PT98564B - Processo para a realizacao de processos catalizados por enzimas com cristais reticulados como forma de imobilizacao de enzimas e dispositivos que os contem - Google Patents

Processo para a realizacao de processos catalizados por enzimas com cristais reticulados como forma de imobilizacao de enzimas e dispositivos que os contem Download PDF

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Description

A invenção refere-se ao processo para a realização de processos catalisados por enzimas mediante utilização de cristais reticulados para imobilização de enzimas para a preparação de produtos seleccionados, que compreende
a) combinar-se pelo menos um substrato apropriadamente escolhido com pelo menos uma enzima que actua sobre o substrato e está sob a forma de cristais imobilizados reticulados; e
b) manter-se a combinação produzida na operação a) sob as condiçães apropriadas para que a enzima actue sobre o substrato e origine o produto pretendido.
No âmbito da invenção estão também incluídos o processo de imobilização das enzimas sob a forma de cristais reticulados, opcionaimente liofilizados assim como os dispositivos que os contêm.
PEDIDOS DE DEPOSITO RELACIONADOS
Este pedido de depósito é uma continuação à parte da Memória Descritiva da Patente Americana de N2. de Série 07/562 280 emitida a 3 de Agosto de 1990 β intitulada Processos para a preparação e uso de cristais reticulados como uma nova forma de imobilização enzimática”. Os ensinamentos da patente acima referida são aqui incorporados como referência.
HISTORIAI DA INVENÇÃO
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As enzimas são usadas como catalisadores industriais na preparação de especialidades químicas e finas de forma económica à escala laboratorial e industrial (Jones, J. B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1986)), para a preparação de produtos alimentares (Zaks et. al., Trens in Bioteehnology 6:272-275 (1988)), e como agentes para a síntese de compostos orgânicos (Wong, C.-H., Science 244: 1145-1152 (1989); CHEMTRACTS-Org. Chem. 3:91-111 (1990)).
A produção baseada em enzemas pode reduzir significativamente a poluição ambiente grandemente implícita na produção à escala industrial de intermediários químicos que de outra forma não seriam usados, como revela a produção à escala industrial de acrilamida usando a enzima hidratase de nitrilo (Nagasawa, T. and Yamada, H., Trends in Bioteehnology 7: 153-158 (1989)).
As enzimas são também usadas em aplicações biosensoras para detectar várias substâncias de interesse clínico, industrial e outros (Hall, E., Biosensora”, Open University Press (1990)). Na área clínica, as enzimas podem ser usadas em terapia extraeorporal, tal como hemodiálise e hemofiltração, em que as enzimas r.emovem selectivamente materiais residuais e tóxicos do sangue (Klein, M. e langer, R., Trends in Biotechnology 4:179-185 (1986)). As enzimas são usadas nesta área porque funcionam eficientemente como catalisadores num intervalo lato de vários tipos de reacção, a temperaturas moderadas, e com estere o-séísctividade e especificidade para com 0 substrato. No entanto, existem desvantagens assiociadas ao uso de catalisadores enzimáticos cujo uso foi limitado a processos químicos laboratoriais e industriais (Akiyama et.
al., CHEMTECH 627-634 (1988)).
As enzimas são caras e relatívamente instáveis em comparação com a maior parte dos catalisadores industriais e laboratoriais, mesmo quando usadas em meio aquoso onde normalmente as enzimas funcionam. Muitas das reacçães químicas de interesse mais econánico realizadas na prática comum são incompatíveis com o meio aquoso, em que, por exemplo, os substratos e produtos são frequentemente insolúveis ou instáveis, e em que a hidrólise pode competir significativamente como complemento, a recuperação de catalisadores enzimáticos solúveis a partir do produto de reacção e substrato que não reagiu no stock de alimentação requer frequentemente o uso de tecnologias de separação onerosa e complicada. Einalmente, as enzimas são de difícil armazenamento pois é indispensável manter a sua actividade e integridade funcional, durante períodos de tempo comercialmente razoáveis (meses a anos) sem ter que se reco®rer a refrigeração 420 a -802C, para temperaturas de Ng líqui do), ou manter em solventes aquosos de força iónica adequada, pH, etc.
Os processos de imobilização de enzimas superaram, em alguns casos, estas desvantagens. A imobilização pode aperfeiçoar a estabilidade dos catalisadores enzimáticos e proteger a sua integridade funcional em ambientes com solventes rígidos β temperaturas extremas características de processos químicos laboratoriais e industriais (Harrmeier, W. Trends in Biotechnology 3 : 149-153 (1985)). Processos de fluxo contínuo podem ser realizados com partículas enzimáticas imobilizadas em colunas, por exemplo, quando o stock de alimentação solúvel passa atravâs das partículas e á gradualmente convertido em produto.
Tal como aqui é usado, o termo '‘imobilização de enzimas” refe
refe-se à insolubilização do catalisador enzimático pela ligação a, encapsulação de, ou por agregação em, partículas macroscópicas(IO-1 mm).
Numerosas revistas úteis sobre processos de imobilização de enzimas apareceram como literatura (Maugh, Τ. Η., Science 223:474-476 (1984); Tremper, J., Trends in Bioteehnology 3: 45-50 (1985)). Maugh descreve cinco processos principais de imobilização de enzimas, esses processos incluem: adsorçâo num suporte sólido (tais como resinas de pe.rmuta iónica); ligações covalentes a suportes (tais como resinas de permuta iónica, cerâmicas porosas ou camadas de vidro); retenção em gels poliméricos; encapsulação; e a precipitação de proteínas solúveis mediante reticula-çao das mesmas com reagentes ' bifuncionais duma forma à toa e não definida. Em adição, podem imobilizar-se todas as células (normalmente mortas e tornadas permeáveis) que evidenciaram a actividade enzimática desejada a níveis elevados (por exemplo, Nagasawa, Τ. β Yamada, H., Trends in Bioteehnology 7: 153-158 (1989)).
Cada uma destas técnicas de imobilização apresentam as suas próprias vantagens e limitações e nenhuma delas pode ser considerada óptima ou dominante. Na maior parte delas, o catalisador enzimático representa por último apenas uma pequeuia fracção do volume total do material presente no reactor. químico. Como tal, o volume do meio imobilizado é preparado a partir duma substância veicular inerte, mas frequentemente dispendiosa. Em todas elas, as interaeções de imobilização das moléculas do catalisador enzimático umas com as outras e/ou com a substância veicular tendem a ser ocasionais e indefinidas. Como resultado, apesar destas interaeções conferirem alguma estabilidade acrescida às moléculas do catalisador ; enzimático, a sua não-especificidade relativa e irregularida- |
de torna essa estabilização sub-ôptima e irregular. Na maior parte dos casos, o acesso à zona actíva do catalisador enzimático mantêm-se mal definido. Adicionalmente, os processos de imobilização acima descritos falham porque se debatem com problemas associados com o armazenamento e refrigeração, e nem sequer podem imobilizar convencionalmente as enzimas normalmente manipuladas, como sendo permutadas de dentro dum para dentro de outro solvente de escolha, sem haver o risco para a integridade estrutural e funcional da enzima. Em termos práticos, excepto para a ligação com as partículas da substância veicular, as enzimas convencionalmente imobilizadas apresentam semelhanças estreitas às enzimas solúveis, e partilham com elas a susceptibilidade de desnaturação e perda de função em ambientes rígidos.
Em geral,, os processos de imobilização conduzem à redução de taxas observadas em reacçbes catalisadas por enzimas relativamente às obtidas em solução. Este facto é principalmente uma consequência dos limites de difusão interna do substrato e difusão externa do produto com as partículas de enzima imobilizadas (Quiocho, E. A., e Rlchards, Ε. Μ., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). A presença necessária da substância vei cular inerte nas partículas enzimáticas imobilizadas aumenta a linha livre média entre o solvente exterior das partículas enzimáticas imabillzadas e a zona activã do catalisador enzimático promovendo - assim , esses Λ problemas de difusão. Quando se trabalha com células imobilizadas, os problemas de imobilização são particularmente graves, mesmo se as paredes celulares e membranas se tornaram permeáveis de alguma forma ao substrato e produto, o que pode estar relacionado com as múltiplas actividades enzimáticas de contaminação, metabolitos, toxinas compreendidas nas células, e com a estabilidade das células em solventes rígidos e ambientes
de operação de temperaturas elevadas. Uma técnica de imobilização aperfeiçoada que evita as limitações dos processos presentemente disponíveis será útil na promoção do uso de enzimas como catalisadores industriais, principalmente se forem apresentados como úteis numa grande escala (Daniels, M. J., Methods in Enzymology 136: 371-379 (1987)).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo para a imobilização de enzimas mediante a formação de cristais de enzimas e, principalmente, reticulando também os cristais resultantes usando para tal um reagente bifuncional; refere-se a cristais de enzimas reticulados e imobilizados (referidos como ClECs ou CLIECs) preparados por este processo; refere-se a liofilização como meio de aperfeiçoamento do armazenamento, manuseamento, e propriedades de manipulação de enzimas imobilizadas e a um processo de produção dum produto desejado por meio duma reacção catalisada por um C1EC ou por um conjunto de CLECs.
No processo da presente invenção, pequenos (10-1 mm) cristais proteicos desenvolvem-se em soluções aquosas ou em soluções aquosas que compreendem solventes orgânicos, em que o catalisador enzimático é funcionalmente e estruturalmente estável. Numa realização preferida, os cristais são então reticulados com um reagente bifuncional, tal como o glutaraldeído. Esta reticulação origina a estabilização do contacto da gelosia de cristal entre as moléculas do catalisador enzimático específico que constituem o cristal. Como resultado desta estabilização acrescida, os cristais enzimáticos imobilizados e reti8 culados podem funcionar a temperaturas elevadas, pH extremos e meios aquosos rígidos, orgânicos, ou meios quase anidros, incluindo misturas destes. Isto é, um CLEC da presente invenção pode funcionar em ambientes incompatíveis com a integridade funcional da enzima natural porrespondente não cristalizada e não reticulada, ou catalisadores enzimáticos convencionalmente imobilizados.
Adicionalmente, os ClECs preparados a partir deste processo podem ser submetidos a liofilização produzindo um CLEC liofilizado que pode armazenar-se na sua forma liofilizada numa sala a temperaturas de não-refrigeração durante longos períodos de tempo, e que pode ser facilmente reconstituído em solventes aquosos, orgânicos ou numa mistura solvente aquoso-orgânico de escolha, sem que ocorra formação de suspensões amorfas, e com um risco mínimo de desnaturação.
A presente invenção refere-se também aos ClECs produzidos pelo presente processo e ao seu uso na produção industrial, a grande escala, ou à escla laboratorial de materiais seleccionados, moléculas quiral orgânicas, peptídeos, carbohidratos, lípidos, ou outras espécies químicas. Presentemente, estes são preparados tipieamente pelos processos químicos convencionais, que podem requerer condições duras (por exemplo, solventes aquosos, orgânicos ou quase anidros, mistura de solventes aquoso/orgânicos ou temperaturas elevadas) que são incompatíveis com a integridade funcional dos catalisadores enzimáticos naturais, não cristalizados e não reticulados. Outras macromolécuias com actividade catalítica podem também ser incorporados na tecnologia CLEC proposta, podendo incluir anticorpos catalíticos (lerner et al., R.A., Benkovic, S. J., e Sohultz, P.G., Scince 252: 659-667 (1991) θ polinucleotideo| (Cech, T. R., Cell 64:667-669 (1991); Celander, D. W., e Cech^
.if
T. R., 251:401-407 (1991)).
A presente invenção refere-se também a um processo de prepara· ção dum produto escolhido por meio duma reacção catalisada pelo CLEC da presente invençSo.
Num exemplo do processo β prática da presente invenção, foram usadas a enzima termolisina e metaloprotease de zinco para sintetizar um precursor quiral do edulcorante artificial dipeptidil, aspartame. A enzima termolisina foi cristalizada a partir duma solução aquosa de iniciação de sulfõxido de dimetil a 45 acetato de cálcio 1,4M a 55 % e cacodilato de sódio 0,05M, pH 6,5. Os cristais resultantes foram reticulados com glutaraideído para formar uma termolisina OLEC. A termolisina OLEC foi então transferida a partir da solução de cristalização aquosa na qual foi preparada, para uma solução de acetato de etilo que compreendia os substratos, ácido N-(be£ ziloxicarbonil)-Ij-aspártico (Z-L-Asp) e éster L-fenilalanina metílico (ΐι-Phe-OMe). A termolisina OLEO foi então usada para catalisar a reacção de condensação dos dois substratos para sintetizar o éster N-(benziloxicarbonil)-L-aspartil-L-fenilananina metílico (Z-L-Asp-L-Phe-OMe), que é o percursor dipeptidilo do edulcorante artificial aspartame. Usando uma das muitas técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lindeberg, G.,
J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987)) o áeiào L-aspártico no percursor dipeptidilo pode ser protegido mediante remoção do grupo benziloxicarbonilo (Z-) para produzir aspartame (L-Asp-L-Phe-OMe).
Num segundo exemplo do processo e prática da presente invenção, a enzima termolisina foi usada para produzir CLECs termolisina. A actividade e a estabilidade dos CLECs termolisina i !
foram comparadas às das termolisinas solúveis sob condições !
óptimas θ condições de pH e temperatura extremas, seguindo-se a incubação em presença de solventes orgânicos e posteriormente a incubação em presença de protease exógena.
A enzima termolisina foi cristalizada a partir duma solução de acetato de cálcio 1,2 M e sulfóxido de dimetilo a 30 $ pH
8,0. Os cristais resultantes foram reticulados com glutaraldeído a uma concentração de 12,5 $ para se obter uma termolisina CLEC. A termolisina OLEO foi então liofilizada por meio duma técnica padrão (Cooper et T. G., The Tools of Biocbemistry, páginas 379-380 (John Wiley and Sons, NY (1977)) para se obter uma enzima CLEC liofilizada da termolisina. Esta CLEC liofilizada foi então transformada directamente dentro de dois solventes uma mistura dum solvente aquoso/orgânico β um solvente orgânico, diferentes e escolhidos sem intervir pom uma técnica de permuta de solventes e sem a formação de suspensões amorfas, e com um risco mínimo de desnaturação. Estes solventes incluem acetonitrilo, dioxano, acetona e tetrahidrofurano, mas não excluem outros. Após a incubação, foi testada a actividade por meio de espectrofotometria por clivagem do substrato dipeptídeo PLAGA (amida furilacriloil-glicil-L-leu cl.na).
Num terceiro exemplo do processo e técnica da presente invenção a enzima elastase (suco pancreático do suíno) foi cristalizada a partir duma solução aquosa de 5,5 mg/ml de proteína em acetato de sódio 0,1 M a um pH de 5,0 à temperatura ambiente (Sawyer, L. et al., J. Mol. Biol. 118:137-208). Os cristais resultantes foram reticulados com glutaraldeído a uma concentração de 5 $ para se obter uma elastase CLEC. A elastase- CLEC foi liofilizada como se descreve no Exemplo 2.
Num quarto Exemplo do processo e prática da presente invanção,
tal como aqui é desvendado a enzima . es te.rase (fígado de suíno) foi cristalizada a partir duma solução aquosa de 15 mg/ml de proteína em acetato de cálcio a 0,25 Ma um pH de 5,6 à temperatura ambiente. Os cristais resultantes foram reticulados com glutaraldeído a uma concentração de 12,5 $ para se obter uma es.te.rase OLEO. A .este'rase CLEC foi liofilizada como descrito no EXEMPLO 2.
Num quinto exemplo do processo e prática da presente invenção e tal como aqui se desvenda, a enzima lipase (Geotrichum Candidum) foi cristalizada a partir duma solução aquosa de 20 mg/ml de proteína em Tris 50 mM a pH 7 à temperatura ambiente. Os cristais resultantes foram reticulados com glutaraldeído a uma concentração de 12,5 $ para se obter uma lipase OLEO. A lipase CLEC foi lio.filizada como se descreve no Exemplo 2.
Num sexto exemplo do processo e prática da presençe invenção, a enzima lisazima (clara de ovo) foi cristalizada a partir duma solução aquosa de 40 mg/ml de proteína num tampão de ace tato de sódio a 40 mM compreendendo cloreto de sódio a 5 $ a um pH 7,4 à temperatura ambiente (Blake, C.C.E. et al., Nature, 196:1173 (1962)). Os cristais resultantes foram reticulados com glutaraldeído a uma concentração de 20 $ para se obter uma lis:ozima CLEC. A liso-.zima OLEO foi liofilizada como descrito no Exemplo 2.
Num sétimo exemplo do processo e prática da presente invenção a enzima asparaginase (Escherichia coli) foi cristalizada a partir duma solução aquosa de 25 mg/ml de proteína em acetato de sódio e etanol a-33 % a um pH de 5,0 a 4δ C. A cristalização é uma modificação da técnica descrita por Grabner et al., /Memória Descritiva da Batente Norte Americana nS. 3.664.926 (1972_)7* Tal como aqui é descrito, os cristais resultantes foram reticulados com glutaraldeído a uma concentração de 7,5 % para se obter uma asparginase CLBC. A asparginase CIEC foi liofilizada como descrito no Exemplo 2.
