LT3366B - Crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization - Google Patents

Crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization Download PDF

Info

Publication number
LT3366B
LT3366B LTIP1077A LTIP1077A LT3366B LT 3366 B LT3366 B LT 3366B LT IP1077 A LTIP1077 A LT IP1077A LT IP1077 A LTIP1077 A LT IP1077A LT 3366 B LT3366 B LT 3366B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
enzyme
crystal
cross
clec
hydrolase
Prior art date
Application number
LTIP1077A
Other languages
English (en)
Inventor
Manuel A Navia
Nancy L Stclair
Original Assignee
Vertex Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharma filed Critical Vertex Pharma
Publication of LTIP1077A publication Critical patent/LTIP1077A/xx
Publication of LT3366B publication Critical patent/LT3366B/lt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C12Q1/003—Functionalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Piezo-Electric Or Mechanical Vibrators, Or Delay Or Filter Circuits (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Šis išradimas yra apie fermento imobilizavimo būdą, pagal kurį suformuojami kristalai ir, : bendru atveju kristalas susiuvamas (sudaromi skersiniai ryšiai tarp kristalą sudarančių baltymo molekulių (šiam procesui pažymėti čia naudojamas terminas skersinis susiuvimas arba tiesiog susiuvimas)), panaudojant bifunkcinį reagentą; susiūtus imobilizuotus fermentų kristalus (toliau trumpintai CLEC arba CLIEC), gautus šiuo būdu; CLEC liofilizaciją, kaip priemonę pagerinančią imobilizuotų fermentų saugojimo, priežiūros ir panaudojimo savybes ir apie norimo produkto panaudojant reakcijas katalizuoj amas rinkiniais.
gavimo būdą, CLEC ar CLEC
Fermentai naudojami kaip katalizatoriai pramoninio bei laboratorinio masto aukštos kokybės ir specializuotų cheminių medžiagų pramoninėje gamyboje (Jonės. J.B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1986)), maisto produktų gamyboje (Zaks ir kt., Trends in Biotechnology 6: 272275 (1988)), ir kaip įrankis organinių junginių (Wong, C.-H., Science 244: 1145CHEMTRACTS-Org. Chem. 3: 91-111 (1990);
, Acc. Chem. Res. 23: 114-120 (1990)).
sintetinimui 1152 (1989); Klibanov, A.M
Gamyba, paremta fermentų panaudojimu, gali žymiai sumažinti aplinkos teršimo naštą, pasireiškiančią plataus masto gamyba kitur nepanaudojamų tarpinių chemikalų, kaip parodyta plataus masto akrilamido gamyboje, panaudojant fermentą nitrilo hidratazę (Nagasawa, T. ir Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)).
Fermentai taip pat panaudojami kaip biosensoriai, įvairių medžiagų aptikimui klinikiniams, pramoniniams bei kitiems poreikiams (Hali, E., Biosensors, Open University Press (1990)). Klinikinių tyrimų srityje fermentai gali būti panaudoti ekstrakorporalinėj e terapijoje, pavyzdžiui hemodializėje ir hemofiltracijoje, kur fermentai selektyviai pašalina nereikalingas ir toksines medžiagas iš kraujo (Klein, M., Langer, R., Trends in Biotechnology 4: 179185 (1986)). Fermentai naudojami šiose srityse todėl, kad jie efektyviai katalizuoja daugelio tipų reakcijas prie vidutinių temperatūrų, be to jie yra specifiški substratui ir stereoselektyvūs. Vis dėlto, tirpių fermentinių katalizatorių vartojimas turi trūkumų, kurie riboja fermentų panaudojimą pramoniniuose ir laboratoriniuose cheminiuose procesuose (Akiyama ir kt., CHEMTECH 627-634 (1988)).
Fermentai yra brangūs ir santykinai nestabilūs, lyginant su dauguma pramoninių ir laboratorinių katalizatorių, net kai jie naudojami vandeninėje terpėje, kurioje paprastai fermentai funkcionuoja. Daugumas iš ekonomiškai vertingesnių cheminių reakcijų, plačiai vykdomų praktikoje, nesuderinamos su vandenine terpe, kurioje, pvz., dažnai substratai ir produktai yra netirpūs ar nestabilūs ir kurioje hidrolizė gali turėti didelę Įtaką. Be to, kad išgauti fermentinį katalizatorių iš produkto ir nesureagavusio substrato, esančio žaliavoje, dažnai reikia panaudoti sudėtingą ir brangią atskyrimo technologiją. Galiausiai, fermentus sunku išsaugoti, išlaikant jų aktyvumą komerciškai priimtinam laikotarpiui (nuo mėnesių iki metų), be jų užšaldymo (nuo 4°C iki -80°C ir iki skysto azoto temperatūros) arba be laikymo vandeniniuose tirpikliuose su atitinkama jonine galia, pH ir t.t.
Fermentų imobilizacijos būdai, dauguma atvejų, leidžia išvengti šių problemų. Imobilizacij a gali pagerinti fermentinių katalizatorių stabilumą ir apsaugoti jų funkcionalini integralumą agresyvių tirpiklių aplinkoje bei ekstremaliose temperatūrose, t. y. sąlygose, kurios būdingos pramoniniams ir laboratoriniams cheminiams procesams (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149-153 (1985)). Nenutrūkstamo srauto procesai gali vykti kolonose su imobilizuoto fermento dalelėmis, pavyzdžiui, kai tirpi žaliava praeina pro tas daleles ir palaipsniui virsta produktu.
Šiame aprašyme, terminas fermentų imobilizacija reiškia fermentinio katalizatoriaus pervedimą į netirpią būseną, panaudojant prijungimą, inkapsuliaciją arba agregaciją į makroskopines (10_1 mm) daleles.
Literatūroje pasirodė eilė vertingų fermentų imobilizacijos būdų apžvalgų (Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984); Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45-50 (1985)). Maugh aprašė penkis bendrus fermentų imobilizacijos būdus. Tarp jų: adsorbavimas kietuose nešikliuose (tokiuose kaip jonitinės dervos); kovalentinis prijungimas prie nešiklių (tokių kaip jonitinės dervos, poringa keramika arba stiklo rutuliukai); surišimas polimeriniuose geliuose; inkapsuliacija; ir tirpių baltymų nusodinimas, sudarant tarp jų atsitiktinius ir neapibrėžtus skersinius ryšius bifunkcinių reagentų pagalba. Be to, galima imobilizuoti ištisas ląsteles (paprastai negyvas arba padarytas pralaidžiomis), kurios parodė gero lygio aktyvumą (pvz., Nagasawa, T. ir Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)).
Kiekviena iš šių imobilizacijos procedūrų turi savo privalumus ir apribojimus ir nei viena iš jų negali būti laikoma optimalia ar dominuojančia. Daugumoje jų, pats fermentinis katalizatorius galiausiai tesudaro tik mažą dalį viso tūrio, kurį užima medžiaga, esanti cheminiame reaktoriuje. Iš esmės, didžiąją dalį imobilizuotos terpės sudaro inertiška, tačiau dažnai brangi nešiklio medžiaga. Visuose būduose imobilizuojančios sąveikos tarp fermentinio katalizatoriaus molekulių ir/arba jų sąveika su nešiklio medžiaga turi polinkį į atsitiktinumą ir neapibrėžtumą. To pasėkoje, nors šios sąveikos ir padidina tam tikru laipsniu fermentinio katalizatoriaus molekulių stabilumą, dėl santykinio jų nespecifiškumo ir netaisyklingumo gauta stabilizacija yra suboptimali ir netolygi. Daugumoje atvejų, pablogėja priėjimas prie fermentinio katalizatoriaus aktyvaus centro. Be to, aprašytieji imobilizacijos būdai neišsprendžia saugojimo ir šaldymo problemų. Kaip taisyklė, tradiciniais būdais imobilizuotais fermentais negalima laisvai manipuliuoti, pavyzdžiui, pakeisti vieną tirpiklį į kitą, be rizikos suardyti struktūrinį ir funkcinį fermento integralumą. Praktiškai, išskyrus tą atvejį, kai prie nešiklio dalelių prijungiama rišančioj i grupė, tradiciškai imobilizuoti fermentai labai panašūs į tirpius fermentus ir, kad pastarieji, turi polinkį denatūruotis bei praranda funkcines savybes agresyviose aplinkose. Bendru atveju, imobilizacijos būdai sumažina fermento katalizuojamos reakcijos greitį, lyginant su gaunamu tirpikliuose. Tai apsprendžia apribojimai, susiję su substrato difuzija į imobilizuoto fermento daleles ir produkto difuzija iš jų (Quiocho, F.A., ir Richards F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)). Neišvengiamas inertinio nešiklio buvimas dalelėse su imobilizuotu fermentu prailgina vidutinį laisvą kelią tarp imobilizuoto fermento dalelių išorės su tirpikliu ir fermentinio katalizatoriaus aktyvaus centro ir, tuo būdu, pasunkina šias difuzijos problemas. Imobilizuotu ląstelių atveju, difuzijos problemos ypač sunkios, net jei ląstelių sienelės ir membranos tuo ar kitu būdu padarytos pralaidžiomis substratui ir produktui. Be to, reikia įvertinti daugybę pašalinių fermentinių aktyvumų, esančius ląstelėje metabolitus ir toksinus, o taip pat, ląstelės stabilumą darbinėje aplinkoje su agresyviais tirpikliais ir ekstremaliomis temperatūromis. Patobulinta imobilizacijos metodika, kuri
-ei * išvengia apribojimų, būdingų šiuo metu egzistuojantiems būdams, būtų naudinga skatinant fermentų, kaip pramoninių katalizatorių, vartojimą,· ypač, jei būtų jos naudingumas plataus masto gamyboje parodytas (Daniels,
M. J., Methods in Enzymology 136: 371379 (1987)).
Šio išradimo būde, nedideli (10’1 mm) baltymo kristalai iš vandeninių tirpalų arba vandeninių tirpalų su organiniais tirpikliais, kuriuose fermentinis katalizatorius išlieka struktūriškai ir funkciškai stabilus. Labiau priimtiname išpildyme, kristalai yra susiuvami su bifunkciniu reagentu, tokiu kaip glutaraldehidas. Šis susiuvimas stabilizuoja kristalinės gardelės kontaktus tarp atskirų fermento molekulių, sudarančių šį kristalą. Šios papildomos stabilizacijos dėka, susiūti imobilizuotų fermentų kristalai gali funkcionuoti pakeltose temperatūrose, ekstremaliuose pH ir agresyviose vandeninėse, organinėse ar beveik bevandenėse terpėse, tame tarpe ir jų mišiniuose. Tuo būdu, šio išradimo CLEC gali veikti aplinkose, kuriose nekristalizuoti, nesusiūti, natyvūs fermentai ar tradiciniais būdais imobilizuoti fermentiniai katalizatoriai negali išlaikyti savo funkcinio integralumo.
Be to, su CLEC, gautais šiuo būdu, galima atlikti liofilizaciją ir gauti liofilizuotus CLEC, kurie tokioje liofilizuotoje būsenoje gali ilgesni laikotarpi nešaltoje (kambario) ir kurie gali lengvai atsistatyti vandeniniame, organiniame ar maišytame organiniame tirpiklyje, be amforinės suspensijos suformavimo ir su minimalia denatūracijos rizika.
būti laikomi temperatūroje pasirinktame vandeniniameŠis išradimas aprašytu būdu taip pat susijęs ir jų panaudojimu su CLEC, gautais laboratorinėje bei plataus masto pramoninėje gamyboje pasirinktų medžiagų, tokių kaip chiralinės organinės molekulės, peptidai, angliavandeniai, lipidai ar kiti cheminiai junginiai. Šiuo metu, tos medžiagos paprastai gaunamos tradiciniais cheminiais būdais, kurie reikalauja agresyvių sąlygų (pvz.: vandeninių, organinių ar beveik bevandenių tirpiklių, mišrių vandens-organinių tirpiklių arba aukštų temperatūrų), nesuderinamų su nekristalizuotų, nesusiūtų, natyvių fermentinių katalizatorių funkciniu integralumu. Kitos makromolekulės, turinčios katalitinį aktyvumą, taip pat gali būti įtrauktos į pasiūlytą CLEC technologiją. Tai gali būti kristalizuojantys antikūniai (Lerner, R.A., Benkovic, S.J., ir Schultz,
P.G., Science 252: 659-667 (1991)) ir katalizuoj antys polinukleotidai (Cech T.R., Cell 64: 667-669 (1991); Celander, D.W., and Cech, T.R., Science, 251: 401407 (1991)).
Šis išradimas taip pat susijęs su pasirinktų produktų gamybos būdu, panaudojant reakcijas, kurias katalizuoj a šio išradimo CLEC.
Praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje dipeptidilinio dirbtinio saldintojo, aspartamo, chiralinio pirmtako sintezei buvo panaudotas fermentas termolizinas, cinko metaloproteazė. Termolizinas buvo kristalizuotas iš vandeninio 45% dimetilsulfoksido ir 55% 1.4M kalcio acetato, 0,05M natrio kakodilato, prie pH 6,5. Iš gautų kristalų buvo suformuoti termolizino CLEC, susiuvant su glutaraldehidu. Po to termolizino CLEC buvo perkeltas iš vandeninio kristalizacijos tirpalo, kuriame jis buvo pagamintas, į etilacetato tirpalą, turintį substratus, N-(benziloksikarbonil)-L-asparagino rūgštį (Z-L-Asp) ir L-fenilalanino metilo esterį (L-Phe-OMe). Termolizino CLEC panaudotas katalizuoti šių dviejų substratų kondensacijos reakciją susintetinti N-(benziloksikarbonil )-L-aspartil-L-fenilalanino metilo esterį (Z-LLT 3366 B
Asp-L-Phe-OMe), kuris yra dirbtinio saldintojo aspartamo dipeptidilinis pirmtakas. Naudojant bet kurį iš daugelio žinomų būdų (žr. pvz., Lindeberg, G., J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987)), galima nuimti apsaugą nuo L-asparagino rūgšties, esančios susintetintame dipeptidiliniame pirmtake, pašalinant benziloksikarbonilo (Z-) grupę ir tokiu būdu gauti aspartamą.
Antrame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas termolizinas buvo panaudotas termolizino CLEC gavimui. Gautų CLEC aktyvumas ir stabilumas buvo palyginti su tomis pačiomis tirpaus termolizino charakteristikomis prie optimalių sąlygų, o taip pat prie sąlygų su ekstremaliomis pH ir temperatūra, po inkubavimo organiniuose tirpikliuose ir po inkubavimo tirpale su su egzogenine proteaze.
Fermentas termolizinas buvo kristalizuotas iš 1,2M kalcio acetato ir 30% dimetilsulfoksido tirpalo, prie pH 8,0. Iš gautų kristalų buvo suformuoti termolizino CLEC, susiuvant su 12,5% glutaraldehidu. Po to termolizino CLEC buvo liofilizuotas, naudojant standartinę procedūrą (Cooper, T.G., The Tools of Biochemistry, pp. 379-380 (John Wiley and Sons, NY (1977)), ir buvo gautas liofilizuotas termolizino CLEC. Po to šis liofilizuotas CLEC buvo tiesiogiai perkeltas į įvairius pasirinktus vandeninius, organinius ar maišytus vandens-organinius tirpiklius, be tarpinės tirpiklių keitimo procedūros, be amorfinių suspensijų formavimo ir su minimalia denatūracijos rizika. Tarp šių tirpiklių buvo acetonitrilas, dioksanas, acetonas ir tetrahidrofuranas, bet galima panaudoti ir kitus. Po inkubacijos, aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriniu būdu, skaidant dipeptidinį substratą FAGLA (furilakriloil-glicil-L-leucino amidą).
Trečiame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas elastazė (iš kiaulės kasos) buvo kristalizuotas iš 5,5 mg/ml baltymo, O,1M natrio acetato vandeninio tirpalo, prie pH 5,0 ir kambario temperatūroje (Sawyer, L. ir kt., J. Mol. Biol. 118: 137-208). Iš gautų kristalų buvo suformuoti elastazės CLEC, susiuvant su 5% glutaraldehidu. Elastazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Ketvirtame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje, kaip čia atskleista, fermentas esterazė (iš kiaulės kepenų) buvo kristalizuotas iš 15 mg/ml baltymo ir 0,25M kalcio acetato vandeninio tirpalo, prie pH 5,6 ir kambario temperatūroje. Iš gautų kristalų buvo suformuoti esterazės CLEC, susiuvant su 12,5% glutaraldehidu. Esterazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Penktame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje, kaip čia parodyta, fermentas lipazė (Geotrichum candidum) buvo kristalizuotas iš 20 mg/ml baltymo, 0,50M Tris vandeninio tirpalo, prie pH 7 ir kambario temperatūroje. Iš gautų kristalų buvo suformuoti lipazės CLEC, susiuvant su 12,5% glutaraldehidu. Lipazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Šeštame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas lizocimas (iš vištos kiaušinio baltymo) buvo kristalizuotas iš 40 mg/ml baltymo, 40 mM natrio acetato buferio, turinčio 5% natrio chlorido, vandeninio tirpalo, prie pH 7,4 ir kambario temperatūros (Blake, C.C.F. ir kt., Nature, 196: 1173 (1962)). Iš gautų kristalų buvo suformuoti lizocimo CLEC, susiuvant su 20% glutaraldehidu. Lizocimo CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Septintame praktiniame šio išradimo būdo pavyzdyje fermentas asparaginazė (Escherichia coli) buvo kristalizuotas iš 25 mg/ml baltymo, 50 mM natrio acetato ir 33% etanolio vandeninio tirpalo, prie pH 5,0 ir ir 4°C. Kristalizacijai panaudota modifikuota procedūra, aprašyta Grabner ir kt. [U.S. Patent 3664926 (1972)] . Iš gautų kristalų buvo suformuoti asparaginazės CLEC, susiuvant su 7,5% glutaraldehidu. Asparaginazės CLEC buvo liofilizuotas kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Panašiai gali būti imobilizuotos ir panaudotos atitinkamų reakcijų katalizei liuciferazė ir ureazė. Kiti fermentai, tokie kaip nurodyti 1-5 lentelėse, taip pat gali būti kristalizuoti ir susiūti pagal šį būdą, o gauti CLEC gali būti panaudoti kristalizavimui reakcijų, kurių pagalba gaunamas pasirinktas produktas, arba reakcijų, kurios yra tarpinis žingsnis (t.y. viena iš eilės reakcijų) pasirinkto produkto gamyboje. Kaip žinoma, nors skersinis susiuvimas padeda stabilizuoti daugumą kristalų, jis nėra būtinas ar pageidautinas visais atvejais. Kai kurie kristaliniai fermentai išlaiko funkcinį ir struktūrinį integralumą agresyviose aplinkose, net jei neatliktas susiuvimas. Nors labiau priimtiname išpildyme kristalai yra susiuvami, skersinių jungčių sudarymas ne visada būtinas, kad pagamintume naudingą fermentinį kristalą pagal šį būdą.
