素活性の分光計的評価はｐＨ７，０の０゜５Ｍ酢 酸カルシウム緩衝液中でおこなわれ、そして酵素濃度を２倍に増加させた。架橋 結合された結晶性酵素は上記の如く評価された。

図４および表１１に示されている如く、可溶性サーモリシンは急速に劣化しそし て９０分の培養後には全ての活性を失った。それとは対照的に、サーモリシンＣ ＬＥＣの活性はプロテアーゼの存在下での４日間の培養により影響を受けなかっ た。この蛋白分解に対してほとんど敏感性でないことは、適当なＣＬＥＣが未知 の天然産出蛋白分解酵素のカクテルの存在下で作用するように要求されているよ うな診断用のバイオセンサー用途において特に有利である。

表１１ プロテアーゼ耐性 ％最大活性 時間（日）　ＣＬＥＣ可溶性酵素　時間（分）１　０．０００　１００．０　１ ００．０　０．０００２　０．００３　２５．０　５．０００３　０．０１０　 １７．５　１５．０００４　０．０２１　９．５　３０．０００５　０．０４２ 　９８．０　３．０　６０．０００６　０．０６３　１．０　９０．０００７　 ０．０８４　１０１．０　０．０ ８　１．０００　９７．０ ９　２．０００　９９．０ １０　３．０００　９８．０ １１　４．０００　９６．０ 有機溶媒の。（表１２）。有機溶媒中で培養できるであろう可溶性酵素濃度は最 高１０ｍｇ／ｍｌに限定されていた。この値より大きい濃度は有機溶媒の添加で サーモリシンの瞬間的沈澱を生じた。それとは対照的に、サーモリシンＣＬＥＣ 濃度は結晶により占拠されている容量によってのみ限定されていた。可溶性サー そりシンはアセトン中での培養後に最大活性（７５％）をそしてテトラヒドロフ ラン中で最少活性（３６％）を保有していた。アセトニトリルまたはジオキサン の存在下での１時間の培養後に、可溶性酵素はそれの初期活性の約５０％を失っ た。ＣＬＥＣサーモリシンは評価された全ての有機物質を用いる培養後に９５％ より大きい最大活性を保有していた。

表１２ ％最大活性 可溶性酵素　ＣＬＥＣ アセトニトリル　４２　１０２ ジオキサン　６６　９７ アセトン　７５　９９ ＴＨＦ本　３６　９６ 本テトラヒドロフラン サーモリシンＣＬＥＣまたは可溶性サーモリシン調合物を指定された有機溶媒の ５０％（容量／容量）溶液中で培養した。１００μｌのサーモリシンＣＬＥＣ（ １０ｍｇ／ｍｌ）のｐＨ７の１０ｍＭトリス中スラリーを１／２ドラムガラス瓶 中に入れた。等量の指定有機溶媒を加え、そして混合物を短時間撹拌した。１／ ２ドラムガラス瓶中で２０μＩの可溶性サーモリシン（１００ｍｇ／ｍｌ）をＢ ｏμｌのｐＨ７，０の０゜０１５Ｍ１−リス緩衝液中で希釈した。培養後に、上 記の如きジペプチド基質ＦＡＧＬＡの切断により酵素活性を評価した。

低い水濃度は酵素変性への経路に対する中間段階の出現を好まないようである。

ＣＬＥＣでは、立体配座移動度のこの制限は、媒体中で水がほぼ存在しないとい うことによってではなくむしろ、分子内接触および結晶格子を構成している成分 酵素分子間の架橋結合により供されている。

その結果、中間的な水−有機溶媒濃度は一部はこれまでの酵素を用いては観察さ れていないＣＬＥＣとして調合される時には酵素により容易に耐えられるものと なる（表１２参照）。この発見により、全ての新分野の合成化学が酵素触媒作用 を用いる開発が展望される。

しかしながら、はぼ無水の有機溶媒中でさえ酵素の日常的使用はそれらが塊状化 および他の集塊問題を受けて不満足と定義される懸濁液を生成するというそれら の傾向により妨害されていた。この性質により、これらの調合物が大規模な工業 的方法を元々魅力のないものにしている。