Outras enzimas que podem ser imobilizadas de forma idêntica e usadas para catalisar reacções adequadas incluem luciferase e urease. Outras enzimas, tais como as mencionadas nas Tabelas 1 a 5, podem também ser cristalizadas e reticuladas segundo o processo presente, para produzir uma CIEC desejada que pode, por sua vez, ser usada para catalisar uma reacção que resulta na produção dum produto escolhido ou para catalisar uma reacção que é uma fase intermediária (isto é, uma de entre uma série de reacções) na produção dum produto seleccio·· nado. Reconhece-se que apesar da retieulação ajudar a estabilizar a maioria dos cristais, nem sempre é necessário ou desejável em todos os casos. Algumas enzimas cristalinas retêm integridade funcional e estrutural em ambientes agressivos mesmo na ausência de retieulação. Apesar de nas realizações preferidas, o cristal ser reticulado, a retieulação não é sempre necessária para produzir um cristal enzima útil no presente processo.
Os CIECs possuem várias características-chave que conferem vantagens significativas sobre os processos convencionais de imobilização de enzimas presentemente usados. Os CIECs dipensam a necessidade duma estrutura de suporte inerte e separada. A lacuna dum suporte inerte melhorará as propriedades de difusão do substrato e produto dentro nos CIEGs e desenvolverá concentrações de enzima dentro do cristal que são concentrações próximas ao limite de capacidade teórico para as molêcui las de tal tamanho. Concentrações elevadas de enzimas podem j conduzir a economia operacional significativa através dum au-ί ./'Ί ~ '1 .-.eruo o.a acrxx^xdaue ex-ecciva g.ux. Giac.0 volume u.o caualj-eu.uox', u reuiçâo no c empo ufc conuacco uo óuwcraGjO co_i a enzima e reauçao global no camando c..a Aaorica e em aixxcaçoes u~ cagi cao-3 rar.—el s, _..· j ·, ... SC-, ods in xjnzpixol, lpt>: p/1—p/ρ ^Ipo/ ) A uniformidade através do volume do cristal e emcabiiidade acmíSiitacLH ao ^ι^ζιΧ^β. ccrj.xLi<zUx_j.ite 'cm ^s c
G?/ ''•na novas ovoruuuirai
Zxui. e.cA.C- e ώ í.j c.·... a o Lt o o c. v. g. c*. v &. i ase ΰ x.zj j——..o. u r ua v.—·. υ —. —l.j_ < o ·>— í/ ax '□ v :O íz vO.. u ar u o *x v a«cx s, o o 1 ν·** x~. v s a ’~u. x. o s, o x cxi..^ ·«. o ou anidros, bem como misturas destes, rn complemento, o aces restrito do solvente e o ambiente regular ce proteína ciíO ru_..a gulOoia ae crxsoul meve comzxx* a .χχ·!...orxa tal iónico e retenção do eo-faccor para os DLxds versus sisGt^iXas convencionais cie eiiZimas ii.iODxixzaG.as· ,o
AO DOS Dilgura 1 e uma repres^ncaçao ^x^axica nos mui.
Z-imo s oocimos pura a acúivx.~aue enziráuiea es wruoi cOxíXvel· r z; s*xlta~· o s cuma conparaçao cias depenas »ina vijXij e -..ta temolisma solúvel.
GG x GctU.0 S ClO S • ifdiao u,i G.a Gã;l\xOiÍ
A Figura ρ e uma repressnuaçao gr:
ia actividade das ter.rli sinas cristalinas · .. .. ,. ~ . ..-0..
D 1 · Q -·-* is . i r X O Ca. . Ô i.
Λ .Tigura cox a a. x o x 4 e Uiíiti su sucia represvala das ternol:
'Sitâ-dâO p.*]?0 G ouíl GxC •a c^ojtxxâ.»
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A Pigura J? 6 uL._ci ú- ·—** qU 4— Cz «vz* ·—* p. G vú
soluwl ;
.x _ lO (DPcllICcí C.Oio r^vu-luS.
G.OS QDii-iOS ^.-ara c. ciC uiVÍ0.3.0.6 CUSÍjaS.GZLG3 G.S. ôTcxSGSl&c S0m.GLV6Í e para a sxascas u> PlzXJs,/ correspondente.
uma re^reg ^ixCcvÇao y?áxiG& g<
ilb ο ϊ i
$ α & .«ΐ cia de elastase solúvel e da elastase dE_id corj?espondente à .ÚL’8.0.3.08-0 pTO^uôOxl úiCS.
xx J-L;-tLP3. / UííxS. X^pj/Gcb.uCcVÇcLO qx*&IIíC8. uOo rcbUiuc dOS O D C-ú r _ O to H 8.C b XVÍ \/-8.u.G θ1χΖΧη.,Η*υ J-38. G.3. CduvS.I'àofc vel e para a esuerase Jíá/ corresz onuente ·
O to J_wL
X .... tocí «Lto. »L*£/ Sm kJ Uvi.
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Ji .:/x5?XlCS õ Θ uLiilcí Pw^PCbc-Iu-bSÇSO ^i'ò.
cia da esterase solúvel e da estera? '......
z.uo proceolicica enógena.
«xto . pÁ. C*.-õ. .A Eigura 9 é uma representação gráfica los rssulua ros odcí.j-Oo pura s. ar tivic-ans enzxmatica para a lipase sola— vsl e a lipase dmmd correspondente·
A Aipura IC é uma rs rθ*cntaçao .rim.cu uos r<
.-.:1 xt dos obtidos la actividade enzimática para a lisozima solúvel lisozima OLEO correspondente.
A ligura 11 e uma representação g; bcLílOS OUuiitOij CLca 8.3uX5zXÍÍclClG θϋ21^·3.ϋΧ^δ. J3._l?cí láfica dos resulL »to Cx X. C.j—^ -t— Xx-to. XO *solúvel e a asparaginase d-,md correspondente.
p- '.r . . J. .0u~.7xXía^Xí.OA r2i. J__ã) A.
XL·. <4. to uXcã técnica geral
O _L toijp roles cíj.e
Ul e função para uma dada enzima ou conjunto cp Θ to L/S.u1xj.“* , enzínas sop l J conuiçoes que sao Ic interesse para a preparaçao sxntsJtxcu que sao CtS2._3.ois.<.o curas pura 0 uso cor. enzimas UoU—as nos excessos presentemente disponíveis, s^ria muito útil. rs cris-
ΰ ar s g. z: 3 nz i ma s imobilizadas reticuladas ί — -Λ - 4 r' X* to X Ε X* X Ci.3. to COmO
ou jxjimds^) bal c omo aqui ucocrito, poucm O to 1* çX to Cc to. 0 >□ _,rra
ts ncor0oit0. A estabilização de geleia torto GHSu£l± e dos
11sadores ensimaticos constituintes no cristal
- ·' ic ·. ',<. -v-. _ .dUXC.liUU _P --dto ção ns reticaiação permite 0 uso de dxmds em atooierpes, incido solventes aquosos, Orgânicos, 0,. anidros, misturas cto s te si
I solventes, pm entremos e temperaturas elevauas, que sao incoA,
I patíveis com a função de enzima usando um processo presentemente disponíveis. Lm adição, a estabilização da geleia de cristal de JL^ds torna possível a liofilização .sadiante -rocessos-padrão. Cs jLLOs liofilizados poder ser armazenados por períodos de tempo comercialmente atractivos (meses a anos) em ausência de refrigeração e facilitam a utilização rá-ida e não complicada de ÍLLjs em processos à escala laboratorial 5 industrial me diante a simples adição ds solventes de escolha, sem necessitar da intervenção de processos de permuta ds solventes. As CLdbs são também. altamente resistentes & diges tão por parte de proteases snógenas. f. processo da pressnte iu'.-enção facilita o uso de catalisadores enzi-áticos versáteis nos processos químicos industriais de flumo principal, be^ como tum οΧΙη'ύχ sse laboratorial de novos compostos para ed qni s a.
Apesar da reticulação contribuir ^ara a estabilida de do cristal enzima, nem sempre e necessária ou desejável t.u todos os casos. Algumas ensinas cristalizadas mantêm integri dade funcional e estrutural em ambientes agressivos mesmo em ausência de reticulação. realização preferida do -resento processo inclui a reticulação dum cristal enzima e está descrita em detalhe nas secções que se seguem, Lreteme-se que se entenda, no entanto, que as enzimas cristalizadas que não sao subsequ ent emente reticuladas podem ser usadas óíú algumas realizações da ^resente invenção.
As interacções normais entre as moléculas constituintes da ensina na geleia cristalina duma resulta em poros bem definidos de tamamo limitado que conduzem as molá cuias ae enzima para dentro do corpo da partícula d- 11^2, t) ao remltado, os substratos maiores que o tamanho de poros disponível não penetram no corpo d& partícula de domo uma consequência do tamanho de poros limitadoL
uuiuas reacções ©nzi^áticas ae ÍAbSresss 3.câu54ico θ ii-'iuótrp.ai envolvei substratos uaioi-es cio que 0 tamarno de poros das X que estariam p&ra além do âmbito da pre sente invenção. dal .0
P6S, Gâ-.S COlO prOãsIIHS.
.irucleotideos, polissacandooí e outros polímeros orgânicos, em cue 0 número de eub-uniiaie poliméricas seria tal que tornava 0 polímero maior do que 0 lanando de poros lo cristal nas Oiuis.
tanto, a catálise pode tomar laçar na superfície das presente invenção é tn. processo de imobilização ,n tais caeOs, no vn~ . j?0 b r- XXlâ. CS te- 3 O X..^i Ciei. jp te.X1 υ X C ϋ.-1-ct-bten. -t li kj G dc^n.3- p. Âj-b» Χ^ίιθ.
ilύ an.no
Ai®. Ji ouutao j-Uíu cristal —nzima mobila.sana re-ticulaua un po oue se :-Un usct^xd. C·'.ι '.í. ®.cal 1 saj \ 'Al-ulv-y nuto esolXcLo, cs.j. co^.o um psptm=o, caruO_imrato, ΐίχ..ΐηο o molécula orpumca quiral. A presc-nue invenção ref ore—se ainda a tais Pites θ a ua processo de ^reparar produto esco1... iuo or ..iO duma rsucpao caGalizaaa ç-Or una on j^or mexo numa s-ase catalisada j>or uu um-i-iO uma serie ne r^ac.40c ?d,'.a realização da presente invenção, 0 percursor dipeptic.il * produzido numa reacção de condensação entalilolisina imobilizada reticulada preparada a par ;e processo, duma ostra realização
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->-p-nitro-anilida (elastase), 4-ueuilurbàliferil d-acetil- qui trio eido (lisozina) s bAd.i (as^ara^in&se).
I-lo processo d = sta invenção, un periro na técnica zol3 adaptar un protocolo para a reparação -ln prelato dese jado ..or -,-^io dura reacção catalisada <or u^a enzira i„_obili sala. A encira de inceresse, quando cristalizada a partir du na solução apropriada, pode ser reticulada con glutaralu.eído ou cor outro reagente bifuncional adequado na solução de cri ualisaçao a. ara preparar ura «uá* nessa ensura· nuossquenuerôn te, a jUj da enzima de escolha pode ser liofilizada coro s descreve no uaxemolo d.
dxiste^ varias vantagens rue o uso apresefr ta sobre os processos catalisados por ensinas presmtemente dispuníva s. Por ememplo, a matriz do cristal reticulado numa OLhõ desenvolve o seu suporte próprio, ião são requeridos leitos, vidros, gels ou películas de substâncias veiculares onorosas no sentido de vincular o catalisador ensirátíco, ta coro g necessário nos processos de imobilização preserteeerte disponíveis. Como resultado a concentração da enzira nu_a CldO é feorada tara o lirite de armazenamento teórico cue oo de ser alcançado para moléculas de ao dado tarai /•cedendo grardeeicite as densidades alcançáveis mss.uo er soluções concentradas. A 11.10 inteira consiste na enzima activa (e us|o na subitâreia veicular inactiva), e portanto, a redução das proporções da enzira na reacção relacionada co-„ a difusão no •._ar.asnte observada co^. as ensinas conveuoioralrente imobilizadas Cm relação às ensinas na solução deve ser rinirizada, pois a concuta média livre para o substrato e produto entre a ensi Liei. u- o solvente livre será gr£ aecre rena:
•a sara as ddmOs (eu comparação cor as partículas das substâncias veiculares de ensinas imobilizadas convencionais). ^stas sidaies _.roteicas elevadas serão particalarrente úteis er aplicações tiosensoras, analíticas e outras re^a-rsndo gran-j
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des quantidades de proteínas em pequenos volumes. Em processos industriais, a performance e solidez das CLECs originam economia de operação significativa, através do aumento da actividade efectiva dum dado volume do catalisador, parmitin do assim a redução do tamanho das fábricas, bem como o inves timento em termos de capital (Daniels, M.J., Methods in Enzjr mol. 136: 371-379 (1987)). As CLECs são relativamente monodis persas, com um tamanho e forma macrostópicos reflectindo características naturais de crescimento de cristal dos catalisadores de enzimas individuais. A substituição do meio substância veicular - enzima imobilizada existente por CLECs não deve ser difícil, pois ambos os sistemas são comparáveis em tamanho e forma, e ambos podem ser similarmente recuperados a partir do stock de alimentação por meio de qualquer um dos processos simples, incluindo operações económicas básicas, tais como filtração, centrifugação, decantação de solvente, e outras.
Em adição, o uso de CLECs liofilizados permite o manuseamento e armazenagem rotineiros destes materiais antes do uso (armazenamento seco à temperatura ambiente sem refrigeração, por largos períodos de tempo). As CLECs liofilizadas permitem também a formulação rotineira por adição directa de solventes e substratos de interesse, sem requerer processos de permuta de solvente longos, ou a formação de suspensões amorfas. A forma CLEC liofilizada abrange a utilidade principal das enzimas como catalizadoras e um vasto espectro de en zimas e condições funcionais.
Uma segunda vantagem duma CLEC é que a reticulação das enzimas cristalizadas estabiliza e confere resistência à gelosia de cristal e às moléculas constituintes da enzima, * quer mecânica quer química. Como resultado, uma CLEC pode ser o único meio de alcançar concentrações significativas do cata lizador enzimático activo em solventes aquosos rígidos, orgâ
nicos e pró-anidros, ou em misturas de solventes aquosos-orgânicos. 0 uso de enzimas como catalizadores em sínteses orgânicas tem sido dificultado pela sua tendência para a desna turação em presença de solventes não aquosos, e particularmente em misturas de solventes aquosos e não aquosos (Klibanjov,
A.R., Trends in Bioch.em.ical Sciences, 14: 141-144 (1989))·
Ras OLEOs, a restrição de modilidade conformacional que conduz à estabilidade é desenvolvida pelos contactos inter-mole culares e reticulação entre as moléculas constituintes da en zima que formam a gelosia de cristal, e não pela ausência de água no meio. Oomo resultado, as concentrações intermédias da água podem ser toleradas pelas enzimas quando formuladas comp OLEOs, tal como não tem sido possível atê aqui (ver Tabela 12). Em aplicações comerciais, as misturas de solvente aquosos-orgânicos permitem a manipulação da formação do produto tomando como vantagem as solubilidades relativas dos produtos e substratos. Mesmo em meios aquosos, os catalizadores enzimáticos imobilizados ou solúveis, são objecto de forças mecânicas dentro dum reactor que pode conduzir à desnaturação e uma vida média mais curta. A reticulação química da GLEO desenvolve a resistência mecânica necessária (Quiocbo e Ricbards, Proc. Ratl. Acad. Sei. (USA) 52: 833-839 (1964)) que resulta dum tempo de reactor aumentado para o catalizador enzimático.
Uma terceira vantagem duma GLEO é que como resulta do da sua natureza cristalina, ela pode alcançar uniformidade ao longo de todo o seu volume de cristal reticulado. As enzimas cristalinas tal como aqui se descrevem, desenvolvem-se e são reticuladas em ambiente aquosos e, consequentemente, o arranjo das moléculas dentro da gelosia de cristal man tém-se uniforme e regular. Esta uniformidade é mantida pelos contactos inter-moleculares e reticulações químicas entre as moléculas da enzima que constituem a gelosia de cristal, mes
mo quando permutadas entre outros meios aquosos, orgânicos ou pré-anidros, ou entre outros solventes mistos aquoso/orga nicos, em todos estes solventes, as moléculas da enzima mantêm uma distância uniforme entre elas, formando poros estáveis bem definidos dentro das OLEOs que facilitam o acesso dí substrato aos catalisadores enzimáticos, bem como a remoção do produto. A uniformidade da actividade enzimática é crítica em aplicações industriais, medicas e analíticas em que a reprodutibilidade e consistência são imprescindíveis.