Fermentiniai CLEC turi keletą svarbių charakteristikų, kurios jiems suteikia reikšmingą pranašumą lyginant su šiuo metu vartojamais tradiciniais fermentų imobilizavimo būdais. Fermentiniams CLEC nereikia atskiros inertinės nešančiosios struktūros. Be inertinio nešiklio pagerėja substrato ir produkto difuzija CLEC viduje ir galima kristale gauti fermento koncentraciją, artimą teorinei tokio dydžio molekulių supakavimo ribai. Aukštos fermento koncentracijos gali io duoti žymią gamybinę ekonomiją, dėka efektyvinio aktyvumo išaugimo duotame katalizatoriaus tūryje, substrato ir fermento kontaktavimo laiko sutrumpėjimo ir bendro gamyklos dydžio bei kapitalinių įdėjimų sumažėjimo (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371-379 (1987)). Tolygus pasiskirstymas kristalo tūryje ir padidintas CLEC sudarančių fermentų stabilumas sukuria naujas galimybes fermentinės katalizės panaudojimui agresyviose aplinkose, tokiose kaip aukštos temperatūros, vandeniniai, organiniai ar beveik bevandeniai tirpikliai, o taip pat jų mišiniai. Be to, apribotas tirpiklio priėjimas ir taisyklinga baltymų aplinka, kuri būdinga kristalinei gardelei, leidžia fermentiniams CLEC geriau išlaikyti metalo jonus ir kofaktorius, palyginus su tradicinėmis fermentų imobilizavimo sistemomis.
Trumpas figūrų aprašymas
Fig. 1 grafiškai pavaizduoti tirpaus termolizino ir termolizino CLEC aktyvumų įvertinimo rezultatai.
Fig. 2 grafiškai pavaizduotas termolizino CLEC ir tirpaus termolizino priklausomybių nuo pH palyginimas.
Fig grafiškai pavaizduoti tirpaus termolizino aktyvumo matavimai prie 65°C.
ir kristalinio po inkubacijos
Fig. 4 grafiškai pavaizduoti tirpaus termolizino ir termolizino CLEC atsparumo egzogeninei proteolitinei degradacijai įvertinimo rezultatai.
Fig. 5 grafiškai pavaizduoti tirpios elastazės ir atitinkamo elastazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai.
Fig. 6 grafiškai pavaizduoti tirpios elastazės ir atitinkamo elastazės CLEC atsparumai egzogeninei proteolitinei degradacijai.
Fig. 7 grafiškai pavaizduoti tirpios esterazės ir atitinkamo esterazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai.
Fig. 8 grafiškai pavaizduoti tirpios esterazės ir atitinkamo esterazės CLEC atsparumai egzogeninei proteolitinei degradacijai.
Fig. 9 grafiškai pavaizduoti tirpios lipazės ir atitinkamo lipazės CLEC fermentinių aktyvumų Įvertinimo rezultatai.
Fig. 10 grafiškai pavaizduoti tirpaus lizocimo ir atitinkamo lizocimo CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai.
Fig. 11 grafiškai pavaizduoti tirpios asparaginazės ir atitinkamo asparaginazės CLEC fermentinių aktyvumų įvertinimo rezultatai.
Būtų labai naudinga, turėti paprastą ir bendrą būdą, užtikrinantį duoto fermento ar jų rinkinio stabilumą ir funkcionavimą prie sąlygų, kurios domina chemiką, užsiimantį sinteze, ir kurios yra perdaug agresyvios, kad galėtų būti panaudoti šiuo metu žinomi fermentiniai būdai. Susiūti imobilizuoti fermentų kristalai (toliau sutrumpintai CLEC arba CLIFC), kaip čia aprašyta, gali būti panaudoti šiam tikslui. Kristalinės gardelės bei sudarančių kristalą fermentinių katalizatorių stabilizavimas, panaudojant skersinio susiuvimo reakciją, leidžia vartoti CLEC tokiose aplinkose, kaip vandeniniai, organiniai ar beveik bevandeniai tirpikliai, šių tirpiklių mišiniai, kraštutinės pH reikšmės ir aukštos temperatūros, kurios nesuderinamos su fermentų funkcionavimu, naudojantis šiuo metu esamais būdais. Be to, CLEC kristalinės gardelės stabilizacija, leidžia jiems pritaikyti standartinius liofilizacijos būdus. Liofilizuoti CLEC gali būti išsaugomi be užšaldymo komerciškai priimtiną laiko periodą (nuo mėnesių iki metų), o taip pat sudaro galimybę greitai ir paprastai panaudoti CLEC pramoninio ir laboratorinio masto procesuose, tiesiog sumaišant su pasirinktu tirpikliu be jokių tarpinių tirpiklio keitimų. Be to fermentiniai CLEC yra labai atsparūs egzogeninių proteazių poveikiui. Šio išradimo būdas palengvina lanksčių fermentinių katalizatorių panaudojimą pagrindiniuose pramoniniuose cheminiuose procesuose, o taip pat laboratorinėje sintezėje, ieškant naujų junginių.
Nors susiuvimas pagerina kristalinio fermento stabilumą, ne visais atvejais jis yra būtinas ir pageidautinas. Kai kurie kristaliniai fermentai išlaiko funkcinį ir struktūrinį integralumą agresyviose aplinkose ir be skersinių ryšių. Labiau priimtiname šio būdo išpildyme kristaliniai fermentai yra susiuvami, kaip smulkiai aprašyta tolesniuose skyriuose. Tačiau turi būti suprasta, jog kristalizuoti fermentai, nepraėję tolimesnės skersinio susiuvimo stadijos, gali būti panaudoti kai kuriuose šio išradimo išpildymuose.
Reguliarios sąveikos tarp CLEC kristalinę gardelę sudarančių fermentų molekulių apsprendžia riboto dydžio poras, vedančias prie fermento molekulių CLEC viduje. Todėl substratai, didesni už porų dydi, negali patekti į CLEC dalelių vidų.
Dėl riboto porų dydžio, daugelis fermentinių reakcijų, turinčių komercinę ir mokslinę reikšmę, bet susijusių su substratais, didesniais nei CLEC porų dydis, turėtų likti už šio išradimo ribų. Tarp jų patektų daugumas reakcijų, susijusių su dideliais polimerais, tokiais kaip baltymai, polinukleotidai, polisacharidai ir kiti organiniai polimerai, kuriuose polimerinių subvienetų skaičius būtų toks, jog polimeras pasidarytų didesnis už CLEC kristalų porų dydį. Tačiau, tokiais atvejais, katalizė, vis dėlto, gali vykti CLEC paviršiuje.
Šis išradimas yra pasirinkto baltymo tame tarpe fermento imobilizavimo būdas, kristalizuojant ir susiuvant šį baltymą, to rezultate, gautas susiūtas imobilizuotas fermento kristalas (CLEC), gali būti panaudotas norimų produktų gamybos katalizavimui, tokių, kaip peptidai, angliavandeniai, lipidai ir chiralinės organinės molekulės. Be to šis išradimas susijęs su CLEC ir su pasirinkto produkto gamybos būdu, panaudojant CLEC katalizuojamą reakciją arba CLEC katalizuojamą žingsnį, tokių reakcijų sekoje. Viename iš šio išradimo išpildymų kondensacijos reakcijoje, katalizuojamoje susiūtu imobilizuotu termolizinu, gautu pagal šį būdą, buvo pagamintas dipeptidilinis aspartamo pirmtakas. Kitame šio išradimo išpildyme buvo skaldomas indikatorinis substratas, FAGLA, ir gauti kolorimetriniai produktai, kurių atsiradimas parodo termolizino CLEC fermentinį aktyvumą. FAGLA - hidrolizė buvo panaudota kaip modelinė reakcija, kad parodyti termolizino CLEC atsparumą visai eilei aplinkų, kurios paprastai būtų nesuderinamos su šio fermento aktyvumu.
Kituose šio išradimo išpildymuose fermentai elastazė, lipazė, asparaginazė ir lizocimas buvo panaudoti įvairių indikatorinių medžiagų skaldymui, tokių, kaip p-nitrofenilo acetatas (esterazė ir lipazė), sukcinil(ala)3-p-nitroanilidas (elastazė), 4-metilumbeliferilo N-acetil-chitriozidas (lizocimas) ir NADH (asparaginazė).
būdu, vidutinis šios pritaikyti protokolą panaudojant reakciją, fermentu. Po to, kai
Pasinaudodamas šio išradimo srities specialistas gali reikalingo produkto gamybai, katalizuojamą imobilizuotu dominantis fermentas yra iškristalizuotas iš atitinkamo tirpalo, jis gali būti susiūtas su glutaraldehidu ar su kitu tinkamu bifunkciniu reagentu kristalizacijos tirpale, kad būtų gautas šio fermento CLEC. Vėliau, pasirinkto fermento CLEC gali būti liofilizuotas, kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
CLEC naudojimas turi keletą privalumų, lyginant su šiuo metu egzistuojančiais fermentinės katalizės būdais. Pavyzdžiui, susiūta kristalinė matrica yra pačio CLEC nešiklis, todėl fermentinio katalizatoriaus surišimui nereikalingi brangūs nešikliai, rutuliukų, stiklo, gelių ar plėvelių pavidalo, kaip šiuo metu egzistuojančiuose fermentinės katalizės būduose. Todėl fermentų koncentracija fermentiniame CLEC yra artima teorinei supakavimo ribai, kurią galima pasiekti tokio dydžio molekulėms, ir žymiai viršija tankį pasiekiamą net koncentruotuose tirpaluose. Visas CLEC sudarytas tik iš aktyvaus fermento (nėra neaktyvaus nešiklio), todėl turėtų būti minimizuotas, fermentinės reakcijos greičio paprastai fermentuose, susietas su difuzija sumažėjimas, kuris stebimas tradiciškai imobilizuotuose lyginant su fermentais tirpale, kadangi
CLEC atveju žymiai sutrumpėja (lyginant su tradiciškai imobilizuotu fermentų nešiklio dalelėmis) vidutinis laisvas kelias, kurį turi nueiti substratas ir produktas tarp išorinio laisvo tirpiklio ir aktyvaus fermento. Šie dideli baltymų tankiai gali būti ypatingai naudingi biosensoriniuose, analitiniuose ar kituose pritaikymuose, kurie reikalauja didelių baltymų kiekių mažuose tūriuose. Didesnis CLEC našumas ir kompaktiškumas pramoniniuose procesuose gali duoti reikšmingą gamybos ekonomiją, dėl padidinto kataliLT 3366 B zatoriaus efektyvinio aktyvumo duotame tūryje/ kas leidžia sumažinti gamyklos dydį, o taip pat kapitalinius įdėjimus (Daniels, M.J., Methods in EnzymolV 136: 371-379 (1987)). CLEC yra santykinai monodispersipis ir
I jo makroskopinis dydis bei forma atspindi atskiro fermentinio katalizatoriaus natūralaus kristalo augimo charakteristikas. Egzistuojančių terpių su fermentais, imobilizuotais nešikliuose, pakeitimas fermentiniais CLEC, turėtų būti nesudėtingas, kadangi abi sistemos yra panašaus dydžio ir formos ir abi gali būti panašiai išgautos iš žaliavos, panaudojant eilę paprastųr būdų, tame tarpe panaudojant pagrindines ekonomiškas procedūras tokias kaip filtravimą, centrifugavimą, tirpiklių dekantavimą ir kitas.
Be to, naudojant liofilizuotus CLEC supaprastėja kasdienis elgesys su jais ir šių medžiagų saugojimas prieš jų pavartojimą (sausas saugojimas ilgesnį laikotarpį kambario temperatūroje be šaldymo). Liofilizuotus CLEC paprasta vartoti, nes prie jų galima tiesiogiai pridėti norimą tirpiklį ir substratą be ilgų tirpiklio keitimo procesų ir amorfinės suspensijos formavimo. Liofilizuota CLEC forma praplečia bendrą fermentų kaip katalizatorių panaudojimą, leisdama panaudoti platesnį fermentų bei jų funkcionavimo sąlygų spektrą.
Antras CLEC privalumas yra tas, kad kristalizuoto fermento susiuvimas stabilizuoja ir sustiprina kristalinę gardelę ir ją sudarančias fermentų molekules tiek mechaniškai, tiek ir chemiškai. Todėl CLEC gali būti vienintelė priemonė pasiekti dideles aktyvaus fermentinio katalizatoriaus koncentracijas agresyviuose vandeniniuose, organiniuose, beveik bevandeniuose tirpikliuose ar vandens-organinių tirpiklių mišiniuose. Fermentinių katalizatorių panaudojimą organinėje sintezėje stabdė jų polinkis denatūruotis nevandeninių tirpiklių aplinkoje, ypač vandeninitf ir nevandeninių tirpiklių mišiniuose (Klibanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141-144 (1989)). Fermentiniuose CLEC stabilumą apsprendžiantys konformacinio mobilumo apribojimai yra sąlygoti tarpmolekulinių kontaktų ir skersinių ryšių tarp kristalų gardelę sudarančių fermento molekulių, o ne beveik visiško vandens nebuvimo terpėje. Todėl, fermentai CLEC formoje gali toleruoti tarpines vandens koncentracijas, kas anksčiau buvo neįmanoma (žr. 12 lentelę). Komerciniuose taikymuose vandens-organinių tirpiklių mišiniai leidžia valdyti produktų formavimą, pasinaudojant produktų ir substratų santykiniu tirpumu. Cheminio reaktoriaus viduje net vandeninėje terpėje imobilizuoti ar tirpūs fermentiniai katalizatoriai yra veikiami mechaniškai, todėl jie gali denatūruotis arba gali sutrumpėti jų gyvenimo pusperiodis. Cheminiai skersiniai ryšiai CLEC viduje suteikia būtiną mechaninį stiprumą (Quiocho ir Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833839 (1964)), kurio dėka pailgėja fermentinių katalizatorių išgyvenimas reaktoriuje.
Trečias CLEC privalumas yra sąlygotas jų kristalinės kilmės, dėl kurios galima pasiekti tolygumą visame susiūto kristalo tūryje. Kaip čia aprašyta, kristaliniai fermentai yra auginami ir susiuvami vandeninėje aplinkoje ir todėl molekulių išsidėstymas kristalinėje gardelėje išlieka tolygus ir taisyklingas. Šis tolygumas yra palaikomas tarpmolekulinių kontaktų ir cheminių skersinių ryšių tarp kristalinę gardelę sudarančių fermento molekulių ir išlieka perkėlus į kitą vandeninę, organinę ar beveik bevandenę terpę ar maišytus vandens-organinius tirpiklius. Visuose šiuose tirpikliuose fermento molekulės išlaiko pastovų tarpusavio atstumą, suformuodamos gerai apibrėžtas stabilias poras CLEC viduje, kurios palengvina substrato priėjimą prie fermentinio katalizatoriaus, o taip pat produkto pašalinimą. Fermento aktyvumo tolygumas yra labai svarbus pramoniniuose, medicininiuose ir analitiniuose taikymuose, kuriuose pasikartojamumas ir stabilumas turi pirmaeilę svarbą.
Ketvirtas CLEC privalumas yra tas, kad kristalinėje formoje fermentai gali turėti ilgesnį darbo ir saugojimo pusperiodį. Kaip žinoma, gardelės sąveikos, net ir be skersinių jungčių, stabilizuoja baltymus, dalinai dėl to, kad apriboja konformacinius laisvės laipsnius, reikalingus baltymo denatūracij ai. CLEC gardelinės sąveikos, fiksuotos cheminiais skersiniais ryšiais, ypatingai reikšmingos denatūracijos apribojimui, ypač, vandeninių ir nevandeninių tirpiklių mišiniuose (Klibanov, A.M., Trends in Biochemical Sciences, 14: 141-144 (1989)). Fermentai, kurie išbuvo kristalinėje būsenoje mėnesius ar metus, paprastai išlaiko didelį procentą savo katalitinio aktyvumo. Susiūti imobilizuotų fermentų kristalai saugoti bevandeniuose tirpikliuose būtų dar labiau apginti nuo mikrobinio užterštumo ir pažeidimo, kas sudaro rimtą problemą saugant didelius kiekius baltymų turtingoje maistinėmis medžiagomis vandeninėje terpėje. Liofilizuotų CLEC atveju, imobilizuoti fermentai saugomi be tirpiklio. Tai ir susiuvimo pagalba pasiekta stabilizacija, leidžia ilgalaikį CLEC saugojimą be šaldymo.
Penktas CLEC privalumas yra tas, kad dėl kristalinės gardelės stabilizavimo skersinėmis jungtimis jie gali turėti padidintą temperatūrinį atsparumą. Reakcijos vykdymas aukštesnėje temperatūroje negu tradiciniuose būduose gali padidinti dominančių reakcijų greitį tiek termodinamiškai, tiek ir pagerinant difuzijos greitį į ir iš CLEC kristalinės gardelės. Šių efektų visuma įneštų pagrindinį indėlį į reakcijos efektyvumo padidinimą, kadangi jie maksimizuotų produktyvumą duotam fermentinio katalizatoriaus kiekiui, kuris bendru atveju yra brangiausia reakcijos proceso sudedamoji dalis (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371-379 (1987)). CLEC temperatūrinis stabilumas yra išskirtinis, kadangi daugumas fermentinių sistemų reikalauja švelnių reakcijos sąlygų. CLEC taip pat turėtų būti atsparūs denatūracij ai, sąlygotai laikino temperatūros pakilimo saugojimo metu.
Paskutinis CLEC privalumas susijęs su taisyklingos formos ir dydžio poromis tarp fermento molekulių jo kristalinėje gardelėje. Šis tirpiklio priėjimo apribojimas stipriai pagerina metalo jonų ir kofaktorių išlaikymą CLEC kristaluose, lyginant su tradiciškai imobilizuotais fermentais ir fermentais tirpaluose. Ši CLEC savybė duotų galimybę panaudoti ekonomiškai labiau apsimokančius nenutrūkstančio srauto procesus tose situacijose (žr. pvz., Oyama ir kt. Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)), kuriuose, kitu atveju, fermentai būtų inaktyvuoti dėl metalo jonų arba kofaktorių išplovimo. Pavyzdžiui, kaip žinoma dipeptidilinio aspartamo pirmtako Z-L-Asp-L-Phe-OMe sintezėjee, dalyvaujant termolizinui, tradiciniais būdais imobilizuotas fermentas praranda savo katalitinį aktyvumą nenutrūkstamo srauto procesuose, iš dalies dėl kalcio jonų, svarbių termolizino aktyvumui, išplovimo. Praktiškai kalcio jonų išplovimas verčia naudoti mažiau efektyvius ciklinius procesus (Nakanishi ir t., Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Išplovimas įvyksta kada susiformuoja kalcio jonų kompleksai su substratu Z-LAsp, konkuruojantys su natūraliais kalcio surišimo saitais fermento paviršiuje, dėl ko ir prarandamas katalitinis aktyvumas. Didelis fermentų tankis ir atitinkamai ribotas tūris prieinamas tirpikliui CLEC tarpsluoksniuose, trukdo susidaryti kontroliuojantiems L-Asp-Ca++ kompleksams, kurie atsakingi už metalo jonų išplovimą.
CLEC gavimas - fermentų kristalizacija
Šio išradimo bude susiūtas imobilizuotas fermento kristalas (arba CLEC) gaunamas sekančiai:
veikiančių išspausdinta baltymų McPherson to, tiek
Fermentiniai kristalai auginami kontroliuojant fermento nusodinimą iš vandeninio tirpalo arba vandeninio tirpalo su organiniais tirpikliais. Tarp sąlygų, kurios turi būti kontroliuojamos, yra, pavyzdžiui, tirpiklio išgarinimo greitis, pridėjimas į tirpalą atitinkamų ištirpusių medžiagų ir buferių ir pH bei temperatūra. Išsami įvairių faktorių, kristalizaciją, apžvalga buvo (Methods Enzymol. 114: 112 (1985)). Be
McPherson tiek ir Gilliland (J. Crystal Growth 90: 5159 (1988)) suformavo išsamų sąrašą visų baltymų bei nukleotidinių rūgščių, kurios buvo kristalizuotos, taip pat sąlygas, prie kurių vyko jų kristalizacija.
