FI120099B - Ristisidottuja entsyymikiteitä ja niiden käyttö uutena entsyymien immobilisointimuotona - Google Patents

Ristisidottuja entsyymikiteitä ja niiden käyttö uutena entsyymien immobilisointimuotona Download PDF

Info

Publication number
FI120099B
FI120099B FI930454A FI930454A FI120099B FI 120099 B FI120099 B FI 120099B FI 930454 A FI930454 A FI 930454A FI 930454 A FI930454 A FI 930454A FI 120099 B FI120099 B FI 120099B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
enzyme
crystal
clec
cross
att
Prior art date
Application number
FI930454A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI930454A (fi
FI930454A0 (fi
Inventor
Manuel A Navia
Clair Nancy L St
Original Assignee
Vertex Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharma filed Critical Vertex Pharma
Publication of FI930454A publication Critical patent/FI930454A/fi
Publication of FI930454A0 publication Critical patent/FI930454A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120099B publication Critical patent/FI120099B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C12Q1/003—Functionalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Piezo-Electric Or Mechanical Vibrators, Or Delay Or Filter Circuits (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Ristisidottuja entsyymikiteitä ja niiden käyttö uutena entsyymien iiraaobi 1 i soinfc imuotona Läheisesti yhteen liittyvä hakemus 5 Tämä hakemus on cip-hakemus USSN 07/562 280:Ile, joka on jätetty elokuun 3. 1990 ja otsikoitu nimellä ''Risti-sidottujen kiteiden käyttö uutena entsyymien immobilisoin-timuotona", USSN 07/562 280:n sisältö liitetään tähän viitteellä.
10 Keksinnön tausta
Entsyymeitä käytetään teollisina katalyytteinä suuressa ja laboratoriomittakaavassa tapahtuvassa taloudellisessa tuotannossa, valmistettaessa hieno- ja erikoiskemikaaleja (Jones, J- B., Tetrahedron 42: 3351 - 3403 (1986) ) , 15 valmistettaessa elintarvikkeita (Zaks et ai.. Trends in Biotechnology 6: 272 - 275 (1988)) sekä työvälineinä orgaanisten yhdisteiden synteeseissä (Wong, C.-H., Science 244: 1145 - 1152 (1989); CHEMTRACTS-Org, Chem. 3: 91 - 111 (1990);
Klihanov, A.M., Acc, Chem, Res. 23: 114 - 120 (1990)).
20 Entsyymeihin perustuva valmistus voi vähentää mer kittävästi ympäristön saastekuormitusta, jota ilmenee valmistettaessa suuressa mittakaavassa kemiallisia välituotteita, joita muutoin ei käytetä, kuten käy ilmi suuressa mittakaavassa tapahtuvan: akryyliamidin valmistuksesta, käy-25 tehtäessä entsyymiä, nikriilihydrataasia (Nagasawa, T. ja Yamada, H., Trends in Biotechnology 7: 153 - 158 ¢1989)).
Entsyymejä käytetään myös biosensorisovelluksissa ilmaisemaan erilaisia kliinisiä, teollisia ja muita kiin-nostavia aineita (Hall, E,, "Biosensors", Open University 30 Press (1990)}. Kliinisellä alalla entsyymejä voidaan käyttää kehon ulkopuolella tapahtuvassa hoidossa, kuten hemo-dialyysissä ja verensuodatuksessa, jolloin entsyymit poistavat selektiivisesti jäte- ja toksisia aineita verestä (Klein, M. ja Longer, R:, Trends in Biotechnology 4; 179 -35 185 (1986)), Entsyymejä käytetään näillä aloilla, koska ne toimivat tehokaasti katalyytteinä monissa reaktiotyypeissä, ) j 2 kohtuullisissa lämpötilöissä ja ne ovat substraattispesifi-siä ja stereoselektiivisiä.
Tästä huolimatta liukenevien entsyymikatalyyttlen käyttöön liittyy haittoja, jotka ovat rajoittaneet niiden 5 käyttöä teollisuudessa ja laboratoriossa tapahtuvissa kemiallisissa menetelmissä (Äkiyama et ai., CHEMTECH 627 - 634 (1388)) ,
Entsyymit ovat kalliita ja suhteellisen pysymättö-miä verrattuna useimpiin teollisesti ja laboratoriossa käy-10 tettäviin katalyytteihin, jopa silloin kun niitä käytetään vesipitoisissa väliaineissa, jossa entsyymit normaalisti toimivat. Monet useista taloudellisesti kiinnostavista kemiallisista reaktioista, joita suoritetaan yleisen käytännön mukaisesti,, eivät sovi yhteen vesipitoisen väliaineen 15 kanssa, kuten sellaiset, joissa esimerkiksi substraatit ja tuotteet ovat Usein liukenemattomia täi pysymattömiä, ja. joissa hydrolyysi voi kilpailla merkittävästi.. Lisäksi liukenevan entsyymikatalyytin talteen otto tuotteesta ja reagoima ttomasta substraatista, jotka ovat syötettävässä raa-20 ka-äineessa, edellyttää usein monimutkaisen ja kalliin erotustekniikan soveltamista. Lopuksi, Entsyymejä on vaikea säilyttää siten, että ne säilyttäisivät aktiivisuutensa ja toiminnallisen eheytensä kaupallisesti ajatellen järkevien ajanjaksojen ajan (kuukausista vuosiin) ilman, että niitä 25 täytyy säilyttää jääkaapissa (4 °C - -80 °C - nestetyppi- lämpötilat), tai ilman, että niiden täytyy olla vesiliuoksissa, joissa on sopiva ionivahvuus, pH, jne.
Entsyymien immobilisointimenetelmillä näitä haitto- \ ja on monissa tapauksissa kierretty. Immobilisointi voi pa- j 30 rantaa entsyymikatalyyttien pysyvyyttä ja suojata niiden toiminallista eheyttä vaativissa liuotinympäristöissä ja äärilämpötiloissa, jotka ovat luonteenomaisia teollisille f ja laboratoriossa tapahtuville kemiallisille prosesseille j (Hartmeier, W., Trends in Biotechnology 3: 149 - 153 35 (198:5)). Jatkuvia virtausprosesseja voidaan suorittaa ko lonnissa olevilla immobi1i s o idui11a entsyymipartikkeleilla, 3 esimerkiksi si Ilo iiri, kun liukoinen raaka-ainesyöttö kulkee partikkeleiden ohi ja muuttuu vähitellen tuotteeksi. Tässä käytettävällä termillä entsyymien immobilisointi tarkoitetaan entyYminkätalyytin tekemistä liukenemattomaksi kiin-5 riittämällä se, kapseloimalla se tai aggregoimalla se makroskooppisiin CLO"1 mm) partikkeleihin.
Joitakin käyttökelpoisia katsauksia entsyymien im-mobilisointimenetelmistä on ilmestynyt kirjallisuudessa (Maugh, T.H., Science 223: 474 - 476 {1984) ; Tramper, J., 10 Trends in Biotechonology 3: 45 - 50 (1985)) . Maugh kuvaa viisi yleistä yritystapaa entsyymien immobilisoimiseksi.
Tällaisia ovat: adsorptio kiinteisiin kantaja-aineisiin {kuten ioninvaihtohartseihin); kovalenttiset sidokset kantaja-aineisiin (kuten ioninvaihtohartseihin, huokoisiin ke-15 raamisiin aineisiin tai lasihelmiin); sulkeminen polymeeri-geeleihin; kapselointi ja liukenevien proteiinien seostaminen ristisitomalla ne bifunktionaalisten reagenssien kanssa satunnaisella ja määrittelemättömällä tavalla. EP-A-367 302 (Soejima et ai.) kuvaa vesiliukoisen ristisidotun Achromo-20 bacter-proteaasi I:n, jota käytetään puolisynteettisen humaani-insuliinin menetelmässä. EP-A-341 503 (Visuri) kuvaa veteen liukenemattoman glukoosi-isomeraasin, jonka muodostaa kiteinen entsyymi, joka on muutettu kiinteään muotoon ristisitomalla dialdehydin {glutaarialdehydin) kanssa ami-25 noryhmän sisältävän yhdisteen, läsnä ollessa. Lisäksi kokonaiset solut (tavallisesti kuolleita ja tehty läpäiseviksi) > joilla on ilmennyt haluttua entsyymiaktiivisuutta suurilla tasoilla (esim. Nagasawa, T. ja: Yamada, H., Trends: in Biotechnology 7: 153 - 158 (1989)), voidaan immobilisoiäa.
30 Kullakin näistä immobilisointimenetelmistä on omat etunsa ja rajoituksensa, eikä yhtäkään voida pitää optimaalisena tai hallitsevana menetelmänä. Monissa niistä entsyy-mikatalyytti edustaa ainoastaan pientä osaa kemiallisessa reaktorissa mukana olevan aineen kokonaistilavuudesta. Si-35 ten suurin osa immobi1isoidusta väliaineesta koostuu iner- \ tistä,; mutta usein kalliista kantaja-aineesta, Kaikkissa \ 4 näissä entsyymikatalyyttimölekyylien ja kunkin muun ja/tai kantaja-aineen väliset imrnobi 1 i s o iva t vuorovaikutukset ovat yleensä satunnaisia ja määrittelemättömiä. Tämän tuloksena, vaikka nämä vuorovaikutukset parantavat entsyymikatalyytti-5 molekyylien pysyvyyttä, niiden suhteellisen ei-spesifi-syytensä ja säännöttömyytensä vuoksi tämä pysyvyys ei ole optimaalista eikä säännöllistä. Useissa tapauksissa pääsy entsyymikatalyytin aktiiviseen kohtaan jää huonosti määritellyksi. Lisäksi edellä kuvatuissa immobilisointimenetel-10 missä ei käsitellä ongelmia, jotka liittyvät säilytykseen ja jääkaappisäiiytykseen. Tunnetulla tavalla immobilisoituja entsyymejä ei myöskään voidaan tavallisesti manipuloida, kuten siirrettäessä yhteen tai johonkin toiseen valittuun liuottimeen, vaarantamatta entsyymin rakennetta ja toimin-15 nallista eheyttä. Käytännöllisesti katsoen, lukuun ottamatta kantaja-ainepartikkeliin kiinnittyvää kiinnitystä, tunnetulla tavalla immobilisoidut entsyymit muistuttavat suuresti liukenevia entsyymejä ja ovat samoin herkkiä denaturoi turaiselie ja toimintakyvyn menetykselle vaativissa ympä-20 ristöissä. Yleisesti immobisointimenetelmät johtavat ha vaittujen entsyymikatalysoitujen reaktionopeuksien pienenemiseen suhteessa reaktionopeuksiin, jotka on saatu liuoksessa. Tämä on suurimmaksi osaksi seurausta substraatin sisäisen diffuusion ja tuotteen ulkoisen diffuusion rajoituk-25 sista immobilisoidussa enstyymipartikkelissa {Quioehö, F.A.
ja Richards, F,M., Biochemistry 5: 4062 4076 (1967)).