Uma quarta vantagem do uso duma OLEO é o facto de ela exibir uma vida média operacional e de armazenagem aumen tada. As interacções da gelosia, mesmo em ausência de reticu lação, são conhecidas por estabilizar as proteínas, devido em parte âs restrições dos graus de liberdade conformacional necessários para a desnaturação proteica. Nas OLEOs, as inte racções da gelosia, quando fixadas por reticulação química, sao particularmente importantes na prevenção da desnaturação, especialmente nas misturas de solventes aquosos e não aquoso; (Klibanov, A.M., Trends in BioChemical Sciences 14: 141-144 (1989)). As enzimas que estiveram no estado cristalino duran te meses ou anos normalmente retêm uma elevada percentagem da sua actividade catalítica. Os cristais de enzimas reticuladas imobilizadas em solventes anidros serão mesmo posterior mente protegidas de danos e contaminação microbiana 0 que co:is titui um problema grave do armazenamento de grandes quantida des de proteínas num ambiente aquoso com nutriente rico. No caso duma OLEO liofilizada, a enzima imobilizada á armazenada em ausência de solvente. Tal facto, e a estabilização alcançada por reticulação permite o armazenamento em ausência de refrigeração durante longos períodos de tempo.
Uma quinta vantagem do uso duma OLEO é o facto de exibir a estabilidade aumentada em relação à temperatura como consequência da estabilização por reticulação da gelosia
de cristal. Realizando reacções a temperaturas mais elevadas do que as que são usadas nos processos convencionais aumenta rão as taxas reaccionais para as reacções químicas de interes se quer termodinâmicamente quer aumentando a taxa de difusão dentro e fora da gelosia de cristal das CLEGs. Estes efeitos combinados poderão representar um aperfeiçoamento principal sobre a eficiência reaccional porque maximizam a produtivida de duma dada quantidade do catalisador enzimático, que é nor malmente o componente mais onoroso do processo reaccional (Da niels, M.J., Methods in Enzymol. 156: 371-579 (1987))· A estabilidade à temperatura exibida pelas OLECs ê notável porque a maior parte dos sistemas enzimáticos requerem condições reaç cionais suaves. As CLECs serão também estabilizadas contra a desnaturação pelas temperaturas elevadas transitórias durante a armazenagem.
Uma ultima vantagem do uso duma CLEC é que os poros de tamanho e formas regulares são criados entre as moléculas de enzima individuais na superfície inferior da gelosia de cristal. Esta acessibilidade de solvente restringida aumenta grandemente as caracteristicas de retenção do co-factor ou iónica da OLEO em comparação com as enzimas imobilizadas con vencionalmente ou em solução. Esta propriedade das CLECs per mitirá o uso de processos de fluxo contínuo economicamente superiores (Ver por exemplo Cyama et al., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)) cm situações em que a enzima poderia de outra forma ser inactivâda por ião metálico branqueamento por co-factor. Por exemplo, na síntese mediada por termolisina d-> percursor dipeptidilo aspartame, a Z-L-Asp-L-Phe-CMe, enzima convencionalmente imobilizada ê conhecida como perdendo acti vidade catalítica em processos em coluna de fluxo contínuo, em parte através do branqueamento dos iões de cálcio essenciais para a actividade da termolisina. Na prática, o branqueamento dos iões cálcio forçou 0 uso de processos de lote menos
eficientes (NaKanishi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985)) 0 branqueamento ocorre quando os complexos de cálcio iónico são formados com o substrato Z-L-Asp, em competição com as zonas de ligação do cálcio naturais na superfície da enzima, resultando na perda de actividade catalítica. A elevada densidade da enzima, e o volume correspondentemente limitado acss sível ao solvente nos interstícios das CLECs, desencoraja a formação do complexo L-Asp-0a++ responsável pelo branqueamen to por ião metálico.
Preparação das GLEGs - Cristalização de enzimas
No processo da presente invenção, um cristal duma enzima imobilizada reticulada (ou OLEO) é preparado como se segue:
Os cristais da enzima são desenvolvidos por precipitação controlada de proteínas removidas da solução aquosa, ou da solução aquosa que compreende solventes orgânicos.
As condiçSes a serem controladas incluem, por exem pio, a taxa de evaporação do solvente, a presença de co-solu tos e tampões apropriados, e pH e temperatura adequados. Uma revista compreensiva dos vários factores que afectam a cristalização de proteínas foi publicada por McPherson (Methods Enzymol. 114:112 (1985)). Em adição, tanto McPherson como Gi liland (J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)) compilaram lista compreensivas de todas as proteínas e ácidos nucleicos que tinham sido registadas como cristalizadas, bem como as condi ções que conduziram à sua cristalização. Um compêndio de cri tais e processos de cristalização, bem como uma erposição de coordenadas de proteínas tratadas por solvente e estruturas de ácidos nucleicos cristalinas, á mantida pelo Protein Data Bank (Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112: 555-542 (1977)) n Brookhaven National Laboratory, Tais referências podem ser
Ls i
usadas para determinar as condições necessárias para a cristalização duma dada proteína ou enzima previamente cristalizada, com um prelúdio à formação duma CLEG apropriada, e pode guiar a formulação duma estratégia de cristalização para proteínas que não possuem. Alternativamente um ensaio inteli gente e uma estratégia de investigação de erro (Ver por exem pio Oarter, G. W. Jr. θ Garter, C. W., J. Biol. Chem. 254; 12219-12223 (1979)) podem, na maioria dos casos, produzir co dições de cristalização adequadas para a maior parte das pr teínas, incluindo, mas não se limitando a, às acima discutidas, ao facto de se incrementar um nível aceitável de pureza que pode ser alcançado por estas. O nível de pureza requerido pode variar largamente de proteína para proteína. No caso da lisozima, por exemplo, a enzima pode ser directamente cri talizada a partir da sua fonte não purificada, a clara do ov (Gilliland, G. L., J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)).
Para uso como GLEGs no processo desta invenção, os cristais simples maiores que são necessários para as análise de difracção de raios X não são requeridos, e podem, de facto, serem indesejáveis devido a problemas de difusão relacio nados com 0 tamanho do cristal. Qristais pulverizados microcristalinos (isto é cristais cujo tamanho/secção transversal se situa na ordem de 10 mm) são adequados para as GLEGs e são frequentemente observados como raramente resistentes no que se refere à literatura cristalográfica de raios X. Os mi crocristais são muito úteis no processo desta invenção para minimizar problemas com a difusão (Ver por exemplo, Quiocho, Ρ. A., e Richards, Ρ. M., Bioohemistry 5: 4062-4076 (1987)).
Normalmente, os cristais são produzidos por combinação da proteína a ser cristalizada com um solvente aquoso apropriado ou com um solvente aquoso que compreende os agentes precipitantes adequados, tais como sais ou compostos orgânicos. 0 solvente é combinado com a proteína à temperatura
determinada experimentalmente como sendo apropriada para a indução da cristalização e aceitável para a manutenção da es tabilidade e actividade da proteína. 0 solvente pode opcionaL mente incluir co-solutos, tais como catiões bivalentes, co-factores ou quaotropos, bem como espécies tampão para contra lo do pH. A necessidade de co-solutos e suas concentrações são determinadas experimentalmente para facilitar a cristali zação. Num processo à escala industrial a precipitação contr> lada que conduz à cristalização pode ser realizada mediante a simples combinação da proteína, precipitante, co-solutos, e, opcionalmente, tampões num processo de em série. Em alter nativa os processos de cristalização laboratoriais, tais como diálises, ou difusão de vapor podem também ser adaptados. McPhersons (Methods Enzymol. 114:112 (1985)), θ Gilliland (J. Orystal Growth 90: 51-59 (1988)) incluem uma lista compreensiva de condições adequadas nas suas revistas da literatura de tristalização. Ocasionalmente, a incompatibilidade entre o reagente de reticulação e o meio de cristalização pode requerer a permuta de cristais dentro dum sistema solvente mais adequado.
Muitas das proteínas para as quais as condições de cristalização têm já sido descritas na literatura, possuem p. tencial considerável como catalisadores enzimáticos práticos em processos químicos laboratoriais e industriais, e são directamente submetidas à formulação como OLEGs através do pro cesso da presente invenção. A Tabela 1 é uma amostragem de enzimas que já têm sido cristalizadas. Note que as condições registadas na maioria destas referências foram optimizadas para o desenvolvimento de cristais grandes com qualidade de difracção, frequentemente com grandes esforços. Algum grau ajuste das condições para cristais mais pequenos usados na produção de CLEOs pode ser necessário em alguns casos.
- 25 TABELA 1
Enzima
Ponte Biológica ou microbiana
Referências (incluindo as aqui citadas) álcool desidro genase fígado de cavalo
Eklund et al., J. Mol. Biol. 146: 561-587 (1981) álcool oxidase
Pichia pastoris
Boys et al., J. Mol. Biol. 208: 211-212 (1989)
Tykarska et al., J. Pro tein Oliem. 9: 83-86 (1990) «aldolase (frutose-biofosfato) músculo de coelho músculo de vitelo músculo humano
Drosophila melanogaster
Eagles et al., J. Mol. Biol. 45: 533-544 (1969)
Heidmer et al., Science 171: 677-680 (1971) Goryunov et al., Biofizika 14: 1116-1117 (196|9) Millar et al., Trans.
Roy. soc. Lond. B293: 209-214 (1981)
Brenner et al., J. Biol. Oh em. 257: H747-H749 (1982) aaldolase (PKDG)
Pseudomonas putida
Vandlen et al., J. Biol
Chem. 248: 2251-2253 (197?)
Enzima
Fonte Biológica ou microbiana
Referências (incluindo as aqui citadas) ^fosfatase alcalina
Escherichia coli
Sowadski et al., J. Mol Biol. 150: 245-272 (1981) aasparaginase
Erwinia carotova
Escherichia coli
Escherichia coli
Proteus vulgaris
North et al., Eature 224: 594-595 (1969)
Epp et al., Eur. J. Bio chem. 20: 452-437 (1971) Yonei et al., J. Mol. Biol. 110: 179-186 (1977)
Tetsuya et al., J. Biol|. Chem. 248: 7620-7621 (1972) *anidrase carbónica eritrócito humano (C) eritrócito humano (B) eritrócito de bovino *catalase eritrócito de cavalo
Micrococcus luteus
Penicillium vitale
Kannan et al., J. Mol. Biol. 12: 740-760 (1965) Kannan et al., J. Mol. Biol. 63: 601-604 (1972) Oarlsson et al., J. Mol Biol. 80: 375-375 (1975)
Glauser et al., Acta Cryst. 21: 175-177 (1960) Marie et al., J. Mol. Biol. 129; 675-676 (1979) Vainshtein et al., Acta Cryst. A37: 029 (1981)
t z / Z '· - 27 - f-'
TABELA 1 (Gont.)
acatalase fígado de bovino Eventoff et al., J. Mol. Biol. 103: 799-801 (1976)
ereatina quinase coração de bovino músculo de coelho Gilliland et al., J. MoL Biol. 170: 791-793 (1983 McPherson, J. Mol. Biol. 81: 83-86 (1973)
Mglu.tamin.ase Actenobacter Glutanimasificans Pseudomonas 7A Wlodawer et al., J. Mol. Biol. 99; 295-299 (1975) Wlodawer et al., J. Mol. Biol. 112: 515-519 (197?
Mglucose oxidase Aspergillus niger Kalisz et al., J. Mol. Biol. 213: 207-209 (199-
m -lactamases Staphylococcus aureus Bacillus cereus Mou.lt et al., Biochem. J. 225: 167-176 (1985) Sutton et al., Biochem. J. 248: 181-188 (1987)
Mlacate deshidro genase suinos galinha peixe cão Bacillius stearo thermophilus Hackert et al., J. Mol. Biol. 78: 665-673 (1973) Pickles et al., J. Mol. Biol. 9; 598-600 (1964) Adams et al., J. Mol. Biol. 41: 159-188 (1969) Schar et al., J. Mol. Biol. 154; 349-353 (198g
Mlipase Geotrichum can didum Hata et al., J. Biochem. 86: 1821-1827 (1979)
(Cont.)
Enzima
Fonte Biológica ou microbiana
Referências (incluindo as aqui citadas) aelipase suco pancreato de cavalo Mucor meibei suco pancreático humano
Lombardo et al., J. Mol Biol. 205: 259-261 (198^) Brady et al., Nature 343: 767-770 (1990) Winkler et al., Nature 343: 771-774 (1990) aluciferase
Firefly
Green. A.A., et al., Bi chem. Biophys, Ac ta,
20; 170 (1956)
Mluciferase
Vibrio harveyii
Swanson et al., J. Biol Chem. 260: 1287-1289 (1985) anitrile hydratase
Brevibact er ium R312
Nagasawa et al., Bioche Biophys. Res. Cornrnun 159: 1305-1512 (1986)
m.
«peroxidase
P. chlororaphis B25
Nagasawa et al., Eur.J. Biochem. 162: 691-698 (1987) rábano
Braithwaite et al., J. Mol. Biol. 106: 229-23C (1976) raízes de rábano (Tipo E4)
Aibara et al., J. chem. 90: 489-496
Bio(19811 ί/ *,»· £ABELA_1 (Cont.)
Enzima Ponte Biológica ou microbiana Referências (incluindo as aqui citadas)
«peroxidase rábano Japonês Morita Acta Cryst.A28: S52 (1979)
«peroxidase Caldaromyces Rubin et al., J. Biol.
(cloreto) fumago Chem. 257í 7768-7769 (1982)
«peroxidase Sarchomyces Poulos et al., J. Biol.
(citrocromo) cerevisae Ohem. 253: 3730-3735 (1978)
«peroxidase (glutatione) eritrócito bovino Ladenstein et al., J. Mol. Biol. 104: 877-882 (1979)
«subtilisina Bacillus subtilis (Novo) Bacilius amyloliquefaciens (BPN’) Bacilius subtilis (Carisberg) Drenth et al., J. Mol. Biol. 28: 543-544 (1967) Wright et al., Nature 221: 235-242 (1969) Petsko et al., J. Mol. Biol. 106: 453-456 (197G
«súperóxido dismutase bovino espinafres Sac ch.ar omy c e s cerevisiae Esche richia coli Eichardson et al., J. Biol. Chem. 247: 6368-6369 (1972) Morita et al., J. Mol. Biol. 86: 685-686 (1974) Beem et al., J. Mol. Biol. 105: 327-332 (197$
TABELA_1 (Cont.)
Enzima «superóxido dismutase ^termolisina «urease *xilose isomerase
Ponte Biológica ou microbiana
Bacillus stearothermopbillus
Pseudomonas ovalis
Bacillus thermo proteolyticus feijão verde
Streptomyces rubiginosus
Arthrobacter
B3728
Streptomyces olivochromogene s
Streptomyces violaceoniger
Actinoplanes missouriensis
Referências (incluindo as aqui citadas)
Bridgen et al., J. Mol Biol. 105: 353-335 (1976)
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Sumner, J.B., J. Biol. Chem. 69: 455 (1926)
Carrell et al., J. Bio Chem. 259; 3230-3236 (1984)
Akins et al., Biochym. Biophys Acta 874; 375-377 (1986)
Paber et al., Protein Engineering 1; 459-466 (1987)
Glasfeld et al., J.BiojL Chem. 263; 14612-14613 (1988)
Rey et al., Proteins; Struc.Punc.Genet. 4; 165-172 (1988)
Preparação das GLECs - Reacção de reticulação
Uma vez os cristais desenvolvidos num meio adequado, podem então ser reticulados. A reticulação origina a estabilização da gelosia de cristal introduzindo ligações cova lentes entre as moléculas de enzima constituintes no cristal, tornando possível a transferência da enzima para dentro dum meio de reacção alternado que poderia de outra forma ser incompatível com a existência da gelosia de cristal, ou mesmo com a existência da proteína nao desnatura intacta. A reticu lação pode ser alcançada por uma vasta variedade de reagentes bifuncionais, apesar de, na prática, o glutaraldeído barato e simples se ter tornado no reagente de escolha. (Para uma listagem representativa de outros agentes de reticulação dis poniveis, pode-se consultar por exemplo o catálogo de 1990 da Pierce Chemical Company).
A reticulação com glutaraldeído forma fortes ligações covalentes entre principalmente os resíduos aminoácidos de li sina dentro e entre as moléculas da enzima na gelosia d' cristal que constituem o cristal. As interacções da reticula ção evitam a constituição das moléculas da enzima em cristal com regresso à solução, imobilizando ou insolubilizando as moléculas da enzima dentro das partículas microcristalinas (idealmente IO-1). Os cristais macroscópicos, insolubilizado imobilizados podem então ser prontamente separados a partir do stock de alimentação que compreende 0 produto e 0. substra to que não reagiu por meio de técnicas simples, tais como, filtração, decantação e outras. Esses cristais podem também ser usados em colunas embaladas de GLECs em processos de flu xo contínuo, onde eles exibem propriedades de retenção de iõi metálicos e co-factores aumentadas.