Kristalų bei kristalizacijos receptų rinkinys, o taip pat duomenų saugykla apie tirpių baltymų ir nukleotidinių rūgščių kristalų struktūras yra palaikomi Baltymų Duomenų Banke (Protein Data Bank) kt. J. Mol. Biol. 112: 535-542 (1977))
Brookhaven laboratorijoje. Šie šaltiniai gali būti panaudoti nustatymui būtinų kristalizacijos sąlygų tiems baltymams ir fermentams, kurie anksčiau buvo kristalizuoti, prieš pradedant formuoti atitinkamus CLEC arba jais galima vadovautis, formuojant kristalizacijos strategiją tiems baltymams, kurie prieš tai nebuvo kristalizuoti. Kita galimybė, tai bandymų ir klaidų paieškos strategija Carter, C.W. Jr. and Carter, C.W.,
Chem. 254: 12219-12223 (1979)), kuri daugeliu duoda priimtinas kristalizacijos sąlygas daugumai baltymų, tame tarpe, bet ne tik jiems, kurie buvo aptarti aukščiau, jeigu gali būti pasiektas (Bernstein ir nacionalinėje intelektuali (žiūr. pvz. J. Biol atvejų priimtinas šių baltymų švarumo lygis. Reikalingas švarumo lygis nuo baltymo prie baltymo gali kisti plačiose ribose. Pavyzdžiui, lizocimo atveju fermentas buvo kristalizuotas iš jo nevalyto šaltinio - vištos kiaušinio baltymo (Gilliland, G.L., J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)).
Kad galėtų būti panaudoti kaip CLEC pagal šio išradimo būdą, fermentiniai kristalai neturi būti tokie dideli, kaip naudojami rentgeninėje difrakcinėje analizėje ir faktiškai tokie kristalai yra nepageidautini dėl difuzinių problemų, surištų su jų dydžiu. Mikrokristalinė medžiaga (t.y. kristalai 10_1mm dydžio/ skersinio pjūvio) gali būti naudojama kaip CLEC ir dažnai aptinkama, nors retai aprašoma rentgeninės kristalografijos literatūroje. Mikrokristalai labai naudingi šio išradimo būde, nes leidžia sumažinti iki minimumo problemas, susijusias su difuzija (žr. pvz., Quiocho, F.A., and Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)).
Aplamai, kristalai gaunami maišant baltymus, kurie turi būti kristalizuoti, su atitinkamu vandeniniu tirpikliu arba vandeniniu tirpikliu, turinčiu reikalingą nusodinimo agentą, tokį kaip druskos ar organinės medžiagos. Tirpiklis sumaišomas su baltymu prie eksperimentiškai nustatomos temperatūros, kuri tinka kristalizacijos indukavimui bei leidžia baltymams išlaikyti jų stabilumą ir aktyvumą. Esant reikalui, tirpiklis gali turėti papildomų tirpių medžiagų, tokių kaip dvivalenčiai katijonai, kofaktoriai ar chaotropai, o taip pat buferines medžiagas pH kontrolei. Ar reikia papildomų ištirpusių medžiagų ir turi būti jų koncentracijos tam kad pagerintų kristalizaciją, nustato eksperimentiškai. Plataus masto pramoniniuose procesuose, kristalizaciją per kontroliuojamą nusodinimą geriausia atlikti paprasčiausiai maišant baltymus, nusodintoją, papildomas ištirpintas medžiagas ir, esant būtinybei, buferius cikliniame procese. Taip pat galima pritaikyti alternatyvius laboratorinius kristalizacijos būdus, tokius kaip dializė ar garų difuzija. McPherson (Methods Enzymol. 114: 112 (1985)) ir Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51-59 (1988)) savo kristalizacijos literatūros apžvalgose yra įtraukę išsamų tinkamų sąlygų sąrašą. Retkarčiais nesuderinamumas tarp susiuvančio reagento ir kristalizacijos terpės gali pareikalauti perkelti kristalus į labiau tinkamą tirpiklį.
Daugumas baltymų, kurių kristalizacijos sąlygos jau aprašytos literatūroje, jau sukaupę žymų potencialą kaip praktiniai fermentiniai katalizatoriai pramoniniuose ir laboratoriniuose cheminiuose procesuose, ir iš jų tiesiogiai galima suformuoti CLEC pagal šio išradimo būdą. 1 lentelėje pateikti fermentų pavyzdžiai, kurie buvo kristalizuoti anksčiau. Reikia pažymėti, kad sąlygos, pateiktos šiose nuorodose, buvo optimizuotos didelių difrakcinės kokybės kristalų auginimui, dažnai pridedant milžiniškas pastangas. Mažesniems kristalams, naudojamiems CLEC sudaryme, kai kuriais atvejais gali tekti šiek tiek paderinti kristalizacijos sąlygas.
lentelė
Fermentai Mikrobinis ar biologinis šaltinis Literatūra (tame tarpe ir čia cituota)
alkoholdehidro- arklio kepenys Eklund ir kt., J. Mol.
genazė Biol. 146: 561-587 (1981)
alkoholoksidazė Pichia pastoris Boys ir kt., J. Mol. Biol. 208: 211-212 (1989) Tykarska ir kt., J. Protein Chem. 9: 83-86 (1990)
aldolazė triušio raumuo Eagles ir kt., J. Mol.
(fruktozės- Biol. 45: 533-544 (1969)
bifosfatazė) Heidmer ir kt., Science 171: 677-680 (1971)
veršiuko raumuo Goryunov ir kt., Biofizika 14: 1116-1117 (1969)
žmogaus raumuo Millar ir kt., Trans. Roy. Soc. Lond. B293: 209- 214 (1981)
Drosophila Brenner ir kt., J. Biol.
melanogaster Chem. 257: 11747- 11749 (1982)
aldolazė (PKDG) Pseudomonas putida Vandlen ir kt., J. Biol. Chem. 248: 2251-2253 (1973)
šarminė Escherichia coli Sowadski ir kt., J. Mol.
fosfatazė Biol. 150: 245-272 (1981)
asparaginazė Erwinia carotova North ir kt., Nature 224: 594-595 (1969)
Escherichia coli Epp ir kt., Eur. J. Biochem. 20: 432-437 (1971)
Escherichia coli Yoney ir kt., J. Mol. Biol. 110: 179-186 (1977)
Proteus vulgaris Tetsuya ir kt., J. Biol. Chem. 248: 7620-7621 (1972)
karboanhidrazė žmogaus eritrocitas (C) Kannan ir kt., J. Mol. Biol. 12: 740-760 (1965)
lentelė, tęsinys
Fermentai Mikrobinis ar biologinis šaltinis Literatūra (tame tarpe ir čia cituota)
žmogaus eritrocitas (B) jaučio eritrocitas Kannan ir kt., J. Mol. Biol. 63: 601-604 (1972) Carlsson ir kt., J. Mol. Biol. 80: 373-375 (1973)
katalazė arklio eritrocitas Microccocus luteus Penicillium vitale jaučio kepenys Glauser ir kt., Actą Cryst.J. 21: 175-177 (1966) Marie ir kt., J. Mol. Biol. 129: 175-676 (1979) Vainshtein ir kt., Actą Cryst. A 37: C29 (1981) Eventoff ir kt., J. Mol. Biol. 103: 799-801 (1976)
kreatinkinazė jaučio širdis triušio raumuo Gilliland ir kt., J. Mol. Biol. 170: 791-793 (1983) McPherson, J. Mol. Biol. 61: 83-86 (1973)
glutaminazė Actenobacter glutanimasificans Pseudomonas 7A Wlodawer ir kt., J. Mol. Biol. 99: 295-299 (1975) Wlodawer ir kt., J. Mol. Biol. 112: 515-519 (1977)
gliukozės oksidazė Aspergillus niger Kalisz ir kt., J. Mol. Biol. 213: 207-209 (1990)
β-laktamazės Staphyloccocus aureus Bacillus cereus Moult ir kt., Biochem J. 225: 167-176 (1986) Sutton ir kt., Biochem J. 248: 181-188 (1987)
laktatdehidro- genazė kiaulės viščiuko ryklio Hackert ir kt., J. Mol. Biol. 78: 665-673 (1973) Pickles ir kt., J. Mol. Biol. 9: 598-600 (1964) Adams ir kt., J. Mol. Biol. 41: 159-188 (1969)
lentelė, tęsinys
Fermentai Mikrobinis ar biologinis šaltinis Literatūra (tame tarpe ir čia cituota)
Bacillus Schar ir kt., J. Mol. Biol.
stearothermophilus 154: 349-353 (1982)
lipazė Geotrichum candidum Hata ir kt., J. Biochem. 86: 1821-1827 (1979)
arklio kasos liauka Lombardo ir kt., J. Mol. Biol. 205: 259-261 (1989)
Mucor meihei Brady ir kt., Nature 343: 767-770 (1990)
žmogaus kasos liauka Winkler ir kt., Nature 343: 771-774 (1990)
liuciferazė skraidantis Green, A.A., ir kt., Biochem.
jonvabalis Biophys. Actą. 20: 170 (1956)
liuciferazė Vibrio harveyii Swanson ir kt., J. Biol. Chem. 260: 1287-1289 (1985)
nitrilhidratazė Brevibacterium P312 Nagasawa ir kt., Biochem. Biophys. Res. Coram. 139: 1305-1312 (1986)
P. chlororaphis B23 Nagasawa ir kt., Eur. J. Biochem. 162: 691- 698 (1987)
peroksidazė krienas Braithwaite ir kt., J. Mol. Biol. 106: 229-230 (1976)
krieno šaknys Aibara ir kt., J. Biochem.
(E4 tipas) 90: 489-496 (1981)
japoniškas krienas Morita, Actą Cryst. A28: S52 (1979)
peroksidazė Caldaromyces fumago Rubin ir kt., J. Biol.
(chlorido) Chem. 257: 7768-7769 (1982)
peroksidazė Sarchomyces Poulos ir kt., J. Biol.
(citochromo) cerevisae Chem. 253: 3730-3735 (1978)
peroksidazė jaučio eritrocitas Ladenstein ir kt., J. Mol.
(glutationo) Biol. 104: 877-882 (1979)
lentelė, tęsinys
Fermentai Mikrobinis ar biologinis šaltinis Literatūra (tame tarpe ir čia cituota)
subtilizinas Bacillus subtilis (Novo) Bacillus amylolique- faciens (BPN*) Bacillus subtilis (Carlsberg) Drenth ir kt., J. Mol. Biol. 28: 543-544 (1967) Wright ir kt., Nature 221: 235-242 (1969) Petsko ir kt., J. Mol. Biol. 106: 453-456 (1976)
superoksido dismutazė j aučio špinatų Saccharcmyces cerevi- siae, Escherichia coli Bacillus stearothermophillus Pseudomonas ovalis Richardson ir kt., J. Biol. Chem. 247: 6368-6369 (1972) Morita ir kt., J. Mol. Biol. 86: 685-686 (1974) Beem ir kt., J. Mol. Biol. 105: 327-332 (1976) Bridgen ir kt., J. Mol. Biol. 105: 333-335 (1976) Yamakura ir kt., J. Biol. Chem. 251: 4792-4793 (1976)
termolizinas Bacillus thermoproteolyticus Matthews ir kt., Nature New Biol. 238: 37-41 (1972)
ureazė kanavalija (Canavalia ensiformis) Summer J.B., J. Biol. Chem. 69: 435 (1926)
ksilozės Streptomyces Carrell ir kt., J. Biol.
izomerązė rubiginosus Arthrobacter B3728 Streptomyces oi ivochromogenes Streptomyces violaceoniger Actinoplanes missouriensis Chem. 259: 3230-3236 (1984) Akins ir kt., Biochym. Biophys Actą 874: 375-377 (1986) Farber ir kt., Protein Engineering 1: 459-466 (1987) Glasfeld ir kt., J. Biol. Chem. 263: 14612-14613 (1988) Rey ir kt., Proteins: Struc. Func. Genet. 4: 165-172 (1988)
CLEC gavimas - skersinio susiuvimo reakcija
Po to, kai kristalai išauginti tinkamoje terpėje, juos galima susiūti. Skersinis susiuvimas stabilizuoja kristalinę gardelę, įvesdamas kovalentines jungtis tarp kristalą sudarančių fermento molekulių. Tai sudaro galimybes perkelti fermentą į kitą reakcinę terpę, kuri kitaip gali būti nesuderinama su kristalinės gardelės ar net su intaktinio nedenatūruoto baltymo egzistavimu. Susiuvimą galima atlikti įvairiausių bifunkcinių reagentų pagalba, nors praktiškai dažniausiai vartojamas pigus ir paprastas glutaraldehidas. (Kitų galimų susiuvimo reagentų sąrašą galima rasti, pavyzdžiui, 1990 m. Pierce Chemocal Company kataloge).
Skersinis susiuvimas su glutaraldehidu suformuoja stiprius kovalentinius ryšius pirmiausia tarp lizino amino rūgšties liekanų pačioje fermento molekulėje ir tarp fermento molekulių, sudarančių kristalą. Susiuvimo sąryšiai neleidžia kristalą sudarančioms fermento molekulėms grįžti į tirpalą, efektyviai padaro netirpiomis arba imobilizuoja fermento molekules į mikrokristalines (idealiu atveju 10'1 mm) daleles. Po to makroskopiniai, imobilizuoti, netirpūs kristalai gali būti lengvai atskiriami nuo produkto ir nesureagavusio substrato, esančių žaliavoje, paprastų procedūrų, tokių kaip filtravimas, dekantavimas ir kt., pagalba. Juos taip pat galima panaudoti nenutrūkstančio srauto procesų kolonose, užpildomose fermentiniu CLEC, kuriose jis pasižymi geresniu kofaktorių ir metalo jonų išlaikymu.
Pagal šio išradimo būdą fermentiniai CLEC daromi kaip fermentiniai katalizatoriai, kurie gali veikti egzistuojančiose ir naujose aplinkose. Padidintas CLEC stabilumas, kurį nulemia skersinio susiuvimo reakcija, leidžia juos perkelti į tirpiklius (pvz., vandeninius, organinius ar beveik bevandenius tirpiklius arba jų mišinius), su kuriais, kitu atveju, fermentinis CLEC būtų nesuderinamas, ir leidžia vykdyti operacijas cheminiuose reaktoriuose su pakelta temperatūra ir ekstremaliais pH. Makroskopinėmis katalizuojančiomis CLEC dalelėmis lengva manipuliuoti, nes jas galima išgauti iš žaliavos tokiais paprastais būdais, kaip filtravimas, centrifugavimas arba dekantavimas iš tirpiklio. Be to, jas galima naudoti nenutrūkstamo srauto procesų kolonose.
CLEC gavimas-liofilizacija
Vienas tūris susiūtų termolizino kristalų suspensijos buvo liofilizuojamas per naktį dešimtyje tūrių demineralizuoto vandens, esant pH 7,0, panaudojant liofilizatorių VirTis Modelis #24. Liofilizuoti kristalai buvo atstatomi pridedant dešimt tūrių pasirinkto tirpiklio tiesiai prie kristalų, kurie prieš tai buvo laikomi kambario arba 4°C temperatūroje. FAGLA skaldymo eksperimentams, rehidratuoti kristalai buvo atstatomi 10 mM kalcio acetato buferyje, prie pH 7. Atstatyti liofilizuoti CLEC paprastai buvo saugomi kambario temperatūroje. Palyginimui, kad tirpus fermentas išlaikytų specifinį aktyvumą ilgiau nei savaitę, jį reikia laikyti prie -70°C. Tokia saugojimo ir apdorojimo tvarka buvo pritaikyta fermentams, aprašytiems čia pateiktuose pavyzdžiuose.
Aspartamo pirmtako sintezė termolizino CLEC pagalba
Šio išradimo būdas, pagal kuri gaminami susiūti kristaliniai fermentai, aprašytas žemiau ir pailiustruotas gamyba termolizino susiūtų imobilizuotų fermentinių kristalų, naudojamų aspartamo dipeptidilinio pirmtako gavimui etilo acetate, kuris yra beveik bevandenis organinis tirpiklis. Termolizinas jau buvo kristalizuotas ir jo struktūra išaiškinta iki 1,6A skiriamosios gebos (Holmes and Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)), ir yra vienas iš fermentų, kurį galima naudoti kaip CLEC pagal šį būdą. Termolizinas naudojamas dirbtinio saldintojo aspartamo gamyboje (Isowa ir kt. U.S. Patent #4436925 (1984); Lindeberg, J. Chem. Ed. 64: 1062-1064 (1987); Nakanishi ir kt.,
Biotechnology 3: 459-464 (1985); Oyama, ir kt., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)). Pasirodo, didžioji dalis aspartamo šiuo metu gaminama tradiciniais sintetinės chemijos būdais, nors tradiciškai imobilizuoto termolizino panaudojimas beveik benvandenėje terpėje davė skatinančius rezultatus (Oyama ir kt., J. Org. Chem. 46: 5242-5244 (1981); Nakanishi ir kt.,
Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Pagerintas, panaudojant šio išradimo būdą, aspartamo fermentinis gamybos būdas galėtų konkuruoti su šiuo metu naudojamais gamybos būdais tiek patogumo, tiek ir kainos požiūriu (Oyama, ir kt., Methods in Enzymol. 136: 503-516 (1987)).
Termolizino CLEC įvertinimas
Šio išradimo būdas buvo panaudotas termolizino CLEC gamyboje, ir buvo įvertinti gautų termolizino CLEC stabilumas ir priklausomybė nuo pH, stabilumas prie pakeltų temperatūrų, atsparumas egzogeninei proteolizei ir stabilumas organiniuose tirpikliuose. Termolizino CLEC palyginimas su tirpiu termolizinu smulkiau aprašytas 2 pavyzdyje ir 1-4 pav. Įvertinimo rezultatai parodė:
1. Kas dėl priklausomybės ir stabilumo nuo pH, tai abi formos rodė maksimalų aktyvumą prie pH 7 ir turėjo panašų aktyvumą rūgštiniame diapazone. Šarminiame diapazone termolizino CLEC išlaikė maksimalų aktyvumą iki pH 10; tirpus termolizinas prie pH 8,5 turėjo 75% aktyvumo, prie pH 9 - 25% aktyvumo ir prie pH 9,5 buvo visiškai neaktyvus.
2. Papildomas stabilumas, gaunamas fermentiniuose CLEC, leidžia jiems išlaikyti fermentinį aktyvumą prie aukštesnių temperatūrų, nei tai įmanoma tirpaus termolizino atveju. Padidintas termolizino CLEC stabilumas prie žemesnių temperatūrų supaprastina jų saugojimą, lyginant su tirpiu fermentu. Termolizino CLEC, taip pat, parodė terminį stabilumą ir atsparumą autolizei, nes išlaikė maksimalų aktyvumą po 5 dienų inkubacijos prie 65°C. Priešingai, tirpus termolizinas prarado 50% savo pradinio aktyvumo po 2 valandų inkubacijos ir parodė vos pastebimą aktyvumą po 24 valandų inkubacijos prie 65°C.
3. Fermentinis termolizino CLEC aktyvumas nepakito po 4 dienų inkubacijos galingos streptokokinės proteazės, Pronase®, aplinkoje. Priešingai, tirpus termolizinas greitai degradavo ir prarado visą aktyvumą po 90 minučių inkubacijos.
4. Kaip matosi iš 12 lentelės, termolizino CLEC ir tirpaus termolizino stabilumas organinių tirpiklių aplinkoje stipriai skyrėsi. Termolizino CLEC išlaikė daugiau kaip 95% maksimalaus aktyvumo po inkubacijos visuose tirtuose organiniuose tirpikliuose.
Dėl šių savybių, termolizino ir kitų fermentų CLEC yra ypač naudingi, kadangi juos lengviau saugoti, jie yra stabilesni ir sunkiau inaktyvuojasi ar degraduoja nei atitinkami tirpūs fermentai.