Välttämätön inert.in kantaja-aineen mukänäalo immobilisoi-duissa entsyymipartikkeleissa lisää iminobilisoidun entsyy- ; mipartikkelin ulkopuolella olevan liuottimen ja entsyymika- \ 30 talyytin aktiivisen kohdan välillä olevaa keskimääräistä f vapaata polkua ja siten pahentaa näitä diffuusio-ongelmia, Ϊ Käsiteltäessä imrnobi Iisoitta ja soluja, diffuusio-ongelma on Ϊ erityisesti vakava, vaikka soluseinät ja -kalvot tehdään j jollain tavoin substraattia ja tuotetta läpäiseviksi. On-35 gelma voi liittyä myös moniin kontaminoiviin entsyymivaiku-tuksiin, metaboliitteihin ja soluissa oleviin toksiineihin, 5 sekä solujen pysyvyyteen vaativissa liuottixnissa tai ääri-lämpötiloissa toimivissa ympäristöissä. Parannettu immobi-lisointitekniikka, jolla vältetään nykyisten menetelmien rajoitukset, auttaisi edistämään entsyymien käyttöä teolli-5 sinä katalyytteinä, erityisesti, jos se on osoittautunut käyttökelpoiseksi suuressa raittakaavassa (Daniels, M.J.,
Methods in Enzymology 136: 371 - 379 (1987))· yhteenveto keksinnöstä
Esillä oleva keksintö koskee entsyymikidettä, joka 10 on ristisidottu monifunktionaalisella ristisidosaineella niin, että sen resistenssi eksogeeniselle proteolyysille Pronase™-proteaasilla on sellainen, että ristisidottu ent-syymikide säilyttää vähintään 91 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan, kun sitä on inkuboitu kolme tuntia sellaisessa 15 pitoisuudessa Pronase™-proteaasia, joka saa entsyymin liukoisen, ristisitomättomän muodon, joka kiteytetään mainitun ristisidottavan entsyymikiteen muodostamiseksi, säilyttämään korkeintaan 6 %: alkuperäisestä aktiivisuudestaan samoissa olosuhteissa, jolloin entsyymi valitaan joukosta: 20 (a) pyridoksaalifosfaattientsyymit, me tai li entsyy mit, C.öA:ta vaativat entsyymit ja sulfuraasit (PAPS); (b) termölysiini, nitrilaasi, aminosyklaasi ja hydantoinaasi; (c) elastaasi, sminopeptidaasi, asparaginaasi,. glu-25 taminaasi, arginaasi, ureaasi, alkalifosfataasi, lipaasi, edullisesti fosfolipaasi, beeta-laktamaasi, ACL-hydrolaasi, L-ÄGT-hydrolaasi, aryylisulfataasi,: glykosidaasi, edulli sesti beeta-galaktosidaasi ja beeta-fruktosIdaasi, penisil-liiniasylaasi, amidaasi, edullisesti penisilliiniamidaasi, 30 aminohappoesterääsi, 5'-fosfodiesterääsi, nukleaasi ja kreatiinideiminaasi (d) aminohappodehydrogenaasi, formaattidehydroge-naas i, laktaattidehydrogenaasi, glutamaattidehydrogenaasi, bydroksis:teroi;didehydrogenaas:i, glukoosi-Ö-pyruvaattide-35 hydrogenaasi, sukkinaattidehydrogenaasi, glukoosidehydro- | genaasi, katalaasi, superoksididismutaasi, peroksidaasij 6 lusiferääsi, tyrosinaasi, flavoentsyymi, nitraatti/nitriitti -reduktaasi, oksidoreöuktaasi (NAD/P), oksidaasi ja lyaasi; (e) kinaasi (ATP), edullisesti kreatiinikinaasi, 5 transaminaasi, glykosyyli trans £ eraas i ja metyylitransterääsi {SAM) ,- (f) L-tryptofaanisyntetaasi ja striktodiinisyn-tetaasi; ja (g) esterääsi.
10 Esillä olevan keksinnön menetelmässä pieniä .(UCf1) proteiinikiteitä kasvatetaan vesiliuoksista tai vesiliuoksista, jotka sisältävät orgaanisia liuottimia, joissa ent-syymikatalyytti on rakenteellisesti ja toiminnallisesti pysyvä. Edullisessa suoritusmuodossa kiteet ristisidotaan sen 15 jälkeen hifunktionaalisen reagenssin, kuten glutaarialdehy-din kanssa. Tämän ristiinsitomisen tuloksena yksittäisten entsyymikatalyyttimolekyylien välissä olevat kidehilayhtey-det, jotka muodostavat kiteen, stabiloituvat. Tämän lisääntyneen stabiiliuden seurauksena ristisidotut immobilisoidut 20 entsyymikiteet voivat toimia kohotetuissa lämpötiloissa, ääri-pH-aluei11a ja vaativissa vesipitoisissa, orgaanisissa tai lähes vedettömissä väliaineissa, kuin myös niiden seoksissa. Eli esillä olevan keksinnön CLEC voi toimia ympäristöissä, jotka eivät sovi yhteen vastaavien kiteyttämättömi-25 en, ei-ristlsidottujen, alkuperäisen entsyymin tai tunnetulla tavalla immobilisoitujen entsyymikatalyyttien toiminnallisen eheyden kanssa.
Lisäksi tällä menetelmällä valmistetut CLEC:t voidaan lyöfilisoida, jolloin saadaan lyofilisoitua CLEC:tä,
30 jota voidaan säilyttää tässä lyofilisöidussa muodossa ei-jääkaappi- (huoneen-) lämpötiloissa pidennettyjä aikoja, ja jotka voidaan helposti muodostaa uudelleen valituissa vesi-, orgaanisissa tai- vesi-orgaanisissa seosliuottimissa I
ilman, että muodostuu amorfisia suspensioita ja mahdolli-'35 sirnrnan pienellä denaturoiLumisen vaaralla.: 7
Esillä oleva keksintö koskee myös CLEC:-ejä>, jotka on valmistettu esillä olevan keksinnön menetelmällä, sekä niiden käyttöä 1 arbor at or i o - ja suuren mittakaavan teollisessa tuotannossa, jossa valmistetaan valittuja aineita, 5 kuten kiraalisia orgaanisia molekyylejä, peptidejä, hiilihydraatteja, lipidejä tai muita kemiallisia lajeja. Tällä hetkellä nämä valmistetaan tavallisesti tunnetuilla kemiallisilla menetelmillä, jotka voivat edellyttää vaativia olosuhteita (esim. vesi-, orgaanisia tai lähes vedettömiä liu-10 ottimia, vesi/orgaanisia seosliuottimia tai kohotettuja lämpötiloja}, jotka eivät sovi yhteen kiteyttämättömän, ei-ristisidotun, alkuperäisen entsyymikatalyytin toiminnallisen eheyden kanssa. Muita makromolekyylejä, joilla on katalyyttinen vaikutus, voidaan myös liittää ehdotettuun CLEC-15 teknologiaan. Tällaisia voivat olla katalyyttiset vasta-aineet (Lerner, K.A., Benkovic, S.J. ja Schultz, P.G.,
Science 252: 659 - 667 (1991}) ja katalyyttiset: polynukle-otidit (Cech, T.R. , Cell 64:667 - 669 (1991:)) ; Celander, D.W. ja Cech, T.R. Science, 251:401 - 407 (1991)).
20 Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää, jolla valmistetaan valikoituu tuotetta reaktiolla, jota katalysoi esillä olevan keksinnön CLEC.
Menetelmän esimerkissä ja esillä olevan keksinnön käytäntöön sovelluksessa käytettiin termolysiinientsyymiä, 25 sinkki-metallpproteaasia keinotekoisen dipeptidyylimakeu- } tusaineen, aspartaamin, kiraalisen prekursorin syntetisoi-miseksi. Termolysiinienstyymi kiteytettiin lähtöainevesi-liuoksesta, jossa oli 45 % dimetyylisulfoksidia ja 55 % 1,4-M:. ista kalsiumasetaattia, 0,05-M.:ista natriumkakody-30 laattia, pH 6,5, Syntyneet kiteet ristisidottiin glutaa-rialdehydln kanssa, jolloin muodostui termolysiini-CLEC. Termolysiihi-CLEC siirettiin sitten kiteytysvesiliuoksesta, jossa se oli tehty, liuokseen, jossa oli etyyliasetaattia, joka sisälsi substraatit, H-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-35 äspäragiinihappoa (Z-L-Asp) ja L-fenyylialaniinimetyyli-esteriä (b-Phe-QMej . Termolysi.i.ni-CLEC: iä käytettiin sitten 8 katalysoimaan kahden substraatin konäensaatiareaktiota, jolla syntetisoitiin i^( bent syy lioksikarbonyyli) -L-aspar-tyyli-L-fenyy1iaianiinimetyy1iesteriä (Z-L-Asp-L·-Phe-ÖMe), joka on keinotekoisen makeutusaineen, aspartaamin, dipepti-5 dyyliprekursori. Käyttäen mitä tahansa monista tunnetuista menetelmistä {katso esim. Lindeberg, G., J. Chem Ed. 64: 1062 - 1064 (1987)), syntetisoidussa dipeptidyyliprekurso-rissa olevasta L-asparagiinihaposta voidaan poistaa suojaus poistamalla bentsyylioksikarbonyyli- (Z-) ryhmä, jolloin 10 muodostuu aspartaamia (L-Asp~L-Phe-OMe),
Toisessa menetelmän ja esillä olevan keksinnön käytäntöön sovelluksen esimerkissä käytettiin termolysiinient-syymiä termolysiini-CLEC:ien valmistamiseksi. Termolys iini-CLECvien aktilviisuutta ja pysyvyyttä verrattiin arvoihin, 15 jotka saatiin liukenevalla termolysiinillä optimiolösuh-teissä ja ääri-pH- ja -lämpötilaolösuhteissa, joita seurasi inkubointi orgaanisten liuottimien läsnä ollessa ja inku-bointi ulkoapäin tulevan proteaasin läsnä ollessa.
Termolysiinientsyymi kiteytettiin liuoksesta, jossa 20 oli 1,25-M:ista kalsiumasetaattia ja 30 % dimetyYlisUl f oksidia, jonka pH oli 8,0. Syntyneet kiteet ristisidottiin glutaarialdehydin kanssa konsentraattona, joka oli 12,5 %, jolloin muodostui termolysiini-CLEG:. Tennolysiini-CLEC lyo-filisoitiin sitten standardimenetelmällä (Cooper, T.G., The 25 Tools.: of Biochemistry, ss. 379 - 380 (John Wiley and Sons, NY (1977)), jolloin muodostui lyofilisoitu termolysiinin entsyymi-CLEG. Tämä lyofilisoitu CLEC siirrettiin sitten suoraan valittuihin erilaisiin vesi-, orgaanisiin ja ve- j ϊ si/orgaanisiin seosliuottimiin suorittamatta liuottimen } 30 vaihtomenetelmää, ilman että muodostui amorfisia suspensi- | o itä ja denaturoitumisriskin ollessa hyvin vähäinen. Täi- \ laisia liuottimia ovat asetonitriili, dioksaani, asetoni ja tetrahydrofuraani, muita liuottimia pois sulkematta. Inku-boinnin jälkeen aktiivisuus tutkittiin spektrofotometrises-35 ti 1ohkaisemalla dipeptidisubstraatti PAGLA {furyy1iakrylo-yyli-glysyyli-L-leusiiniamidi).