それとは対照的に、結晶格子内のＣＬＥＣおよび成分酵素は全てのこれらの溶媒 中で単分散性を保っていた。

他の固定化方法との比較 多数の使用できる酵素固定化方法の論文が文献中に見られる（マウフ（Ｍａｕｇ ｈ）、　Ｔ、　Ｈ，、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３　：　４７４−４ ７６　（１９８４）、トランバー（Ｔｒａ■ｐｅｒ）、　Ｊ　、、トレンズ・イ ン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） 、３　：　４５−５０　（１９８５））。

これらでは、酵素は常に固定化された粒子の合計量の小部分を構成しており、そ れの塊は不活性担体物質である。担体は固定化された酵素粒子の溶媒外側と酵素 活性部位との間の平均自由通路を増加させ、拡散問題を悪化させている（クイオ チョ（Ｑｕｉｏｃｈｏ）、　Ｆ、　Ａ、およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ） 、　Ｆ　、　Ｍ、、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５　： 　４０６２−４０７６　（１９６７）”）。

ＣＬＥＣでは、架橋結合された結晶マトリックスがそれ自身担体を供して、担体 の必要性が除かれる。その結果、ＣＬＥＣ中の酵素の濃度は一定寸法の分子に対 して得られる理論的充填限度に近付いて、濃縮溶液中で得られる密度さえも大き く越えることとなる。全体的ＣＬＥＣは活性酵素を含んでおり、従って活性酵素 と遊離溶媒との間の基質および生成物に関する平均自由通路が（従来法で固定化 された酵素担体粒子と比べて）ＣＬＥＣに関しては太き（短縮されるため溶液中 の酵素に関して従来法で固定化された酵素で一般的に見られる酵素反応の拡散− 関連減少は最少になった（図１参照）。重要なことに、ＣＬＥＣ中の成分酵素は 本質的に単分散性であり、そして例えば濾過、遠心または溶媒の傾斜の如きＣＬ ＥＣ粒子の簡単な処理により回収することができる。

実施例３ エラスターゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の凍結乾燥 された豚の膵臓のエラスターゼ（サーヴア）を室温においてｐＨ５，０の０．１ Ｍ酢酸カルシウム中に溶解させて５ｍｇ／ｍｌ　（重量／容量）の濃度とした。

蛋白質の完全溶解から１分以内に棒形のエラスターゼ結晶が見られた。結晶化溶 液を４℃に移行させそして結晶化を−夜で完了させた。結晶を前記の如くして遠 心により回収した。

エラスターゼ結晶の架橋結合 ２００μｍ量のエラスターゼ結晶を室温で５．７７％のグルタルアルデヒドおよ びｐＨ５，０の１．５Ｍ）リスの１．３ｍｌ溶液に加えた。結晶を穏やかに撹拌 しながら（撹拌板）１時間にわたり架橋結合した。架橋結合後に、結晶を１５ｍ １量のｐＨ８，０の０．２Ｍ）リスで３回洗浄した。エラスターゼＣＬＥＣを実 施例２中に記されている如くして凍結乾燥した。

可溶性およびＣＬＥＣエラスターゼの酵素活性基質スクシニル−（Ａｌａ）ｙｐ −ニトロアニリド（バケム）の加水分解を測定することにより可溶性およびＣＬ ＥＣエラスターゼの触媒活性を評価した［ベイＸ（Ｂｅｉｔｈ）他、Ｂｉｏｃｈ ｅｔ　ｌｅｄ、、１１　：　３５０−３５７（１９７４）］。結合の切断は分光 計的に４１０ｎｍにおける吸収増加により測定された。初期基質濃度は２Ｘ１０ −’であった。酵素濃度は２゜８Ｘ１０−’であった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵 素を、５ｍ１反応量の基質を含有しているｐＨ８，０の０．２Ｍ）リスに加えた 。前記の如く、ＣＬＥＣを反応混合物から吸収測定前に除去した。

表１３−エラスターゼ活性 吸収４００ｎｍ 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０　０、ｏｏｏ　ｏ、ｏｏ。