Elastazės CLEC įvertinimas
Šio išradimo būdas taip pat buvo panaudotas elastazės CLEC gamybai, buvo įvertintas gautų elastazės CLEC aktyvumas ir atsparumas egzogeninei proteolizei. Elastazės CLEC palyginimas su tirpia elastaze smulkiau aprašytas 3 pavyzdyje ir 5-6 pav. Įvertinimo rezultatai parodė:
1. Elastazės CLEC išlaikė apie 50% aktyvumo, lyginant su tirpiu fermentu.
2. Tirpi elastazė greitai degradavo proteazės poveikyje. Tirpios elastazės aktyvumas sumažėjo iki 50% pradinio aktyvumo po 10 minučių inkubacijos su proteaze. Po 1 vai. inkubacijos tirpus fermentas prarado daugiau nei 90% savo aktyvumo. Priešingai, elastazės CLEC fermentinis aktyvumas nepakito po inkubacijos proteazės aplinkoje.
Esterazės CLEC įvertinimas
Šio išradimo būdas buvo panaudotas esterazės CLEC gamybai, buvo įvertintas gautų esterazės CLEC aktyvumas bei atsparumas egzogeninei proteolizei. Esterazės CLEC palyginimas su tirpia esteraze smulkiau aprašytas 4 pavyzdyje ir 7-8 pav. Įvertinimo rezultatai parodė:
1. Esterazės CLEC išlaikė apie 50% aktyvumo, lyginant su tirpiu fermentu.
2. Tirpi esterazė buvo labai jautri proteolitinei degradacijai. Tirpios esterazės aktyvumas sumažėjo iki 50% inkubacijos inkubacijos pradinio aktyvumo po proteazės aplinkoje, tirpus fermentas prarado minučių Po 1 vai. daugiau nei
90% savo aktyvumo. Priešingai, fermentinis aktyvumas nepakito proteazės aplinkoje.
esterazės CLEC po inkubacijos
Lipazės CLEC įvertinimas
Šio išradimo būdas buvo panaudotas lipazės CLEC gamybai, ir buvo įvertintas gautų lipazės CLEC aktyvumas. Lipazės CLEC palyginimas su tirpia lipaze smulkiau aprašytas 5 pavyzdyje ir 9 pav. Įvertinimo rezultatai parodė, kad lipazės CLEC išlaiko apie 90% aktyvumo lyginant su tirpiu fermentu.
Lizocimo CLEC įvertinimas
Šio išradimo būdas buvo panaudotas lizocimo CLEC gamybai ir buvo įvertintas gautų lizocimo CLEC aktyvumas ir atsparumas egzogeninei proteolizei. Lizocimo CLEC palyginimas su tirpiu lizocimu smulkiau aprašytas 6 pavyzdyje ir 10 pav. Įvertinimo rezultatai parodė, kad lizocimo CLEC išlaiko apie 50% aktyvumo lyginant su tirpiu fermentu.
Asparaginazės CLEC įvertinimas
Šio išradimo būdas buvo panaudotas asparaginazės CLEC gamybai ir buvo įvertintas gautų asparaginazės CLEC aktyvumas. Asparaginazės CLEC palyginimas su tirpia asparaginaze smulkiau aprašytas 7 pavyzdyje ir 11 pav. Įvertinimo rezultatai parodė, kad asparaginazės CLEC išlaiko apie 77% aktyvumo lyginant su tirpiu fermentu.
Bendras CLEC panaudojimas
Kaip čia atskleista, CLEC atstovauja naujai technologijai, kuri gali būti plačiai taikoma daugelyje sričių, tame tarpe, bet ne tik jose, pramoninio masto sintezėje, laboratorinėse metodikose, biosensoriuose, medicininiuose pritaikymuose. 2-5 lentelėse pateikti pavyzdžiai įvairių sistemų, kurios savo veikloje naudojo tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus.
Šios srities specialistas sugebėtų pritaikyti šias ir panašias sistemas prie CLEC technologijos, atskleistos šioje paraiškoje. Tam, kad tai pailiustruoti, konkretūs pavyzdžiai iš kiekvienos pateiktos kategorijos bus aptarti smulkiau.
lentelėje pateikti pavyzdžiai pramoninių procesų, kuriuose naudojami tradiciniais būdais imobilizuoti fermentai ir kuriuos lengvai galima adaptuoti čia aprašytai CLEC technologijai.
lentelė
Fermentai Produkcija arba pritaikymas Substratai Literatūra (tame tarpe ir cituota)
termoli- zinas aspartamo pirmtakas Z-Asp, L-Phe-OMe Oyama ir kt., J. Org. Chem. 46: 5242- 5244 (1981) Nakanishi ir kt., Trends in Biotechnology 3: 459- 464 (1985)
subtili- zinas aspartamas L-Asp-L-Phe, OMe Davino, A.A., US Patent 4293648 (1981)
lipazė kokoso aliejaus pakaitalas palmių aliejus Harwood, J., Trends in Biochemical Sciences 14: 125-126 (1989) Macrae, A.R., J. Am. Oil Chem Soc. 60: 291-294 (1983)
nitril- hidratazė, nitrilazė, amidazė akrilamidas akrilonitrilas Nagasawa, T. and Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)
lentelė, tęsinys
Fermentai Produkcija arba pritaikymas Substratai Literatūra (tame tarpe ir cituota)
aminoaci- amino rūgščių N-acil-D,L amino Schmidt-Kastner, G. &
lazė atskyrimas rūgštys D, L Egerer, P. in
(grybų) amino rūgščių Biotechnology vol 6a:
amino esteriai 387-421 (1984) ir ten
rūgščių esterazė, esančios nuorodos
subtili- D, L amino Fusee, M.C., Methods in
žinąs rūgščių amidai Enzymology 136:
amidazės hidantoinai 463 (1987)
hidantio- a-hidroksikar-
nazės tam boksilinės
tikros rūgštys
dehidro-
genazės
amino
peptidazė
transami-
nazė
amino amino rūgščių keto ir hidroksi Rozzell, J.D., Methods
rūgščių gamyba: bendra rūgštys in Enzymology 136:
dehidroge- 479 (1987)
nazė +
formiat- amino rūgščių Enzymes in Industry; Ed
dehidro- gamyba: Gerhartz, W., VCH Press
genazė konkreti 1990
L-aspartazė L-asparagino fumaratai/
rūgštis fumarinė rūgštis
L-aspartat L-alanino rūgštis L-asparagino
4 dekar- rūgštis, amonio
boksilazė fumaratas
aspartazė
+ L-aspar-
tat 4
lentelė, tęsinys
Fermentai Produkcija arba pritaikymas Substratai Literatūra (tame tarpe ir cituota)
dekarboksi lazė ACL hidrolazė L-ACT L-lizinas D,L-a amino e- kaprolaktamas (ACL)
hidrolazė L-cisteinas L-isoleucinas L-metioninas D,L-2amino 2- tiazolin-4- karboksilinė rūgštis
liazė L- L-fenilalaninas cinamono
triptofano L-triptofanas rūgšties druskos
sintetazė L-valinas indolas, L- serinas
fumarazė L-obuolių fumaratai 5p-
hidantoi- rūgštis D n hidroksi
nazė karbamoil p- hidroksi-fenilo glicinas hidantoinas
lipazės, racematų sintetiniai Jonės, J.B., Tetrahedron
esterazės atskyrimas cheminiai 42: 3351-3403 (1988)
naudojant stereoselekty- vią sintezę junginiai Butt, S. and Roberts, S.M. Natūrai Product Reports 489-503 (1986), ir jame esančios nuorodos, išsamesnei šios srities apžvalgai.
fumarazė L-obuolių rūgštis fumaro rūgštis Chibata ir kt., Methods in Enzymology 136: 455 (1987)
lentelė, tęsinys
Fermentai Produkcija arba pritaikymas Substratai Literatūra (tame tarpe ir cituota)
laktazė, β-galakt- ozidazės disacharidų sintezė, pvz.: galaktozil-N- acetilo galaktozaminas laktozė & N- acetilo galaktozaminas Larsson ir kt., Methods in Enzymolgy 136: 230 (1987)
lipazė, esterazė L-mentolas mišinys 4 izomerų Fukui, S., Tanaka, A., Methods in Enzymology 136: 293 (1987)
amidazės D-valinas (piretridinių insekticidų tarpininkas) D, L amino rūgščių amidai Schmidt-Kastner, G. & Egerer, P. in Biotechnology vol 6a: 387-421 (1984) ir ten esančios nuorodos
lipazė (Candida cylindri- cea) R(+)2 fenoksi- propiono rūgštys (herbicidai) 2 chloro propiono rūgštys Biocatalysts in Organic Synthesis ads Tramper, van de Plas & Linko; Proceedings of International Symposium in Netherlands 1985
lipazės, esterazės, amidazės, aldolazės, proteazės, peptidazės, mielių lipazė organinė sintezė monogliceridai peptidai 2(p-chlorofe- noksi) propiono rūgštis: herbicidas atskyrimas raceminių esterių Jonės, J.B., Tetrahedron 42: 3351-3403 (1988) Butt, S. and Roberts, S.M. Natūrai Product Reports 489-503 (1986), ir jame esančios nuorodos, išsamesnei šios srities apžvalgai.
strikto- dinsinte- tazė alkaloidų gamyba pvz. striktozidinas Pfitzner ir kt., Methods in Enzymology 136: 342 (1987)
lentelė, tęsinys
Fermentai Produkcija arba pritaikymas Substratai Literatūra (tame tarpe ir cituota)
penicilino acilazė penicilino amidazė 6-amino penicilinano rūgštis ir 7- ADCA penicilinas G arba V Enz Eng 6: 291 (1982) Enz Eng 8: 155
hidroksi- steroidų dehidro- genazė steroidų transformacijos Carrea ir kt., Methods in Enzymology 136: 150 (1987)
5’ fosfo- diesterazė, nukleazės esterazė 5’-ribonukleo- tidai β-laktamo pirmtakas (chirali- niai mono esteriai, pvz. β amino glutaro rūgšties mono- alkilinis esteris) atitinkami diesteriai Keller ir kt., Methods in Enzymology 136: 517 (1987) Japonų patentinė paraiška: 82- 159493 (1981) Biseibutsu Company
lipazės β-blokatoriai Kloosterman, M ir kt., Trends in Biotechnology 6: 251-256 (1988)
Akrilamido gamyba, panaudojant CLEC technologiją
Žemiau aprašytas venas iš šio išradimo būdo panaudojimų: pritaikymas akrilamido gamybos, naudojančios imobilizuotas ląsteles, kurios duoda fermento nitrilo hidratazės perprodukciją (Nagasawa, T. and Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)), prie anksčiau šiame aprašyme atskleistos CLEC technologijos.
Akrilamido, svarbaus ir plačiai vartojamo chemikalo, pramoninio masto gamybą aprašė Yamada ir bendradarbiai (Nagasawa, T. and Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153-158 (1989)). Cheminiuose reaktoriuose, užpildomuose imobilizuotomis ląstelėmis, kurios parinktos kaip fermento nitrilo hidratazės perproduktoriai, per metus pagaminama tūkstančiai tonų akrilamido. Nitrilo hidratazė, kaip skelbta literatūroje, buvo išvalyta ir kristalizuota iš dviejų šaltinių, Brevibacterium R312 (Nagasawa et. ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 139: 1305-1312 (1986) ir P. chlororaphis B23 (Nagasawa et. ai., Eur. J. Biochem. 162: 691-698 (1987)). Kaip čia atskleista, šie kristaliniai fermentai gali būti imobilizuoti, panaudojant susiuvimą su glutaraldehidu ar kitu tinkamu susiuvimui reagentu ir gauti jų CLEC. Po to, nitrilo hidratazės CLEC galima naudoti tradiciniuose reaktoriuose vietoj šiuo metu naudojamų imobilizuotų ląstelių. Šio proceso pritaikymas prie CLEC technologijos duoda tiesioginius privalumus. Tarp jų, sumažėjusį gamyklos dydį ir geresnę išeigą, dėka padidėjusio aktyvumo tūrio vienete, dėl didesnės fermento koncentracijos CLEC viduje ir pagerinto substrato ir produkto difuzijos greičio; nepageidautino užteršimo ir šalutinių reakcijų sumažėjimą, dėl didesnio CLEC grynumo; ir mažesnį jautrumą mikrobiniam užteršimui, kadangi nėra ląstelių. Be to, yra ir kitų, tik fermentiniais CLEC pagrįstam būdui būdingų, privalumų. Tarp jų, aukštesnė darbo temperatūra, padidinanti reakcijos greitį; galimybės dirbti vandeniniuose, organiniuose ir beveik bevandeniuose tirpikliuose, kas leidžia optimizuoti akrilamido gamybos reakciją; ir ilgesnis darbo ir saugojimo pusperiodis, išplaukiantis iš didesnio cheminio ir mechaninio CLEC stabilumo, ypač netradiciniuose tirpikliuose.
CLEC technologijos pritaikymai medicinoje - ekstrakorporalinis gydymas
Šio išradimo būdas ir atitinkamai parinktas CLEC ar jų rinkinys taip pat gali būti panaudotas medicininiuose taikymuose. Pavyzdžiui, CLEC arba CLEC rinkinys gali būti panaudotas komponento pašalinimui iš skysčio, tokio kaip kraujas, paprastai jį pakeičiant, tuo pačiu paverčiant jį į medžiagą, nežalingą pacientui, arba medžiagą, kurią gali pašalinti normalūs organizmo procesai (pvz., per detoksikacją ar suskaidymą kepenyse ar išskyrimą per inkstus). Šiame pritaikyme, sudaromas kontaktas tarp atitinkamai parinkto fermentinio CLEC ar jų rinkinio ir audinių skysčio, turinčio komponentą, kurį reikia pakeisti, arba reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, reaktantą (produktų ar substratą), kurį veikia CLEC fermentas. To pasėkoje, fermentas gali paveikti komponentą, kurį reikia pakeisti, arba kitą medžiagą, esančią reakcijos, kurioje dalyvauja toks komponentas, produktu. Fermento aktyvumo dėka tiesiogiai pakeičiamas pats šalinamasis komponentas arba reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, produktas (tuo būdu sustabdomas tolimesnis reakcijos vyksmas) . Tai galima padaryti panaudojant ekstrakorporalinį (išorinį kūno atžvilgiu) prietaisą, kuriame yra specialiai parinktas CLEC ar jų rinkinys ir turintį priemones jų išlaikymui, kurios arba padarytos iš akytos medžiagos, išlaikančios CLEC, arba yra vamzdis, kuriame laikomi CLEC, ir kuris pasirūpina kontaktu tarp pačio norimo pakeisti komponento ar medžiagos, esančios reakcijos, kurioje toks komponentas dalyvauja, produktu.
Taip pat, tai galima atlikti, įvedant parinktą CLEC į tinkamą kūno ertmę, tokią kaip pilvaplėvę ar limfinį mazgą, kurioje CLEC gali susisiekti su audinių skysčiu. Šį įvedimą galima atlikti chirurginiu būdu arba atliekant CLEC suspensijos injekciją. Tiesioginė CLEC injekcija į kraują nepriimtina dėl didžiulės embolijos (kraujagyslių užsikimšimo) rizikos.
Atitinkamų CLEC panaudojimas šioje srityje gali pakeisti genetinius būdus, naudojamus fermentų pakeitimo terapijoje, koreguojant įgimtus nepakankamumus, tokius kaip fenilketonurija.
3 lentelėje pateiktos kai kurios medicininės sitys, kuriose gali būti panaudoti CLEC. Daugumoje šių atvejų ekstrakorporalinis gydymas yra tiktai tyrimo stadijoje, bet pranašumai būdingi fermentiniams CLEC gali pateikti naujus gydymo būdus tokiose srityse, kuriose anksčiau nebuvo alternatyvaus gydymo.
lentelė
Naudoj amas fermentas Pašalinimas: Gydoma liga/pacientai Literatūra
asparaginazė asparaginas leukemija (pašalinant asparaginą, svarbią vėžiui maistinę medžiagą, pažeidžiamos leukemi- nės ląstelės, kurios nesugeba gaminti šios svarbios amino rūgšties; normalios ląstelės gali gaminti asparaginą ir todėl gydymo nepaveikiamos) Klein, M., Langer, R., Trends in Bio- technology 4: 179- 185 (1986) ir ten esančios nuorodos Chang, T.M.S., Methods in Enzymology 137: 444-457 (1987) ir ten esančios nuorodos
heparinazė heparinas hemoperfuzuoj amų pacientų deheparini- zacija, pvz., inkstų dializė Langer, R., ir kt., Science 217: 261- 263 (1982)
lentelė, tęsinys
Naudoj amas fermentas Pašalinimas: Gydoma liga/pacientai Literatūra
bilirubino oksidazė bilirubinas naujagimių geltligė Lavin, A., ir kt., Science 230: 543- 545 (1985)
karboksi- peptidazė metotreksa- tas chemoterapij os pacientai Pitt, A.M., ir kt. Appl. Biochem. Biotechnol. 8: 55- 68 (1983)
tirozinazė aromatinės amino rūgštys kepenų sutrikimas, pasireiškiantis nesveiku amino rūgščių pagausėjimu Chang, T.M.S., Sem. Liver Dis. Ser. 6: 148 (1986)
fenilalanino amonio liazė fenilala- ninas fenilketonuria ir kepenų sutrikimas Ambrus, C.M., ir kt., J. Pharm. & Exp. Ther. 224: 598- 602 (1983)
multifer- mentinė sistema apjungianti : ureazę, glu- tamato de- hidrogenazę, gliukozės dehidroge- nazę & transaminazę šlapalas (paverčiamas į glutamino ir kitas amino rūgštis, per amoni detoksikacija pacientų su chronišku inkstų nepakankamumu Chang, T.M.S., Methods in Enzymology 137: 444- 457 (1987) ir ten esančios nuorodos Chang, T.M.S., Enzyme Eng 5: 225 (1980)
arginazė argininas paveldima hiperargininemia Kanalas, J.J. ir kt., Biochem. Med. 27: 46-55 (1982)
glutamato dehidrogena- zė & amonis amonis kepenų sutrikimai Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1984)
Žemiau aprašytas konkretus šio būdo pritaikymas heparino liazės sistemoje, skirtoje heparino pašalinimui iš kraujo (Bernstein ir kt., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987)).
Kad išvengti kraujo sukrešėjimo, naudojant ekstrakorporalinius prietaisus per kuriuos teka kraujas, tokius kaip inkstų dializės, nepertraukiamo veikimo kraujo filtravimo prietaisai arba ekstrakorporaliniai mechaniniai membraniniai oksigenatoriai, būtinas heparino įvedimas pacientui. Tačiau, paciento heparinizacija sukelia hemoraginių komplikacijų ir sudaro pavojų žmogaus sveikatai. Šios problemos išauga ilgėjant perfuzijos laikui, pavyzdžiui membraninių oksigenatorių atveju, ir gali įvykti rimtas nukraujavimas. Po ekstrakorporalinės terapijos, hepariną galima pašalinti iš kraujo prietaisu, įtaisytu prie ekstrakorporalinio prietaiso išėjimo ir turinčiu heparinazės, kuris pašalina visą hepariną iš pacientui grąžinamo kraujo ir tuo būdu išvengiama šiuo metu esančių heparinizacijos problemų.