9
Esillä olevan keksinnön menetelmän käytäntöön sovelluksen kolmannessa esimerkissä elastaasientsyymi {porsaan haimaentsyymi) kiteytettiin vesiliuoksesta, jossa oli 5,5 mg/ml proteiinia 0,1-M:issa natriumasetaatissa, jonka 5 pH oli 5,0, huoneenlämpötilassa (Saywer, L. et ai., J. Mol.
Biol. 118: 137 - 208) , Syntyneet kiteet ristisidottiin giutaärialdehydin kanssa konsentraationa, joka oli 5 %, jolloin muodostui elastaasi-CLEG.: Elastaasi-CLEC lyofili- soitiin esimerkissä 2: kuvatulla tavalla.
10 Esillä olevan keksinnön menetelmän ja käytäntöön sovelluksen neljännessä esimerkissä, ja kuten tässä tuodaan esille, esteraasientsyymi (porsaan maksa) kiteytettiin vesiliuoksesta, jossa oli 15 mg/ml proteiinia Q,25-M:issa kalsiumasetaatissa, jonka pH oli 5,6, huoneenlämpötilassa.
15 Syntyneet kiteet ristisidottiin, glutaarialdehydin kanssa konsentraationa, joka oli 12,5 %, jolloin muodostui este-raasi-CLEC.: Ε3ίθη3Ββί-0ΒΕ0 lyofilisöitiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Esillä olevan keksinnön menetelmän ja käytäntöön 20 sovelluksen viidennessä esimerkissä, ja kuten tässä tuodaan esille, lipaasientsyyli (Geotrichum candidum) kiteytettiin vesiliuoksesta, jossa oli 20 mg/ml proteiinia 50~mM>ssa Tris:ssä, jonka pH oli 7, huoneenlämpötilassa. Syntyneet kiteet ristisidottiin glutaarialdehydin kanssa konsentraa-25 tiona, joka oli 12,5 %, jolloin muodostui lipaasi-CLEC. Li-paasi-CLEC lyofilisöitiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Esillä olevan keksinnön menetelmän ja käytäntöön sovelluksen seitsemännessä esimerkissä asparaginaasientsyy-mi (Esclierlohia coli) kiteytettiin vesiliuoksesta, jossa 30 oli 25 mg/ml proteiinia 50-mM:ssa natriumasetaatissa, 33-%:isessa etanolissa pH:ssa 5,0, 4 °C:ssa. Kiteytys on muunnelma menetelmästä, jonka ovat kuvanneet Grabner et ai. [US-patentti 3 664 926 (1972)]. Kuten tässä tuodaan esille, syntyneet kiteet ristisidottiin glutaarialdehydin kanssa 35 konsentraationa, joka oli 7,5 %, jolloin muodostui aspara- : 10 ginaasi-CLEC. Asparaginaasi-CLEC lyofilisoitiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Muita entsyymejä, jotka voidaan immobilisoida samalla tavoin ja käyttää katalysoimaan sopivaa reaktiota, 5 ovat lusiferääsi ja ureaasi. Muita entsyymejä, kuten taulukoissa 1-5 esitettyjä entsyymejä, voidaan myös kiteyttää ja ristisitoa esillä olevaa menetelmää käyttäen, jolloin saadaan haluttu CLEC, jota voidaan vuprostäan käyttää katalysoimaan reaktiota, josta saadaan valikoitua tuotetta, tai 10 katalysoimaan reaktiota, joka on välituoteväihe (se on yksi reaktio reaktiosarj assa) valikoidun tuotteen valmistuksessa. On todettu, että vaikka ristiäitominen auttaa stabiloimaan suurimman osan kiteistä, se ei ole välttämätöntä eikä toivottavaa kaikissa tapauksissa. Joissakin kiteisissä ent-15 syymeissa toiminnallinen ja rakenteellinen eheys säilyy vaativissa ympäristöissä jopa ilman ristisitömistä. Vaikka edullisessa suoritusmuodossa kide on ristisidottu, ris-tisitominen ei aina ole välttämätöntä esillä olevassa menetelmässä käyttökelpoisen entsyymikiteen valmistamiseksi.
20 CLECreillä on useita pääominaisuuksia, joiden vuok si niillä on merkittäviä etuja tunnettuihin tällä hetkellä käytettäviin entsyymien immobilisointimenetelmiin verrattuna . GLEG:it eivät tarvitse erillistä inerttiä kantaja-ainerakennetta. Inertin kantaja-aineen puuttuminen parantaa 25 substraatin ja tuotteen diffuusio-ominaisuuksia CLEC:ssä ja tämän avulla saadaan kiteen sisäisiä entsyymikonsentraati-oita, jotka ovat lähellä tämän kokoisten molekyylien teoreettista täyterajaa. Korkeat entsyymikosentraatiot voivat johtaa merkittäviin kävttösäästöihin annetun katalyyttimää-30 rän tehokkaan vaikutuksen lisääntymisen, substraatin ja entsyymin kontaktihan vähenemisen ja kokonaistehdaskoon ja kokonaispääomakustannusten pienenemisen kautta (Daniels, 1 M.J., Methods in Enzymol, 136: 371 - 379 (1987)). Kidetila-vuuden ja entsyymirakermeosan parantuneen pysyvyyden yhden-35 mukaisuus CLEC:ssä luo uusia mahdollisuuksia, entsyymikatalyysien käyttämiseksi vaativissa olosuhteissa, kuten koho- 11 tetuissa lämpötiloissa sekä vesi-, orgaanisissa- tai lähes vedettömissä liuottimissa,: kuin myös näiden seoksissa. Lisäksi kidehilaan liittyvän rajallisen liuottimen pääsyn ja Säännöllisen pröteiiniympäristön ansiosta metalli-ionin ja 5 ko-faktorin viipymä CLEC:ssä olisi parempi tunnettuihin im-mobilisoituihin entsyymisysteemeihin verrattuna.
Lyhyt selostus piirroksista
Kuvio 1 on graafinen esitys liukenevan ja termoly-siini-CLECm entsyymiaktiivisuuden määrityksen tuloksista. 10 Kuvio 2 on graafinen esitys termolysiini-GLECtn ja liukenevan termolysiinin pH-riippuvuusvertailun tuloksista.
Kuvio 3 on graafinen esitys: liukenevan ja kiteisen termolysiinin aktiivisuuden mittauksesta 65 °C:ssa inku-boinnin jälkeen.
15 Kuvio 4 on graafinen esitys tuloksista, määritettä essä liukenevan ja termolysiini-CLEC:n kestävyyttä ulkoapäin tulevalle pröteolyyttiselle hajoamiselle.
Kuvio 5 on graafinen esitys tuloksista, määritettäessä entyymiaktiivisyutta liukenevalle elastaasille ja vas~ 20 taavälle elastaasi-CLECrile.
Kuvio 6 kuvaa graafisesti liukenevan elastaasin ja vastaavan elastaasi-CLECrn kestävyyttä ulkoapäin tulevaa proteolyyttistä hajoamista vastaan.
Kuvio 7 on graafinen: esitys tuloksista, määritettä-25 essä entsyymiaktiivisuutta liukenevalle esteraasille ja vastaavalle esteraasi-CLEG:lie.
Kuvio 8 kuvaa graafisesti liukenevan :e$terää.sin ja vastaavan esteraasi-CLECtn kestävyyttä ulkoapäin tulevalle pröteolyyttiselle hajoamiselle.
30 Kuvio 9 on graafinen esitys tuloksista, määritettä essä entsyymiaktiivisuutta liukenevalle lipaasille ja vas-t a avalle 1ipaaS i-CLEG:11e.
Kuvio 10 on graafinen esitys tuloksista, määritettäessä entsyymiaktiivisuutta liukenevalle lysotsyymille ja 35 vastaavalle lysotsyymi-CLEC:lle.
12 kuvio 11 on graafinen esitys tuloksista, määritettäessä entsyymiaktiivisuuttaa liukenevalle aspäraginaasille ja vstaavalle asparaginäasi-CLEC:Ile.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5 Yksinkertainen, yleinen menetelmä, joka varmistaa annetun entsyymin tai entsyymiryhmän pysyvyyden ja toiminnan synteettistä kemistiä kiinnostavissa olosuhteissa, jotka ovat liian vaativia entsyymikäyt töön, tällä hetkellä käytettävissä olevia menetelmiä käyttäen, olisi hyvin käytit)' tökeipoinen. Tässä kuvattavat ristisidotut immobilisoidut entsyymikiteet (joihin viitataan lyhentein GLEG tai CLISC) voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Stabiloimalla kidehila ja entsyymikatalyyttien osa kiteessä ristisidontareaktiol-la, CLEG:eitä voidaan käyttää ympäristöissä, kuten vesi-, 15 orgaanisissa tai lähes vedettömissä liuottimissa, näiden liuottimien seoksissa, ääri-pH-alueilla ja kohotetuissa lämpötiloissa, jotka eivät sovi yhteen entsyymitoiminnan kanssa käytettäessä nykyisiä menetelmiä. Lisäksi GLEGreissä olevan kidehilan stabiloiminen mahdollistaa CLEG:ien lyofi-20 lisoinnin standardimenetelmillä. Lyofilisoituja CLEC:eitä voidaan säilyttää .kaupallisesti kiinnostavia ajanjaksoja (kuukausista vuosiin) ilman jääkaappia ja voidaan helpottaa CLEG:ien nopeaa ja yksinkertaista käyttöä teollisen ja laboratoriomittakaavan. prosesseissa yksinkertaisesti lisää-25 mällä haluttuja liuottimia, suorittamatta liuottimen vaih-tomenetelmiä. CLEC-t ovat myös erittäin kestäviä ulkopäin tulevalle proteaasien hajotukselle. Esillä olevan keksinnön mukainen ristisidottu entsyymikide helpottaa monipuolisten entsyymikatalyyttien käyttöä teollisisten kemiallisten pro-30 sessien päävirrassa, kuin myös tutkimusta varten suoritettavissa uusien yhdisteiden laboratoriosynteeseissä.
Vaikka ristisiäonnan avulla saadaan kiteisestä entsyymistä stabiili, se ei ole välttämätöntä eikä toivottavaa kaikissa tapauksissa. Jotkut kiteytetyt entsyymit säilyttä-35 vät toiminnallisen ja rakenteellisen eheytensä vaativissa olosuhteissa vaikkei niitä ole ristisidottu.
13 CLEC:n kidehilassa olevien entsyymimolekyyliosien välisten säännöllisten vuorovaikutusten vuoksi saadaan hienoja huokosia, joiden koko on rajattu ja jotka johtavat entsyymimolekyyleihin, jotka ovat CLEC-rangassa. Tämän tu-5 loksena substraatit, jotka ovat kooltaan suurempia kuin käytettävissä ole huokoskoko, eivät tunkeudu CLEC-partikkelin rankaan.