２　０．５　０．１０３　０．２０５ ３　１．０　０．１９５　０．３９０ ４　２．０　０．３６６　０．６７２ ５　３．０　０．５２３　０．９２３ ６　４．０　０．６５７　１．０９８ ７　５．０　０．７８０　１．２２７ ８　６．０　０．８８８　１．３２６ ９　７．０　０．９７４　１．３９３ １０　１０．０　１．１７０　１．５１２１１　１５．０　１．３６５　１．５ ８６外因性蛋白分解に対する耐性 プロテアーゼの作用に対するエラスターゼＣＬＥＣの耐性の評価もサーモリシン に関して記載されているのと同一条件下で行った（実施例２）。

プロテアーゼを用いる培養後に、上記の如きニトロアニリド基質の加水分解によ り可溶性およびＣＬＥＣ酵素の活性を評価した（表１４および図６）。

表１４−蛋白分解に対するエラスターゼ耐性％最大活性 時間　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０　１００．０　１００．０ ２　１０．０　５３．０ ３　２０．０　３２．０ ４　３０．０　１０１．０　１８．０ ５　４５．０　１１．０ ６　６０．０　１０２．０　８．０ ７　１２０．０　１０１．０　３．０ ８　１８０．０　１０３．０　２．０ 実施例４ エステラーゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成物の特性の評 価 エステラーゼの結晶化 ここに開示されている如く、３０ｍｇ／ｍｌの豚の肝臓エステラーゼ（フル力） の硫酸アンモニウム懸濁液を室温においてｐＨ５，６の０゜２５Ｍ酢酸カルシウ ム中に溶解させた。酢酸カルシウム溶液の添加後数分以内にエステラーゼ結晶が 見られた。結晶化溶液を室温に放置しそして結晶化を一夜で完了させた。結晶を 以上で実施例２に記されている如くして遠心により回収した。

エステラーゼ結晶の架橋結合 ここに開示されている如く、３００μｍ量のエステラーゼ結晶を１２゜５％のグ ルタルアルデヒドおよびｐＨ５，５の０．５酢酸カルシウムの５ｍｌ溶液に加え た。結晶を穏やかに撹拌しながら（撹拌板）１時間にわたり架橋結合した。架橋 結合後に、結晶を１５ｍ１量のｐＨ６，３の０゜５Ｍ酢酸カルシウムで３回洗浄 した。エステラーゼＣＬＥＣを以上で実施例２中に記されている如（して凍結乾 燥した。

可溶性およびＣＬＥＣエステラーゼの酵素活性基質である酢酸ｐ−ニトロフェニ ル（フル力）の加水分解を監視することにより可溶性およびＣＬＥＣエステラー ゼの触媒活性を評価した（表１５および図７）。切断は分光計的に４００ｎｍに おける吸収増加により測定された。初期基質濃度は０．００１％であった。酵素 濃度は１×１０−８Ｍであった。ＣＩ、ＥＣまたは可溶性酵素を５ｍ１反応量の 基質を含有しているｐＨ６，３の０．２５Ｍ酢酸カルシウムに加えた。以上で実 施例２に記されている如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に除去し た。

表１５−二ステラーゼ活性 吸収４００ｎｍ 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 ｉ　ｏ、ｏ　ｏ、ｏｏｏ　ｏ、ｏｏ。

２　０．５　０．７７０　０．２５２ ３　１．０　０．１２８　０．２９７ ４　２．０　０．２０８　０．３３７ ５　３．０　０．２６０　０．３４６ ６　５．０　０．３２４　１．３５３ ７　７．０　０．３５３　１２５９ ８　１０．０　０．３６９　１．３６８外因性蛋白分解に対する耐性 プロテアーゼの作用に対するエステラーゼＣＬＥＣの耐性の評価もサーモリシン に関して記載されているのと同一条件下で行つた（実施例２）。プロテアーゼを 用いる培養後に、上記の如き基質ｐ−ニトロアニリドの加水分解により可溶性お よびＣＬＥＣ醇素の活性を評価した（表１６および図８）。

！１旦−蛋自分解に対するエステラーゼ耐性％最大活性 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０　１００．０　１００．０ ２　１０．０　６８．０ ３　２０．０　４７．０ ４　３０．０　９９．０　２５．０ ５　４５．０　２０．０ ６　６０．０　９７．０　１６．０ ７　１２０．０　９４．０　１０．０ ８　１８０．０　９１．０　６．０ ここに開示されている如く、酵素リパーゼ（ジオトリラム・カンジズム）を２０ ｍｇ／ｍｌの蛋白質のｐＨ７の５０ｍＭトリス含有８％硫酸アンモニウム中溶液 から蒸気拡散により結晶化させた。室温における２０−３０日間の培養後に、ビ ビリミダル結晶が見られた。結晶を以上で実施例２に記されている如くして遠心 により回収した。