Publikuotose tyrimuose (Langer ir kt., Science 217: 261-263 (1982); Bernstein ir kiti., Methods in Enzymology 137: 515-529 (1987)), smulkiai aprašytos problemos kylančios panaudojant tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus ekstrakorporaliniuose įrenginiuose. Pagrindinė problema susijusi su blogu fermentinio aktyvumo tūrio vienetui išlaikymu naudojant tradicinius imobilizacijos būdus, dėl ko, tam, kad atlikti būtiną heparinizaciją, reikalingas didelis imobilizuoto fermento tūris. Šis tūris yra per daug didelis, kad jį galima būtų naudoti praktiniame žmonių gydyme. Tačiau, didelis aktyvumas tūrio vienete, kuris išlaikomas fermentiniuose CLEC, neturinčiuose inertinio nešiklio, apeina šią problemą ir pasiūlo praktinį žmogaus heparinizacijos problemos sprendimą. Padidintas
CLEC stabilumas sumažins fermentų disociaciją susiūtame kristale. Tuo jie yra pranašesni už mažiau stabilius tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus, nes bus sumažintas imuninis atsakas, sukeltas fermentų nuotėkio. Dėka CLEC temperatūrinio stabilumo neįvyksta fermentų denatūracija saugojimo metu dėl laikinos aukštos temperatūros, galima tikėtis, jog CLEC išlaikys aukštą aktyvumą saugant net prie kambario temperatūros. Be to CLEC bus pigiau ir patogiau naudoti, nei analogiškus fermentus, imobilizuotus tradiciniais būdais, kadangi jie turi ilgesnį darbo ir saugojimo laiką.
Papildomi CLEC technologijos pritaikymai: biosensoriai
CLEC arba jų rinkinys gali būti vartojami kaip dalis sensoriaus, čia vadinamu biosensoriu, kuris gali būti panaudotas aptikimui ir/arba kiekybiniam dominančios medžiagos (analito) įvertinimui įvairiuose tokiose terpėse (fluiduose), tokiose kaip organizmo skysčiai (pvz.: kraujas, šlapimas), chemijos pramonės ir laboratorinės reakcinės terpės, organinės terpės, vanduo, terpės, kuriose auginamos kultūros, ir gėrimai. Kai kuriais atvejais, dominančia takia terpe gali būti dujos, kaip pavyzdžiui iškvepiamo alkoholio analizatoriuje (Barzana, E., Klibanov, A., and Karell, M., NASA Tech Briefs 13: 104 (1989)). Šiame pritaikyme sudaromas kontaktas tarp atitinkamai parinkto CLEC ar jų rinkinio ir analizuojamos takios terpės, turinčios dominantį analitą. Ši medžiaga gali būti išmatuota tiesiogiai (pavyzdžiui, gliukozės kiekis kraujyje) arba netiesiogiai (pvz., aptinkant arba išmatuojant kiekybiškai junginį, kuris yra reaktantas (produktas arba substratas) reakcijoje, vykstančioje dalyvaujant dominančiam analitui). Bet kuriuo atveju CLEC gali paveikti analitą ar junginį, esantį reaktantu reakcijoje, kurioje taip pat dalyvauja analitas.
Veikiant fermentui gaunami pastebimi pokyčiai (pvz., pH pakitimai, šviesos arba šilumos išspinduliavimas, elektrinio potencialo pakitimai), kurie aptinkami ir/arba išmatuojami kiekybiškai atitinkamais matavimo prietaisais (pvz., pH elektrodu, prietaisu jautriu šviesai ar šilumai, priemonėmis matuojančiomis elektrinio potencialo pokyčius) (Janata, J., et ai., Anai. Chem. 62: 33R-44R (1990)). Gali būti panaudoti bet kokie prietaisai, sugebantys aptikti pakitimus, sukeltus fermentine katalize paremtu būdu. Šio išradimo biosensoriai sudaryti iš CLEC ar jų rinkinio ir priemonių, skirtų CLEC sulaikymui ir leidžiančių susidaryti kontaktui tarp CLEC ir dominančio analito arba junginio, esančio reaktantu reakcijoje, kurioje dalyvauja dominantis analitas.
lentelė
Naudojamas fermentas Aptikimas ko: Pritaikymas Literatūra
gliukozės oksidazė gliukozė diabetikai Daniles, B., Mossabach, K., Methods in Enzymo- logy 137: 4-7 (1987) Hali. E Biosensors Open University Press (1990) Taylor, R., Prooeed. Biotechnology Conference 1989; 275-287 Anthony ir kt., Biosensors, Fundamentais and Applications, Oxford University Press (1987)
kreatinino deiminazė kreati- ninas inkstų funkcijos Tabata, M., ir kt., Anai. Biochem. 134: 44 (1983)
lentelė, tęsinys
Naudoj amas fermentas Aptikimas ko: Pritaikymas Literatūra
ureazė šlapalas inkstų funkcijos Hsuie, G.H. ir kt., Polym. Mater. Sci. Eng. 57: 825-829 (1987) Kobos, ir kt., Anai. Chem. 60: 1996-1998 (1988)
laktato oksidazė & dehidroge- nazė laktatas klinikiniai taikymai Blaedel, W.J. & Jenkins, R.A., Anai. Chem. 48(8): 1240 (1976) Sagaguchi, Y., ir kt., J. Appl. Biochem 3: 32 (1981)
gliukozės-6- piruvato dehidroge- nazė gliukozės- 6-fosfatas, sacharozė ir ATF diabetikai ir kiti medicininiai taikymai ten pat kur apie gliukozės oksidazę
alkoholde- hidrogenazė, alkoholio oksidazė etanolis & kiti alkoholiai acto, skruzdžių rūgštys iškvepiamo oro analizatoriai ir pramoniniai taikymai Romette, J.L. ir kt., Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987) Ho, M.H., Methods in Enzymology 137: 271- 288 (1987)
β-frukto- zidazė sacharozė pramoniniai taikymai Romette, J.L. ir kt., Methods in Enzymology 137: 217-225 (1987)
cholesterino oksidazė cholesteri- nas cholesterino tikrinimas Satoh, I., Methods in Enzymology 137: 217- 225 (1987)
katalazė šlapimo rūgštis, choles- terinas aterosklerozė ir kiti medicininiai taikymai Saton, I., Methods in Enzymology 137: 217- 225 (1987)
karboksipep- tidazė metotrek- satas vėžys ten pat kur apie gliukozės oksidazę
lentelė, tęsinys
Naudoj amas fermentas Aptikimas ko: Pritaikymas Literatūra
anglies anhidrazė anglies dvideginis pramoniniai, laboratoriniai & aplinkos saugojimo ten pat kur apie gliukozės oksidazę
L-amino rūgšties oksidazė amino rūgštys medicininiai ir pramoniniai taikymai ten pat kur apie gliukozės oksidazę
β-laktamazė penicilinazė penicili- nas medicininiai taikymai Anzai ir kt., Bull. Chem. Soc. Jpn. 60: 4133-4137 (1988)
šarmų fosfatazė fosfatai metabolitų kontrolė ten pat kur apie gliukozės oksidazę
nitratų/ nitritų reduktazė nitratai & nitritai metabolitų ir maisto kontrolė ten pat kur apie gliukozės oksidazę
arilsulfa- tazė sulfatai metabolitų kontrolė ten pat kur apie gliukozės oksidazę
sukcinatde- hidrogenazė sukcinatai pramoniniai taikymai ten pat kur apie gliukozės oksidazę
bakterinė liuciferazė FMNH2 ir susietos reakcijos aptikimas iki 1018 M EMNH2 kiekio matuojant fotonų išspinduliavimą Wannlund J., ir kt., Luminescent assays: Perspectives in endocrino- logy and clinical chemis- try; Eds Šerio, M. and Pazzagli, M. 1: 125 (1982) Kurkijarvi ir kt., Methods in Enzymology 137: 171- 181 (1987)
skraidančių jonvabalių liuciferazė ATF ir susietos reakcijos aptikimas iki 10'12 M ATF kiekio matuojant fotonų išspinduliavimą Kurkijarvi ir kt., Methods in Enzymology 137: 171-181 (1987) Murachi ir kt., Methods in Enzymology 137: 260- 271 (1988)
lentelėje pateikti kai kurie biosensoriniai pritaikymai, kuriuose gali būti panaudoti CLEC. Šiuo metu tuose taikymuose naudojami imobilizuoti fermentai, bet susiduriama su sunkumais dėl žemo stabilumo, mažo fermentų tankio, trumpo išgyvenimo periodo ir blogo pasikartojamumo. Pateiktus pavyzdžius lengvai galima pritaikyti prie čia atskleistos CLEC technologijos.
Šio išradimo būde, kai jis naudojamas pavyzdžių analizėje kaip biosensorius, ypatingai svarbu gauti didžiausią signalą, kurį galima defektuoti, naudojant kaip galima mažesnį kiekį substrato ir katalizatoriaus. Šiuo požiūriu, čia atskleista CLEC technologija ypatingai patraukli, kadangi ji pasiekia maksimaliai galimą fermentinio katalizatoriaus koncentraciją duotame tūryj e.
Dažnai dedamos didžiulės pastangos tam, kad sujungti, tiesiogiai ar per tinkamą tarpininką, dominančią galutinę fermentinę reakciją su fermentų, tokių kaip liuciferazė, šviesos išspinduliavimu (Kurkijarvi ir kt., Methods in Enzymology 137: 171-181 (1988)). Tai daroma tam, kad pasinaudoti neparaleliu jautrumu ir efektyvumu prietaisų, skaičiuojančių fotonus, kurie prie atitinkamų sąlygų leidžia aptikti femtomolines fermentinės reakcijos produkto koncentracijas. Pagal šį principą buvo sukurtos biosensorinės sistemos, naudojančios tradiciniais būdais imobilizuotus fermentus ir skirtos aptikimui įvairių substratų, įdomių klinikiniuose ir kituose taikymuose. Šviesą išspinduliuojančios reakcijos buvo sujungtos su mėginių reakcijomis, aptikimui tokių substratų kaip D-gliukozė, L-laktatas, L-glutamatas ir etanolis, bei eilės kitų, prie ypatingai žemų substrato koncentracijų.
Kas dėl šio taikymo, tai fermentas liuciferazė iš Vibrio harveyii, kaip aprašyta, buvo kristalizuotas (Swanson ir kt., J. Biol. Chem. 260: 1287-1289 (1985)). Šios liuciferazės kristalai gali būti susiūti, naudojant glutaraldehidą ar kitą tinkamą reagentą, tam, kad suformuoti liuciferazės CLEC. Biosensoriniams ir analitiniams pritaikymams, liuciferazės CLEC turi daug pranašumų, lyginant su tradiciniais būdais imobilizuotais fermentais. CLEC atveju, visas liuciferazės CLEC tūris sudarytas iš šviesą spinduliuojančių fermentų. Tuo tarpu sistemoje su tradiciniais būdais imobilizuotu fermentu net 95% viso tūrio užima inertinė nešiklio medžiaga, kuri greičiau veikia kaip fermentų išspinduliuotos šviesos absorbuotojas. Be to, padidintas CLEC stabilumas turėtų supaprastinti saugojimą kambario temperatūroje ir, taip pat, įgalinti naujus sensorinius pritaikymus agresyviose aplinkose ir pakeltose temperatūrose.
Papildomi CLEC technologijos pritaikymai laboratorinės reakcijos
CLEC galima naudoti kaip laboratorinius reagentus mažose kolonose arba cikliniuose procesuose, vartojamuose laboratorinių reakcijų vykdyme. Kai kurios iš platesnių, reakcijų kategorijų pateiktos 5 lentelėje.
lentelė
Naudojamas fermentas Katalizuojamos reakcijos tipas Literatūra
lipazės, fosfolipazės Stereoselektyvi sintezė: tame tarpe esterifikacija, trans- esterifikacija, amino- lizė, laktonizacijos, polikondensacij os, acilinimas, oksimolizė ir raceminių mišinių išskyrimas Zaks, A. & Klibanov, A.M. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82: 3192-3196 (1986) Klibanov, A.M. Acc. Chem. Res. 23: 114-120 (1990) ir nuorodos jame Wong. C. H., Chemtracts-Organic Chemistry 3: 91- 111 (1990) ir nuorodos jame
esterazės Stereoselektyvi sintezė ir išskyrimas Kobayashi ir kt., Tetrahedron Letters Vol 25, #24: 2557-2560 (1984) Schneider ir kt., Agnew. Chem. Int. Ed. Engi. 23 (#1): 64-68 (1984)
tirozinazė fenolų oksidacija chinonų gamybai Kazandjian, R.Z. ir Klibanov, A.M. J. Am. Chem. Soc 110: 584- 589 (1986)
proteazės, pvz., subtilizinas stereoselektyvus karbohidratų acilinimas Riva ir kt., J. Am. Cem. Soc. 110: 584-589 (1988)
oksidazės selektyvi hidrokarbonatų oksidacija Klibanov, A.M. Acc. Chem. Res. 23: 114-120 (1990) ir nuorodos jame
kiti fermentai, nereikalauj antys kofaktorių: izome- razės, liazės, aldolazės, glikozil- transferazės, gli- kozidazės Stereoselektyvi sintezė Wong. C.H., Chemtracts- Organik Chemistry 3: 91-111 (1990) ir nuorodos jame
lentelė, tęsinys
Naudojamas fermentas Katalizuoj amos reakcijos tipas Literatūra
kiti fermentai, nereikalauj antys pridėtų kofak- torių: flavofer- mentai, piri- doksal-fosfatiniai fermentai, metalo fermentai Stereoselektyvi sintezė Wong. C.H., Chemtracts- Organik Chemistry 3: 91-111 (1990) ir nuorodos jame
fermentai, reikalaujantys kofaktorių: kinazės (ATF), oksidore- duktazės (NAD/F), metiltrasferazės (SAM), CoA-reika- laujantys fermentai, sulfurazės (PAPS) Stereoselektyvi sintezė Wong. C.H., Chemtracts- Organik Chemistry 3: 91-111 (1990) ir nuorodos jame
Šneideris ir kt. (Agnew. Chem. Int. Ed. Engi. 23 (No. 1): 64-68 (1984)) iliustruoja, kaip galima panaudoti fermentus organinės sintezės procesuose. Kiaulės kepenų esterazė naudota transformuojant mezoesterį į chiralinį mono-esterį vandeniniame fosfato buferyje.
Reakcijų, katalizuojamų CLEC pagalba, naudojimo laboratorijoje pranašumas yra trigubas. Pirma, CLEC išlaiko didelį aktyvumą agresyviose aplinkose (pvz., vandeniniuose, organiniuose, beveik bevandeniuose tirpikliuose ir jų mišiniuose bei aukštoje temperatūroje), kurios yra būdingos cheminės sintezės laboratoriniams bandymams. Antra, CLEC yra labai stabilus darbo ir saugojimo metu, o tai svarbu nuolat pertraukiamiems laboratoriniams bandymams. Trečia, didelis CLEC aktyvumas tūrio vienetui leidžia sutrumpinti reakcijos laiką ir sumažinti būtiną fermento kiekį (aktyvumo vienetui). Taigi, pranašumai, kuriuos turi CLECfermentai, lyginant su laisvais arba imobilizuotais fermentais, duoda chemikams-organikams alternatyvų, labai selektyvų, sintetinimo instrumentą.
Visuose minėtuose pavyzdžiuose, ir ne tik juose, šitos srities specialistas gali pritaikyti šio išradimo būdą tam, kad panaudoti atitinkamą CLEC fermentą procese, kuriame buvo naudojamas fermentinis katalizatorius, imobilizuotas tradiciniu būdu. CLEC ne tik gali pakeisti fermentus, imobilizuotus tradiciniais būdais, bet taip pat gali būti panaudojami transformacijose, kurios buvo vykdomos ląstelių pagalba. Toliau šis išradimas bus iliustruojamas žemiau pateiktais pavyzdžiais, kuriais jokiu būdu nesiekiama susiaurinti išradimo apimtį.
pavyzdys
Termolizino kristalizavimas ir skersinis susiuvimas aspartamo pirmtako, Z-Asp-Phe-OMe, sintezei.
Kristalizacij a
250 mg termolizino Bacillus thermoproteolyticus, pirkto iš Boehringer-Mannheim GmbH kompanijos, ištirpinta 4ml 45% dimetilsulfoksido (DMSO) ir 55% l,40M kalcio acetato, 0,50M natrio kakodilato, esant pH 6,5. Šios pradinės sąlygos analogiškos aprašytoms Matthews ir kt. stambiųjų termolizino kristalų (difrakcinės kokybės) gamybai, (žr., pvz. Holmes ir Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623-639 (1982)). Po to baltymų tirpalas koncentruojamas iki 1 ml mikrokoncentratoriuj e CenLT 3366 B tricon-10 . Gera mikrokristalų išeiga buvo gauta staigios kristalizacijos būdu, pavaizduotu šiame aprašyme, pagal kurį Imi vandens arba l,40M kalcio acetato, 0,50M natrio kakodilato, esant pH 6,5, greitai įvesdavo į tą ar kitą DMSO - termolizino tirpalą, aprašytą anksčiau. Šiuo būdu gaunama daugybė maždaug vienodo dydžio (apie 10-1 mm ilgio) heksagonalinių mikrokristalų.
Termolizino mikrokristalų susiuvimas
Procedūros, atliktos šiame konkrečiame pavyzdyje pagal išradimą, yra pritaikymas protokolo, aprašyto Nakanishi ir kt. (Biotechnology 3: 459-464 (1985)), pagal kurį termolizinas pradžioje adsorbuotas ant granuliuoto nešiklio, sudaryto iš jonitinės dervos Amberlite XAD-7, o po to imobilizuotas susiuvant jį glutaraldehidu (Quicho ir Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 52: 833-839 (1964). Šiame pavyzdyje gautieji termolizino mikrokristalai centrifūguojami ir nusodinami, o supernatantas išpilamas. Po to prie mikrokristalų pridedama 5 ml 17,5% techninio glutaraldehido 2,5% DMSO, 0,05M kalcio acetato ir 0,025M natrio kakodilato, esant pH 6,5. Mišinys inkubuotas 4 valandas 37°C temperatūroje lengvai maišant. Skersinio susiuvimo reakcija nutraukiama pakartotinai praplaunant kristalus 10 ml vandens mėginiais glutaraldehido tirpalo pašalinimui. Praplauti susiūti termolizino kristalai ir sudaro tą termolizino CLEC, kuris toliau naudojamas kaip katalizatorius.
Z-Asp-Phe-QMe sintezė vandeniniame tirpale
5ml termolizino CLEC suspensijos pridedama į ciklinį reaktorių su nuolatiniu maišymu, inkubuojama 37°C temperatūroje. Centrifūgavus ir dekantavus supernatantą, prie CLEC pridedamas vandeninis reakcinis mišinys. Šis tirpalas gaunamas sumaišant 80 mg Z-L-Asp ir 80 mg L-Phe-OMe-HCl 1 ml vandens; kad būtų pH 7,0 pridedama acto rūgšties. Pavyzdžiai analizuoti HPLC pagalba. 6 lentelėje pateikti substrato Z-L-Asp-HPLC pikų aukščiai po nurodyto reakcijos laiko, normalizuoti iki 1, esant laikui t=0. Kadangi Z-L-Asp apriboja šios reakcijos greitį, tai šios medžiagos kiekio sumažėjimo matavimas yra ekvivalentiškas matavimui atsiradusio produkto Z-L-Asp-L-Phe-OMe (Nakanishi et ai. Biotechnology 3: 459-464 (1985)). Be dar nesureagavusio ribojančio substrato Z-L-Asp normalizuotų HPLC pikų aukščių, 6 lentelėje taip pat pateiktas reakcijos užbaigtumo lygio įvertinimas. Aišku, kad reakcija pasiekia 20% užbaigtumo lygį per pirmąsias 30 sekundžių ir išeina į plato. Šie rezultatai atitinka Nakanishi ir kt. stebėjimams (Biotechnology 3: 459-464 (1985)), gautiems panaudojus termoliziną, imobilizuotą tradiciniais būdais, vandenėje reakcinėje terpėje, analogiškoje aukščiau minėtai, ir gali būti paaiškinti blogu produkto Z-L-Asp-L-Phe-OMe tirpumu vandenyje.
lentelė
Reakcijos trukmė (sek) Piko aukštis (normalizuotas) Užbaigtumo procentas
0 1.000
30 0.727 27.3%
60 0.857 14.3%
120 0.940 6.0%
180 0.797 20.3%
Z-Asp-Phe-OMe sintezė beveik bevandeniame tirpale ml termolizino CLEC suspensijos pridedama į periodinį reaktorių su nuolatiniu maišymu, inkubuojant 37°C. Po centrifugavimo ir supernatanto dekantavimo, prie CLEC pridedama beveik bevandenės organinės reakcinės terpės.