Rajoitetun huokoskoon seurauksena monet entsyymire-aktiot, jotka ovat kaupallisesti tai akateemisesti kiinnos-lö tavia ja joihin liittyy substraatteja, jotka ovat suurempia kuin CLEC:ien huokoskoko, olisivat keksinnön suojapiirin ulkopuoellä. Tähän kuuluisivat myös reaktiot, joihin liittyy suuria polymeerejä ja muita orgaanisia polymeerejä, joissa polymeeriyksiköiden lukumäärä olisi sellainen, et-15 tä polymeeristä tulisi suurempi kuin kidehuokosköko CLEC:eisää. Täilaisisä tapauksissa katalyysi voi kuitenkin tapahtua CLEC:n pinnalla.
Esillä oleva keksintö koskee ristisidottua immobi-lisoitua entsyyraikidettä (CLEC), jota voidaan käyttää kata-20 lysoimaan valitun tuotteen, kuten peptidin, hiilihydraatin, lipidin tai kiraalisen orgaanisen molekyylin valmistusta. Esillä oleva keksintö koskee myös sellaisia CLEC:eitä ja menetelmää valitun tuotteen valmistamiseksi CLEC-katalysoidun reaktion tai reaktiosarjassa tapahtuvan CLEC-kataly-25 soidun vaiheen avulla. Eräässä esillä olevan keksinnön suori tu smuodo s s a aspartaamin dipeptidyyliprekursöri on valmistettu kohdensäatiöreaktiölla, jota on katalysoinut ris-tisidottu immobilisedtu termolysiini, joka on valmistettu esillä olevalla menetelmällä, Toisessa tämän keksinnön suo- 3.0 ritusmuodossä indikaattörisubstraatti, FAGLA, on lohkaistu, jolloin on saatu kolorimetrinen tuote, jonka mukanaolo on osoitus entsyymiaktiivisuudesta termolysiini-CLEC:ssä. FAG-LA-hydrolyysiä on käytetty mallireaktiona osoittamaan termolysiini-CLEC: n voimakkuutta tietyissä ympäristöissä, jot-35 ka normaalisti eivät olisi yhteensopivia entsyymin aktiivisuuden kanssa.
14
Toisessa tämän keksinnön suoritusmuodossä ©lastaasi-',.. esteraäsi-, lipaasi-, asparaginaasi- ja lysotsyym.ient-syymejä on käytetty lohkaisemaan erilaisia annettuja aineita, kuten p-nitrofenyyliasetaattia (esteraasi ja lipaasi), suk-5 sinyyli-(ala)-3-p-nitroanilidia (elastaasi), 4-metyylibelli-feryyli-N-asetyylikitriosidia (lysotsyymi) ja NäDH:ta (asparaginaasi) ...
Tämän keksinnön menetelmällä alan asiantuntija voi omaksua menettelyn, jolla valmistetaan haluttua tuotetta re~ 10 aktiolla, jota katalysoi immobilisoitu entsyymi. Kyseessä oleva entsyymi, kun se kiteytetään sopivasta liuoksesta, voidaan ristisitoa glutaarialdehydin tai jonkin toisen sopivan Mfunktionaalisen reagenssin kanssa kiteytysliuoksessa*, jolloin saadaan tämän entsyymin CLEC. Tämän jälkeen valitun 15 entsyymin CLEC voidaan lyofilisoida esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
On useita etuja, jotka CLEGrtä käyttämällä saadaan, nykyisin käytössä oleviin entsyymikatalysoituihin menetelmiin verrattuna. Esimerkiksi CLEC:ssä oleva ristisidottu 20 kidematriksi toimii sen omana kantaja-aineena. Kalliita kantaja-ainehelmiä, laseja, geelejä tai kalvoja ei tarvita sitomaan entsyymikatalyyttiä, kuten nykyisin käytössä olevissa immobilisointmenetelmissä. Tämän tuloksena CLEC:ssä olevan entsyymin konsentraatio on lähellä sitä teoreettista 25 täyterajaa, joka voidaan saavuttaa annetun kokoisille mole-kyyleille, ja tiheydet ovat huomattavasti suurempia kuin mihin voidaan päästä edes väkevöidyissä liuoksissa. Koko CLEC koostuu aktiivisesta entsyymistä (ja ei-aktiivisesta kantaja-aineesta) ja siten diffuusioon liittyvän entsyymi-30 reaktionopeuksien vähenemisen·, mikä tavallisesti havaitaan tunnetulla tavalla immobilisoiduiila entsyymeillä, suhteessa liuoksessa oleviin entsyymeihin, tulisi olla mahdolli-simman vähäistä, sillä substraatin ja tuotteen keksimääräinen vapaa polku aktiivisen entsyymin ja vapaan liuottimen 35 välillä lyhenee huomattavasti CLEC:eillä (verrattuna tunnettuihin immobilisoituihin entsyymikantaj a-ainepartikke- 15 leihin) . Tällaiset: korkeat proteiinitiheydet ovat erityisesti 'käyttökelpoisia· biosensori-, analyyttisillä ja muissa sovelluksissa·, joissa tarvitaan suuria määriä proteiinia pienillä tilavuuksina. Teollisissa prosesseissa CLEG: ien 5 ylivoimainen suorituskyky ja tiiviys johtaa merkittäviin käyttösäästöihin, lisäämällä katalyytin annetun tilavuuden tehokasta vaikutusta, jolloin on mahdollista pienentää teh-daskokoa, kuin myös pääomakustannuksia (Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371 - 379 (1987) ) . CLEC: t ovat suh- 10 teellisen monodisperssejä, niillä on makroskooppinen koko ja muoto, joka kuvastaa yksittäisten entsyymi ka talyy t tien luonnollisia kidekasvuominaisuuksia.. Olemassa olevan kanta-jä-alne-immobilisoidun entsyymiväliäineen korvaaminen CLECreillä ei pitäisi olla vaikeaa, koska kummatkin systee-15 mit ovat vastaavia kooltaan ja muodoltaan ja kumpikin voidaan saada samalla tavoin uudelleen talteen syötettävästä raaka-aineesta tietyillä yksinkertaisilla menetelmillä, mukaan lukien taloudelliset perusmenettelyt, kuten suodattamalla, sentrifUgoimalla, clekantoimal 1 a liuotin ja muilla 20 tavoin.
Lisäksi lyofilisoitujen CLEC:ien käyttö mahdollistaa näiden materiaalien rutiinikäsittelyn ja varastoinnin ennen käyttöä (kuivasäilytys huoneenlämpötilassa ilman jääkaappia pidennetyiksi ajanjaksoiksi). Lyofilisoitujen 25 CLEC:ien ansiosta on myös mahdollista suorittaa rutiinifor-mulointi lisäämällä suoraan haluttuja liuottimia ja substraatteja ilman pitkittäviä liuottimen vaihtomenetelmiä tai amorfisten suspensioiden muodostusta. LyofilisoitU CLEC-muoto laajentaa entsyymien yleistä käyttökelpoisuutta 30 katalyytteinä laajemmaksi entsyymien kirjoksi ja toiminta-olosuhteiksi.
CLEC:n toisena etuna on se, että kiteytetyn entsyymin ristisitominen stabiloi ja vahvistaa kidehilaa ja ent-svymiosan molekyylejä sekä mekaanisesti että kemiallisesti.
35 Tämän tuloksena CLEC voi olla ainoa keino päästä merkittäviin aktiivisen entsvymikatalyytin konsentraatioihin vaati- i 16 vissa vesi-, orgaanisissa, lähes vedettömissä liuottimissa tai vesi-orgaanisissa liuotinseoksissa, Entsyymien käyttöä katalyytteinä orgaanisissa synteeseissä on estänyt niiden taipumus denaturoitua ei-vesipitoisten liuottimien läsnä 5 ollessa, erityisesti vesi- ja ei~yesipitoisten liuottimien seoksissa (Klibanov, A.M,, Trends in Biochemical Sciences, 14:141 - 144 (198,9)). CL.EC:eissä rakenteellisen liikkuvuu den rajoittuminen, mikä johtaa pysyvyyteen, johtuu molekyylien välisistä yhteyksistä ja entsyymiosan molekyylien vä-10 Iillä olevista ristisidpksista, jotka muodostavat kidehila, eikä niinkään siitä, että väliaine on lähes vedetöntä. Tämän tuloksena entsyymit voivat sietää välituotteen vesikon-sentraatioita, kun ne formuloidaan CLECbeinä, mikä. ei aikaisemmin ole ollut mahdollista (katso taulukko 12). K&u-15 pallisissa sovelluksissa vesi-orgaanisten liuotinseosten äVulla, on mahdollista manipuloida tuotteen muodostumista, käyttämällä hyväksi tuotteiden ja substraattien suhteellisia liukoisuuksia. Jopa vesipitoisessa väliaineessa entsyy-mikatalyytit, immobilisoitUinä tai liukenevina, joutuvat 20 alttiiksi mekaanisille voimille kemiallisessa reaktorissa, mikä voi johtaa denaturoitumiseen ja lyhyempään puoliintu-misaikaan. CLECbssä olevien kemiallisten ristisidosen avulla saadaan tarvittava mekaaninen kestävyys (Quiocho ja Richards, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 52: 833 - 839 25 (1964)), mikä johtaa entsyymi katalyytin pidentyneeseen re aktorissa oloaikaan.
CLEC:n kolmantena etuna on se, että sen kiteisen luonteensa ansiosta CLEC on yhdenmukaista koko ristisidotun kiteen tilavuudelta. Tässä kuvatuttuja kiteisiä entsyymejä 30 kasvatetaan ja ne ristisidotaan vesipitoisessa ympäristössä ja siten molekyylien järjestys kidehilassa, säilyy yhtenäisenä ja säännöllisenä. Tätä yhdenmukaisuutta pitävät yllä molekyylien väliset yhteydet ja entsyymimölekyylien väliset kemialliset ristisidoket, jotka muodostavat kidehilan, jopa 35 silloin, kuin ne siirretään muihin vesi-, orgaanisiin tai lähdes vedettömiin väliaineisiin tai vesi/orgaanisiin liu- 17 ottismiin. Kaikissa näissä liaottimissa entsyymimolekyylit pitävät saman etäisyyden toinen toisiinsa, muodostaen hyvin määriteltyjä stabiileja huokosia CLECreissä, ja huokoset helpottavat substraatin pääsyä entsyymikatalyyt teihin, kuin 5 myös tuotteen poistamistä. Entsyymiaktiivisuuden yhdenmukaisuus on kriittisen tarkkaa teollisissa, lääketieteellisissä ja analyyttisissä sovelluksissa, joissa toistettavuus ja konsistenssi ovat ehdottoman tärkeitä.