3,
Através do processo da presente invenção, as GLECs são obtidas para uso como catalisadores enzimáticos nos ambi- 32 entes existentes e nos novos ambientes. A estabilidade aumen tada das OLECs, que resulta da reaoção de reticulação, torna possível transferir a OLEO para dentro dum solvente (por exem pio, solventes aquoso, orgânico, ou anidros, ou uma mistura destes), em que de outra forma seria incompatível levar a ca bo a operação no reactor químico e temperaturas elevadas com pH extremos. As partículas catalisadoras de OLEO macrostópica podem também ser prontamente manipuladas permitindo a recuperação a partir do stock de alimentação através de proces sos simples, tais como filtração, centrifugação ou decantaçãji do solvente. Em adição, estes podem ser usados em colunas em baladas em processos de fluxo contínuo.
Preparação de OLEOs - Liofilização
Uma suspensão dum volume de cristais de termolisina reticulados em 10 volumes de água esterilizada a pH 7,0 foi liofilizada durante a noite usando para tal um liofiliza dor VirTis Model /£ 24. Os cristais liofilizados foram armaze nados à temperatura ambiente ou a 4°0 antes da reconstituição, que foi completada pela adição de dez volumes do solvente de escolha directamente em cristais sobre os cristais retirados da armazenagem. Os cristais re-hidratos foram reconstruídos num tampão de acetato de cálcio 10 mM a pH 7,0 para as experiências de clivagem FAGLA. As OLEOs liofilizadas reconstituí das foram rotineiramente armazenadas à temperatura ambiente.
Em contraste, as enzimas solúveis requeriam armazenagem a -70°0 para manter actividade específica superior a uma semana. Este protocolo foi usado para todas as enzimas descritas na exemplificação aqui incluída.
Síntese do percursor aspartame com a termolisina OLEO processo da presente invenção, através do qual as enzimas cristalizadas são produzidas, é abaixo descrito e exem ~ 33 -
plificado pela preparação de cristais de enzimas reticuladas imobilizadas de termolisina para uso na produção do percurso}? dipeptidilo do aspartame, em acetato de etilo, que é um solvente praticamente anidro, orgânico. A termolisina, uma termolisina que pode ser cristalizada e cuja estrutura foi resojL vida à resolução de 1,6 A (Holmes e Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)), é um exemplo duma enzima que pode ser usada como CLEC no presente processo. A termolisina é usada na produção do edulcorante artificial aspartame (Isowa et al Patente Norte Americana NS. 4.436.925 (1984); Lindeberg, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Nakanishi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985); Oyama, et al., Methods in Enzymol.
156: 503-516 (1987)). Até aqui, a maior parte dos aspartames parecem ser produzidos por meio de técnicas químicas sintéti cas convencionais, apesar do uso de termolisinas convenciona^ mente imobilizadas em meios praticamente anidros ter origina do resultados encorajantes (Oyama et al., J. Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Nakanishi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Aperfeiçoamentos das experiências enzimáticas para a produção de aspartame, tal como é possível através do uso do processo presente, tornálo-à competitivo em relação ao prb cesso presentemente usado, quer em termos de conveniência qupr em termos de custo (Oyama et al., Methods in Enzymol. 136:
503-516 (1987)).
Avaliação das termolisina CLECs processo da presente invenção foi também usado para produzir termolisina CLECs que têm sido avaliadas pela sua dependência ao pH e estabilidade, estabilidade e tempera turas elevadas, resistência à proteólise exógena e estabilidade em presença dum solvente orgânico. As termolisina CLECs foram comparadas à termolisina solúvel, como descrito em detalhe no Exemplo 2 e Eiguras 1 a 4. Os resultados da avalia- 34 -
ção revelou o seguinte;
1. Em relação à dependência ao pH e estabilidade, ambas as formas demonstraram actividade máxima a pH 7 e demonstraram actividade similar no intervalo acídico. No intervalo de pH alcalino, a GLEC mantém actividade máxima a pH 10; a termolisina solúvel apresenta 75% da actividade a pH 8,5 e apenas 25% da actividade a pH 9 θ θ completamente inactiva a pH 9,5·
2. A estabilização adicional alcançadas com as GLECs resulta na actividade enzimática a temperaturas mais elevadas do que a que ê possível com a termolisina solúvel. A estabilL dade aumentada da termolisina OLEO a temperaturas mais bai xas torna o armazenamento mais simples do que Q da enzima solúvel. A estabilidade térmica e resistência à autólise foi também demonstrada para as termolisina CLEGs, que retêm o máximo de actividade apôs cinco dias de incubação a 65°0. Em contraste, a termolisina solúvel perdeu 50% úa sua actividade inicial duas horas após a incubação e reve lou actividade reduzida após 24 horas de incubação a 65°C·
5.
A actividade enzimática das termolisina OLECs não foi afe tada pelo período de incubação de quatro dias em presença •d do poderoso protease dos estreptococcus, Pronase . Em con traste, a termolisina solúvel foi rapidamente degradada e perdeu praticamente toda a actividade apôs 90 minutos de incubação.
4. As termolisina GLEGs e a termolisina solúvel exibiram estabilidades marcadamente diferentes em presença de solven tes orgânicos, tal como se refere na Tabela 12. As termolisinas GLECs mantiveram uma actividade máxima superior 95% após a avaliação e depois de serem submetidas a um pe ríodo de incubação em todos os solventes orgânicos.
Estas caraeterísticas das termolisinas GLECs e de
outras enzimas OLEOs tornam-as particularmente úteis, pois são mais fáceis de armazenar, mais estáveis e menos facilmen te inactivacLas ou degradadas do que as enzimas solúveis correspondentes.
Avaliação das esterase OLEOs processo da presente invenção foi também usado para produzir esterase OLEOs que têm sido avaliadas pela sua actividade e resistência à proteólise exógena. As esterase OLEOs foram comparadas à esterase solúvel, como descrito em detalhe no Exemplo 4 e Figuras 7 e 8. Os resultados da avali ção revelaram o seguinte:
1. A esterase OLEOs mantiveram aproximadamente 50% da activi dade em comparação com a enzima solúvel.
2. A esterase solúvel foi altamente susceptível à degradação proteolítica. A actividade da esterase solúvel foi reduzi da a 50% da actividade inicial após 10 minutos de incubação em presença da protease. Uma hora após o período de incubação a enzima solúvel tinha perdido mais do que 90% da sua actividade inicial. Em contraste, a actividade enzimática das esterase OLEOs não foi afectada pela incubação com a protease.
Avaliação das lipases OLEOs processo da presente invenção foi também usado pa ra produzir a lipases OLEOs que têm sido avaliadas pela sua actividade. As lipases OLEOs foram comparadas com as lipases solúveis, como descrito em detalhe no Exemplo 5 e Figura 9·
Os resultados da avaliação demonstraram que as lipases OLEOs retêm aproximadamente 90% da actividade em comparação com a enzima solúvel.
Avaliação daslispzimas OLEOs
- 36 0 processo da presente invenção foi também usado para produzir lisozimas CLECs que foram avaliadas pela sua actividade e resistência à protease exógena. As lisozimas CLECs foram comparadas com as lisozimas solúveis, como descrito em detalhe no Exemplo 6 e Figura 10. Os resultados da avaliação demonstraram que as lisozimas CLECs retêm aproxima damente 50% da actividade em comparação com a enzima solúvel. Avaliação das asparaginases CLECs processo da presente invenção foi também usado para produzir asparaginases CLECs que foram avaliadas pela sua actividade. As asparaginases CLECs foram comparadas com as asparaginases solúveis, como descrito em detalhe no Exemplo 7 e Figura 11. Os resultados da avaliação demonstraram que as asparaginases CLECs retêm aproximadamente 77% da actividade em comparação com a enzima solúvel.
Aplicações gerais das CLECs
μ.' μι»ι.·ιιιι ..ι i»
Tal como aqui é desvendado as CLECs representam uma nova tecnologia de uso vasto em muitas áreas, incluindo mas não se limitando a síntese à escala industrial, operações la boratoriais, biosensoras e aplicações médicas. Exemplos de vários sistemas que usam processos convencionais cie imobilização de enzimas na sua execução são dados nas Tabelas 2 e 5 abaixo. Um perito na técnica deve estar apto em as adaptar, e adaptar sistemas similares à tecnologia CLEC desvendada nes ta Memória Descritiva. Para ilustrar tal facto são discutidos exemplos específicos em maior detalhe a partir das categorias enunciadas.
A Tabela 2 abaixo apresenta exemplos que usam enzimas convencionalmente imobilizadas num processo industrial. Esses exemplos podem ser prontamente adaptados à tecnologia
- 37 CLEG aqui descrita.
TABELA 2
Enzima
Produção ou Aplicação
Substratos
Referências (incluindo as citadas) «thermolisi na «percursor aspartame
Z-Asp, L-Phe-OMe
Oyama et al., J. Org. Ghem. 46: 5242-5244 (1981) Nakanishi et al., Trends in Biotech nology 3; 459-464 (1985) «subtilisina «aspartame
L-Asp-L-Phe,
Davino, A.A., US Patent 4295648 (1981) «lipase «substitutos de manteiga de cacau óleos de palma
Harwood, J., Trenis in Biochemical Sc|ien ces 14: 125-126 (1989)
Macrae, A.R., J.
Am. Oil Chem. Soc 60: 291-294 (1983) «hidratase nitrilo, nitrilase, amidase «acrilamida acrilonitri lo
Uagasawa, T. and
Yamada, H., Trend in Bioteehnology
7: 1532158 (1989)
TABELA_2 (Cont.)
Enzima Produção ou Aplicação Substratos Referências (incluindo as citadas)
«amino acila «resolução aminoâcido Schmidt-Kastner,
se (fúngica) ami no áci- N-acil-L,L G. & Egerer, P. io
«esterase da ésteres de Biotechnology vol
aminoácida aminoácidos 6a: 387-421 (1984)
«subtilisina D,L amidas and references th3
«amidases de aminoáci rein
«hidantionase dos D,L Eusee, M.O., Metho
«dehidrogena- hidantoínas ds in Enzymology
ses específicas ácidos a-hi droxicarbo- 136: 463 (1987)
«amino pepti- dase «transaminase xílicos Pusee, M.O., Metho ds in Enzymology 136: 463 (1987)
«aminoácida «produção: ácidos ceto Rozzell, J.D., Me
desidrogenase aminoácida ou hidroxi thods in Enzymolo
+formato de- geral fumarate/ gy 136: 479 (1987)
sidrogenase «produção: /fumaric Enzym.es in Indus-
«L-aspartase aminoácida ácido, ammo try, Ed Gerhartz,
«L-asparta- específica nium fumarate W., VOH Press 199C
se 4-decar- L-aspartic D,L-a amino
boxilase ácido L-ala e-caprolacta
aspartase + nino ma (ACL) áci
L aspartate- L-lisina do DL-2amino
4 decarboxila se «ACL hidrola • se L-cisteina L-isoleucina L-metionina 2tiazolina 4carboxilio
Enzima
Produção ou Aplicação
Substrato
Referências (incluindo as citadas) *L-ACT hydro lase slyase *L-tryptophan sinthetase «fumarase «hidantoinase
L-isoleucina
L-metionina
L-fenilalani na
L-triptofano
L-valina
L-malico ácido
D n carbamoil p-hidr2 xi-fenil gli cina cinnamato indole, L-serino fumarato
5p-hidroxi-hidantoina
Mlipases, es terases *resolução de racemates de stereoselective sinthesis sinthetic chemistry
Jones, J.B., Tetra Γ hedron 42: 3351-3403 (1988)
Butt, S. and Robert s, S.M·, Natu ral Product Reporjbs 489-503 (1986), and references cited therein for a more comprehensiv review of this area * fumarase «L-malic acido ácido fumaric
Chibata et al.,
Methods in Enzymo logy 136: 455 (19^7)
TABELA 2 (Cont.) 1 · Zr
Enzima Produção ou Aplicação Substrato Referências (incluindo as citadas)
«lactase, β-galactosi- dases «disaccharide synthesis eg galactosyl- -N-aeetyl ga- lactosamine lactose & N- -acetyl ga- lactosamine Larsson et al., Methods in Enzymology 136: 230 (198?)
«lipase, es- terase «L-menthol 4 isomer mix Eukui, S., Tanaka, A., Methods in Enzymology I56: 293 (1987)
«amidases *D-valine (intermediate for pyre- throid insec ticide fluvinate) B,L amino acid amide Schmidt-Kastner, G. & Egerer, P. ir Biotechnology vol 6a: 387-421 (1984) and references therein
«lipase (Can dida cylindricea) *R(+)2 phenoxipropionic acids (herhicides) 2chloro pro pionic acids Biocatalysts in Qrganic Syntheses eds Tramper, van de Pias & Linko; Proceedings of In ternational Sympo sium in Netherlan3 1985
ΑΊ ·
TABELA_2 (Cont.)
Enzimas Produção ou Aplicação
«lipases, es «organic syn-
terases, ami theses mono-
dases, aldo- glycerides
lases peptides
«proteases, «2(p-chloro-
peptidases phenoxy) pro
«yeast lipase pionic acid: herbicide
«strictodine «alkaloid
synthetase production eg stricto- sidine
«penicillin «6-amino pe-
acylase nicillinamic
«penicillin amidase acid and 7- -ADCA
«hydroxyste- «steroid
roid dehydro transforma-
genase tions
Substrato resolution of racemic ester penicillin G or V
Referências (incluindo as citadas)
Jones, J.B., Tetra hedron 42: 3351-3403 (1988)
Butt, S. and Roberts, S.M., Natu ral Product Reports 489-503 (1986), and references cited therein for a more comprehensive review of th area is
Pfitzner et al., Methods in Enzymo logy 136: 342 (1987)
Enz.Eng 6:291(1982) Enz.Eng.8:155
Carrea et al., Me thods in Enzymolo gy 136: 150 (1987)
- 42 1ΙΛ / '·
L
TABELA 2 (Cont.)
Enzimas Produção ou Aplicação Substrato Referências (incluindo as citadas)
*5’phospho- diesterase, nucleases *5’ribonucleo MM tides Keller et al., Ele thods in Enzymolo gy 136: 517 (1987)
*esterase lactam pre cursor (chiral mono esters eg /iamino glutaric acid mono- alkyl ester) correspon- ding diesters Japanese patent application: 82-159, 493 (1981) Biseibutsu Company
Mlipase κβ-blockers Kloosterman, M et al., Trends in Biotechnology 6: 251-256 (1988)
Produção de acrilamida utilizando tecnologia OLEO
A descrição que se segue é uma descrição duma realização do processo da presente invenção: A adaptação da produção da acrilamida a partir de células imobilizadas que sobreproduzem enzima nitrilo hidratase (Nagasawa, T. e Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)) è tecnolo gia OLEO aqui previamente revelada.
A produção à escala industrial da acrilamida, um processo químico comodamente importante, foi descrito por Yamada e colaboradores (Nagasawa, T. e Yamada, Η., Trends in Biotechnology 7· 153-158 (1989)). Kilotons de acrilamida por
- 43 dia são produzidos em reactores químicos carregados com cêlu las induzidas escolhidas como sobreprodutoras da enzima nitrilo hidratase. A nitrilo hidratase tem sido também regista da como purificada e cristalizada a partir de duas fontes, Brevibacterium R312 (Kagasawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 139; 13θ5-1312 (1986) e P. chlororaphis B23 (Nagasawa et al., Eur. J. Biochem. 162; 691-698 (1987)). Tal como aqui é revelado as enzimas cristalinas podem cada uma delas ser imobilizadas por reticulação com glutaraldeído ou com ou tros reagentes de reticulação adequados para produzir uma CLEC. A nitrilo hidratase CLEC pode então ser usada num reac tor convencional em vez de células induzidas correntemente usadas. A adaptação deste processo à tecnologia CLEC conduz a vantagens imediatas. Tais vantagens incluem; dimensões da fábrica reduzidas melhoria do fluxo de entrada como resultado da actividade aumentada pop unidade de volume implícita na concentração mais elevada de enzimas nas CLECs, e substra to e taxa de difusão do produto aperfeiçoadas; redução da cojn taminação indesejada e reacções secundárias, como resultado da pureza mais elevada das CLECs; e sensibilidade reduzida à contaminação microbiana na ausência de células. Em adição, existem OutrOs benefícios disponíveis apenas por um processo baseado nas CLECs. Esses benefícios incluem; operação e temperaduras mais elevadas para melhorar as taxas de reacção; a capacidade para operar em solventes aquosos, orgânicos e pra ticamente anidros, permitindo uma vida média aumentada quer em processamento quer em armazenamento, resultante da estabilidade mecânica e física mais elevada das CLECs, particulajç mente em solventes não convencionais.