Šis tirpalas gaminamas sumaišant 80 mg Z-L-Asp ir 240 mg L-Phe-OMe 1 ml 99% etilacetato su 1% vandens. Pavyzdžiai analizuoti HPLC pagalba. 7 lentelėje pateikti substrato Z-L-Asp HPLC pikų aukščiai po nurodyto reakcijos laiko, normalizuoti iki 1, esant laikui t=0. Kadangi Z-L-Asp apriboja šios reakcijos greitį, tai šios medžiagos kiekio sumažėjimo matavimas yra ekvivalentiškas matavimui atsiradusio produkto Z-LAsp-L-Phe-OMe (Nakanishi ir kt. Biotechnology 3: 459464 (1985) ) . Be normalizuotų HPLC pikų aukščių, dar nesureagavusio ribojančio substrato Z-L-Asp, 7 lentelėje taip pat pateiktas reakcijos užbaigtumo lygio įvertinimas. Šiuo atveju, reakcija pasiekia 70% užbaigtumo lygį per pirmąsias 30 sekundžių ir išeina į plato. Šie rezultatai taip pat atitinka Nakanishi ir kt. stebėjimams (Biotechnology 3: 459-464 (1985)), gautiems panaudojus termoliziną, imobilizuotą tradiciniais būdais, beveik bevandenėje reakcinėje terpėje, ir yra aiškinami produkto sukeltu fermento inhibavimu.
lentelė
Reakcijos trukmė (sek) Piko aukštis (normalizuotas) Užbaigtumo procentas
0 1,000
30 0, 323 67,7%
60 0,314 68, 6%
120 0,305 69, 5%
180 0,272 72,8%
pavyzdys
Termolizino kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gautojo produkto charakteristikų įvertinimas
Termolizino kristalizacija
Termolizinas (Diawa Kasei K.K., Japonija) ištirpinamas lOmM kalcio acetato (Sigma), esant pH 10, iki 10% koncentracijos (svoris/tūris) . Tirpalo pH palaikomas 10,0 lygyje titruojant jį 2 M NaOH. Po pilno ištirpimo, baltymo tirpalas titruojamas 2M HC1 iki pH 8,0. Pridedama sauso kalcio acetato iki 1,2M. Po to iki 30% pridedama dimetilo sulfoksido (Sigma). Baltymas koncentruojamas iki 100 mg/ml ultrafiltracijos būdu Amikon maišomoje kameroje (membrana 10000 MWCO) . Po to koncentruotas fermentas buvo išdalintas į mėginius ir laikomas -70°C temperatūroje. Termolizinas kristalizuojamas pridedant 9 tūrius demineralizuoto vandens į 1 tūri, koncentruoto (100 mg/ml) baltyminio tirpalo. Tirpalas trumpai maišomas ir paliekamas per naktį kambario temperatūroje. Kristalai praplaunami su 10 tūrių 10 mM kalcio acetato pH 7,0 ir išskiriami centrifūguojant nedideliu greičiu (10 min. prie 1500 x G, Beckman GPR centrifūga).
Greitas vandens įpylimas į koncentruotą (100 mg/ml) termolizino tirpalą sukelia susidarymą kristalų, kurie tampa matomi po 10 min. mažu padidinimu. Šiuo būdu gaunamų kristalų dydis pasikartojančiai priklauso nuo galutinės baltymo koncentracijos. Esant 3 tūriams vandens ir vienam tūriui termolizino koncentrato (100 mg/ml) susidaro 0,5 mm ilgio heksagonalinės rentgenografinės kokybės kristalinės lazdelės, kurios atitinka kristalus, anksčiau aprašytus Colman ir kt. (Colman, P.M., Jansonius, J.N. ir Matthews, B.W., J.
Mol. Biol. 70: 701-724 (1972)), ką mes patvirtinome difrakcinės analizės pagalba. Įpylus 10 tūrių vandens į vieną koncentruoto baltymo tūrį, gaunamų kristalų ilgis sumažėja iki 0,05 mm. Šie mikrokristalai yra pranašesni naudojant CLEC, kadangi sumažėja difuzinės problemos, susijusios su kristalų dydžiu (žr. pvz. Quiocho, F.A. ir Richarde, F.M. Biochemistry 5: 4062-4076 (1967)).
Vienoje konkrečioje baltymų partijoje kristalų dydis išlaikomas pastovus. (Šiame tyrinėjime naudoti 0,0510 0,10 mm ilgio kristalai, siekiant palengvinti tikslų kristalų suspensijos matavimą pipete). Densitometrinis SDS-PAGE skanavimai parodė šešiakartį fermento išvalymą kristalizuojant, o tai žymiai padidina specifinį CLEC aktyvumą. Kristalizacija sąlygojo 20% sumažėjimą bendro
CLEC baltymo aktyvumo, palyginus su tirpiuoju termolizinu, ką parodė žemiau aprašyti spektrofotometriniai tyrimai skaldant dipeptidinį substratą furilakriloilglicil-L-leucino amidą (FAGLA).
Termolizino kristalų skersinis susiuvimas
Termolizino kristalų susiuvimas buvo atliekamas 3 vai. kambario temperatūroje 12,5% glutaraldehido (Sigma), 5% DMSO ir 50 mM Tris tirpale, esant pH 6,5. Susiūti kristalai tris kartus praplaunami demineralizuotu vandeniu ir išskiriami centrifūguoj ant nedideliu greičiu, kaip aprašyta termolizino kristalizavimo poskyryje. Fermento kristalų cheminis skersinis susiuvimas pakankamai stabilizuoja kristalinę gardelę ir kristalą sudarančias fermento molekules, kad CLEC būtų galima praktiškai naudoti terpėse, kurios kitaip nesuderinamos su fermento funkcionavimu. Tyrinėjant spektrofotometriškai (aprašyta žemiau) dipeptidinio substrato FAGLA skaldymą, nebuvo pastebėta skirtumų tarp susiūtų ir nesusiūtų kristalų fermentinių aktyvumų. Be to, susiuvimas stabilizuoja CLEC iki tokio lygio, kad jie gali būti liofilizuoti, išsaugant pilną po jų atstatymo vandeniniuose, mišriuose vandens-organiniuose ir 8 lentelėje. Nors baltymų specifinio fermentinį aktyvumą organiniuose ir tirpikliuose, kaip parodyta 1 pav.
kristalizacija sąlygojo CLEC aktyvumo sumažėjimą 30%, lyginant su tirpiu termolizinu, CLEC susiuvimas ir liofilizacij a vėliau nemažino jo specifinio aktyvumo.
lentelė - Termolizino aktyvumas
Absorbcija 345 nm
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 0, 0 0, 314 0,315
2 1,0 0,272 0,271
3 3,0 0,235 0,218
4 5,0 0,204 0,198
5 10,0 0,184 0,185
6 15, 0 0,183 0,184
Tirpaus termolizino ir jo CLEC fermentinis aktyvumas
Tirpiojo ir CLEC termolizino katalitinis aktyvumas buvo vertinamas (Feder, J. ir Schuck, J.M., Biochemistry 9: 2784-2791 (1970)) blokuoto dipeptidinio substrato furilakriloil-glicil-L-leucino amido (FAGLA) (Schweizerhall) hidrolizės pagalba. Amidinių ryšių nutraukimas matuotas registruojant spektrofotometriškai absorbavimo sumažėjimą 345 nm bangos ilgiui. Pradinė fermento koncentracija buvo 10 7 M pagal Bradford baltymų matavimo metodą ir densitometrinį dažytų Coomassie SDSPAGE gelių skanavimą (Pharmacia LKB UltroScan XL). CLEC fermentai tai atstatyti liofilizuoti susiūti termolizino kristalai. Tirpus fermentas tai termolizinas koncentruotas iki 100 mg/ml. Fermento pridėta prie 5 ml reakcinės terpės, turinčios substratą. Nurodytu laiku buvo imami vienodo dydžio reakcinio mišinio mėginiai ir matuojama jų absorbcija prie 345 nm. Prieš matuojant absorbciją, termolizino CLEC buvo atskiriamas nuo reakcinio mišinio trumpai centrifūguoj ant Absorbcija buvo greičio lygties (Beckman, mikrocentrifūga E) . aproksimuota pseudo pirmos eilės pagalba ir santykis kcat/Km buvo skaičiuojamas dalinant aproksimuotą reikšmę iš fermento koncentracijos (Multifit Apple Macintosh Computer,
Milton, Cambridge CB4 6WL, U.K. (1990)).
2.0 Curve Fitting for tha Day Computing P.O. Box 327,
Priklausomybė nuo pH ir stabilumas
Tirpaus termolizino ir jo CLEC optimalus pH ir stabilumas lygintas skaldant dipeptidinį substratą FAGLA. Rezultatai parodyti 2 pav. ir 9 lentelėje. Tiek tirpaus tiek ir kristalinio fermento maksimalus aktyvumas buvo prie pH 7. CLEC ir tirpus termolizinas, taip pat, turėjo panašų aktyvumą rūgštiniame diapazone ir varpo formos pH profilis gautas tirpaus fermento atveju puikiai sutapo su publikuotais duomenimis (Feder, J. ir Schuck, J.M., Biochemistry 9: 27842791 (1970)). Tačiau, šarminiame pH diapazone kristalinis fermentas išlaikė maksimalų aktyvumą iki pH 10, tuo tarpu tirpus fermentas turėjo 75% aktyvumo prie pH 8,5, ir tik 25% aktyvumo prie pH 9. Esant pH 9,6, tirpus fermentas buvo visiškai neaktyvus.
lentelė - Termolizino pH kreivė % nuo maksimalaus aktyvumo
PH CLEC Tirpus fermentas
1 5,0 10,25 5,17
2 5,5 9,75 6,07
3 6,0 52,50 39,10
4 6,5 85,00 74, 61
5 7,0 97,50 100,00
6 7,5 100,00 98, 65
7 8,0 97,50 82, 92
8 8,5 95, 00 71,91
9 9,0 96,25 24,72
10 9,5 95, 00 0, 00
11 10,0 90,00 0, 00
Stabilumas prie pakeltų temperatūrų
Vykdant cheminius procesus prie aukštesnės temperatūros, galima pasiekti didesnį reakcijos greitį ir mažesnį substrato ir produkto difuzijos laiką, kuriuos paprastai apriboja substrato ir produkto temperatūrinis stabilumas. Tačiau, naudojant fermentinę katalizę, praktinę ribą temperatūros, prie kurios gali vykti procesas, dažniausiai nustato fermentinio aktyvumo netekimas. Dėl padidinto stabilumo, CLEC išlaiko fermentinį aktyvumą prie daug aukštesnių temperatūrų nei tirpūs fermentai.
CLEC katalizatorių padidintas stabilumas žemoms temperatūroms supaprastina kasdienį ilgalaikį jų saugojimą. Pavyzdžiui, koncentruotus (>50mg/ml) tirpaus termolizino tirpalus reikėdavo laikyti prie -80°C, kad išsilaikytų jų maksimalus specifinis aktyvumas. Kambario temperatūroje aktyvumas paprastai buvo prarandamas per vieną dieną. Palyginimui, dehidratuotas termolizino CLEC paprastai gali būti laikomas ištisus mėnesius kambario temperatūroje be pastebimo aktyvumo pakitimo. Neatstatyti liofilizuoti termolizino CLEC atrodo išlieka gyvybingi neapibrėžtą laiką.
Termostabilumas ir atsparumas autolizei buvo pademonstruotas penkias dienas inkubuojant termolizino CLEC prie 65°C (3 pav. ir 10 lentelė). Termolizino CLEC išlaikė maksimalų aktyvumą po penkių dienų inkubacijos prie pakeltos temperatūros. Palyginimui, tirpus termolizinas prarado 50% savo pradinio aktyvumo tik po dviejų valandų inkubacijos, o po 24 valandų inkubacijos 65°C temperatūroje rodė vos pastebimą aktyvumą.
lentelė - Termolizino termostabilumas prie 65°C % nuo maksimalaus aktyvumo
Laikas (dienos) CLEC Tirpus fermentas
1 0,000 100,0 100,0
2 0,041 70,0
3 0,083 0, 96 50, 0
4 0,164 32,0
5 0,246 17, 0
6 0,410 97,0 10, 0
7 1, 000 101,0 2,0
8 2, 000 97, 0
9 3, 000 94,0
10 4, 000 96, 0
11 5, 000 92, 0
Tirpaus termolizino ir jo CLEC aktyvumas buvo matuojamas po inkubacijos prie 65°C. Tirpus termolizinas buvo inkubuojamas 10 mM kalcio acetate, 50 mM Tris, esant pH 7, 65°C vandens vonioje. Reakcinės terpės tūris užėmė 500 μΐ. Galutinė fermento koncentracija buvo 10 mg/ml. Vienodi mėginiai buvo imami po
0, 1, 2, 6, 10 ir 18 valandų. Pavyzdžiai buvo tiriami naudojant SDS-PAGE ir FAGLA skaldymą prie kambario temperatūros, kaip aprašyta aukščiau. Termolizino CLEC atveju, 250 μΐ kristalų suspensijos 10 mM kalcio acetate ir 50 mM Tris buvo inkubuojami 65°C vandens vonioje. Aktyvumas buvo tiriamas po 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 ir 120 valandų FAGLA skaldymo būdu.
Atsparumas egzogeninei proteolizei
Taip pat, buvo įvertintas termolizino CLEC atsparumas egzogeninių proteazių poveikiui. SDS-PAGE (elektroforezė natrio dodecilsulfato poliacrilamido gelyje) analizė rodo, kad komerciniai fermentai gali turėti žymų procentą priemaišų, kai kurios iš jų gali turėti proteolitinį aktyvumą pagrindinių fermentų rūšių atžvilgiu. Supakavus fermento molekules į kristalinę gardelę, galima tikėtis jog CLEC viduje fermento molekulės bus apsaugotos nuo proteolizės. Tam kad tai patikrinti, termolizino CLEC ir tirpaus termolizino preparatai buvo inkubuojami terpėje su streptokoko proteaze Pronaze®, nespecifine proteaze, galinčia suardyti daugumą baltymų iki laisvų amino rūgščių (Calbiochem 1990 Catalog, LaJolla, CA).
Tirpus termolizinas ir jo CLEC buvo inkubuojami 50 mM Tris su proteaze Pronaze® (Calbiochem), esant pH 7,5 prie 45°C. Pronazės® ir termolizino santykis buvo 1/40. Kad prislopinti termolizino autolizę ir išvengti pronazės suardymo dėl proteolitinio termolizino poveikio, prie tirpių fermentų reakcinės terpės buvo pridėtas EDTA su galutine 100 mM koncentracija (EDTA inhibuoja termolizino aktyvumą, bet nekeičia Pronaze® aktyvumo). Nurodytu laiku buvo imami reakcinio mišinio mėginiai ir spektrofotometriškai tiriamas jų aktyvumas, skaldant dipeptidinį substratą FAGLA. Kad pašalinti termolizino inhibavimą dėl EDTA, tirpių fermentų aktyvumo spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami 0,5 M kalcio acetato buferyje, esant pH 7, ir fermento koncentracija buvo padvigubinta. Susiūti kristaliniai fermentai buvo tiriami kaip aprašytai aukščiau.
Kaip matosi iš 4 pav. ir 11 lentelės, tirpus termolizinas greitai degradavo ir prarado visą aktyvumą po 90 minučių inkubavimo. Palyginimui CLEC aktyvumas nepasikeitė po keturių dienų inkubavimo proteazės aplinkoje. Šis beveik visiškas atsparumas proteolizei ypač domintų diagnostiniuose biosensorių taikymuose, kuriuose atitinkamas CLEC gali būti veikiamas kokteilio iš nežinomų, natūraliai egzistuojančių fermentų su proteolitiniu veikimu.
lentelė - Proteazinis atsparumas % nuo maksimalaus aktyvumo
Laikas (dienos) CLEC Tirpus fermentas Laikas (min)
1 0, 000 100, 0 100, 0 0, 000
2 0, 003 25, 0 5,000
3 0,010 17,5 15,000
4 0,021 9,5 30,000
5 0, 042 89,0 3,0 60,000
6 0,063 1,0 90,000
7 0, 084 101, 0 0,0
8 1,000 97,0
9 2, 000 99, 0
10 3, 000 98, 0
11 4, 000 96, 0
Stabilumas, esant organiniams tirpikliams
Tam, kad fermentai taptų idealiai priimtinais, gyvybingais pramoniniais katalizatoriais, jie turi sugebėti funkcionuoti, nereikalauti per didelio pakeitimo praktiškai nusistovėjusių aplinkų gamybiniuose procesuose. Konkrečiau, tai apimtų vandeninių, poliarizuotų, vandeninių-organinių tirpiklių bei jų mišinių naudojimą. Komerciniuose taikymuose, vandeninių-organinių tirpiklių mišiniai leidžia valdyti produkto susidarymą, pasinaudojant produktų ir substratų santykiniu tirpumu.
Tirpus termolizinas ir jo CLEC organiniuose tirpikliuose turi ryškiai skirtingą stabilumą (12 lentelė). Tirpaus fermento koncentracijos, kurias dar galima laikyti organiniame tirpiklyje, apribotos maksimalia 10 mg/ml koncentracija. Esant koncentracijoms didesnėms už šią reikšmę, termolizinas akimirksniu nusėsdavo, pridėjus organinį tirpiklį. Palyginimui, termolizino CLEC koncentracijos ribojamos tik kristalų užimamu tūriu. Tirpus termolizinas išlaikė didžiausią aktyvumą (75%) aktyvumą po inkubacijos acetone ir mažiausią (36%) - tetrahidrofurane. Po 1 vai. inkubacijos acetonitrile ir dioksane tirpus fermentas prarado apie 50% savo pradinio aktyvumo. Termolizino CLEC išlaikė daugiau nei 95% maksimalaus aktyvumo po inkubacijos visuose tirtuose organiniuose tirpikliuose.
lentelė % nuo maksimalaus aktyvumo
Tirpus fermentas CLEC
Acetonitrilas 42 102
Dioksanas 66 97
Acetonas 75 99
Tetrahidrofuranas 36 96
Stabilumas organiniuose tirpikliuose
Termolizino CLEC arba tirpaus termolizino preparatai buvo inkubuojami 50% (tūris/tūris) nurodytų tirpiklių tirpaluose 100 μΐ termolizino CLEC suspensijos (lOmg/ml) su 10 mM Tris, esant pH 7, supiltas į 0,5 drachmos talpos stiklinį buteliuką. Prie jo pridėtas toks pat tūris nurodyto organinio tirpiklio ir mišinys trumpai maišomas sukant. Dvidešimt μΐ tirpaus termolizino (lOOmg/ml) atskiesta 80 μΐ 0,015 M Tris buferiu, esant pH 7, kitame 0,5 drachmos talpos stikliniame buteliuke. Po to į fermentinį tirpalą pridėta 100 μΐ organinio tirpiklio ir trumpai maišoma sukant. CLEC ir tirpus fermentas buvo inkubuojami organinio tirpiklio aplinkoje vieną valandą prie 40°C. Po inkubacijos, fermentų aktyvumas buvo tiriamas dipeptidinio substrato FAGLA skaldymu, kaip aprašyta aukščiau.