リパーゼ結晶の架橋結合 ここに開示されている如く、リパーゼ結晶を１２．５％のグルタルアルデヒドお よびｐＨ５，６の５０ｍＭ）リスの溶液に加えた。結晶を１時間にわたり架橋結 合した。架橋結合後に、結晶を１５ｍ１量のｐＨ７゜０の５０ｍＭトリスで３回 洗浄した。リパーゼＣＬＥＣを以上で実施例２中に記されている如くして凍結乾 燥した。

可溶性およびＣＬＥＣリパーゼの酵素活性基質である酢酸ｐ−ニトロフェニルの 加水分解を監視することにより可溶性およびＣＬＥＣリパーゼの触媒活性を分光 計的に評価した（表１７および図９）。切断は分光計的に４００　ｎｍにおける 吸収増加により測定された。初期基質濃度は０．００５％であうた。酵素濃度は １．５×１０−８Ｍであった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵素を５ｍｌの反応量の基 質を含有しているｐＨ７，０の０．２Ｍトリスに室温で加えた。以上で実施例２ に記されている如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に遠心により除 去した。

表１７−リパーゼ活性 吸収４００ｎｍ 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０　０．０００　０．０００ ２　０．５　０．０１３　０．０２１ ３　５．０　０．０９４　０．１１６ ４　１０．０　０．１６４　０．１８６５　１５．０　０．２４８　０．２５８ ６　３０．０　０．３４６　０．３５７７　４５．０　０．４０７　０．４２０ ８　６０．０　０．４６１　０．４５９９　９０．０　０．４９７　０．５０２ ブレーク（Ｂｌａｋｅ）、　Ｃ，Ｃ，Ｆ、他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　１ ９６　：１１７３　（１９６２）の方法に従い、２００ｍｇの凍結乾燥された鶏 卵白のリゾチーム（ベーリンゲル・マンハイム）を２．５ｍｌのｐＨ４，７の０ ゜０４Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に室温において溶解させた。蛋白質の溶解後に 、２．５ｍｌの１０％塩化ナトリウムをリゾチーム溶液に撹拌しなから滴々添加 した。結晶化溶液を室温に一夜放置し、そして結晶化を４８時ｒ５で完了させた 。結晶を以上で実施例２に記されている如くして遠心により回収した。

リゾチーム結晶の架橋結合 ここに開示されている如く、５００μ■量のりゾチーム結晶を１０ｍ１の２４％ のグルタルアルデヒドおよびｐＨ５，６の５０ｍＭ）リス含有２０％塩化ナトリ ウムの溶液に加えた。結晶を穏やかに撹拌しながら（撹拌板）２０分間にわたり 架橋結合した。架橋結合後に、結晶を５０ｍ１量の２０ｍＭ酢酸カルシウムおよ びｐＨ５，３の５０ｍＭ塩化カリウムで３回洗浄した。リゾチームＣＬＥＣを以 上で実施例２中に記されている如（して凍結乾燥した。

可溶性およびＣＬＥＣリゾチームの酵素活性基質である酢酸４−メチルウンベリ フェリルＮ−アセチル−チドリオシド（フル力）の加水分解速度を測定すること により可溶性およびＣＬＥＣリゾチームの触媒活性を評価した（ヤング（Ｙａｎ ｇ）、　Ｙ、およびハマグチ（■ａｍａｇｕｃｈｉ）、　Ｋ、、ザ・ジャーナル ・オブ・バイオケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｓ、　）、８　：１００３−１０１４　（１９８０）（表１８およ び図１０）。４−メチルウンベリフェロンの放出は蛍光計により追跡された（パ ーキン・エルマー・モデルＬＳ−５０）。初期基質濃度は１．４２ｘ１０−３で あった。酵素濃度は３Ｘ１０”であった。ＣＬＥＣまたは可溶性酵素を２ｍｌの 反応量の基質含有しているｐＨ５，３の０．２Ｍトリスに４２℃において加えた 。４５０ｎｍにおける蛍光強度を３６０ｎｍにおける励起と共に測定することに より、４−メチルウンベリフェロンの量を蛍光計により測定した。励起および発 光の両者に関するスリ、ト幅はＩＱｍｍであつた。以上で実施例２に記されてい る如く、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に遠心により除去した。