Aplicações médicas da tecnologia CLEC - tratamento extracorporal processo da presente invenção e uma CLEC ou conjunto de CLECs apropriadamente seleccionadas podem também ser usados para aplicações médicas. Uma CLEC ou um conjunto de CLECs podem ser usados, por exemplo, para remover um compone.i te dum fluído, tal como sangue, normalmente alterando o componente, e então convertendo-o numa substância não prejudicial a um indivíduo Ou numa substância que pode ser removida pelos processos orgânicos normais (por exemplo, via desintoxicação, degradação no fígado, excreção via renal). Nesta híe méria Descritiva, uma CLEC ou conjunto de CLECs apropri adame.i te escolhidas sao postas em contacto com um fluído corporal, que compreende o componente a ser alterado, ou um reagente (produto ou substrato) duma reacção em que o componente participa, sobre o qual a enzima CLEC actua. Como resultado, a enzima é capaz de actuar sobre o componente a ser alterado ou com uma outra substância que é um produto duma reacção em que o componente a ser alterado participa. A actividade da enzima resulta na alteração directa do componente a ser remo vido ou na alteração do produto da reacção em que o componen te participa (fazendo assim a continuação da reacção impossí·vel). Tal pode ser realizado mediante o uso dum dispositivo extracorporal que inclui uma CLEC ou conjunto de CLECs apropriadamente escolhidas e um meio de retenção que ê feito dum material: tal como um material poroso em que uma CLEC é reti da ou um tubo em que a CLEC esteja presente, que permite o contacto entre o próprio componente Qu a substância no fluído que é um produto duma reacção em que o componente a ser alte rado participa.
Tal pode ser alcançado mediante a inserção duma CLEC apropriada num compartimento corporal adequado, tal como, peritoneu ou um nódulo linfático, em que a CLEC terá acesso aos fluídos corporais. Esta inserção pode ser feita cirurgicamente ou por meio de uma injecção duma mistura CLEC. A injecção directa da CLEC para dentro do fluxo sanguíneo não será apro- 45 -
priada, dado o elevado risco de embolia. O uso das CLECs apr? priadas nesta área deve servir como uma alternativa aOs processos genéticos na terapia de substituição de enzimas para corrigir uma deficiência natural, tal como, por exemplo, fenilcetonoria.
A Tabela 3 ilustra algumas aplicações médicas em que as CLECs podem ser usadas. Para a maior parte destes casos, o tratamento extracorporal encontra-se ainda em fase de pesquisa, nas os benefícios que as CLECs oferecem podem promover novos tratamentos em áreas que não existiam tratamentos alternativos anteriormente.
TABELA 3
Enzima usada
Remoção· de
Asparaginase
Asparagina
D o ença/Pac i ent e s Tratado s
Leucemia (Remoção de aspargina um nutriente importante no cancro, danifica as células leucémicas que não podem produzir o aminoácido essen ciai-asparagina; as células normais podem produ zir asparagina e por isso não são afectadas por es te tratamento)
Referências
Klein, M. Lan, ger, R., Trenâ in Biotechnolo gy 4: 179-185 (1986) e suas referências
Chang, T.M.S., Methods in Enzymology I37: 444-457 (1987) e suas referên cias
- 46 í;/' * ’ •1^·· £ABELA_J (Cont.)
Enzima usada Remoção de Doença/pacientes Tratados
Heparinase Heparina Desheparinização para hemo-perfusão de pacientes por exemplo diáli se renal
Bilirubina oxidase bilirubina Icterícia neo- -natal
Carboxipepti dase Metotrexato Pacientes sub metidos a qui mioterapia
Tirosinase Ácidos amino aromáticos Deficiências hepáticas exibindo elevações patológicas de aminoácidos
Eenilalanina amonialiase Eenilalani- na Eenilcetonuria e deficiência hepática
Referências
Langer, R., et al., Science 217; 261-263 (1982)
Lavin et al., Science 230; 545-545 (1985)
Pitt, A.M., et al., Appl. Bio chem. Biotechnol. 8: 55-68 (1983)
Chang, T.M.S., Sem. Liver Dis. Ser. 6; 148 (1986)
Ambrus, et al.,
C.M.,
J · Phí rm.
& Exp. Ther.
224; 598-602 (1985)
TABELAR (COnt.)
Enzima usada Remoção de Doença/Pacientes Tratados Referências
Sistema de Ureia (con Desintoxicação Ohang, T.M.S.,
muiti-enzimas vertida em por deficiência Methods in En N»
incluindo; ácido glu- crónica renal zymology 137;
urease, gluta mato desidro- genase, gluco se, desidroge nase e uma transaminase tâmico) de pacientes 444-457 (1987) e suas referêa cias Ohang, T.M.S., Enzym Eng. 5: 225 (1980)
Arginase Arginina Hiperargininaé mia familiar Kanalas, J.J. et al., Biochem. Med. 27; 46-55 (1982)
Glutamato, de sidrogenase e amoníaco amoníaco deficiência hepá tica Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984)
Uma aplicação particular do processo da presente invenção é o sistema heparina liase para a des-heparinização (Bernstein et al., Methods in Enzymology 137; 515-529 (1987), que ê abaixo discutido.
Todos os dispositivos extracorporais espargidos com sangue, tais como diálise renal, hemofiltração artériovenosa contínua, ou oxigenadores por membrana extracorporal, requerem a heparinização do paciente para evitar a coagulação do sangue. No entanto, a heparinização do paciente origina complicações hemorrágicas e mantém-se um risco na segurança huma na. Estes problemas aumentam quando o tempo de espargir o sa.i gue aumenta, por exemplo, com o oxigenador de membrana, e podem originar hemorragias graves. Após a terapia extracorporaL, a heparina pode ser removida do sangue usando para tal um dis positivo de heparinase no efluente do dispositivo extracorpo ral que elimina toda a heparina do fluxo de sangue que retor na ao paciente e evita assim os problemas de heparinização.
As pequisas publicadas (Langer et al., Science 217 261-263 (1982)); Bernstein et al., Methods in Enzymology 137 515-529 (1987), detalham os problemas apresentados pelas enzimas convencionalmente imobilizadas usadas nos dispositivos extracorporais. 0 problema principal é que a imobilização convencional origina uma baixa retenção da actividade enzimá tica por unidade de volume, requerendo assim um grande volume da enzima imobilizada para realizar a heparinização neces sária. Este volume é demasiado grande para ser usado em sere humanos. No entanto, a elevada retenção de actividade por dade de volume na GLEG, devido à falta dum suporte inerte ta este problema e oferece uma solução prática para a des-heparinização do ser humano. A estabilidade aumentada da CLEG reduz a des-associaçao da enzima a partir do cristal reticulado, sendo superior às enzimas convencionalmente imobilizadas menos estáveis porque a resposta imunitária resultante di clivagem da enzima á reduzida. A estabilidade da OLEO em fun ção da temperatura evita a desnaturação da enzima devido a temperaturas transitórias elevadas durante 0 armazenamento, sendo similar quando a GLEG retém elevada actividade, mesmo quando armazenada a temperaturas elevadas. Acrescente-se que a GLEG é mais barata e 0 seu uso é mais conveniente do que 0 das suas contrapartes convencionalmente imobilizadas devido aos seus tempos de vida operacionais e de armazenagem serem mais longos.
AplicaçSes adicionais da tecnologia GLEG: biosensores
Uma GLEO ou um conjunto de CLECs podem ser usadas como um componente dum sensor referindo-as como biosensores, detectar e/ou quantificar um elemento de análise de interesse num fluído, tal como, fluído corporal (por exemplo, sangu urina), um meio reaccional laboratorial e químico, meio orgâ nico, água, meio de cultura e bebidas. Em alguns casos, o fluí do em questão pode ser um gás, tal como num analisador de rejs piração alcoólica (Barzana, E., Klibanov A., e Karell, M.,
RASA Tech Briefs 13: 104 (1989)). Resta aplicação uma OLEO ou conjunto de OLEOs apropriadamente seleccionadas são posta|s em contacto com um fluído para ser analizado em relação ao elemento de análise de interesse. 0 elemento de análise de interesse pode ser directamente medido (por exemplo, nível d glucose no sangue) ou indirectamente (por exemplo, detectando ou quantificando uma substância que é um reagente (produt ou substrato) numa reaeção em que o analito de interesse par ticipa). Em ambos os casos, a OLEO é capaz de actuar sobre o elemento de análise ou a substância que é um reagente numa reaeção em que o elemento de análise também participa. A actl vidade da enzima resulta numa permuta detectável (por exemplo, alteração do pH, produção de luz, calor, alteração do potencial eléctrico) que é detectada e/ou quantificada por meios de detecção apropriados (por exemplo, eléctrodo de pH, dispo sitivo sensor de calor ou luz, meios para medição de permuta eléctrica) Janata, J., et al., Anal. Chem. 62: 33R-44R (199θ). Qualquer meio útil para detecção da alteração resultante do processo catalisado: pela enzima pode ser usado. Um biosensod? da presente invenção compreende uma OLEO ou conjunto de OLEOs e um meio de retenção para as OLEOs que permite o contacto en tre as OLEOs e o elemento de análise de interesse ou a subs tância no fluído que é um reagente na reaeção em que o elemen to de análise de interesse participa.
A Tabela 4 ilustra algumas aplicações biosensoras em que as CLECs podem ser usadas. As enzimas correntemente imobilizadas são usadas nestas aplicações, mas apresentam bajL xa estabilidade, baixa densidade enzimática, tempo de vida curto e falta de reprodutibilidade. Estes exemplos podem ser prontamente adaptados à tecnologia CLEC aqui revelada.
TABELA 4
Enzima usada Detecção de: Aplicação Referências
Glucose oxi- dase Glucose Diabetes Daniles, B., Moss bacb, K., Methods in Enzymology 137 4-7 (1987) Hall, E.“Biosenso Open University Press (Ι99θ) Taylor, E., Proce Biotechnology Cor ference (1989); 275-287 Anthony et al., Biosensors, Fundamentais and App cations, Oxford University Press (1987)
Criatinina deiminase Criatinina Punção renal Tabata, M. et al. Anal. Biochem. 134: 44(1983)
Urease Ureia Punção renal Hsuie, G.H. et al Polym. Mater. Sei Eng. 57: 825-829 (1987)
1 A · - 51 -
TkBELk 4 (Cont.)
Enzima usada Detecção de: Aplicação Referências
Kobos, et al., Ana. Chem. 60: 1996-199 (1988)
Lactato oxi- dase e desi- drogenase lactato Aplicações clínicas Blaedel, W.J. & Jenkins, R A., Ana Chem. 48(8): 1240 (1976) Sagaguchi, Y. et al., J. Appl. Bio chem. 3: 32 (1981)
Glueose-6-pi- ruvato desi- drogenase Glucose-6- -fosfato sa carose e ATI? diabetes e Outras apli cações médi cas ibid as glucose Oxidase
Álcool desidrogenase, álcool oxi- dase Etanol e outros alcoóis; ácidos acético e fórmico Bafômetro e aplicações industriais Romette, J.L. et al., Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987) Ho, M.H., Methods in Enzymology 157: 271-288 (1987)
β-fructosida se Sucrose Aplicações industriais Romette, J.L., et al., Methods in Enzymology 137; 217-225 (1987)
Colesterol oxidase Colesterol Ensaio de colesterol Satoh, I., Methods in Enzymology 137· 217-225 (1987)
1ABELA_4 (Oont.)
Enzima usada Detenção de; Aplicação Referências
Gatalase Ácido úrico, colesterol ArterOscle- róticos e outras apli cações médi cas Satoh. I., Methods in Enzymology 137; 217-225 (1987)
Carboxi pep- tidase metotrexato Oancro ibid as glucose oxidase
Anidrase carbónica Dióxido de carbono Aplicações industriais, laboratoriais e ambientais ibid as glucose oxidase
L-aminoácido oxidase aminoácidos médicas e industriais ibid as glucose oxidase
β-lactamase penicilina penicilina Aplicações médicas Anzai et al., Buli Chem. Soc. Jpn.60; 4133-4137 (1988)
Posftatase alcalina Eosfato Monitorização de meta bólitos ibid as glucose Oxidase
Nitrato/nitri to redutase Nitratos e nitritos Monitorização alimentar e de me tabólitos ibid as glucose oxidase
Aril-sulfa- tase Sulfato Monitorização de me- tabolitos ibid as glucose oxidase
TABELA_4 (Gont.)
Enzima usada
Succinato desidrogena
Luciferase bacteriana
I.uciferase de pirilampo
Detenção de: Aplicação Eeferências
Succinato Industrial ibid as glucose
oxidase
FMNH2 e reac Detecção de Wannlund J., et al.
çães acopla- quantidades Luminescent assays
das IO’18 de Perspectives in en-
MH2 medi- docrinology and cli
ante medi- nical chemistry11,
ção de li- Eds Serio, M. and
bertação and Pazzagli 1:125
fotónica (1982)
Kurkijarvi et al.,
Methods in Enzymo-
logy 137: 171-181
(1987)
ATP e reac- Detecção de Kurkijarvi et al.,
ções acopla- quantidades Methods in Enzymolo
das ÍO”1^ de gy 137: 171-181
ATP median- (1987)
te liberta- Murachi et al., Me
ção fotóni- thods in Enzymology
ca 137: 260-271 (1988)
No processo da presente invenção, tal como ê reali zado para análise de amostras num biosensor, é particularmen te desejável a produção de sinais detectáveis o mais fortes possível a partir das quantidades mais pequenas possíveis de substrato e catalisadores. Nesse sentido, a tecnologia CLEG aqui desvendada ê particularmente atractiva, pois é alcançada
- 54 a concentrações possível mais elevadas do catalisador enzimá tico num dado volume.
Frequentemente, foram realizados esforços consideré veis para acoplar uma reacção enzimática última de interesse quer directamente, quer através de intermediários adequados, para a produção de luz através de enzimas semelhantes a luci ferase (Kurkijarvi et al., Methods in Enzymol. 157: 171-181 (1988)). Tal ê feito no sentido de obter vantagem da sensibilidade não paralela e eficiência do equipamento de detecção protónica, que permite a detecção de concentrações femtomola res dos produtos da reacção enzimática sob condições apropri das. Seguindo este princípio, os sistemas biosensores foram desenhados usando enzimas imobilizadas convencionalmente, pa ra detectar vários substractos de interesse clínico ou outrois. Reacções de produção de luz foram acopladas para ensaio de reacções de detecção de substractos semelhantes a D-glucose, L-lactato, L-glutamato e etanol, entre outras, a concentrações extremamente baixas.
No que se refere a esta aplicação, a enzima lucife rase obtida a partir de Vibrio harveyii foi registada como cristalizada (Swanson et al., J. Biol. Ghem. 260: 1287-1289 (1985))· Os cristais desta luciferase podem ser reticulados com glutaraldeído ou outro reagente adequado para obter uma GLEC de luciferase. Rara usos biosensores Ou analíticos, uma OLEO de luciferase oferece muitas vantagens sobre as enzimas convencionalmente imobilizadas. Numa OLEO, 0 volume total da luciferase OLEO consiste na enzima que emite luz. Num sistemji de enzima convencionalmente imobilizada, no entanto, 95% úo volume total é apreendido pela substância veicular inerte”, cuja função se assemelha à absorção da luz emitida pela enzi ma. Em adição, a estabilidade aumentada das CLEGs pode facilitar 0 armazenamento à temperatura ambiente, e torna também possível novas aplicações sensoras em ambientes duros e a tem
-55Ζ * peraturas elevadas.
Aplicações adicionais da tecnologia CLEC - reacções laborato· riais
As CLECs podem ser usadas como reagentes laboratori ais ou em processos a grande escala, que podem ser usados para reacções laboratoriais. Algumas das categorias mais vasta de reacções são apresentadas na Tabela 5·
TABELA 5
Enzima usada
Lipases, fosfoli pases
Tipo de reacção catalisada
Síntese estereoselectiva; incluindo esterificação, transesterificação, aminólise, lactonização, po lização, acilação, oximÓ lise e resolução de misturas recémicas
Referências
Zaks, A. banov, A Proc.Nat &
M.
Aca<
Sei.USA. 82:
3192-5196 (1985)
KlibanoVjA.B
Acc.Chem.Ees
23:114-120 (1990) and re ferences the-rein
Esterases
Síntese estereoselectiva e resolução
Wong,C.H.Chent ract s- Organ;. c Chemistry 3: 91-111 (1990) and reference therein
Kobayashi et al., Tetrahedron Letters
TABELA_5 (Confc.)
Enzima usada Tipo de reacção catalisada Referências
Vol. 25, #24: 2557-2560 (1984) Schneider et al., Agnew. Chem.Int.Ed. Engl.23 (#1): 64-68 (1984)
Tirosinase Oxidação de fenóis para produção de quinonas Kazandjian, R.Z. and Kli banov.A.M. J. Am. Chem.Soc. 110; 584-589 (1986)
proteases, por exemplo subtili sina acilação estereoselectiva de hidrocarbonetos Riva et al., J.Am.Chem.Sos 110; 584-589 (1988)
oxidases selective oxidation of hydrocarbons Klibanov,A.M. Acc.Chem.Res. 23: 114-120 (1990) and Γ3 ferences the- rein
Outras enzimas que requerem co- -factores: iso- merases, liases, Síntese estereoselectiva Wong,C.H.,Che tracts-OrganÍ Chemistry 3: 91-111 (1990)
Enzima usada Tipo de reaeção catalisada Referências
aldolases, glico sil transferases e glicosidases and referen- ces therein
Outras enzimas que não requerem co-factores adicionados: flavo enzimas, pirido- xal fosfato enzi mas, metalo enzi mas Síntese estereoselectiva Wong,C.H.,Obe tracts-Organi Ghemistry 3: 91-111 (1990) and reference therein
Enzimas que reque rem co-factores quinases (ATP), oxiredutases (RAD/P), metil transferases (SArn), enzimas que requerem CoA, sulfurases (PAPS) Síntese estereoselectiva W0ng,G.H. ,Ghe tracts-Organi Ghemistry 3: 91-111 (1990) and reference therein
Schneider et al., (Agnew. Ghem. Int. Ed. Engl. 23 (RS.l); 64-68 (1984)) ilustra como as enzimas podem ser usadas em sínteses Orgânicas. Foi usada esterase de fígado de porco na transformação meso-ester dentro dum quiral mono-ester num tampão de fosfato aquoso.