Manoma, jog žemos vandens koncentracijos trukdo fermento molekulei išsivynioj ant pereiti į tarpines būsenas, jos denatūracijos metu. Fermentiniuose CLEC šiuos konformacinio judrumo apribojimus greičiau apsprendžia tarpmolekuliniai kontaktai ir skersiniai susiuvimai tarp kristalinę gardelę sudarančių fermento molekulių, nei beveik visiškas vandens nebuvimas terpėje. Todėl, fermentai, jei iš jų suformuoti CLEC, lengvai išlaiko vidutines vandens-organinio tirpiklio koncentracijas, kas anksčiau, dirbant su fermentais, nebuvo pastebėta (žr. 12 lentelė). Šis atradimas atveria fermentinės katalizės pritaikymui ištisas naujas cheminės sintezės sritis.
Tačiau, net beveik bevandeniuose organiniuose tirpikliuose įprastinis fermentų vartojimas buvo nelengvas dėl jų polinkio sudaryti blogų charakteristikų suspensijas, kurios linkusios granuliuotis, ir kitų agregacijos problemų. Dėl šių savybių plataus masto pramoniniuose procesuose tokie preparatai nepatrauklūs iš prigimties. Palyginimui, CLEC ir jo kristalinę gardelę sudarantys fermentai išlieka monodispersiniais visuose šiuose tirpikliuose.
Palyginimas su kitais imobilizacijos būdais
Literatūroje pasirodė keletas naudingų fermentų imobilizacijos būdų apžvalgų (Maugh, T.H., Science 223: 474-476 (1986); Tramper, J., Trends in Biotechnology 3: 45-50 (1985)). Tuose būduose, fermentai visada sudaro mažą dalį viso imobilizuotų dalelių tūrio, kurio pradinę dalį užimą inertinė nešiklio medžiaga. Nešiklis padidina vidutinį laisvą kelią tarp imobilizuotų fermentų dalelių išorės, skalaujamos tirpiklio, ir fermentų aktyvių centrų, tuo apsunkindamas difuzijos (Quiocho, F.A., ir Richards F.M., Biochemistry 5: 40624076 (1967)).
CLECL susiūta kristalinė matrica sudaro nuosavą pagrindą, atmesdama nešiklio būtinumą. Todėl CLEC fermento koncentracija yra artima teorinei tokio dydžio molekulių supakavimo ribai ir žymiai viršija tankius, pasiekiamus net koncentruotuose tirpaluose. Kadangi visas CLEC sudarytas iš aktyvaus fermento, tai minimizuojamas (žr. 1 pav.) reakcijos greičio sumažėjimas, susietas su difuzija ir stebimas tradiciniais metodais imobilizuotuose fermentuose, lyginant su fermentais, esančiais tirpale, nes CLEC atveju (lyginant su tradiciniais metodais imobilizuotų fermentų nešiklio dalelėmis) labai sumažėja vidutinis laisvas kelias, kurį reikia nueiti substratui tarp aktyvaus fermento ir laisvo tirpiklio. Ypač svarbu, jog CLEC sudarantis fermentas iš prigimties yra monodispersinis ir jį galima atstatyti atliekant su
CLEC dalelėmis tokias paprastas operacijas kaip filtravimą, centrifugavimą ir tirpiklio dekantavimą.
pavyzdys
Elastazės kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
Elastazės kristalizacija
Liofilizuota elastazė (Servą) iš kiaulės kasos liaukos kambario temperatūroje ištirpdoma 0,1 M natrio acetate prie pH 5 iki 5 mg/ml (svoris/tūris) koncentracijos. Lazdelių pavidalo elastazės kristalai pasirodo praėjus vienai minutei po pilno baltymo ištirpimo (solvacijos). Kristalizacijos tirpalas perkeliamas į 4°C temperatūrą ir kristalizacija užbaigiama per naktį. Kristalai išskiriami centrifuguojant, kaip aprašyta anksčiau.
Elastazės kristalų susiuvimas
200 μΐ elastazės kristalų pridedama prie 1,3 ml tirpalo, turinčio 5,77% glutaraldehido ir 1,5 M natrio acetato, esant pH 5. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas vieną valandą lengvai maišant (maišoma lėkštėje). Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 15 ml tūrio 0,2 M Tris, esant pH 8,0. Elastazės kristalai liofilizuojami kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Tirpios elastazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
Tirpios ir CLEC elastazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant substrato sukcinil-(Ala)3 p-nitroanilido (Bachem) hidrolizę [ Bief, et ai. Biochem. Med 11: 350-357 (1974)] (13 lentelė, 5 pav.). Skaldymas stebimas registruojant absorbavimo padidėjimą 400 nm bangos ilgiui. Pradinė substrato koncentracija buvo 2xl0’4. Fermento koncentracija buvo 2,8xl07 M. CLEC ir tirpus fermentai pridedami prie 5 ml reakcinio tūrio su substratu ir 0,2 M Tris, esant pH 8,0. Kaip aprašyta anksčiau, CLEC fermentas buvo pašalinamas iš reakcinio mišinio, prieš *
matuojant absorbciją.
13 lentelė
Absorbcija 400 nm
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 o o 0, 000 0,000
2 0,5 0,103 0,205
3 1,0 0,195 0,390
4 2,0 0,366 0, 672
5 3,0 0,523 0,923
6 4,0 0, 657 1,098
7 cn o 0,780 1,227
8 6,0 0,888 1,326
9 7,0 0, 974 1,393
10 10,0 1,170 1,512
11 15, 0 1,365 1,586
Atsparumas egzogeninei proteolizei
Elastazės CLEC atsparumas proteazių poveikiui matuotas tokiose pat sąlygose kaip ir termolizimo (2 pavyzdys). Po inkubacijos su proteaze, tirpaus ir CLEC fermento aktyvumas įvertintas hidrolizuojant nitroanilido substratą, kaip aprašyta aukščiau (14 lentelė ir 6 pav.).
lentelė - Elastazės atsparumas protealizei % nuo maksimalaus aktyvumo
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 0,0 1, 00 1,00
2 10,0 53, 0
3 20,0 32,0
4 30,0 101,0 18,0
5 45,0 11,0
6 60,0 102,0 00 o
7 120, 0 101, 0 3,0
8 180, 0 103,0 2,0
pavyzdys
Esterazės kristaiizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
Esterazės kristalizacija
Kaip čia parodyta, 30 mg/ml esterazės (Fluka) iš kiaulės kepenų amonio sulfato suspensijos kambario temperatūroje ištirpdoma 0,25 M kalcio acetato tirpalo prie pH 5,6. Esterazės kristalai pasirodo po kelių minučių, pridėjus kalcio acetato tirpalo. Kristalizacijos tirpalas paliekamas kambario temperatūroje ir kristalizacija užbaigiama per naktį. Kristalai išskiriami centrifūguoj ant, kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
Esterazės kristalų skersinis susiuvimas
Kaip čia parodyta, 300 μΐ esterazės kristalų pridedama į 5 ml tirpalo, turinčio 12,5% glutaraldehido ir 0,5 M natrio acetato, esant pH 5,5. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas vieną valandą lengvai maišant (maišoma lėkštėje). Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 15 ml tūrio 0,5 M kalcio acetatu, esant pH 6,3. Esterazės kristalai liofilizuojami kaip aprašyta aukščiau 2 pavyzdyje.
Tirpios esterazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
Tirpios ir CLEC esterazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant substrato pnitrofenilo acetato (FLUKA) hidrolizę (15 lentelė ir 7 pav.). Skaldymas stebimas registruojant absorbavimo padidėjimą 400 nm bangos ilgiui. Pradinė substrato koncentracija buvo 0,001%. Pradinė fermento koncentracija buvo 1x1O’8 M. CLEC ir tirpūs fermentai pridedami prie 5 ml reakcinio trio su substratu 0,25 M kalcio acetatu, esant pH 6,3. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, esterazės CLEC centrifuguojant pašalinamas iš reakcinio mišinio, prieš matuojant absorbciją.
lentelė - Esterazės aktyvumas
Absorbcija 400 nm
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 0, 0 0,000 0, 000
2 0,5 0,770 0,252
3 1,0 0, 128 0,297
4 2,0 0,208 0,337
5 3, 0 0,260 0, 346
6 5, 0 0, 324 0, 353
7 7,0 0,353 0,359
8 10, 0 0, 369 0,368
Atsparumas egzogeninei proteolizei
Esterazės CLEC atsparumas proteazių poveikiui taip pat matuotas tokiose pat sąlygose kaip ir termolizino (2 pavyzdys). Po inkubacijos su proteaze, tirpaus ir CLEC fermento aktyvumas įvertintas skaidant substratą, p-nitrofenilo acetatą, kaip aprašyta aukščiau (16 lentelė ir 8 pav.).
lentelė - Esterazės atsparumas proteolizei % nuo maksimalaus aktyvumo
Laikas CLEC Tirpus fermentas
1 i o o 100,0 100,0
2 10, 0 68,0
3 20, 0 47, 0
4 30, 0 99, 0 25,0
5 45,0 20,0
6 60,0 97,0 16,0
7 120, 0 94, 0 10, 0
8 180,0 91, 0 6, 0
pavyzdys
Lipazės kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
Lipazės kristalizacija
Kaip čia atskleista, fermentas lipazė (Geotrichum candidum) kristalizuotas, difunduojant garams iš vandeninio 20 mg/ml baltymo tirpalo su 50 mM Tris prie pH 5,6, turinčio 8% amonio sulfato. Bipiramidiniai kristalai pasirodo po 20-30 dienų inkubacijos kambario temperatūroje. Kristalai išskiriami centrifuguojant, kaip anksčiau aprašyta 2 pavyzdyje.
Lipazės kristalų skersinis susiuvimas
Kaip čia atskleista kristalai įdedami į 12,5% glutaraldehido ir 50 mM Tris tirpalą, esant pH 5,6. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas vieną valandą. Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 15 ml tūrio 50 mM Tris, esant pH 7,0. Lipazės CLEC liofilizuojami kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje.
Tirpios lipazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
Tirpios ir CLEC lipazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant substrato pnitrofenilo acetato hidrolizę (17 lentelė ir 9 pav.). Skaldymas stebimas registruojant absorbavimo padidėjimą 400 nm bangos ilgiui. Pradinė substrato koncentracija buvo 0,005%. Pradinė fermento koncentracija buvo l,5xl0’8 M. CLEC ir tirpūs fermentai pridedami prie 5 ml reakcinio tūrio su substratu ir 0,2 M Tris, esant pH 7, kambario temperatūroje. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, prieš matuojant absorbciją, CLEC fermentas centrifūguojant pašalinamas iš reakcinio mišinio.
lentelė - Lipazės aktyvumas
Absorbcija 400 nm
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 0, 0 0, 000 0,000
2 1,0 0, 013 0, 021
3 5, 0 0, 094 0,116
4 10, 0 0, 164 0,186
5 15, 0 0,248 0,258
6 30,0 0, 346 0,357
7 45,0 0,407 0,420
8 60, 0 0,461 0, 459
9 90, 0 0,497 0,502
pavyzdys
Lizocimo kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija ir gauto produkto charakteristikų įvertinimas
Lizocimo kristalizacija
Pagal BLAKE, C.C.F. ir kt., Nature 196: 1173 (1962) 200 mg liofilizuoto vištos kiaušinio baltymo lizocimo (Boehringer Mannheim) ištirpinta 2,5 ml 0,04 M natrio acetato buferyje kambario temperatūroje, esant pH 4,7. Po baltymo solvatacijos prie lizocimo tirpalo lašinant pridedami 2,5 m; 10% natrio chlorido, nuolat maišant. Kristalizacijos tirpalas paliekamas per naktį kambario temperatūroje ir kristalizacija užbaigiama per 48 valandas. Kristalai išskiriami centrifuguoj ant, kaip anksčiau aprašyta 2 pavyzdyje.
Lizocimo kristalų skersinis susiuvimas
Kaip čia atskleista, 500 μΐ lizocimo kristalų pridedama į 10 ml 24% glutaraldehido ir 50 mM Tris tirpalą, turintį 20% natrio chlorido, esant pH 5,6. Kristalų skersinis susiuvimas vykdomas 20 minučių švelniai maišant (maišančioje lėkštėje). Po susiuvimo kristalai tris kartus praplaunami 50 ml tūrio 20 mM kalio chloridu, esant pH 5,3. Lizocimo CLEC liofilizuojami kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje.
Tirpaus lizocimo ir jo CLEC fermentinis aktyvumas
Tirpaus ir CLEC lizocimo katalitinis aktyvumas buvo tiriamas matuojant substrato 4-metilumbeliferilo Nacetil-chitriosido (FLUKA) (Yang, Y. ir Hamaguchi, K., J. Biochem. 8: 1003-1014 (1980)) (18 lentelė ir pav.). 4-metilumbeliferono atpalaidavimas buvo sekamas fluorimetru (Perkin Elmer Model LS-50). Pradinė substrato koncentracija buvo l,42xl03. Fermento koncentracija buvo 3xl07. CLEC ir tirpus fermentai pridedami prie 2 ml reakcinio tūrio su substratu ir 20 mM kalcio acetatu ir 50 mM kalio chloridu, esant pH 5,3, prie 42°C. 4-metilumbeliferono kiekis 'buvo registruojamas fluorimetriškai matuojant fluorescencjos intensyvumą prie 450 nm, žadinant prie 360 nm. Plyšio dydis tiek žadinimui tiek ir emisijai buvo 10 nm. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, prieš matuojant fluorescenciją, fermentų CLEC buvo pašalinami iš reakcinio mišinio centrifuguojant.
18 lentelė - Lizocimo aktyvumas
Fluorescencija
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 0, 0 o o O o
2 10, 0 4,4 18, 9
3 30, 0 10,5 29, 4
4 60, 0 27,5 44,8
5 90,0 33, 8 51,7
6 120,0 45, 9 59, 8
7 pavyzdys
Asparaginazės kristalizavimas, skersinis susiuvimas ir liofilizacija bei gauto produkto charakteristikų įvertinimas
Asparaginazės kristalizacija
Modifikavus procedūrą, aprašytą Grabner ir kt. [U. S.
Patent 3664926 (1972)] , 25 mg liofilizuotos aspara30 ginazės (Worthington) ištirpinama 500 μΐ 50 mM natrio fosfato buferyje, prie pH 7,2. Tirpalas atšaldomas iki 4°C ir pasiekiamas pH 5,0 1 M acto rūgšties pagalba. Po to į asparaginazės tirpalą lašinamas šaltas etanolis (-20°C) ir pasiekiama galutinė 33% koncentracija. Tirpalas inkubuojamas prie 4°C. Kristalizacija užbaigiama per keturiasdešimt aštuonias valandas. Kristalai išskiriami centrifuguojant, kaip anksčiau aprašyta.
Asparaginazės kristalų skersinis susiuvimas
Kaip čia atskleista, asparaginazės kristalai susiuvami 7,5% glutaraldehido ir 50 mM natrio fosfato buferio tirpale, esant pH 5,6. Po susiuvimo kristalai penkis kartus perplaunami 15 ml tūrio 50 mM Tris, esant pH 7,0. Asparaginazės CLEC liofilizuojami kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje.
Tirpios asparaginazės ir jos CLEC fermentinis aktyvumas
Tirpios ir CLEC asparaginazės katalitinis aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai matuojant amonio evoliuciją sukabintoje fermentinėje reakcijoje, aprašytoje žemiau (visi reagentai pirkti Boehringer Mannheim kompanijoje) (19 lentelė ir 11 pav.).
asparaginazė
L-asparaginas -> aspartatas + NH4 + glutamatdehidrogenazė
NH4+ + NADH + a ketogliutaratas —>
glutamino rūgštis + NAD+
NADH oksidacija buvo registruojama matuojant absorbcijos sumažėjimą 340 nm bangos ilgiui. Pradinė NADH koncentracija buvo 10’3M. Alfa ketoglutarato koncentracija buvo 10’3M. Glutamatdehidrogenazės koncentracija buvo 10 7M. Asparaginazės koncentracija buvo 2,3x10 8M. Kaip aprašyta anksčiau 2 pavyzdyje, prieš matuojant absorbciją, fermentų CLEC buvo pašalinamas iš reakcinio mišinio centrifuguojant.
19 lentelė - Asparaginazės aktyvumas
Absorbcija 340 nm
Laikas (min) CLEC Tirpus fermentas
1 0,0 1,000 1,000
2 1,0 0, 867 0,825
3 3,0 0,739 0,684
4 5,0 0, 603 0,538
5 10, 0 0,502 0,406
6 15,0 0,449 0,338
7 30, 0 0,328 0,199
8 45,0 0,211 0,187

Claims (33)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Skersinio susiuvimo baltymo kristalas, vadinamas kristalu, atsparus egzogeninei proteolizei, besiskiriantis tuo, kad po inkubavimo 3 vai. pronazės tirpale, jis išlaiko mažiausiai 91% savo pradinio aktyvumo, tuo tarpu, kai tirpi baltymo forma, atitinkanti šį kristalą, tose pačiose sąlygose praranda daugiau negu 90% savo pradinio aktyvumo.
  2. 2. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad kristalas yra mikrokristalas.
  3. 3. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad baltymas yra fermentas.
  4. 4. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentas yra
    hidrolazė. 5. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 4 punktą, b e - s i s k i r i a n t i s tuo, kad hidrolazė yra parenkama iš termolizino, elastazės , esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo. 6. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, b e - s i s k i r i a n t i s tuo, kad hidrolazė yra termolizinas • 7. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, b e - s i s k i r i a n t i s tuo, kad hidrolazė yra asparaginazė .
  5. 8. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra lizocimas.
  6. 9. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra esterazė.
  7. 10. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra elastazė.
  8. 11. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad esterazė yra lipazė.
  9. 12. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad proteino:pronazės santykis yra 1:40.
  10. 13. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikrokristalas turi 10 1 mm skersinio susiuvimo sekcijas.
  11. 14. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikrokristalas turi skersinio susiuvimo sekcijas mažesnes, negu 10 1 mm.
  12. 15. Skersinio susiuvimo hidrolazės mikrokristalas, besiskiriantis tuo, kad turi mažiausiai 35% hidrolazės tirpios formos katalitinį aktyvumą, atitinkanti minimą hidrolazės mikrokristalą.
  13. 16. Skersinio susiuvimo hidrolazės mikrokristalas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė yra parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
  14. 17. Skersinio susiuvimo kristalas, besiskiriantis tuo, kad fermento kristalas turi didesnį, negu 100 kartų, aktyvumo pusperiodį už tirpios formos fermentą, atitinkantį fermento kristalą.
  15. 18. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis kristalas yra mikrokristalas.
  16. 19. Skersinio susiuvimo fermento kristalas pagal 16 arba 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentas yra hidrolazė.
  17. 20. Skersinio susiuvimo fermento kristalas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazė parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
  18. 21. Skersinio susiuvimo kristalas, besiskiriantis tuo, kad fermento kristalas turi tokį stabilumą 50 tūrių % vandens/organinio tirpiklio mišinyje, kurį išlaiko mažiausiai 40% nuo inicijuoto aktyvumo inkubuojant minėtame tirpiklyje mažiausiai bent valandą.