表１８−リゾチーム活性 蛍光 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０００　０．０００　０．０００２　１０．０００　４．４００　１８ ．９００３　３０．０００　１０．５００　２９．４００４　６０．０００　２ ７．５００　４４．８００５　９０．０００　３３．８００　５１．７００６　 １２０．０００　４５．９００　５９．８００実施例７ アスパラギナーゼの結晶化、架橋結合および凍結乾燥並びに生じた生成ゲラブナ −（Ｇｒａｂｎｅｒｅ）他［米国特許３，６６４．９２６　（１９７２）］によ り記されている工程の変法としてｓ　２５　ｍ　ｇの凍結乾燥されたアスパラギ ナーゼ（ワーシングトン）を５００μｌのｐＨ７，２の５０ｍＭ燐酸ナトリウム 緩衝液中に溶解させた。溶液を４℃に冷却し、そして１Ｍ酢酸を用いてｐＨを５ ．０に調節した。冷たい（−２０℃）エタノールを次にアスパラギナーゼ溶液に 滴々添加して３３％の最終的濃度にした。溶液を４℃において培養した。結晶化 を４８時間で完了させた。結晶を以上で記されている如く遠心により回収した。

アスパラギナーゼ結晶の架橋結合 ここに開示されている如（、アスパラギナーゼ結晶を７．５％のグルタルアルデ ヒドのｐＨ５，６の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中溶液の中で架橋結合した。

架橋結合後に、結晶を１５ｍＩ量のｐＨ７，０の５９ｍＭ）−リスで５回洗浄し た。アスパラギナーゼＣＬＥＣを以上で実施Ｎ２中に記されている如くして凍結 乾燥した。

可溶性およびＣＬＥＣアスパラギナーゼの酵素活性以下に記されている一緒にさ れた酵素反応におけるアンモニウムイオンの発生を測定することにより可溶性お よびＣＬＥＣアスパラギナーゼの触媒活性を評価した（全ての試薬はベーリンゲ ル・マンハイムから購入された）（表１９および図１１）。

アスパラギナーゼ Ｌ−アウパラギンーーーーーーーーーー→アスパレート十ＮＨ４＋グルタメート デヒドロゲナーゼ ＮＨ４＋十ＮＡＤＨ＋αケトグルタレートー−−−−一−−−−−−→グルタミ ン酸＋ＮＡＤ＋ ３４０ｎｍにおける吸収減少により、ＮＡＤＨの酸化が測定された。初期基質濃 度は１．４ｍｇ／ｍ！であった。アスパラギン酵素濃度は１０−ＩＭであった。