Neljäntenä etuna CLEC:n käytössä on se, että siinä 10 pitäisi ilmetä pidentynyt käyttö- ja varastointipuoliintu-misikä. Hilan vuorovaikutusten, jopa silloin kuin ris-tisidoksia ei ole läsnä, tiedetään stabiloivan proteiineja osaksi proteiinin denaturoitumiseen tarvittavien rakenteellisten vapautusasteiden rajoituksien vuoksi. CLECreissä hi-15 lan vuorovaikutukset, kun hila on kiinnitetty kemiallisin ristisidoksin, ovat erityisesti tärkeitä estettäessä denaturoitumista, erikoisesti vesi- ja ei-vesipitoisten liuottimien seoksissa {Klibanov, A.M., Trends in Bipchemieal Sciences 14: 141 - 144 (1989)). Entsyymit, jotka ovat ol-20 leet kiteisessä tilassa kuukausia tai vuosia, säilyttävät prosentuaalisesti suuren osan katalyyttisestä aktiivisuudestaan. Ristisidotut immobilisoidut entsyymikiteet, joita on säilytetty vedettömissä liuottimissä, ovat edelleen jopa suojattuna mikrobikontaminaatioilta ja vaurioilta, mikä on 25 suuri ongelma varastoitaessa suuria määriä proteiineja ravintorikkaissa vesiympäristöissä. Lyofilisoidun CLEC:n tapauksessa immobilisoitu entsyymi säilytetään siten, ettei liuotinta ole mukana. Tämä on saatu aikaan risti-sidoksien-avulla., samoin kuin stabiilius, ja näin säilytys on mahdol-30 lista ilman jääkaappia pitkiksi ajanjaksoiksi.
Viidentenä etuna CLEC;ta käytettäessä on se, että siinä pitäisi ilmetä lisääntynyttä lämpötilastabiiliutta, joka on seurausta siitä, että ristidokset stabiloivat kide-hilan. Reaktioiden suorittaminen korkeammissa lämpötiloissa 35 kuin mitä käytetään tunnetuissa menetelmissä, nostaisi reaktionopeuksia halutuissa kemiallisissa reaktioissa sekä 18 termpchynaamisesti että lisäämällä diffuusionopeutta CLEC:ien kidehilan sisään ja sieltä ulos. Nämä yhdistetyt vaikutukset edustaisivat suurta parannusta reaktion tehokkuudessa, koska ne maksimoisivat entsyymikatalyytin annetun 5 määrän tuottavuuden, joka entsyymikatalyytti tavallisesti on reaktioprosessin kallein komponentti {Daniels, M.J., Methods in Enzymol. 136: 371 - 379 (1987)). CLEC:eissä ilmenevä lämpötlastabiilius on huomattavaa, sillä monet enfc-syYmisysteemit vaativat lauhkeita reaktio-olosuhteita. 10 CLEC:t stabiloitaisiin myös varastoinnin aikana ilmenevien ohimenevien korkeiden lämpötilojen aiheuttamaa denaturoitumista vastaan.
CLEC:n käytön viimeisenä etuna on se, että säännöllisen kokoiset ja muotoiset huokoset muodostuvat alla ole-15 vassa kidehilassa yksittäisten entsyymimolekyylien välille. Tämä rajoitettu liuottimen sisään pääsy parantaa suuresti CLEC;n metalli-ionin tai ko-tekijän viipymäominaisuuksia verrattuna tunnetulla tavalla immobilisoituihin entsyymeihin liuoksessa. Tämän CLEC·;n ominaisuuden vuoksi sitä on 20 mahdollista käyttää taloudellisesti paremmissa jatkuvavir-tauksisissa prosesseissa tilanteissa (katso esim.. Qyamä et ai., Methods in Enzymol. 136 503 - 516 (1987)), joissa entsyymi muutoin inaktivoituisi metalli-ioni- tai ko-tekijä-uuton vaikutuksesta. Esimerkiksi dipept.idyyli-aspartaami-25 prekursorin, Z-L-Asp-L-Phe-OMe, termo:lysiinivälitteisessä synteesissä tunnetulla tavalla immobilisoidun entsyymin tiedetään menettävän katalyyttisen aktiivisuutensa j atkuva-virtauksisessa prosesseissa osittain kalsiumionien uUttumi-sen kautta, jotka kalsiumionit ovat välttämättömiä termoly-30 siinin aktiivisuudelle. Käytännössä: kalsiumioninen uuttumi-nen on pakottanut käyttämään vähemmän tehokkaita eräproses-seja (Nakanishi et ai., Biotechology 3: 459 - 464 (1985)). Uuttamista· ilmenee, kun kalsiumionikompleksit muodostuvat substraatin, Z-L-Asp, kanssa kilpailussa luonnollisista 35 kalsiumin sitoutumispaiköista entsyymin pinnalla, ja se johtaa katalyyttisen aktiivisuuden katomiseen. Entsyymin 19 suuri tiheys ja. 'vastaavasti rajoittunut liuottimen sisään pääsy GLECixen huokosiin estää kilpailevan L-Asp-Ca**-kompleksien muodostumisen, jotka kompleksit, ovat vastuussa metalli-ionien uuttamisesta.
5 CLEC;ien valmistaminen - entsyymin kiteytys
Esillä olevassa keksinnössä ristisidottu immohili-soitu entsyymikide (tai (CLEC) valmistetaan seuraavasti:
Entsyymikiteitä kasvatetaan saostamalla säädellystä proteiini ulos vesiliuoksesta tai vesiliuoksesta, joka si-10 sältää orgaanisia liuottimia. Säädeltäviä olosuhteita ovat esimerkiksi liuottimen haihdutusnopeus, sopivien yhteisliu-ottimien tai puskureiden länsäolo ja pH sekä lämpötila.
Tyhjentävän katsauksen erilaisista proteiinien kiteyttämi-seen vaikuttavista tekijöistä on julkaissut McPherson (Metis hods Enzymol. 114: 112 (1985)). Lisäksi sekä McPherson että Gilliland (J. Crystal Growth 90: 51 - 59 (1988)) ovat koonneet tyhjentäväii luettelon kaikista proteiineista ja nukleiinihapoista, jotka on raportoitu kiteytettyinä, kuin myös olosuhteista, jotka johtavat niiden kiteytymiseen. Käsikir- j 20 jaa kiteistä ja kiteytyöohjeista, kuin myös liuotetun proteiinin ja nukieiinihappokideräkenteiden säilytyskoordinaa-teista pitää yllä Proteiini-tietopankki (Bernstein et ai.,
Mol. Biol. 112: 535 - 542 (1977)) Brookhavenin kansallisessa laboratoriossa. Tällaisia viitteitä voidaan käyttää mää-25 ritettäessä olosuhteita, jotka ovat välttämättömiä annetun proteiinin kiteytykselle tai aikaisemmin kiteytetylle entsyymille sopivan CLEC:n muodostumisen alkamiseksi, ja ne voivat opastaa kiteytysmenetelmän formuloinnissa proteiineille, joilla sellaista ei ole. Vaihtoehtoisesti taidok-30 kaalia yritys- ja erehdystekniika11a (katso esim. Carter, C.W. jr. ja Carter, C.W., J. Biol. Chem. 254: 12219 - 12223 (1979)) voidaan useissa tapauksissa saada sopivia kiteytys- j olosuhteita useimmille proteiineille, mukaan lukien, mutta j ei näihin rajoittuen, edellä selostetut proteiinit, edel- | 35 lyttäen, että nämä saavuttavat hyväksyttävän puhtaustason. j
Vaadittu puhtaustaso voi vaihdella laajasti proteiinista j 20 toiseen, Lys o t syyniin tapauksessa esimerkiksi entsyymi on kiteytetty suoraan sen puhdistamattomasta lähteestä, kanan-munanvalkuaisesta (Gilliland, G.L., J. Crystal Growth 90: 51 - 59 (1988)).
5 Käytettäessä tämän keksinnön menetelmässä CLEC:einä, suuria yksittäisiä kiteitä, joita tarvitaan rontgensädedif-fraktioanälyysissä, ei välttämättä tarvita, ja itse asiassa ne voivat olla ei-toivottuja kiteiden kokoon liittyvien diffuusio-ongelmien vuoksi. Mikr©kiteiset suihkeet (se on 10 kiteet, jotka ovat suuruusluokkaa 10'1 mm kooltaan/poik-kileikkaukseltaan) ovat sopivia CLEC:eihin ja niitä havaitaan: usein, joskin niistä raportoidaan harvoin röntgensäde-kristallofrafisessa kirjallisuudessa. Mikrokiteet ovat hyvin, käyttökelpoisia, tämän keksinnön menetelmässä minimoi-15 maan diffuusioon liittyviä ongelmia (katso esim. Ouiocho, F .A. ja Richards, F,M., Biochemistry 5.: 4062 - 4076 (.1976) ) *
Yleisesti kiteet valmistetaan yhdistämällä kiteyttävä proteiini: sopivan vesiliuottimen tai sellaisen vesi-20 liuottimen kanssa, joka sisältää sopivia säästäviä aineita, kuten suoloja tai orgaanisia aineita. Liuotin yhdistetään proteiinin kanssa lämpötilassa, joka määritetään kokeellisesti sopivaksi kiteytymisen alkamiseksi ja hyväksyttäväksi ylläpitämään proteiinin stabiiliutta ja aktiivisuutta-: Liu-25 otin voi valinnaisesti sisältää yhteisiiuotteita, kuten kahdenarvoisiä kationeja, ko-faktoreita tai kaotrooppeja, kuin myös puskurilajeja pH:n säätämistä varten. Yhteisliu-otteiden tarve ja niiden konsentraatiot määritetään kokeellisesti helpottamaan kiteytymistä. Teollisen mittakaavan 30 prosessissa, kontrolloitu saostuminen, joka johtaa kiteytymiseen, voidaan parhaiten suorittaa yksinkertaisesti yhdistämällä proteiini, saostava aine, yhteisliuottimet ja valinnaiset puskurit erämenetelmässä. Vaihtoehtoisesti voidaan soveltaa myös laboratoripkiteytysmenetelmiä, kuten 35 dialyysiä tai höyrydiffuusiota. McPherson (Methods Enzymol.
114: 112 (1985)) ja Gilliland (J, Crystal Growth 90: 51 - 59 j 21 (1988}) sisältävät tyhjentävän luettelon sopivista olosuhteista kiteytyskirjallisuuden katsauksissaan. Silloin tällöin ristisidotun reagenssin ja kiteytysväliaineen välisen yhteensopimattomuuden vuoksi voidaan kiteet joutua vaihta-5 maan sopivampaan liuotinsysteemiin.
Monet proteiinit, joille kiteytys olosuhteet on jo kuvattu kirjallisuudessa, ovat erittäin potentiaalisia käytännön entsyymikatalyytteinä teollisissa ja laboratoriossa tapahtuvissa kemiallisissa prosesseissa, ja ne voidaan suo-10 raan formuloida CLEC;einä tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Taulukossa 1 on näytteitä entsyymeistä, jotka on jo kiteytetty. Huomatkaa, että olosuhteet, jotka on raportoitu suurimmassa osassa näistä viitteistä, on optimoitu suurien, diffraktioltaan laadukkaiden, kiteiden kasvun suh-15 teen usein suurella työllä. Voidaan joutua joissakin tapauksissa Suorittamaan jonkinasteista olosuhteiden säätöä pienimpien kiteiden, joita käytetään CLEC:eja valmistettaessa, tapauksissa* :
Taulukko 1 22 (Mikrobi-’ tai biologi- (Viitteet (siteeratut viit-Entsyymi ner lähde teet mukaan lukien) __ 5 . a 1 kohol i dehy d r o - Hevosen maksa Eklund et aLJ.Mal.Bwl. 146: 563- genaasi____587 0981) . a Iko ho Iloksi- Pichia pastoris Boys ei al.,J.Mol.Biol. 208: 211-212 daasi (1989)
Tykarska et ai., J.Protein Chcm. 9: __________83-860990) _' . aldoiaasi kanin lihas Eagles el al.,J.Mol3iol. 45; 533-544 1 f ruktoosi-bis- (1969) 1Π tostaatti) Heidmer et ai., Science 171: 677-680 0971) vasikan lihas Goryunov ei ai., Biofiiika 14: 1116- 1117(1969) ihmisen lihas MiHar ei ai, Trans.Roy.Soc.Lond.