  19. 22. Skersinio susiuvimo fermento kristalas pagal
    20 punktą, besiskiriantis tuo, kad kristalas yra mikrokristalas.
  20. 23. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 20 arba
    21 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentas yra hidrolazė.
  21. 24. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrolazę parenka iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
  22. 25. Skersinio susiuvimo kristalas, besiskiriantis tuo, kad kristalas turi sustiprintą pH aktyvumą palyginus su hidrolazės tirpia forma, kuri atitinka minimą hidrolazės kristalą.
  23. 26. Skersinio susiuvimo hidrolazės kristalas pagal
    24 punktą, besiskiriantis tuo, kad šis kristalas stabilesnis esant šarminėms pH reikšmėms, negu hidrolazės tirpi forma, atitinkanti hidrolazės kristalą.
  24. 27. Skersinio susiuvimo kristalas pagal 24 arba
    25 punktą, besiskiriantis tuo, kad minimas kristalas yra mikrokristalas.
  25. 28. Skersinio susiuvimo hidrolazės kristalas pagal 24 arba 25 punktus, besiskiriantis tuo, kad minima hidrolazė parenkama iš termolizino, elastazės, esterazės, lipazės, asparaginazės ir lizocimo.
  26. 29. Prietaisas, besiskiriantis tuo, kad turi fermentą su skersinio susiuvimo fermento kristalu pagal 3 arba 4 punktą, priemones, išlaikančias minimą susiūtą fermento kristalą, kurios leidžia susidaryti kontaktui tarp minimo susiūto fermento kristalo ir substrato, kuri veikia fermentas, kai substratas yra tokioje terpėje.
  27. 30. Biosensorius, skirtas nustatyti analizuojamą medžiagą terpėje, besiskiriantis tuo, kad jis turi:
    a) skersinio susiuvimo fermento kristalą pagal 3 arba 4 punktą, kuriame fermentas veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reagentą reakcijoje, kurioje dominanti analizuojama medžiaga dalyvauja; ir
    b) minimo skersinio susiuvimo fermento kristalui išlaikymo priemonių, turinčių medžiagas, leidžiančias susidaryti kontaktui tarp minimo skersinio susiuvimo fermento kristalo ir terpės, turinčios (1) analizuojamą medžiagą, kurią veikia fermentas, kai analizuojama medžiaga yra tokioje terpėje, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja analizuojama medžiaga, reagentą, kai reagentas yra tokioje terpėje.
  28. 31. Biosensorius pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai turi detektavimo priemonių.
  29. 32. Biosensorius pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad minimas dominanti analizuojama medžiaga yra gliukozė, kreatininas, karbamidas, laktatas, gliukozės-6-fosfatas, sacharozė, ATF, etanolis, acto rūgštis, skruzdžių rūgštis, cholesterolis, karbamido rūgštis, metotreksatas, anglies dioksidas, aminorūgštys, fosfatai, penicilinas, nitratai, nitritai, sulfatai ir sukcinatai.
  30. 33. Biosensorius, skirtas nustatyti analizuojamą medžiagą terpėje, besiskiriantis tuo, kad jis turi:
    a) skersinio susiuvimo liuciferazės kristalą pagal 3 punktą, kuriame liuciferazė veikia dominančią analizuojamą medžiagą arba reakcijos, kurioje dominanti medžiaga dalyvauja, produktą; ir
    b) minimo skersinio susiuvimo liuciferazės kristalo išlaikymo priemonių, turinčių medžiagos, leidžianLT 3366 B čios susidaryti kontaktui tarp skersinio susiuvimo liuciferazės kristalo ir terpės, turinčios (1) analizuojamą medžiagą, kurią veikia liuciferazė, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja analizuojama medžiaga, produktą.
  31. 34. Ekstrakorporalinis prietaisas terpės komponento pakeitimui, besiskiriantis tuo, kad jis turi:
    a) skersinio susiuvimo fermento kristalą pagal 3 arba 4 punktą, kuriame fermentas veikia komponentą arba reagentą reakcijos, kurioje reagentas dalyvauja; ir
    b) minimo skersinio susiuvimo fermento kristalo išlaikymo priemonių, turinčių medžiagas, leidžiančias susidaryti kontaktui tarp skersinio susiuvimo fermento kristalo ir (1) komponento, kurį veikia fermentas, kai komponentas yra tokioje terpėje, arba (2) reakcijos, kurioje dalyvauja komponentas, produkto, kai reagentas yra terpėje.
  32. 35. Ekstrakorporialinis prietaisas pagal 33 punktą, besiskiriantis tuo, kad komponentas yra asparaginas, heparinas, bilirubinas, metotreksatas, aminorūgštys, karbamidas ir amoniakas.
  33. 36. Prietaisas, skirtas panaudoti pasirinkto produkto gamyboje, turintis fermentą skersinio susiuvimo fermento kristalo formoje pagal 3 arba 4 punktą ir skersinio susiuvimo fermento kristalui išlaikymo priemonių.
LTIP1077A 1990-08-03 1993-09-22 Crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization LT3366B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56228090A 1990-08-03 1990-08-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1077A LTIP1077A (en) 1995-04-25
LT3366B true LT3366B (en) 1995-07-25

Family

ID=24245600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1077A LT3366B (en) 1990-08-03 1993-09-22 Crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization

Country Status (25)

Country Link
EP (2) EP0861888B1 (lt)
JP (2) JPH05508549A (lt)
AT (2) ATE323158T1 (lt)
AU (1) AU662104B2 (lt)
BR (1) BR9106732A (lt)
CA (1) CA2087730C (lt)
CZ (1) CZ12393A3 (lt)
DE (2) DE69133521T2 (lt)
DK (2) DK0550450T3 (lt)
ES (2) ES2263187T3 (lt)
FI (1) FI120099B (lt)
HU (2) HUT65904A (lt)
IE (1) IE912767A1 (lt)
IL (1) IL99046A (lt)
LT (1) LT3366B (lt)
LV (1) LV10304B (lt)
MD (1) MD1592B2 (lt)
NO (1) NO930360L (lt)
PT (1) PT98564B (lt)
RU (1) RU2124052C1 (lt)
SG (1) SG70966A1 (lt)
SK (1) SK283185B6 (lt)
TJ (1) TJ210R3 (lt)
UA (1) UA27035C2 (lt)
WO (1) WO1992002617A1 (lt)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932212A (en) * 1996-05-24 1999-08-03 Altus Biologics, Inc. Crosslinked protein crystal formulations and their use as catalysts in organic solvents
WO1998013119A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Altus Biologics Inc. Crosslinked protein crystals as universal separation media
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
AU8772498A (en) * 1997-09-05 1999-03-29 Altus Biologics Inc. Carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
US6500933B1 (en) 1997-09-05 2002-12-31 Altus Biologics Inc. Methods of preparing carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
US6979561B1 (en) 1998-10-09 2005-12-27 Gilead Sciences, Inc. Non-homogeneous systems for the resolution of enantiomeric mixtures
GB9823334D0 (en) 1998-10-23 1998-12-23 Darwin Discovery Ltd Enzyme coupling
CA2442524A1 (en) * 2001-02-16 2002-09-12 Guiyi Zhang-Sun Matrix stabilized enzyme crystals and methods of use
US7241272B2 (en) 2001-11-13 2007-07-10 Baxter International Inc. Method and composition for removing uremic toxins in dialysis processes
DE602004023969D1 (de) * 2004-01-01 2009-12-17 Council Scient Ind Res Methode zur herstellung von quervernetzten protein kristallen
PT1729797E (pt) 2004-03-22 2008-12-17 Solvay Pharm Gmbh Composições farmacêuticas orais de produtos contendo lipase, em particular de pancreatina, contendo tensioactivos
WO2006044529A1 (en) 2004-10-14 2006-04-27 Altus Pharmaceuticals Inc. Compositions containing lipase; protease and amylase for treating pancreatic insufficiency
EP1913138B1 (en) 2005-07-29 2016-08-24 Abbott Laboratories GmbH Processes for the manufacture of pancreatin powder with low virus content
US11266607B2 (en) 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US9198871B2 (en) 2005-08-15 2015-12-01 Abbott Products Gmbh Delayed release pancreatin compositions
US10072256B2 (en) 2006-05-22 2018-09-11 Abbott Products Gmbh Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample
US8852904B2 (en) 2009-05-22 2014-10-07 Sanyo Foods Co., Ltd. Protein complex having activity catalyzing asymmetric oxidation reaction and process for producing the same
US8921531B2 (en) 2009-09-15 2014-12-30 Althea Technologies, Inc. Protein a crystals and cross-linked crystals and methods of use thereof
US9303255B2 (en) 2010-08-26 2016-04-05 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Electrode having enzyme crystals immobilized thereon, method for producing electrode having enzyme crystals immobilized thereon, and biological fuel cell and biosensor provided with electrode having enzyme crystals immobilized thereon
DK3003358T3 (da) 2013-06-07 2021-06-21 Allena Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og anordninger til dialyse
WO2016126970A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Abbvie Inc. Pharmaceutical compositions and methods of use thereof to treat pancreatic enzyme insufficiency
ES2962985T3 (es) * 2017-06-15 2024-03-22 Univ Chicago Composiciones para el tratamiento del cáncer
US12516307B2 (en) 2020-08-18 2026-01-06 Onchilles Pharma, Inc. Modified porcine pancreatic elastase proteins
JP7148016B2 (ja) * 2020-10-19 2022-10-05 不二製油株式会社 酵素固定化用担体及びそれを用いた固定化酵素
EP4504961A1 (en) * 2022-04-07 2025-02-12 Need4Health B.V. Method for determining insulin dosage

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3664926A (en) 1970-02-26 1972-05-23 Merck & Co Inc Crystallization of l-asparaginase
US4436925A (en) 1977-01-27 1984-03-13 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Addition compound of dipeptide derivative and amino acid derivative

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4373023A (en) * 1980-10-14 1983-02-08 Massachusetts Institute Of Technology Process for neutralizing heparin
EP0367302A3 (en) * 1982-04-23 1991-06-19 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Process for semi-synthesis of human insulin, water-soluble cross-linked achromobacter protease i for use therein and a process for preparing the same
US4411996A (en) * 1982-06-30 1983-10-25 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
AU3889685A (en) * 1984-01-20 1985-08-09 Eye Products Ltd. Partnership Method for cleaning contact lenses
FR2566798B1 (fr) * 1984-06-27 1986-12-12 Centre Nat Rech Scient Membrane porteuse de la luciferase pour le dosage de l'atp et son procede de production
US4650758A (en) * 1984-09-21 1987-03-17 Cetus Corporation Stabilization of enzymes useful in the production of glucosone and other enzymatic processes
JPS6317691A (ja) * 1986-07-09 1988-01-25 Agency Of Ind Science & Technol アスパルテ−ム製造用固定化酵素
FI85285C (fi) * 1988-05-13 1992-03-25 Stabra Ag Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.
US5010006A (en) * 1988-08-11 1991-04-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The National Research Council Of Canada Lipase immdoilized by cross-linking with inert protein for glyceride synthesis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3664926A (en) 1970-02-26 1972-05-23 Merck & Co Inc Crystallization of l-asparaginase
US4436925A (en) 1977-01-27 1984-03-13 Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. Addition compound of dipeptide derivative and amino acid derivative

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. AKIYAMA ET AL.: "Enzymes in Organic Synthesis", CHEMTECH, 1988, pages 627 - 634
A. M. KLIBANOV ET AL.: "Enzymatic Catalysis in Anhydrous Organic Solvent", TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES, 1989, pages 141 - 144, XP023568949, DOI: doi:10.1016/0968-0004(89)90146-1
A. M. KLIBANOV: "Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents", ACC. CHEM. RES, 1990, pages 114 - 120, XP002073769, DOI: doi:10.1021/ar00172a004
ALEKSEY ZAKS ET AL.: "Potentially commercial enzymatic processes for the fine and specialty chemical industries", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, 1988, pages 272 - 275
C. C. F. BLAKE ET AL.: "Structure Of Lysozyme: A Fourier Map of the Electron Density at 6 A Resolution obtained by X-ray Diffraction", NATURE, 22 December 1962 (1962-12-22), pages 1173
CH WONG: "Enzymatic catalysts in organic synthesis", SCIENCE, 1989, pages 1145 - 1152
CW CARTER JR, CW CARTER: "Protein crystallization using incomplete factorial experiments", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1979, pages 12219 - 12223, XP055044544
D. W. CELANDER, T. R. CECH: "Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule", SCIENCE, 1991, pages 401 - 407, XP001097281, DOI: doi:10.1126/science.1989074
E. HALL: "Biosensors"
F. A. QUIOCHO, F. M. RICHARDS: "Enzyme behavior of carboxypeptidase-A in the solid state", BIOCHEMISTRY, 1967, pages 4062 - 4076
FLORANTE A. QUIOCHO, FREDERIC M. RICHARDS: "INTERMOLECULAR CROSS LINKING OF A PROTEIN IN THE CRYSTALLINE STATE: CARBOXYPEPTIDASE-A", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 1964, pages 833 - 839
FRANCES C. BERNSTEIN ET AL.: "The protein data bank: A computer-based archival file for macromolecular structures", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 1977, pages 535 - 542
G. LINDEBERG: "A Convenient Synthesis of Aspartame", J. CHEM. ED., 1987, pages 1062 - 1064
GARY L. GILLILAND: "A biological macromolecule crystallization database: A basis for a crystallization strategy", JOURNAL OF CRYSTAL GROWTH, 1988, pages 51 - 59, XP028857647, DOI: doi:10.1016/0022-0248(88)90298-9
J. B. JONES: "Enzymes in Organic Synthesis", TETRAHEDRON, 1986, pages 3351 - 3403, XP001319341
J. TRAMPER: "Immobilizing biocatalysts for use in syntheses", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, 1985, pages 45 - 50, XP023595078, DOI: doi:10.1016/0167-7799(85)90058-7
K. NAKANISHI ET AL.: "Continuous Synthesis of N-(Benzyloxycarbonyl)-L-Aspartyl-L-Phenylalanine Methyl Ester with Immobilized Thermolysin in an Organic Solvent", NATURE BIOTECHNOLOGY, 1985, pages 459 - 464, XP001319879
K. OYAMA ET AL.: "Production of aspartame by immobilized thermolase", METHODS IN ENZYMOLOGY, 1987, pages 503 - 516
L. SAWYER ET AL.: "The atomic structure of crystalline porcine pancreatic elastase at 2.5 A resolution: comparisons with the structure of alpha-chymotrypsin", J.MOL.BIOL., 1978, pages 137 - 208, XP024019619, DOI: doi:10.1016/0022-2836(78)90412-6
M. KLEIN, R. LANGER: "Removal of asparagine", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, 1986, pages 179 - 185
M.J. DANIELS: "Industrial operation of immobilized enzymes", METHODS IN ENZYMOLOGY, 1987, pages 371 - 379
MCPHERSON A.: "Crystallization of macromolecules: general principles", METHODS IN ENZYMOLOGY, 1985, pages 112, XP009001314, DOI: doi:10.1016/0076-6879(85)14007-3
R. A. LERNER, S. J. BENKOVIC, P. G. SCHULTZ: "At the crossroads of chemistry and immunology: catalytic antibodies", SCIENCE, 1991, pages 659 - 667, XP000220254, DOI: doi:10.1126/science.2024118
R. HOLMES ET AL: "Structure of thermolysin refined at 1,6 A resolution", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 1982, pages 623 - 639, XP024013040, DOI: doi:10.1016/0022-2836(82)90319-9
T. G. COOPER: "The Tools of Biochemistry", pages: 379 - 380
T. H. MAUGH: "A Renewed Interest in Immobilized Enzymes", SCIENCE, 1984, pages 474 - 476, XP009011405, DOI: doi:10.1126/science.223.4635.474
T. R. CECH: "RNA editing Worlds smallest introns", CELL, 1991, pages 667 - 669
TORU NAGASAWA, HIDEAKI YAMADA: "Microbial transformations of nitriles", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, 1989, pages 153 - 158
W. HARTMEIER: "Immobilized biocatalysts - From simple to complex systems", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, 1985, pages 149 - 153, XP023595341, DOI: doi:10.1016/0167-7799(85)90104-0

Also Published As

Publication number Publication date
DK0861888T3 (da) 2006-08-14
IL99046A (en) 1998-09-24
RU2124052C1 (ru) 1998-12-27
CA2087730A1 (en) 1992-02-04
MD1592B2 (ro) 2001-01-31
DE69133521T2 (de) 2006-12-07
HK1023362A1 (en) 2000-09-08
WO1992002617A1 (en) 1992-02-20
HK1012411A1 (en) 1999-07-30
IL99046A0 (en) 1992-07-15
LV10304B (en) 1995-06-20
JP2004000230A (ja) 2004-01-08
EP0550450B1 (en) 2003-05-14
TJ210R3 (en) 1998-11-14
PT98564A (pt) 1992-06-30
ES2263187T3 (es) 2006-12-01
FI930454A0 (fi) 1993-02-02
FI930454L (fi) 1993-02-02
JPH05508549A (ja) 1993-12-02
DE69133258T2 (de) 2004-03-18
EP0550450A1 (en) 1993-07-14
SK283185B6 (sk) 2003-03-04
NO930360L (no) 1993-04-02
ES2199933T3 (es) 2004-03-01
DE69133521D1 (de) 2006-05-24
IE912767A1 (en) 1992-02-12
PT98564B (pt) 1999-01-29
ATE240391T1 (de) 2003-05-15
BR9106732A (pt) 1993-08-17
LTIP1077A (en) 1995-04-25
AU8315491A (en) 1992-03-02
DK0550450T3 (da) 2003-09-08
ATE323158T1 (de) 2006-04-15
NO930360D0 (no) 1993-02-02
EP0861888A1 (en) 1998-09-02
SK5993A3 (en) 1993-07-07
UA27035C2 (uk) 2000-02-28
DE69133258D1 (de) 2003-06-18
HU211521A9 (en) 1995-11-28
IE20040113A1 (en) 2004-05-05
CA2087730C (en) 1999-07-20
HUT65904A (en) 1994-07-28
EP0861888B1 (en) 2006-04-12
HU9300275D0 (en) 1993-04-28
AU662104B2 (en) 1995-08-24
SG70966A1 (en) 2000-03-21
FI120099B (fi) 2009-06-30
CZ12393A3 (en) 1993-10-13
LV10304A (lv) 1994-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5618710A (en) Crosslinked enzyme crystals
LT3366B (en) Crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
IE83874B1 (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
US5801022A (en) Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin
Chen et al. A novel and efficient method for the immobilization of thermolysin using sodium chloride salting-in and consecutive microwave irradiation
IE85134B1 (en) Use of Crosslinked Crystals as a Novel Form of Enzyme Immobilization
Rai et al. Production of D-amino acids using immobilized D-hydantoinase from lentil, Lens esculenta, seeds
NZ264042A (en) Crosslinked crystalline immobilized protein, biosensor containing the crosslinked protein crystal
HK1012411B (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
HK1023362B (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
EP0092829A2 (en) Process for semi-synthesis of human insulin and alkaline protease for use therein
Inada et al. Fibrin membrane endowed with biological function VI. Immobilization of multienzymes of urea cycle
Hagiwara et al. Fibrin membrane endowed with biological function VII. An approach to an artificial liver; Conversion of ammonia to urea invitro
Arya et al. Pigeonpea (Cajanus cajan) urease immobilized on alginate beads, showing improved stability and operational parameters
LIU ISOLATION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE
LÁSZLÓ SUPERVISOR: MÁRIA L. SIMON
JPH055475B2 (lt)

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20100922