As vantagens das reacções catalisadas por GLEGs pá ra uso laboratorial são três. Primeiro, a GLEG retém elevada
- 58 actividade em ambientes rígidos (por exemplo, solventes aquo sos, orgânicos praticamente anidros e suas misturas, e a tem peraturas elevadas) que são típicos das experiências de sínte se química laboratorial. Segundo, a CLEC exibe elevada estabilidade operacional e de armazenamento que é apropriada para experiências laboratoriais intermitentes. Terceiro, a sua eis vada actividade por unidade de volume permite tempos reaccio nais mais curtos e requer volumes mais pequenos da enzima (par unidade de actividade). Logo, a vantagem que as CLECs oferecem sobre as enzimas imobilizadas ou livres, desenvolvem pro cessos de química orgânica com uma teia sintética altamente selectiva e alternativa.
Em todos estes casos abaixo descritos, aos quais não nos limitamos, apenas, o processo desta invenção pode se adaptado por um perito na técnica para conversão dum processo usando uma enzima convencionalmente imobilizada catalisadora para o uso duma CLEC da enzima apropriada. As CLECs não podem apenas substituir as enzimas convencionalmente imobili zadas mas podem também ser usadas em transformações de céluir las intermédias. A presente invenção será ilustrada a partir dos exemplos que se seguem, que não têm como objectivo limitá-la de qualquer modo possível.
Exemplo 1
Cristalização e reticulação da termolisina para síntese do percursor aspartamo, Z-Asp-Phe-OMe.
Cristalização
25O mg de termolisina obtida a partir do Bacillus termoproteolyticus foram adquiridas na Boehringer-mannheim Gmbh, e dissolvidos em 4 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 45% e em acetato de cálcio 1,40 M a 55%, θ cacodilato de
Α' sódio 0,50 Μ a pH 6,5· Estas condições de iniciação são simi lares às descritas por Matthews et al., para a produção de cristais termolisina com qualidades de difracção (ver, por exemplo, Rolmes and Matthews, J. Mol. Biol., 160; 625-659 (1982)). A solução proteica foi então concentrada para um mi lilítro num micro-concentrador Oentricon 10. Noi obtido um bom rendimento de microcristais através de um processo de cristalização luminosa, agora aqui descrito, em que se injec tou rapidamente para dentro das soluções DMSO-termolisina, acima descritas, 1 ml de água, ou acetato de cálcio 1,40 M, cacodilato de sódio 0,50 M a pH 6,5· Neste processo obteve-se microcristais hexagonais de dimensões aproximadamente un formes (aproximadamente 10-¼^ em comprimento) .
Reticulação dosmicrocristais de termolisina protocolo usado neste exemplo específico do processo da presente invenção ê uma adaptação do descrito por LTakanishi et al., (Biotechnology 3: 459-464 (1985)), em cujo protocolo a termolisina foi primeiramente adsorvida na base duma substância veicular composta por uma resina de permuta iónica Amberlite Xad-7, e subsequentemente imobilizada por reticulação com glutaraldeído (Quicho e Richards, Proc. Natl Acad. Sei. (USA) 52: 833-839 (1964)). Nesta exemplificação, os microcristais de termolisina acima obtidos foram centrifu gados e peletizados, e 0 sobrenadante foi descarregado, 5 ml de glutaraldeído de grau técnico a 17,5%, em PASO a 2,5%, ac tato de cálcio 0,05 Μ θ cacodilato de sódio 0,025 M, a pH 6,|5 foram então adicionados aos uicrocristais. A mistura foi incubada con agitação suave a 37 0 durante 4 horas. A reacção de reticulação foi terminada mediante lavagem repetida dos cristais com aliquotas de 10 ml de água para remover a solução glutaraldeído. Os cristais de termolisina reticulados la vados constituem a termolisina OLEO usada abaixo como catalij- 60 zador.
í ntese de Z-Asp-Phe-Ome numa soluçao aquo sa ml duma suspensão termolisina OLEO foram adicionados a um reactor de lote de agitação contínua e incubados a 37°0. Após centrifugação e decantação do sobrenadante, uma mistura de reacção aquosa foi adicionada às CLECs. Esta solu ção foi preparada misturando-se 80 mg de Z-L-Asp e 80 mg de L-Phe-Ome-Hcl em 1 ml de água, com ácido acético adicionado para se obter um pH de 7>θ· As amostras foram removidas para análises por HPLC. A Tabela 6 mostra a altura do pico de HPL do pico do substracto Z-L-Asp após o tempo indicado da reacção, normalizado para 1 ao tempo t=0. Devido ao facto do Z-L-Asp estar limitado nesta reacção e medição do seu esvazia mento é equivalente à medição do aparecimento do produto Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Nakaniehi et al., Biotechnology 3: 459-464 (1985))· A Tabela 6 compreende também a altura do pico norma lizado do substracto limitante Z-L-Asp que restou, e uma estimativa do grau final da reacção. â evidente que a reacção prossegue até cerca de 20% da finalização dentro dos primeiros 30 segundos e aí estabilizada. Estes resultados são consistentes com as abservaçSes de Nakanishi et al. (Biotechnology 3; 459-464 (1985) quando se usa a termolisina convencio nalmente imobilizada numa mistura de reacção aquosa, tal como descrito acima, e são atribuídos à solubilidade do 'Z-L-1
-Asp-L-Phe-OMe em água.
TABELA 6
Tempo de reacção (s) Altura do Pico (normalizado) % de Completação
0 1.000
30 0.727 27,3%
TABELA. 6 (Cont.)
Tempo de reacção (s) Altura do pico (normalizado) % de Completação
60 0.857 14,3%
120 0.940 6,0°%
180 0.797 20,3%
Síntese de Z-Asp-Phe- -QMe numa solução parcialmente anidra
ml duma suspensão CLEC termolisina foram adicionados a um reactor de lote de agitação contínua e incubados a 37 0· Após contrifugação e decantação do sobrenadante, uma mistura reaccional orgânica praticamente anidra foi adiciona da às CLECs. Esta solução foi preparada misturando-se 80 mg de Z-L-Asp e 240 mg de L-Phe-OMe em 1 ml de acetato de etilo a 99%· θ água a 1%. Ás amostras foram removidas para analises por HPLC. A Tabela 7 mostra a altura do pico da HPLC do pico do substracto Z-L-Asp após o tempo indicado da reacção, normalizado para 1 ao tempo t=0. Devido ao facto do Z-L-Asp estar limitado nesta reacção a medição do seu esvaziamento é equivalente à medição do aparecimento do produto Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Nakanishi et al. Biotechnology 3; 459-464 (1985))· A Tabela 7 compreende também a altura do pico normalizado do substracto limitante Z-L-Asp que restou, e uma estimativa do grau do completamento da reacção. Neste caso a reacção prossegue até cerca de 70% da completação dentro dos primeiros 30 segundos e aí estabiliza. Estes resultados são consistentes com as observações de Nakanishi et al. (Biotechnology 3: 459-464 (1985)) quando se usa a termolisina convencionalmente imobilizada numa mistura reaccional praticamente anidra, e sao atribuídos à inibição do produto da enzima.
TABELA 7
- 62 ..,,-4-, . Λ, / /· U
Tempo de reacção (s)
120
180
Altura do Pico (normalizado)
1.000
0.323
0.314
0.305
0.272 % de Qompletação
67,7%
68,6%
69,%
72,%
Exemplo......2
Cristalização, reticulação e liofilização da termolisina e avaliação das características do produto resultante eMWTfWWWWBWf—;«·* Τί*ί,ι'·.ϊ««»»·<». -· “ «λ-·*·'’·» ’ - -* »··—·-*· j4»”·--· m.-·» »· — -·τ^β· ^r· ew ι- τι .ίμημ*»
Cristalização da termolisina
.. I IIII llli |MIH »1W—WÍWMI—IULHHII—Μΐ··ιrnini<í*lll
A termolisina (Diawa Kasei K. K., Japan) foi dissolvida em acetato de cálcio 10 mM (Sigma), pH 10,0 para uma concentração de 1% (p/v), 0 pH da solução foi mantido a 10,0 por titulação com NaQH 2 M. Após a solubilização completa, a solução proteica foi titulada para um pH 8,0 com HC1 2 M. Adi cionou-se acetato de cálcio sólido para 1,2 M. Foi então adicionado sulfóxido dimetilo (Sigma) para 30%. A proteína foi concentrada para 100 mg/ml por ultrafiltração numa célula de agitação Amicon (membrana 10,000 IJiVCO). A enzima concentrada foi colocada em aliquotas e armazenada a -70°C. A termolisina foi cristalizada mediante a adição de 9 volumes de água esterilizada para um volume da solução proteica concentrada (100 mg/ml). A solução foi brevemente centrifugada e permitiu-se 0 repouso durante a noite à temperatura ambiente. Os cristais foram lavados com 10 volumes de acetato de cálcio 10 mlví a pH 7,θ e recuperou-se mediante centrifugação de baixa velocidade (10 minutos a 1500 χ G, centrifugadora Beckmar. GPFí).
A adição rápida de água a uma solução concentrada (100 mg/ml) de termolisina induz a formação de cristais que se tornam visíveis sob magnificação de baixo poder dentro de 10 minutos. 0 tamanho do cristal é reprodutível em função da concentração proteica final. 3 volumes de água para um volume do concentrado termolisina (100 mg/ml) produzirão varas hexagonais com a capacidade de difracção de raio-Z com 0,5 mm de comprimento que correspondem aos cristais anteriormente descritos por Oolman et al., (Oolman, P. ffi., Jansonius,
J. N. e Matthews, B. W., J. Mol. Biol. 70: 701-724 (1972)), tal como foi confirmado por nós mediante as análises de difracção. Adicionando 10 volumes de água a um dos concentrado; proteicos produziu-se o comprimento dos cristais resultantes para 0,05 mM. Estes microcristais são preferidos nas aplicações OLEO, pois eles tendem, a minimizar os problemas de difu são relacionados com o tamanho do cristal (ver, por exemplo, Quiocho, ρ. A. e Richards, Ρ. M. Biochemistry 5: 4062-4076 (1967))· Dentro de um dado lote de proteínas o tamanho do crLs tal foi consistentemente uniforme. (Cristais de 0,05 - 0,10 mM em comprimento foram usados neste estudo para facilitar a pipetagem precisa das suspensões cristalinas). Visualizações densiomótricas da SDS-PAGE revelaram uma purificação seis ve zes superior da enzima em cristalização aumentando significa tivamente a actividade específica das CLECs. A cristalização resultou numa diminuição em 20% na actividade total da proteína CLEC em comparação à termolisina solúvel, quando testa da por clivagem espectrofotomátrica do substracto dipeptido furilacriloil-glicil-L-leucina-amida (PAGLA), como abaixo se descreve.
Retieulação dos cristais termolisina
Os cristais termolisina foram reticulados durante horas à temperatura ambiente numa solução de glutaraldeído
a 12,5% (Sigma), DMSO % e Tris 50 ml pH 6,5· Os cristais re ticulados foram lavados três vezes em água esterilizada e re cuperados por centrifugação a baixa velocidade como descrito no que respeita à cristalização da termolisina. A reticulação química dos cristais enzimáticos estabiliza a gelósia de cris tal e as moléculas de enzima constituintes no cristal suficientemente de forma a permitir o uso prático das CLECs nos am bientes que de outra forma seriam incompatíveis à função enzimática. Não existiu uma diferença mesurável na actividade enzimática entre os cristais reticulados e não reticulados quando testados (por espectrofotometria) por clivagem monito rizada do seu substracto dipeptido FAGLA (abaixo descrito). Além disso, a reticulação estabiliza as CLECs ao ponto de po derem ser liofilizadas, com retenção da actividade enzimática na sua totalidade sobre reconstituição em solventes aquosos, orgânicos, e misturas aquoso-orgânico como se mostra na Figura 1 e Tabela 8. Apesar da cristalização resultar numa diminuição de 30% da actividade específica da proteína CLEC em comparação à termolisina solúvel, a reticulação e liofili zação das CLECs não diminuiu depois a actividade específica.
TABELA 8 - Actividade da Termolisina
Tempo (min.) Absorvância 345 nm
CLEC Enzima solúvel
1 0,0 0,314 0,315
2 1,0 0,272 0,271
3 3,0 0,235 0,218
4 5,0 0,204 0,198
5 10,0 0,184 0,185
6 15,0 0,183 0,184
Actividade enzimática da termolisina CLEC e solúvel
A actividade catalítica da termolisina CLEC
vel foi testada (Feder, J. e Schuck, J. h., Biochemistry 9: 2784-2791 (197θ)) por hidrólise do substracto do dipeptido bloqueado furilacriloil-glicil-L-leucina-amida (FAGLA) (Schw|ei zerhall). A clivagem da ligação amida foi medida espectrofotometricamente por uma diminuição numa absorvância a 345 nm.
A concentração inicial da enzima foi de 10 1 M por determina ção proteica de Bradford e visualização densiométrica (Pharmacia LKB UltroScan XL) do gel SDS-PAGE de mancha Coomassie.
A enzima CLEC ê definida como cristais de termolisina reticu lados liofilizados reconstituídos a enzima solúvel é definid como termolisina concentrada para 100 mg/ml. A enzima foi adi cionada a um volume reaccional de 5 ml que compreendia o sub tracto. As aliquotas da mistura reaccional foram removidas aos tempos indicados, e a absorvância a 345 nm foi medida. A termolisina CLEC foi separada a partir da mistura reaccional por centrifugação breve (microcentrifugadora E, Beckman) antes da leitura da absorvância. A absorvância foi estabelecida para uma pseudo equação da taxa de primeira ordem e foram calculados os Kcat/Km dividindo o valor estabelecido pela co centração enzimática (Hultifit 2,0 Curve Eitting for the App Macintosh Computer, Day Computing P. 0. Box 327, Milton, Cam bridge CB4 6YL, U.K. (1990))· n
le
Dependência e estabilidade do pH ph óptimo e a estabilidade da enzima solúvel foram comparados com os da termolisina CLEC por clivagem do su bstracto dipeptido FAGLA. Os resultados sao apresentados na Eigura 2 e Tabela 9. Tanto a enzima solúvel como a enzima cristalina demonstraram uma actividade máxima a ph 7. As CL1 e as termolisinas solúveis demonstraram também actividade idêntica na gama acídica e o perfil de pH em forma de sino gerado pela enzima solúvel encontrava-se de acordo com os da dos publicados (Feder, J. e Schuck, J. Μ., Biochemistry 9:
2784-2791 (1970)). No intervalo de pH alcalino, no entanto, a enzima cristalina mantém a actividade máxima, a pH 10, enquanto que a enzima solúvel apresentou 75% úe actividade a p
8,5, θ apenas 25% de actividade a pH 9· A pH 9,5, a enzima solúvel, e complectamente inactiva.
TABELA 9 ~ Ourva de pH Termolisina % Actividade máxima
pH CLEC Enzima solúvi
1 5,0 10,250 5,170
2 5,5 9,750 6,070
3 6,0 52,500 39,100
4 8,5 85,000 74,610
5 7,o 97,500 100,000
6 7,5 100,000 98,650
7 8,0 97,500 82,920
8 8,5 95,000 71,910
9 9,0 96,250 24,720
10 9,5 95,000 0,000
1 10,0 90,000 0,000
Estabilidade a temperaturas elevadas
Pode-se alcançar taxas de reacção mais elevadas
tempos de difusão mais baixos para substractos e produtos realizando a operação dum dado processo químico e temperatura mais elevada, em que normalmente nos encontramos limitados pela estabilidade da temperatura de substractos e produtos. Nas catálises baseadas em enzimas, no entanto, é frequente a perda de actividade enzimãtica que estabelece limite prático de temperatura a que o processo pode decorrer. A estabilização adicional alcançada nas OLECs permite actividade enzimática a temperaturas mais elevadas do que as possíveis com a β
enzima solúvel.