B293: 209-214 (1981)
Drosophila melanogaster Brenner et ai, J..BiQl.Chem.2STi _______________ _ 11747-11749(1982)_ 1 c · aldoiaasi (PKDG) Pseudomonas putida Vandlen et ai., J.Biol.Chem. 248: _ 2253 2253(1973) _ * emäksinen fosfa- Escherichia coli Sowadski ei alitJ.Mol.Biot'i5(ii caasi_______ 245-272(1981)__ * asparaginaasl Erv-inia caroiova North ei al„ Nature 224: 594-595 {1969)
Escherichia coli Epp ei at.,Eur.J,Biochem. 20: 432- 437(1971) | on Escherichia coli Yonei ef ai, J.Mol.Biol. 110; 179- Ϊ 186(1977)
Proteus vulgaris Telsuya ei ai,J.BioLChem.l4%'.
___7620-7621(1972) earixjnic anhydrase Ihmisen punasolu (C) Kannan ei ai., J.Mol.Biol. 12: 740- 760(1965)
Ihmisen punasolu (B) Kannan et aLJ.Moi.Biol. 63: 601- 604(1972) ok i Naudan punasolu Carlsson et ai. J.MohBiol. 80: 373- ____________375(1973) katalaasi hevosen punasolu Glauser et ai.. Aaa Cryst. 21: 175- 177(1966)
Micrococcus luteus Marie ei ai., J.Mol.Biol. 129: 675- 1 676(1979) *
Pemciltium vitalc Vainshtein et ai., Acta Cryst. A37: : €29(1981) 1 30 naudan maksa Evenioff et. al.JMol.Biol. 103: 799- \ ____ 801 (1976) | - krea tiiliini- naudan sydän GiHiland et ai.. J.Mol.Biol. 170; 791- j kinaasi 793(1983) \ kanin lihas MePherson, JMol Mol. 81: 83-86 __ (1973) ; * glutaminaasi Actenobacter glutanimasificans Wlodawer et al., J,Mol.Biol. 99: 295- 299(1975) . |
Pseudomonas 7A Wlodawer et at., J.Mol.Biol. 112: | ____ 515-519(1977) j | j
Taulukko 1 (jatkuu) 23 ~ ~~ IWiicrobl- tai biologi- jViitteer. {siteeratut viit-”
Entsyymi :nen lähde cteet mukaan lukien)__ * glukoosioksi- /ispergillus tuger Kalisi el al.,J.MoLBioL 213: 20"?.
daasi _ 209 (1990) • U-lakcaTnaasit Staphylococcusaureus M chi H et a!., Biochcm /, 225: 167- )76(19¾¾)
Bacilluscereus Sullon et at..Biochem J. 248; 181 - __,__188(1987) ___ . laktaatcide-T~~" Hatkcrl et ai, JMolJioL 78: 665- hydroganaasi μυι&αϊ. 673(1973) kana Pickles et ai, JMoLBioL 9: 596-600 (1964) köirahai Adams ei ai, JMoLBioL 41: 159-188 {1969}
BaciUusmarothermaphilus Schar et αΙ.,/ΜοίΜΐαΙ. 154: 349-353 __________._ 09822 - lipaasi Geotrkhum candidum Hätä et ai, J.Biachem. 86: 1821-1827 (19792 hevosen haima Lombardo ei al.JMolMioL 205: 259- 261 (1989)
Mucor meihei Brady et al.JNaiu.rc 343: 767-770 (1990) ihmisen haima Winkler ei ai, Nature 343: 771-774 ___________________ 0990) * iusifsrassi Tulikärpänen Grten,A.A.,ei ai., Bioc/itm. Biopiiys, ______ Acta. 20: Ι70Π 9562_ »iusiferaasi Vibrio barveyii Swanson ei a/, J.Biol.Chem. 260: ___________I2B7-1289 0985)_; • nitriilihydra- Brevibaamum RSJ2 Nagasswa et a/.BiochemMiophvs.Bes, taasi Corn mun. 139: 1305-1312 (1966) P. chiororaphis B23 Nagasawa ei.aLi EsirJ.Biochem. 162: ____ 691-698 0 987) peroksidaasi piparjuuri Brailhwaite eiaL.JMalJBioi, 106; 229-230(1976) piparjuuren juuret Aibara er aLJMochem, 90: 489-496 (Tyyppi E4) (1981) ______ Japanilainen Pipariuuri Morim. Aaa Crvst. A28: 552 0 9792 •peroksidaasi Caldaromyces fureago Rubin e? al.J.Bioi.Chan. 257: 776S- (kloridi) ________I 7769(1982) ____ -peroksidaasi Sarchomvcts cerevtsac Pouios ei aL.J,Bial.Chem. 253: (sytokromi) ' 3730-3735 0973)______ . peroksidaasi naudan punasolu “ Udensiein ei ai J.Mal.BioL 104: (glutationx) _ 877-882 0 9792 . suhtillsiini Bacillus subiitis (Novo) Dremh ei οίΓ/.Αίόί.δΤοΏδ: 543-544" (1967)
Bacillus amvloiiquefoeiens Wrighi el aL. Nature 22): 235-242 (BPN) ' (1969)
Bacillus subtiUs (Carlsberg) Peisko et al.,J.Mol.Bipl. 106; 453- ____ 456 09762 j
Taulukko 1 (jatkuu) 24
Mikrobi- tai biolo- Viitteet (siteeratut viit-Lntsyymi glnen lähde_teet mukaan lukien) g « superoksidi- nauta Richardson el al.,JMol.Chem. 247: dismutaasi pinaatti 16368-6369(1972)
Moriia ei al.JMolSM. 86: 685-686 (1974)
Sacckarom-yces cerevisias, B«m ei alJ.MolMiol. 303: 327-332 Escherichia coli (3976)
Bacillmstearoihermophillus Bridgen et ai., IMotJBioI, 305: 333- 335(1976) Ί n Pseudomonas ovälis Yamakura et ai., JMoLChem. 251; iU ..... ........ 4792-4793 (1976) _ * termolysiini Bacillus ihermoprotealyiicus Matthews et ai.. Nature New Biol ___238: 37-41 ¢1972) _______ * ureaasi pitkävartinen papu SumnerJ.B.,"j£iol. Chem. 69:435 ________________ 0926)_ * ksyloosi- Strepiomyt.es rubiginosus Carrell ei ai, J.BioLChem. 259: isotneraasi 3230-3236(1984} , j- Arthrobacter B3728 Akins es a!.t Biochym.Biophys Acta XO 874: 375-377 (1986)
Streptomyces olivochromogenes Farber et ai. Protein Engineering 1: 459-466(1987)
Sirepiomyces violaceoniger GSasfeld et ai., J.Biol.Chem. 263: 14612-14613(1988)
Aninoplanes missouriensis Rey ei oi, PraieinsiStruc J^unc.Genei.
__ 14:165-172 0988) _ i \ ] -¾ 25 CLEC; ien valmistus - ristisidoksen rauodostaraisreak- tio
Kun kiteet kasvavat sopivassa väliaineessa, ne voidaan risti sitoa. Ristisitominen saa aikaan kidehilan stabi-5 loitumisen muodostamalla kovalenttisia sidoksia entsyymira-kennemolekyylien välille kiteessä. Tämä mahdollistaa entsyymin siirtämisen vaihtoehtoiseen reaktioympäristöön, joka muutoin voi olla yhteensopimaton kidehilan olemassaolon kanssa, tai jopa koskemattoman denaturoitumattoman proteii-10 nin olemassaolon kanssa. Ristisitominen voidaan saada aikaan monilla erilaisilla bifunktionaalisi 11a reagensseilla, joskin käytännössä yksinkertaisesta hinnaltaan edullisesta glutaarialdehydistä on tullut valittu reagenssi. {Muista käytettävistä risti sidoksen muodostavista reagensseista voi 15 katsoa esimerkiksi Fierce Chemical Companyn luettelosta 1990).
Ristisidosten muodostaminen glutaarialdehydillä saa aikaan vahvoja kovalenttisia sidoksia ensisijassa lysiini-aminohappotähteiden välillä, jotka tähteet ovat kiteen muo-20 dostavassa kidehilassa olevien entsyymimolekyylien sisällä ja välillä. Ristisidosvuorovaikutukset estävät kiteessä olevien entsyymimolekyyliosien pääsyn takaisin liuokseen, tekemällä tehokkaasti liukenemattomaksi tai immobilisoimal- j la entsyymimolekyylit mikrokiteisiin (ideaalisesti 10*1 mm) 25 partikkeleihin. Makroskooppiset, immobilisoidut, liu kenemattomat kiteet voidaan sitten, helposti erottaa, syötettävää raaka-ainetta sisältävästä tuotteesta ja reagoimat-tomasta substraatista yksinkertaisin menetelmin, kuten suodattamalla , dekantoimaila ja muilla menetelmillä. Niitä 30 voidaan käyttää myös CLECrllä täytetyissä kolonneissa jat-kuvavirtauksisissa prosesseissa, joissa niillä ilmenee parantuneita ko-tekijä- ja metalli-ioniviipymäominaisuuksia.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan J
CLEC:ejä, joita voidaan käyttää entsyymikätälyytteinä ole- ] 35 massa olevissa ja uusissa ympäristöissä. CLEC:ien parantu- j i j |
S
j 26 nut stabiilius, joka on seurausta ristisidoksen muodostava reaktiosta, mahdollistaa sen, että CLEC voidaan siirtää liuottiraeen (esim. vesi-, orgaanisiin tai lähes vedettömiin liuottimiin tai näiden seoksiin), joissa se muutoin olisi 5 yhteensopimaton, ja näin voidaan suorittaa kemiallinen reaktorioperaatio kohotetuissa lämpötiloissa tai ääri-pH-alueilla. Makroskooppisia CLEC-katalyyttipartikkeleita voidaan myös helposti manipuloida, jolloin ne on mahdollista ottaa taiteen uudelleen syötettävästä raaka-aineesta yksin-10 kertaisin menetelmin, kuten, suodattamalla, sentrifugoimalla tai dekantoimalla liuotin. Lisäksi näitä voidaan käyttää pakatuissa kolonneissa jatkuvavirtauksisissa prosesseissa.