アルファケトグルタレート濃度は１０−’Ｍであった。

グルタメートデヒドロゲナーゼ濃度は２．３Ｘ１０−’Ｍであった。以上で実施 例２に記されている如（、ＣＬＥＣ酵素を反応混合物から吸収測定前に遠心によ り除去した。

表１８−アスパラギナーゼ活性 吸収３４０ｎｍ 時間（分）　ＣＬＥＣ可溶性酵素 １　０．０　１．０００　１．０００ ２　１．０　０．８６７　０．８２５ ３　３．０　０．７３９　０．６８４ ４　５．０　０．６０３　０．５３８ ５　１０．０　０．５０２　０．４０６６　１５．０　０．４４９　０．３３８ ７　３０．０　０．３２８　０．１９９８　４５．０　０．２１１　０．１８７ ＩＧ−１ ｐＨ 時間（日） 時間（日） ＦＩＧ、　４ 時間（分） ＦＩＧ、　４Ａ 時間（分） ＦＩＧ、５ 時間（分） 時間（分） 時間（分） ＦＩＧ、　８ 時間（分） ＦＩＧ、　９ 時間（分） 時間（分） 要　約　書 酵素の結晶を製造しそして一般的には生じた結晶を二官能性試薬の使用により架 橋結合することによる酵素の固定化方法、この方法により製造された架橋結合さ れ固定化された酵素結晶（ＣＬＥＣ類）、この方法により製造されたＣＬＥＣ類 の凍結乾燥、凍結乾燥された架橋結合され固定化されたＣＬＥＣ類、並びにＣＬ ＥＣまたはＣＬＥＣ類の組により触媒作用を受ける反応による希望する生成物の 製造方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）千１に５年２月２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）少なくとも１種の適切に選択された基質と基質上で作用し且つ架橋結合 され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種の酵素とを組み合わせ、 そして ｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素が基質上で作用するのに適して いる条件下に保ち、それにより選択された生成物を製造することを含んでなる、 選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける方法。 ２）選択された生成物がペプチド類、脂質類、偏光性有機分子および炭水化物類 からなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。 ３）架橋結合され固定化された酵素結晶の寸法が約１０−１ｍｍである請求の範 囲第１項に記載の方法。 ４）段階（ｂ）における条件が架橋結合された形状ではない酵素の有効機能にと っては有害なものである請求の範囲第１項に記載の方法。 ５）段階（ｂ）における条件が高い温度、低いｐＨ、高いｐＨ、水性／有機性と 混合された有機溶媒、およびほとんど無水の条件からなる群から選択される請求 の範囲第４項に記載の方法。 ６）ａ）２種の適切に選択された基質と少なくとも１種の適切に選択された基質 上で作用し且つ架橋結合され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種 の酵素とを組み合わせ、そしてｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素 が少なくとも１種の適切に選択された基質上で作用するのに適している条件下に 保ち、それにより選択された生成物を製造する ことを含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受ける 方法。 ７）選択された生成物がペプチド類、脂質類、偏光性有機分子および炭水化物類 からなる群から選択される請求の範囲第６項に記載の方法。 ８）架橋結合され固定化された酵素結晶の寸法が約１０−１ｍｍである請求の範 囲第６項に記載の方法。 ９）段階（ｂ）における条件が架橋結合された形状ではない酵素の有効機能にと っては有害なものである請求の範囲第６項に記載の方法。 １０）段階（ｂ）における条件が高い温度、低いｐＨ、高いｐＨ、水性／有機性 と混合された有機溶媒、およびほとんど無水の条件からなる群から選択される請 求の範囲第６項に記載の方法。 １１）ａ）少なくとも１種の適切に選択された基質、基質上で作用し且つ架橋結 合され固定化された酵素結晶の形状である少なくとも１種の酵素、および有機溶 媒を組み合わせ、そしてｂ）段階（ａ）で製造された組み合わせ物を酵素が基質 上で作用するのに適している条件下に保ち、それにより選択された生成物を製造 することを含んでなる、選択された生成物を製造するための酵素で触媒作用を受 ける方法。 １２）適切に選択された基質と適当に選択された基質上で作用する架橋結合され 固定化された酵素結晶とを、架橋結合され固定化された酵素結晶が適当に選択さ れた基質上で作用するのに適している条件下で組み合わせ、それにより基質を変 更しそして選択された生成物を製造することを含んでなる、選択された生成物を 製造するための酵素で触媒作用を受ける方法。 １３）ａ）第一のペプチドが式Ｚ−Ｌ−Ａｓｐを有しておりそして第二のペプチ ドが式ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを有している２種のペプチド類と架橋結合され固定 化されたサーモリシン結晶とを、架橋結合され固定化された酵素結晶の作用によ る２種のペプチド類の縮合用に適している条件下で組み合わせ、それにより式Ｚ −Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（ここでＺはベンジルオキシカルボニル基を 表す）の部分的に保護されたジペプチドを製造し、そしてｂ）ベンジルオキシカ ルボニル基を除去し、それによりアスパルターメを製造する段階を含んでなる、 アスバルターメの製造方法。 １４）酵素を結晶状で供給しそして結晶を架橋結合し、それにより寸法が約１０ −１ｍｍの架橋結合され固定化された酵素結晶を製造することを含んでなる、酵 素を固定化しそしてそれの活性を保有する方法。 １５）請求の範囲第１４項に記載の方法により製造された寸法が約１０−１ｍｍ の架橋結合され固定化された酵素結晶。 １６）サーモリシン、リパーゼ類、エラスターゼ類、エステラーゼ類、リゾチー ム類およびアスパラギナーゼからなる群から選択される請求の範囲第１５項に記 載の架橋結合され固定化された酵素結晶。 １７）製造された架橋結合され固定化された結晶を凍結乾燥することをさらに含 んでなる請求の範囲第１４項に記載の方法。 １８）請求の範囲第１７項に記載の方法により製造された凍結乾燥された架橋結 合され固定化された酵素結晶。 １９）サーモリシン、リパーゼ類、エラスターゼ類、エステラーゼ類、リゾチー ム類およびアスパラギナーゼからなる群から選択される請求の範囲第１８項に記 載の凍結乾燥された架橋結合され固定化された酵素結晶。 ２０）サーモリシン結晶を供給しそしてサーモリシン結晶を架橋結合し、それに より寸法が約１０−１ｍｍの架橋結合され固定化されたサーモリシン結晶を製造 することを含んでなる、サーモリシンを固定化しそしてそれの活性を保有する方 法。 ２１）請求の範囲第２０項に記載の方法により製造されたサーモリシンの架橋結 合され固定化された結晶。 ２２）製造された架橋結合され固定化された酵素結晶を凍結乾燥することをさら に含んでなる請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２３）請求の範囲第２０項に記載の方法により製造された凍結乾燥された架橋結 合され固定化されたサーモリシン結晶。 ２４）架橋結合され固定化された酵素結晶および架橋結合され固定化された酵素 結晶用の保有手段を含んでいる装置であり、ここで保有手段は架橋結合され固定 化された酵素結晶と流体中に存在している酵素がその上で作用する基質との間の 接触を可能にさせる物質からなっている装置。 ２５）ａ）存在している酵素が関心のある分析物上または関心のある分析物が関 与する反応における反応物上で作用するような、架橋結合され固定化された酵素 結晶、および ｂ）架橋結合され固定化された酵素結晶と（１）流体中に存在している酵素がそ の上で作用する分析物または（２）流体中に存在している分析物が関与する反応 における反応物を含有している流体との間の接触を可能にさせる物質からなって いる、架橋結合され固定された酵素結晶用の保有手段 を含んでなる、流体中の関心のある分析物を検出するためのバイオセンサー。 ２６）検出手段をさらに含んでなる請求の範囲第２５項に記載のバイオセンサー 。 ２７）グルコース、クレアチニン、尿素、ラクテート、グルコース−６−ホスフ ェート、スクロース、ＡＴＰ、エタノール、酢酸、蟻酸、コレステロール、尿酸 、メトトレキセート、二酸化炭素、アミノ酸類、ホスフェート類、ペニシリン、 ナイトレート類、ナイトライト類、スルフェート類およびスクシネート類からな る群から選択される関心のある分析物を流体中で検出するための請求の範囲第２ ５項に記載のバイオセンサー。 ２８）ａ）ルシフェラーゼが関心のある分析物上または関心のある分析物が関与 する反応における反応物上で作用するような、架橋結合され固定化されたルシフ ェラーゼ結晶、およびｂ）架橋結合され固定化されたルシフェラーゼ結晶と（１ ）ルシフェラーゼがその上で作用する分析物または（２）分析物が関与する反応 における反応物を含有している流体との間の接触を可能にさせる物質からなって いる、架橋結合され固定されたルシフェラーゼ結晶用の保有手段を含んでなる、 流体中の関心のある分析物を検出するためのバイオセンサー。 ２９）ａ）酵素が成分上または該成分が関与する反応における反応物上で作用す るような、架橋結合され固定化された酵素結晶、およびｂ）架橋結合され固定化 された酵素結晶と（１）酵素がその上で作用する流体中に存在している成分また は（２）該成分が関与する反応の生成物である流体中に存在している反応物との 間の接触を可能にさせる物質からなっている、架橋結合され固定された酵素結晶 用の保有手段を含んでなる、流体の成分を変更させるための体外装置。 ３０）成分がアスパラギン、ヘパリン、ビリルビン、メトトレキセート、アミノ 酸類、尿素およびアンモニアからなる群から選択される、流体の成分を変更させ るための請求の範囲第２９項に記載の体外装置。 ３１）架橋結合され固定化された酵素結晶および架橋結合され固定化された酵素 結晶用の保有手段を含んでなる、選択された生成物を製造するために有用な装置 。