A estabilidade aumentada a temperaturas mais baixa simplifica a armazenagem rotineira de longa duração dos cata lisadores CLECs. Por exemplo, foi necessário armazenar soluções concentradas (50 mg/ml) de termolisina solúvel a -80°C para manter a actividade específica máxima. Â temperatura am biente, a actividade foi normalmente perdida-ao fim do prime ro dia. Contrariamente, as termolisinas CLECs re-hidratadas podem ser rotineiramente armazenadas durante meses à tempera tura ambiente com nenhuma perda aparente de actividade. As CLECs liofilizadas não reconstituídas da termolisina parecem ser viáveis indefinidamente.
A estabilidade e resistência térmica à autÓlise fo ram demonstradas com as termolisinas CLECs após incubação a 65°C durante cinco dias consecutivos (Pigura 3 θ Tabela 10). As termolisinas CLECs mantiveram a sua actividade máxima apé os cinco dias de incubação a temperaturas elevadas. Jontrari mente, a termolisina solúvel perdeu 50% da sua actividade in ciai apés duas horas de incubação e demonstrou fraca actividade após 24 horas de incubação a 65°C.
TABELA 10 - Estabilidade térmica de Termolisina a 65°C
Tempo CLEC Enzima solúv,
(dias)
1 0,000 100,000 100,000
2 0,041 70,000
3 0,083 96,000 50,000
4 0,164 32,000
5 0,246 17,000
6 0,410 97,0 10,000
7 1,000 101,0 2,000
8 2,000 97,0
TABELA 10 (Cont.) - Estabilidade térmica de Termolisina a 65
9 Tempo (dias) 5,000 CLEG Enzima solúvel 94,0
10 4,000 96,0
11 5,000 92,0
medidas A actividade das após a incubação a termolisinas GLEG e solúvel foram 65°G. A termolisina solúvel foi
incubada em acetato de cálcio 10 mM, Tris 50 mM pH 7,0 num banho Maria a 65°0· 0 volume reaccional foi de 5θ0 nl. A cor centração proteica final foi de 10 mg/ml. As aliquotas foram removidas aos tempos 0, 1, 2, 4, 6, 10 e 18 horas. As amostras foram ensaiadas por clivagem SL3-PAGE e PAGLA à tempera tura ambiente como acima descrito. Para as termolisinas CLECs, 25O ul duma suspensão de cristal em acetato de cálcio 10 mM e Tris 50 mM foram também incubados num banho de água a 65°G A actividade foi ensaiada aos tempos 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 e 120 horas por clivagem PAGLA.
Resistência à proteôlise exógena
A avaliação da resistência da termolisina CLEG à acção duma protease exógena foi também realizada. As análises SDS-PAGE (Gel electroforese poli acrilamida de sulfato de dodecil de sódio) sugeriram que as enzimas comerciais podem compreender uma percentagem substancial de agentes conta minadores, alguns dos quais podem possuir actividade proteolítica contra as principais espécies de enzimas solúveis. Co ferindo 0 armazenamento das moléculas de enzimas sobre a for ma duma gelosia de cristal pode assumir-se que as moléculas de enzima no interior numa GLEG será protegida da proteôlise Para testar esta possibilidade as termolisinas GLnGs e uma
preparação duma enzima solúvel foram incubadas em presença duma protease de estreptococcus, Pronase (E) uma protease na específica capaz de digerir a maior parte das proteínas dos aminoácidos livres (Galbiochem. 1990 Gatalog; LaJolla, GA)·
As termolisina GLEG e solúvel foram incubadas em Tris 50 mu, pH 7,5? a 40°0 em presença da protease pronase-1·' (Galbiochem). A proporção de Pronase^) para a termolisina foi de 1/40. Para inibir a autólise da termolisina e preveni a destruição proteolítica da pronase pela termolisina, foi adicionado EDTA à reacção de enzima solúvel para uma concentração final de 100 mM (EDTA inibe a actividade da termolisi na mas não da Pronase^). Mos tempos indicados as alíquotas foram removidas a partir da mistura de reacção e a actividade foi ensaiada por espectrofotometria por clivagem dos subs tractos dipeptidos FAGLA. Para a inibição da termolisina estabelecida devido à presença do EDTA, 0 ensaio espectrofotomêtrico da actividade da enzima solúvel foi realizado num tab pão de acetato de cálcio a 0,5 M a pH 7,0 e a concentração da enzima foi duplicada. A enzima cristalina reticulada foi ensaiada como acima se descreveu.
Tal como se pode ver na Figura 4 e Tabela 11, a ter molisina solúvel foi rapidamente degradada e perdeu toda a actividade depois de 9θ minutos de incubação. Gontrariamente, a actividade da termolisina GLEC não foi afectada por quatro dias de incubação em presença da protease. Esta inacessibili dade à proteólise apresenta particular interesse em aplicações biosersoras de diagnóstico onde uma OLEO adequada possa ser chamada para actuar na presença dum cocktail desconhecido das enzimas proteolíticas que ocorrem naturalmente.
TABELA 11
Resistência à Protease
- 70 TABELA 11
Resistência à Protease
Tempo (dias) % Actividade máxima Tempo (min.)
GLEG Enzima solúvel
1 0,000 100,0 100,0 0,000
2 0,003 25,0 5,000
“7 »*» 0,010 17,5 15,000
4 0,021 9,5 30,000
5 0,042 98,0 3,0 60,000
6 0,063 1,0 90,000
7 0,084 101,0 0,0
8 1,000 97,0
9 2,000 99,0
10 3,000 98,0
11 4,000 96,0
Estabilidade em presença dum dissolvente orgânico
Com o objectivo das enzimas ganharem a aceitação ideal como catalisadores industriais viáveis, elas devem ser capazes de funcionar sem intervenção excessiva no ambiente prático do processo de preparação. Particularmente, tal compreende o uso de solventes aquosos, orgânicos polares e não polares e suas misturas. Nas aplicações comerciais, as mistu ras de solventes aquoso-orgânicos parmitem a manipulação da formação do produto tomando como vantagem as solubilidades relativas dos produtos e substractos.
As termolisinas solúveis e as termolisinas GLEOs exibiram estabilidades marcadamente diferentes em presença de solventes orgânicos, (Tabela 12). As concentrações da enzima solúvel que podiam ser incubadas em solventes orgânicos foram limitadas a um máximo de 10 mg/ml. Valores de concentr ção superiores a este originaram a precipitação instantânea
da termolisina sob adição do solvente orgânico. Oontrariamen te, as concentrações das termolisinas CLEGs foram limitadas apenas pelo volume ocupado pelos cristais. A termolisina solúvel manteve a sua maior actividade (75%) após incubação em acetona, e a sua menor actividade (36%) em tetrahidrofurano. Após uma hora de incubação em presença de acetonitrilo ou di? xano a enzima solúvel perdeu aproximadamente 50% la sua acti vidade inicial. A termolisina GLEO mais do que 95% da sua actividade máxima após a incubação com qualquer um dos solventes orgânicos testados.
TABELA 12 % Actividade Máxima
Enzima Solúvel GLEG
Acetonitrilo 42 102
Dioxano 66 97
Acetona 75 99
THF* 36 96
* Tetrahidrofurano
Estabilidade em solventes Orgânicos
As preparações de termolisinas GLEGs ou de termoli sinas solúveis foram incubadas em soluções dos solventes orgânicos indicados a 50% (v/v). 100 ul duma pasta de termolisinas GLEGs (10 mg/ml) em Tris 10 mM pH 7 colocada numa ampola de vidro de 1/2 dram. Um volume igual do solvente orgâ nico indicado foi adicionado e a mistura fortemente agitada durante um curto período de tempo. 20 ul da termolisina solú vel (100 mg/ml) foram diluídos em 80 ul dum tampão Tris 0,01? h pH 7»θ numa ampola de vidro de 1/2 dram. Um volume de 100 ul do solvente orgânico foi então adicionado à solução prote.L ca e esta foi, depois, agitada fortemente durante um curto espaço de tempo. A enzima CLEC e a enzima solúvel foram então incubadas em presença do solvente orgânico durante uma hora a 40°C. Após a incubação, a actividade enzimática foi ensaiada por clivagem do substrato dipeptido FAGLA cosio descrito .
Pensa-se que baixas concentrações de água desfavorecem a não dobragem dos estados intermédios na condução da desnaturação enzimática. Las CLECs, esta restrição da mobili dade conformacional é desenvolvida pelos contactos intermole culares e reticulações entre as moléculas constituintes das enzimas que formam a gelosia de cristal, em vez da quase-ausência de água no meio. Como um resultado, as concentrações do solvente água-orgânico intermediário são prontamente tole radas pelas enzimas quando formuladas como CLECs, algo que previamente não se observava com as enzimas (Ver Tabela 12). Esta descoberta abre um conjunto de novas áreas da química orgânica para exploração usando a catálise enzimática.
Mesmo nos solventes orgânicos praticamente anidros, no entanto, o uso rotineiro de enzimas tem sido dificultado pela sua tendência de formar suspensões mal definidas que são objecto de problemas de agregamento e acumulação. Esta propriedade torna estas preparações inerentemente não atractivas para processos à escala industrial. Contrariamente, as CLECs e as enzimas constituintes da gelosia de cristal, mantêm-se mono-dispersas em todos esses solventes.
Comparação com outros processos de imobilização i'WMUWumi II Wll ... — . 4. ... ..u. - —llll l HM- W Mi wny·* —
Numerosas publicações úteis de processos de imobilização de enzimas têm aparecido na literatura (Maugh, Τ. E., Science, 223: 474-476 (1984); Tramper, J., Trends in Biotechnoiogy 3: 45-5θ (1985))· Sestas revistas, a enzima represem
ta sempre uma pequena fracção do volume total da partícula imobilizada, cuja massa é uma substância veicular inerte. A substância veicular aumenta a conduta de meio livre entre o solvente exterior da partícula de enzima imobilizada e as zo nas activas da enzima activando os problemas de difusão (Quiq cho, F. A., e Pichards, F. Μ., Biochemistry 5: 4062-4076 (1957)).
Numa OLEO, a matriz de cristal reticulado desenvol ve o seu próprio suporte, eliminando a necessidade duma subs tância veicular. Como resultado, a concentração da enzima nu ma OLEO é fechado para o limite de embalagem teórico que pode ser alcançado por moléculas dum dado tamanho, excedendo grandemente as densidades alcançáveis mesmo em soluções concentradas. A OLEO inteira consiste na enzima activa, e portaa to, a redução relacionada com a difusão das proporções da reacção enzimática normalmente observada com as enzimas imobilizadas convencionalmente em relação às enzimas em. solução é minimizada (Ver Figura 1), pois a conduta de meio livre pa ra o substrato e produto entre a enzima e o solvente livre será grandemente reduzida pelas CLECs (em comparação com as partículas da substância veicular enzimática convencionalmen te imobilizada). Le forma importante, a enzima constituinte das CLECs é intrinsecamente mono-dispersa, e pode ser recupe rada por manipulações simples das partículas da CLEC, tal co mo filtração, centrifugação Ou decantação do solvente.
EXEMPLO 3
Cristalização, reticulação e liofilização da elastase e avaliação das características do produto resultante ι .1 ,1 ιιΐ|'1ί!·Ί 11 111.1 .im,i IIP—wwwnwi—yWWIWÍJWWrIWH^iW l»l «W
Cristalização da elastase
Elastase pancreática liofilizada de suínos (Serva)
- 74 .ί foi dissolvida em acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 para uma con centração de 5 mg/ml (p/v) à temperatura ambiente. Cristais de elastase sob a forma de varas tornaram-se visíveis ao fim de 10 minutos de dissolução completa da proteína. A solução de cristalização foi transferida para 4°C e a cristalização foi completada durante a noite. Os cristais foram recuperados por centrifugação como previamente se descreveu.
Eeticulação dos cristais de elastase
Um volume de 200 ul de cristais de elastase foi adi cionado a 1,3 ml duma solução de glutaraldeído a 5,77% θ ace tato de sódio 1,5 M pH 5,0. Os cristais foram reticulados du rante uma hora com agitação suave (placa de agitação). Após a reticulaçao os cristais foram lavados três vezes com volume de 15 ml de Tris 0,2 M pH 8,0. A elastase CLEC foi liofilizada como descrito no Exemplo 2.
Actividade enzimãtica da elastase CLEC e solúvel
A actividade catalítica da elastase CLEC e solúvel foi ensaiada por espectrofotometria por medição da hidrólise do substrato succinil-(Ala)-p-nitroanilida (Bachem) (Bieth, et al., Biochem. Med. 11: 350-357 (1974)) (Tabela 13 Eigura 5). A clivagem foi monitorizada peio aumento de absorvância a 410 nm. A concentração inicial do substrato foi de 2 x 10“ A concentração de enzima foi de 2,8 x 10“%,.. A enzima CLEC ou a solúvel foi adicionadas a um volume reaccional de 5 ml que compreendia 0 substrato em Tris 0,2 pH 8,0. Tal como descrito anteriormente a enzima OLEC foi removida a partir da mistura de reacção antes da medição da absorção.
TABELA 13 ~ Actividade de Elastase
Absorvância a 400 nm
Enzima solúvel
Tempo (min.)
CLEC
- 75 -4 /7^·'
-Γ -Λ
TABELA 15 - Actividade de Elastase
Absorvância a 400 nm
Tempo (min.) OLEO Enzima solúvel
1 0,0 0,000 0,000
2 0,5 0,103 0,205
7 1,0 0,195 0,390
4 2,0 0,366 0,672
5 3,0 0,523 0,923
6 4,0 0,657 1,098
7 5,0 0,780 1,227
8 6,0 0,888 1,326
9 7,0 0,974 1,393
10 10,0 1,170 1,512
11 15,0 1,365 1,586
Resistência à protólise exógena
A avaliação da resistência de elastase OLEO
da protease foi realizada sob condições idênticas às 1
tas para a termolisina (Exemplo 2). A actividade das
OLEO e solúvel, após a incubação com a protease, foi ,
da por hidrólise do substrato nitroanilida como acima
to (Tabela 14 e Figura 6).
TABELA 14 - Resistência de Elastase à Protólise
% Actividade máxima
Tempo OLEO Enzima solúvel
1 0,0 100,0 100,0
2 10,0 53,0
3 20,0 32,0
4 30,0 101,0 18,0
5 45,0 11,0
TABELA. 14 (Cont.) - Resistência de Slastase à Protólise % Actividade Máxima
Tempo OLEO Enzima solúvel
6 60,0 102,0 8,0
7 120,0 101,0 5,0
8 180,0 103,0 2,0
EXEMPLO 4
Cristalização, reticulação eliofilização da esterase e avaliação das caraeterísticas do produto resultante
0ri st alização da esterase
Tal como aqui é revelado, dissolveram-se 30 mg/ml duma suspensão de sulfato de amónia da esterase de fígado de porco (Fluka) em acetato de cálcio 0,25 M pH 5,6 à temperatu ra ambiente. Os cristais esterase foram visíveis alguns minu tos depois da adição da solução de acetato de cálcio. A solu ção de cristalização foi deixada em repouso à temperatura am biente e a cristalização foi completada durante a noite. Os cristais foram recuperados por centrifugação tal como foi ar teriormente descrito no Exemplo 2.
Reticulação dos cristais de esterase fal como aqui é revelado, um volume de 300 ul de cristais de esterase foram adicionados a 5 ml duma solução de glutaraldeído 12,5% © acetato de sódio 0,5 ãí pH 5,5· Os cristais foram reticulados durante uma hora com agitação sua ve (placa de agitação). Após a reticulação 03 cristais foram lavados três vezes com volumes de 15 ml de acetato de cálcio 0,5 E, pH 6,3. A esterase OLEO foi liofilizada tal como se descreveu acima no Exemplo 2.
Actividade enzimática das esterases CLEC e solúvel
A actividade catalítica das esterases CLEC e solúvel foram ensaiadas espectrofotometricamente por monitorização da hidrólise do substrato acetato de p-nitrofenilo (Fluka) (Tabela 15 θ Figura 7)· A clivagem foi monitorizada por aumeu to da absorção a 400 nm. A concentração do substrato inicial foi de 0,001;.·. A concentração da enzima foi de 1 χ 10~^ Μ. A enzima CLEC ou a enzima solúvel foi adicionada a um volume reaccional de 5 ml que compreendia o substrato de acetato de cálcio 0,25 «í ph 6,3. Tal como descrito previamente no Exemplo 2, a enzima CLEC foi removida a partir da mistura de reao ção por centrifugação antes da medição da absorção.
•TABELA 15 - Actividade da Esterase
Absorvância a 400 nm
Tempo (min.) CLmC Enzima solúvel
1 0,0 0,000 0,000
2 0,5 0,770 0,252
3 1,0 0,128 0,297
4 2,0 0,208 0,337
5 3,0 0,260 0,346
6 5,0 0,324 0,353
7 7,0 0,353 0,359
8 10,0 0,369 0,368
.stencia à proteólise exógena
A avaliação da resistência da esterase CLEC em relação à acção da protease foi também realizada sob condições idênticas às descritas para a termolisina (Exemplo 2). A act vidade da enzima CLEC e da solúvel, após a incubação com a protease, foi ensaiada por hidrólise do substrato de acetato p-nitrofenilo como acima se descreveu (Tabela 16 e Figura 8)
TABELA 16 .V
L.