CLEC:ien valmistus - lyofilisointi
Suspensiota, jossa oli yksi tilavuus ristisidottuja 1,5 termolysiinikiteitä kymmenessä tilavuudessa demineralisoi
tua vettä pHrssa 7,0, lyofilisoitiin yön yli, käyttäen VirTis Model; #24- lyofi li saattona, Lyof ilisoituj a kiteitä säilytettiin huoneenlämpötilassa 4 °C:ssa ennen uudelleen muodostusta, joka suoritettiin siten, että lisättiin kymme-20 nen tilavuutta valittua liuotinta suoraan säilytyksestä I
otettujen kiteiden päälle. Eehydratoidut kiteet muodostet- j tiin uudelleen lÖ-mM:isessa kalsiumasetaattipuskurissa, jonka pH oli 7,0 FAGLA-lohkaisututkimuksia varten. Uudelleen muodostettu j a lyof ilisoitu ja CLEG: e ja säilytettiin ru-25 tiininomaisesti huoneenlämpötilassa. Liukenematon entsyymi täytyi päinvastoin säilyttää -70 °C:ssa, jotta sen spesifinen aktiivisuus säilyy pidempään kuin viikon ajan. Tätä j menettelyä käytettiin kaikille tässä mukana olevassa esi- j merkkiosassa kuvatuille entsyymeille. j 30 Aspartaamiprekursorin synteesi termolysiini-CLEC:n j kanssa j
Esillä olevan keksinnön menetelmä, jolla valmiste- j taan ristisidottuja kiteisiä: entsyymejä, kuvataan alla ja j esitetään esimerkein valmistamalla termolysiinin ristisi- :] 35 dottuja immobilisottuja entsyymikiteitä, joita käytetään j j $ $ i 27 aspartaamindipeptidyyliprekursorin valmistamiseksi etyyliasetaatissa, joka on lähes vedetön orgaaninen liuotin. Ter-molysiini, proteiini, joka on kiteytetty ja jonka rakenne on selvitetty 1,6 Ä:n erotuksella (Holmes ja Matthews, J.
5 Mol. Biol, 160: 623 ~ 639 (1982)), on eräs esimerkki entsyymistä, jota voidaan käyttää CLECrnä esillä olevassa menetelmässä. Termolysiiniä käytetään valmistettaessa keino-tekoista makeutusainetta, aspartaamia (Isowa et ai., ÖS-patentti nro 4 436 925 (1984); Lindeberg, J. Chem. Ed. 64: 10 1062 - 1064 (1987); Nakanishi et ai.. Biotechnology 3: 459 - 464 (1985); öyama et ai., Methods in Enzymol. 136: 503 — 516 (1987)). Tällä hetkellä suurin osan aspartaamista tunnutaan valmistettavan tunnetulla synteettisellä kemialla, vaikka tunnetulla tavalla immobilisoidulla termolysii-15 nillä lähes vedettömässä väliaineessa on saatu rohkaisevia tuloksia ('.öyama· et ai., J. Org. Chem. 46: 5242 - 5244 (1981); Nakanishi et ai.. Biotechnology 3: 459 - 464 (1985)). Parannus aspartaamin valmistamisessa entsymaattisesti, kuten se on mahdollista käytetäessä esillä olevaa ··{ 20 menetelmää, voisi tehdä siitä kilpailevan menetelmän nykyi- | sin käytetyn menetelmän kanssa sekä helppoutensa että hintansa suhteen (öyama et ai.. Methods in Enzvmol. 136: 503 ~ 516 (1987)).
Termolys i ini-CLEC:ien arvioiminen 25 Esillä olevan keksinnön menetelmää on käytetty myös sellaisten termolysiini-CLEC:ien valmistuksessa, joista on tutkittu pH-riippuvuutta ja stabiiliutta, stabiiliutta kohotetussa lämpötilassa, kestävyyttä ulkopäin tulevaa pro- \ teolyysiä vastaan ja stabiiliutta orgaanisen liuottimen \ \ 30 läsnä ollessa. Termolysiini-CLEC:ejä verrattiin liukenevaan j termolysiiniin, kuten yksityiskohtaisesti selostetaan esi- ] merkissä 2 ja kuvissa 1-4. Kokeiden tulokset osoittivat \ seuraavaa::: \ 1. pH-riippuvuuden ja stabiiliuden suhteen kummassa- j 35 kin muodossa ilmeni maksimiaktiivisuus pH:ssa 7 ja saman- | [ 28 lainen aktiivisuus happamilla alueilla. 'Emäksisillä pH-alueilla CLEG säilytti maksimiaktiivisuutensa pH-arvoofi 10 saakka:; liukenevalla termolysiinillä on 75-%:inen aktiivisuus pH:ssa 8,5, ainoastaan 25-%:inen aktiivisuus pH:ssa 9 5 ja se oli täydellisesti inaktiivinen pH:ssa 9,5.
2. CLEGreissä aikaan saatu lisästabiloiluminen johtaa entsymaattisen aktiivisuuteen korkeammissa lämpötiloissa kuin mitä on mahdollista liukenevalla termolysiinil-lä. GLEC-termölyslinin parantunut stabiilius alemmissa läm- 10 pötiloissa tekee säilytyksestä yksinkertaisempaa kuin liukenevan entsyymin tapauksessa. LämpöStabiiliuS: ja kestävyys autolyysiä vastaan Osoitettiin myös termölysiini-GLECreillä, jotka säilyttivät maksimiaktiivisuutensa viiden päivän ajan, inkuboltaessa 65 °C:ssa. Päinvastoin liukeneva 15 termolysiini menetti 50 %: a sen alkuperäisestä aktiivisuudesta sen jälkeen, kun sitä oli inkuboitu kaksi tuntia, ja sen aktiivisuus oli häviävän pieni sen jälkeen, kun sitä oli inkuboitu 24 tuntia 65 °C:ssa, 3. Neljän päivän inkubointi voimakkaan streptokokki-20 proteaasin, Pronase®, läsnä ollessa ei vaikuttanut termo- lysiini-CLEG:ien entsyymiaktiivisuuteen. Liukeneva termolysiini hajosi päinvastoin nopeasti ja menetti kaiken aktiivisuutensa 90 minuutin inkuboinnin jälkeen.
4. Termolysiini-CLECrien ja liukenevan termolysiinin 25 stabiilius on merkittävästi erilainen orgaanisten liuottimien läsnä ollessa, kuten käy ilmi taulukosta 12. Termo-lysiini-CLEG:t säilyttivät enemmän kuin 95 %:a maksimiak-tiivisuudestaan sen jälkeen, kun niitä oli inkuboitu kaikkien tutkittavien orgaanisten liuottimien kanssa.
30 Nämä termolysiini-CLEC:ien ja muiden entsyymi- CLEC: ien ominaisuudet tekevät niistä erityisesti käyttökelpoisia, sillä niitä on helpompi säilyttää, ne ovat pysyvämpiä ja inaktivoituvat tai hajoavat huonommin kuin vastaavat liukenevat entsyymit.
29
Elastaasi-GLEC:ien arvioiminen
Esillä olevan keksinnön menetelmää on käytetty myös valmistettaessa eiastaasi-CLEC*ejä, jäistä on tutkittu niiden aktiivisuutta ja kestävyyttä ulkoapäin tulevaa prote-5 olyysiä vastaan» Elastaasx-CLEC:ej ä verrattiin liukenevaan elastaasiin, kuten esimerkissä 3 ja kuvissa 5 ja 6 selostetaan yksityiskohtaisesti, tutkimustulokset osoittivat seu-raavaa* 1, Elastaasi-CLEC:t säilyttivät noin 50-%:±sen ak-10 tiivisuuden liukenevaan entsyymiin verrattuna.
2. Proteaasi hajoitti liukenevan elastaasin nopeasti. Liukenevan elastaasin aktiivisuus aleni 50 %:iin alkuperäisestä aktiivisuudesta sen jälkeen, kun sitä xnkuboi-tiin 10 minuuttia proteaasin läsnä ollessa. Kun oli inku- 15 boitu yksi tunti, liukeneva entsyymi oli kadottanut enemmän kuin 90 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan. Elastaasi-GLtEG: n entsymaattiseen aktiivisuuteen inkubointi proteaasin kanssa ei vaikuttanut. |
Esteraasi-GIiEC: ien arvioiminen I
20 Esillä olevan keksinnön menetelmää on käytetty myös j valmistettaessa esteraasi-CLECrejä, joista on tutkittu nii- ! den aktiivisuus ja kestävyys ulkoapäin tulevaa proteolyysiä ! vastaan. Esteraasi-CLECxejä verrattiin liukenevaan esteraa- | siin esimerkissä 4 ja kuvissa 7 ja 8 yksityiskohtaisesti 25 selostetulla tavalla. Tutkimustuloksista ilmeni seuraavaa: | 1. Esteraasi-CLEC:t säilyttivät noin 50-%:isen ak- f tiivisuuden liukenevaan entsyymiin verrattuna. | 2. Liukeneva esteraasi oli erittäin herkkä proteo- |
lyyttiselle hajoamiselle. Liukenevan esteraasin aktiivisuus I
30 aleni 50 %:iin sen alkuperäisestä aktiivisuudesta sen jäi- j
keen, kun oli inkuboitu 10 minuuttia proteaasin läsnä oi- I
•·ί lessa. Kun oli inkuboitu yksi tunti, liukeneva entsyymi oli ] menettänyt enemmän kuin 90 % alkuperäisestä aktiivisuudes- 1 taan. Esteraasi-CLECxn entsyymiaktiivisuuteen inkubointi j 35 proteaasin kanssa ei vaikuttanut. j ! ] 30
Lipaasi-CLEC* ien arvioiminen
Esillä olevan keksinnön menetelmää on käytetty myös valmistettaessa lipaasi-GLEC:ejä, joista on tutkittu niiden aktiivisuutta. Lipaasl-ClEC:ejä verrattiin liukoiseen li-5: paasiin esimerkissä 5 ja kuviossa 9 yksityiskohtaisesti selostetulla tavalla. Tutkimustulokset osoittivat, että lipaasi-GLEC:t säilyttivät noin 90-%:isesti aktiivisuutensa verrattuna liukenevaan entsyymiin.
Lysotsyyrai-CLEG:ien arvioiminen 10 Esillä olevan keksinnön menetelmää on käytetty myös valmistettaessa lysotsyymi-GLEC:ejä, joista on tutkittu niiden; aktiivisuutta; ja kestävyyttä ulkoapäin tulevalle proteolyySille. Lysotsyymi~CLEC:ejä verrattiin liukenevaan entsyymiin esimerkissä 6 ja kuviossa 10 yksityiskohtaisesti 15 selostetulla tavalla. Tutkimustulokset osoittivat, että lysoisyymi-CLEC:t säilyttivät noin 50-%:isen aktiivisuuden liukenevaan entsyymiin, verrattuna.
03ρ3^9ΐηβ3δ1~ΟΙ.Ε0: ien arvioiminen
Esillä olevan keksinnön menetelmää on käytetty myös 20 valmistettaessa asparaginaäSi-CLECiejä, joista on tutkittu niiden aktiivisuutta. Asparaginaasi-CLEC:ejä verrattiin liukenevaan asparaginaasiin esimerkissä 7 ja kuviossa 11 yksityiskohtaisesti selostetulla tavalla. Tutkimustulokset osoittivat, että seuraavat asparaginaasi-CLEC: t säilyttivät I
25 noin 77 %:n aktiivisuuden liukenevaan entsyymiin verrattuna .