- hesitência de Esterase à Protólise % Actividade máxima
Tempo (min.) OLEO Enzima solúvel
1 0,0 100,0 100,0
2 10,0 68,0
3 20,0 47,0
4 30,0 99,0 25,0
f— P 45,0 20,0
6 60,0 97,0 16,0
7 120,0 94,o 10,0
8 180,0 91,0 θ,Ο
MKiPLO _5
Gristalização, reticulação e liofilização da lipase e avalia-
ção das características do produto resultante
111 · ml......
Gristalização da lipase
Tal como aqui é desvendado, a enzima lipase (Geo-
trichum candidum) foi cristalizada por difusão de vapor a partir duma solução aquosa de 20 mg/ml da proteína em Tris 50 níi ph 7 compreendendo sulfato de amónia a 8%. Os cristais bipiramidais tornaram-se visíveis 20 a 30 dias após a incuba ção à temperatura ambiente. Os cristais foram removidos por centrifugação, como anteriormente descrito no Exemplo 2.
Eeticulação dos cristais de lipase
Tal como aqui se descrave, os cristais de lipase foram adicionados a uma solução de glutaraldeído a 12,3% e Tris 50 mli ph 5,6. Os cristais foram reticulados durante uma hora. Após a reticulação dos cristais foram lavados três vezes com volumes de 15 ml de Tris 5θ ηύχ ph 7,0· A lipase GLEC foi liofilizada, tal como previamente foi descrito no Exempl
2.
Actividade enzimática da lipase solúvel e da lipase CLEC *ww*a**kfciV* miWTr Mimr—..·ί.·)^.— t-ii.-th.ttith— .*-------—r r . ‘ — · . ... _.
As actividades catalíticas das lipases solúvel e
CLEC foram ensaiadas por espectrofotometria por monitorização da hidrólise do substrato acetato de p-nitrofenilo (Tabe la 17 e Figura 9)· A clivagem foi monitorizada por aumento da absorção a 400 nm. A concentração do substrato inicial fo —8 de 0,005%. A concentração da enzima foi de 1,5 x 10 Μ. A enzima CLEC ou a enzima solúvel foram adicionadas a um volume reaccional que compreende 0 substrato em Tris 0,2 ia pH 7,0 à temperatura ambiente. Tal como descrito previamente no Exem pio 2, a enzima CLEC foi removida da mistura de reacção por centrifugação antes da medição da absorção.
TABELA 17 - Actividade de Lipase
Absorvância 400 nm
Tempo (min.) CLEC mnzima solúvel
1 0,0 0,000 0,000
1,0 0,013 0,021
3 5,0 0,094 0,116
4 10,0 0,164 0,186
5 15,0 0,248 0,258
6 30,0 0,346 0,357
7 45,0 0,407 0,420
8 60,0 0,461 0,459
9 90,0 0,497 0,502
mxEKLPLC Lê
QPist/âliSHÇHO, FStiCUlSLÇ&O e liofilização da lisozima
liação das características do produto re sultante
Cristalização da lisozima
Seguindo-se 0 processo de Blake, 0. 0. F. et
- 80 f
V ,<&
Ilature 196: 1173 (1962) 200 mg de lisozima de clara de ovo (Boehringer Manhheim) foram dissolvidos em 2,5 ml dum tampão de acetato de sódio 0,04 M pH 4,7 à temperatura ambiente. Após dissolução da proteína, foram adicionados 2,5 ml de cloreto de sódio a 10% cuidadosamente gota a gota à solução de lisozima com agitação, permitiu-se que a solução de cristalização repousasse durante a noite à temperatura ambiente, e a cristalização foi completada em*48 horas. Os cristais foram recuperados por centrifugação, tal como se descreveu acima no Exemplo 2.
Reticulação dos cristais de lipase
Tal como aqui é .descrito, um volume de 500 ul dos cristais de lisozima foi adicionado a 10 ml de gLuteraldeído a 24% e Tris 50 mM pH 5,6 compreendendo cloreto de sódio a 20%. Os cristais foram reticulados durante 20 minutos com agitação suave (placa de agitação). Após a reticulação Os cristais foram lavados três vezes com volumes de 50 ml de ace tato de cálcio 20 mM e cloreto de potássio 50 mM, pH 5,3· A lisozima CLEC foi liofilizada, tal como previamente foi descrito no Exemplo 2.
Actividade enzimática da lisozima solúvel_e da lisozima GLEG
As actividades catalíticas das lisozimas solúvel e GLEG foram ensaiadas por medição daproporção da hidrólise do substrato 4-metilumbeliferil-N-acetil-quitriosido (Pluka) (Yang, Ϊ. e Hamaguchi, K., J. Biochem. 8: 1003-1014 (1980) (Tabela 18 e Figura 10). A libertação de 4-metilumbeliferons foi seguida fluorimetricamente (Perkin Elmer Model LS-50). A concentração do substrato inicial foi de 1,42 x 10 Λ A concentração da enzima foi de 3 x 10 ? Μ. A enzima GLEG ou a er zima solúvel foram adicionadas a um volume reaccional de 2 ml qu.e compreendia 0 substrato em acetato de cálcio 20 mM e
cloreto de potássio 50 mM, plí 5,3 a 42°C. A quantidade de 4“metilumeliferona foi determinada fluorimetricamente por medição da intensidade de fluorescência a 450 nm com a excitação a 360 nm. A espessura estreita para ambas, excitação e emissão, foi de 10 nm. Tal como descrito previamente no Sxem pio 2, a enzima OLEO foi removida da mistura de reacção por centrifugação antes da medição da fluorescência.
TABELA 18 - Actividade de Lisozima
Fluorescência
Tempo (min.) CLEC Enzima solúvel
1 0,000 0,000 0,000
2 10,000 4,400 18,900
3 30,000 10,500 29,400
4 60,000 27,500 44,800
5 90,000 33,800 51,500
6 120,000 45,900 59,800
EMEMPLO 7
Cristalização,retieulação e liofilização da asparaginase e avaliação dascaracteristicas do^produto resultante
C ri st ali zação da asparaginas e
Como uma modificação da técnica descrita por Grabner et al. (Memória Descritiva da Patente Americana K2. 3.664.926 (1972) 25 mg de asparaginase liofilizada (Worthington) foram dissolvidos em 500 ul dum tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2. A solução foi arrefecida a 4 C e o pH ajustado para 5,0 com ácido acético 1 M. Etanol frio (-20°C) foi então cuidadosamente adicionado gota a gota à solução de asparaginase para uma concentração final de 33%.Ά solução foi incubada a 4°C. A cristalização foi completada em 48 hor
Os cristais foram recuperados por centrifugação, tal como se descreveu anteriormente.
Reticulação dos cristais de asparaginase
Tal como aqui é desvendado, os cristais de aspar ginase foram reticulados numa colução de glutaraldeído a 7,5 num tampão fosfato de sódio 50 mí£ pH 5,6. Após a reticulação dos cristais foram lavados 5 vezes com volumes de 15 ml de Tris 5θ mA/I, pH 7?0· A asparaginase OLEO foi liofilizada, tal como previamente foi descrito no Exemplo 2.
Actividade enzimática da asparaginase solúvel e da asparaginase GLEG
As actividades catalíticas das asparaginases solú vel e GLEG foram ensaiadas espectrofotometricamente por medi ção da evolução do ião amónio na reacção enzimática acoplada abaixo descrita (todos os reagentes foram fornecidos pela Boebringer Mannheim) Tabela 19 e Eigura 11).
asparaginase
L-asparagina--------------> asparate + glutamato dehldrogenase
NH4+ + ΞΑΌΗ + gc cetoglutarate---------------— --------— —> ácido glutâmico + NAD+
A oxidação do 3SADH foi medida pela diminuição de adsorção a 340 nm. A concentração inicial de NA3B foi de 1,4 —r mg/ml. A concentração da asparaginase foi de ΙΟ-^ Μ. A concentração da alfa cetoglutarato foi de 10^ lá. A concentraçã) do glutamato desidrogenase foi de ΙΟ-? Μ. A concentração da asparaginase boi de 2,3 x 10 M. Tal como descrito previamente no Exemplo 2, a enzima GLEG foi removida da mistura reaccional por centrifugação antes da medição da absorvância.
TABELA 19 - Actividade de Asparaginase
Absorvãncia a 340 nm
Tempo (min.) OLEO Enzima solúvel
1 0,0 1,000 1,000
2 1,0 0,867 0,825
3 5,0 0,759 0,684
4 5,0 0,603 0,558
5 10,0 0,502 0,406
6 15,0 0,449 0,558
7 50,0 0,328 0,199
8 45,0 0,211 0,187
Equivalentes ar
Os peritos na técnica reconh.ecerão_ Qu estarão aptosa adapt usando mais do que a experimentação de rotina, muitos equiva lentes a este material específico e componentes aqui descridos. Tais equivalentes entendem-se como abrangidos pelo espí rito das reivindicações que se seguem.

Claims (2)

1 . Processo para a realização de processos catalisados por enzimas com utilização de cristais reticulados como forma de imobilização de enzimas para a preparação de produtos seleccionados, caracterizado pelo facto de compreender
a) combinar-se pelo menos um substrato apropriadamente escolhido com pelo menos uma enzima que actua sobre o substrato e está sob a forma de um cristal da enzima imobilizado reticulado; e
b) manter-se a combinação produzida na operação a) sob as condições apropriadas para a enzima actuar sobre o substrato e originar o produto pretendido.
2 . Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o produto seleccionado ser escolhido do grupo que consiste em pêptidos, lípidos, moléculas organicas quirais e hidratos de carbono.
3 . Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o cristal reticulado de enzima imobilizada ter um tamanho aproximadamente igual a 10 mm.
4a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as condições existentes na fase b) serem prejudiciais para a função eficiente da enzima que não se encontra sob a forma dum cristal de enzima imobilizada reticulada • 5a. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de as condiçoes de realização da
consiste em dissolventes fase b) serem escolhidas do grupo que temperatura elevada, pH baixo, pH alto, orgânicos mistos aquosos/organicos e condições quase anidras.
6 . Processo para a realização de processos catalisados por enzimas com utilização de cristais reticulados como forma de imobilização das enzimas para a preparação de produtos seleccionados, caracterizado pelo facto de compreender
a) combinar-se dois substratos apropriadamente escolhidos com pelo menos uma enzima que actua sobre pelo menos num dos substratos escolhidos e está sob a forma de um cristal da enzima imobilizado reticulada; e
b) manter-se a combinação produzida na operação a) sob as condições apropriadas para a enzima actuar sobre pelo menos um dos substratos e originar o produto pretendido.
â
7 . Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o produto pretendido ser escolhido do grupo que consiste em pêptidos, lípidos, moléculas organicas quirais e hidratos de carbono.
8a. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o cristal reticulado de enzima imobilizada ter um tamanho aproximadamente igual a 10 mm.
9a. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de as condições existentes na fase b) serem prejudiciais para a função eficiente da enzima que não se encontra sob a forma dum cristal de
enzima imobilizada reticulada.
IJ.
Q
10 . Processo de acodo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de as condições de realização da fase b) serem escolhidas do grupo que consiste em temperatura elevada, pH baixo, pH alto, dissolventes orgânicos mistos aquosos/organicos e condições quase anidras.
11 . Processo catalisado por enzimas para a prepararção dum produto seleccionado no seio dum dissolvente orgânico, caracterizado pelo facto de compreender
a) combinar-se pelo menos um substrato apropriadamente escolhido; com pelo menos uma enzima que actua sobre o substrato e está sob a forma de um cristal da enzima imobilizado reticulada; e com o dissolvente orgânico; e
b) manter-se a combinação produzida na operação a) sob as condições apropriadas para a enzima actuar sobre o substrato e originar o produto pretendido.
12 . Processo catalisado por enzimas para a preparação de um produto seleccionado, caracterizado pelo facto de compreender combinar-se um substrato apropriadamente escolhido com um cristal de enzima imobilizado reticulado que actua sobre o substrato apropriadamente escolhido, em condições apropriadas para os cristrais de enzima imobilizada reticulada actuarem sobre o substrato apropriadamente escolhido, alterando-o e originar o produto pretendido.
13 . Processo para a preparação de éster de 1-metilo de NL- —aspartil-L-fenilalanina (aspartame), caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em:
a) combinar-se os dois péptidos com cristais de termolisina imobilizada reticulados, tendo um dos péptidos a fórmula
Z-L-Asp e tendo o segundo péptido a fórmula DL-Phe-OMe sob condições apropriadas para a condensação dos dois péptidos por meio de cristais de enzima imobilizada reticulada, originando um dipéptido parcialmente protegido da fórmula
Z-L-Asp-L-Phe-OMe na qual
Z representa um grupo benziloxi e
b) eliminar-se o grupo benziloxicarbonilo e obter-se aspartame.
14a. Processo para imobilizar uma enzima e reter a sua actividade, caracterizado pelo facto de se empregar a enzima como um cristal e se reticular o cristal de maneira a obter-se um cristal de enzima imobilizada reticulado com um tamanho aproximadamente igual a 10 1 mm.
15 . Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de os critais de enzimas serem escolhidos de termolisina, lipases, elastases, esterases,lisózimas e asparaginase.
16 . Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de adicionalmente compreender a liofilização dos cristais imobilizados reticulados.
17 . Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de a enzima ser escolhida do grupo que consiste em termolisina, lipases, estarases, elastases, lisózimas e asparaginase.
18 . Processo para imobilizar a termolisina e reter a sua actividade, caracterizado pelo facto de se empregar
fc ' //'Λ cristais de termolisina e se reticular os cristais de termolisina, de forma a obter cristais de termolisina imobilisados e reticulados com um tamanho aproximadamente
igual a 10 1 mm.
19 . Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de compreender adicionalmente a liofilização dos cristais de enzima imobilizados reticulados produzidos.
20 . Dispositivo que compreende uma enzima sob a forma de cristais de enzima imobilizados reticulados e meios de retenção para os cristais de enzima imobilizados reticulados, caracterizado pelo facto de os meios de retenção permitirem o contacto entre os cristais de enzima imobilizados reticulados e um substrato sobre o qual a enzima actua, estando o substrato presente num fluido.
21 . Dispositivo biossensor para detectar a presença dum produto de interesse a analisar num fluido, caracterizado pelo facto de compreender
a) um conjunto de cristais de enzima imobilizados reticulados, em que a enzima presente actua sobre o produto de interesse a analisar ou sobre um reagente duma reacção em que o produto de interesse a analisar participa? e
b) meios de retenção para os cristais de enzima imobilizados reticulados que permitem o contacto entre os cristais de enzima imobilizados reticulados e um fluido que contém:
1) o produto que se pretende analisar sobre o qual a enzima actua, encontrando-se o referido produto no seio de um fluido; ou
2) um reagente duma reacção em que o produto a analisar participa, encontrando-se o mencionado reagente presente no fluido.
g
22 . Dispositivo biossensor de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de compreender ainda meios detectores.
23 . Dispositivo biossensor, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de ser apropriado para detectar a presença dum produto escolhido do grupo que consiste em glucose, creatinina, ureia, lactato, glucose6-fosfato, sacarose, trisfosfato de adenosina (ATP), etanol, ácido acético, ácido fórmico, colesterol, ácido urico, ácido N-{4-[[(2,4-diamino-6—pteridinil)-metil]metilamino]-benzoil}-L-glutamico (metotrexato), dióxido de carbono, aminoácidos, fosfatos, penicilina, nitratos, nitritos, sulfatos e succinato.
g
24 . Dispositivo biossensor para detectar a presença dum produto que interessa analisar num fluido, caracterizado pelo facto de compreender
a) cristais de luciferase imobilizados reticulados, que actuam sobre o produto a analisar ou sobre um produto de uma reacção em que ele participa; e
b) meios de retenção para os cristais de luciferase imobilizados reticulados que permitem o contacto entre os cristais de luciferase imobilizados reticulados e um fluido que contém
1) o produto a analisar sobre o qual a luciferase actua ou
2) o produto duma reacção em que o referido produto a analisar participa.
25 . Dispositivo extracorporal para modificar o teor de um componente dum fluido corporal, caracterizado pelo facto de compreender
a) cristais de enzima imobilizados reticulados que actuam sobre o referido componente ou sobre um reagente duma reacção em que esse componente participa; e
b) meios de retenção para os cristais de enzima imobilizados reticulados que permitem o contacto entre os referidos cristais de enzima imobilizados e
1) o componente existente no fluido sobre o qual o enzima actua ou
2) o produto de uma reacção em que o compoente participa e se encontra presente no fluido.
g
26 . Dispositivo extracorporal de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de o componente do fluido cujo teor se pretende modificar ser escolhido do grupo que consiste em asparagina, heparina, bilirrubina, metotrexato, aminoácidos, ureia e amoníaco.
g
27 . Dispositivo útil para a obtenção dum produto escolhido, caracterizado pelo facto de compreender uma enzima sob a forma de cristal de enzima imobilizado reticulado e meios de retenção dos cristais de enzima imobilizados reticulados.
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