OLEG:ien yleinen käytettävyys
Kuten tässä tuodaan esille, CLEC:t edustavat uutta teknologiaa sekä laajaa käyttöä monilla aloilla, jollaisia 30 ovat mutta joihin ne eivät rajoitu, teollisen mittakaavan synteesit, lahoratoriotyövälineet, bipsensorit ja lääketieteelliset sovellukset . Esimerkkeinä erilaisista systeemeistä:, käytettäessä tunnettuja immobilisoitujen entsyymien menetelmiä niiden suorittamisessa, annetaan alla olevissa 35 taulukoissa 2-5. Asiantuntija voi Sovittaa näitä ja sa- | | 31 maalaisia systeemejä CLEC-tekniikkaan, joka on tuotu esille tässä hakemuksessa. Tämän valaisemiseksi erityisiä esimerkkejä selostetaan yksityiskohtaisemmin kustakin luetellusta alueesta* 5 Alla olevassa taulukossa 2 luetellaan esimerkkejä, joissa käytetään tunnetulla tavalla immobilisoituja entsyy-mejä teollisessa prosessissa, ja näitä esimerkkejä voi helposti soveltaa tässä esille tuotuu CLEC-tekniikkaan, 32
Taulukko 2
Entsyymi. Valmistua tai käyt- Substraatit Viitteet (Siteeratut tösaveliutuB viitteet mukaan lu- _ - , kienj termolysiini * aapartaamipreskur- Z-Asp, l<-Fhe-QMa Oyame et ai*,, J.
sori orgr, Chem, 46: 5242- 5244 (1981 Nakanishi et ai,, Trends in Biotechnology 3: ______;____ 459-464 (1985)_ * subtiliaiini a aspartaaini L-Asp-L-Phe, OMe Oavino, A,Ä.y US- patentti 4 293 648 __. _._ (1961} * lipaasi · kaakao ra av ak o rv ik- palmuöljyt Harwood, J,, Trends keet in Biochemical
Sciences 14: 1Z5 -126 (19S9)
Macrae, A. R,, J.. Aro.
Qil Chem Boc, 60: __ .____291-294 (1983)_ * nitriilihydrataa- « akryyliamidi akrylonitriili Nagösawa> T, ja si. hitriaasit, and-*· Yaraada. H,, Trends daasi in Biotechnology 7; _______. ___153 - 158 (1989) * aminoasylaasi * äroinohappcerotus D,L-aminohappojen N- sehmidt-Ksstner. G.
( sieni'*) asyyli-D, L-aroincHap- & Egerer, p,, Bio- * aminohappoesteraa- poesterit technology voi 6a: si D.L-aminohappojen 387 - 421 (1984) ja * subtiiisiini amidit siinä olevat viit- * anidaasit hydantoiihit teet.
* hy d an t ienaa 5 i t a-hydrokai kärboksyy- spesifiset dehyd- lihapot Fusee, M.¢.-, Methods rogeneasit in Enaymology 136i * aminopeptidaasi 463 (1987) * transaminaasi
Fusee, M,C«, Methods in Enzymology 136r * aminohappo * aminohappotuotan- keto- täi hydrplcsi- 463 (196?) i dehydrögenaasi 4 to: yleinen hapot. \ formaatti Rozzell, j.p., \ dehydrogenaasi Methods in Enzy- mology 136: 479 * aminoha ppo tuo t an - (1-987) to: spesifinen » L-asparaesi L-asparagiinihappo fumaraatci/fumaari- Etizyröee in Industry:
* L-aspartaatti-4- 1-aianiini happo Ed Gerharz, w,, WCH
dekarboksylaasi L-asparagiinihappo, Press 1990 äspartsasi 4 L-as- atfimoniumfuroaraatti partaatti-4-dekakar- boksylaesi L-lysiini ivfc-a-amino-e-kapro- * Acl-hydrolaasi laktaami (äGL.) L-ACT-hydrolaasi L-kysteiini Pt-2-amino-2-tiatso*‘ li ini-4 -ks.rboksyy.ti-L-isdleueiihi happo L-roetioniini L-fenyyliälaniini sinnaroaatti L-tryptofäani indoli, L-seriini L-valiini L-omenahappo furo a raa t ti D-n-käi-bamoyyli-p- 5p -hydrok s ί hy d an to - hydröksifenyyl igly- iini siini 33
Entsyymi Valmistus tai käyfcr { Substraatit Viitteet (siteeratut tösovellutus f viitteet mukaan lu~ __________________ [ kl en) - lipaasic, esteraa- - rasemaattien ero- synteettinen kemia Jones. J.B.. Tetra- sit tus scereoselektii- hedron 42: 3351-3403 visellH synteesillä (1988)
Butt S» ja Roberts, S.M., 4B9-503 (1986), ja rtäissä siteeratut viitteet Uyhjentävätnmän katsauksen saamiseksi tältä alueelta • fumaraasi L-omenahappo furaaarihappg Chiba ta et ai..
Methods in Enty-mology 136: 455 ____(1987)_ • läktaasi, (3-galak- disakkariäisyneeesi, laktoosi S M-asetyy- Larsson et ai. , tosidaasi esim. galakfcosyyll- iigalaktosamiini Methods in Enzy- N-asetyyligalakto- raology 136: 230 __Samiini___(1987)_ lipaasi. esturaasi · L-mentoli neljän isomeerin Fukui. S.. Tanaka, seos hr. Methods in Enzy- raology 136: 293 ______(1987)_ • amidaasit D-vaiiini (välituote D.L-happoamiäi Schmidt-Kastner, G, pyretroi.di-insekti- & Egerer. P.. Bio- sidi-fluvinaatilleI technology voi 6a: 387-421 (1984) ja siinä olevat vilt- _____________________ teet • lipaasi (Candida R(tj2-fenokstpropio- 2-klooripropioniha- BiocatalystS in Or- cylindricea) nihapoc (herbisidi t) pot ganie Syntheses eds
Traroper. van de Plas 6: Linko; julkaisuja kansainvälisestä sympiosiumista Alan- _______komeissa 1985_ ' lipaasit, esteraa- - orgaaninen oyntee- Jones, J.B,. Tetra- sit, amidaasit, ai- si hedron 42: 3351-3403 dolaasit raorioglyseridit (1988) Butt, S. ja peptidit Roberts, S.M., ffatu- proteaasit. pepdi- rai Product Reports daasit 489-5Q3 (1986), sekä näissä siteeratut • hiivalipaasi viitteet tyhjentä- varamän katsauksen • 2-(p-kloorifenok- raseemisen esterin saamiseksi Säitä ! silpropionihappo: hajotus alueelta: __herbisidi_ • striktodiinisynte- · alkaloidituotan to, Piitzner et ai, taasi esim. striktasidiini Methods in En-y- mology 136; 342 ___;__(19BT) __ pensisilliiniasy- * S-amiiiOpenisilLi- G- tai V-penisillii- Enz. Eng 6: 291
Isasi naanihappo ja 7-JVECfl ni (1:98,2.) • penlsilliiniami- Ens Eng B: 155 daasi genohydrögenaaEit · sterOidimuutokset Garrea et äl> Meth ods in Enrymology 1____ 136; ISO (1987)_ 34
Entsyymi Valmistus tai käyt- Substraatit Viitteet (siteeratut tösovellutua viitteet mukaan lu- __________klsn)_ * 5'-fosfodiesteraa- * 5’ -rib.onukleotidi t Keller et el», Meth- si, miklueaasit öds in Ensymology _____136; 517 (1967)_ » asteraasi · 5~iaktaartiprskur- vastaavat diesterit JP-patenttihakemus: sori (kiraaliset 82 » 159, 493 {1981') mcnoesterit. esim, Biseihutsu Company fi-aminoglutaarihap-__ pomonoalkyyliesteri) lipaasit * fl»salpaajät Kloosterman, M et ai... Trends in Biotechnology 6: 251- [______j__J_ 256 (1988)_ j | j
I
! | | 35
Akryyli amidin valmistaminen. CLEC-tekniikkaa käyttäen
Seuraajassa kuvataan erästä esillä olevan keksinnön menetelmän käyttöä; tässä aikaisemmin selostetun CLEC-tekniikan soveltaminen akryyli amidin valmistukseen immobi-5 lisoiduista soluista, jotka tuottavat ylimäärin nitriili-hydrataasientsyymiä (Nagasawa, T. ja Yamada, H, Trends in Biotechnology 7: 153 - 158 (1989)).
Akryyliamidin, tärkeän kulutushyödykkeen, teollisessa mittakaavassa tapahtuvan valmistuksen on kuvannut Yamada 10 tutkimusryhmineen (Nagasawa, T. ja Yamada, H. , Trends in Biotechnology 7: 153 - 158 ¢1989)). Akryyliamidia tuotetaan kilotonneja vuosittain kemiallisissa reaktoreissa, joissa on käytetty suljettuja soluja, jotka on valittu siten, että ne tuottavat ylimäärin nitriilihydrataasientsyymiä. Nitriili-15 hydrataas! on myös raportoitu puhdistettuna ja kiteytettynä kahdesta lähteestä, Brevibacterium R312:sta (Nagasawa et al>, Blochem. Biophys. Res. Commun. 139: 1305 - 1312 (1986) ja P. chlororaphis B23:sta (Nagasawa et ai. , Eur. j. Bio-chem. 162: 691 - 698 (1987). Kute tässä tuodaan esille, 20 kiteiset entsyymit voidaan kukin immobilisoida ristisito-malla ne glutaariäldehydin tai jonkin muun sopivan risti-sidoksen muodostavan reagenssin kanssa CLEC:n valmistamiseksi. Nitriilihudrataasi-GljEC: ejä voidaan sitten käyttää tunnetussa reaktorissa nykyisin käytettävien suljettujen solu-25 jen sijaan. Soveltamalla tämä menetelmä CLEC“tekniikkaan, saadaan välittömiä etuja. Tällaisia ovat: pienentynyt tehdaskoko ja parantunut läpimeno, joka johtuu kohonneesta aktiivisuudesta yksikkötilavuutta kohden, mikä ilmenee CLEC:eissä suurempana entsyymikonsentraationa, ja parantu-30 neet substraatin ja tuotteen diffuusionopeudet; ei-toivotun kontaminoitumisen ja sivureaktioiden väheneminen, jotka johtuvat CLEC:ien suuremmasta puhtaudesta; ja vähentynyt herkkyys mxkrobikontäminaatiolle, kun soluja ei ole mukana. Lisäksi on olemassa muita etuja, joita on ainoastaan CLEC-35 perustäisessä menetelmässä. Tällaisia etuja ovat: korkeampi toiitiintaläropötila reak t ionopeuks ien parantamiseksi; kyky 36 suorittaa työ vesi-, orgaanisissa- ja lähes vedettömissä liuottimissa, jolloin akryyli amidin valmistusreaktio on mahdollista optimoida; ja parantunut puoli intiimi® ikä työn suorituksen; aikana ja varastoitaessa, mikä johtuu CLEG:ien 5 suuremmasta kemiallisesta ja mekaanisesta pysyvyydestä, erityisesti ei-tavanomaisissa liuottimissa.
CLEC-tekniikan lääketieteelliset sovellukset ~ kehon ulkopuolella tapahtuva hoito
Esillä olevaa keksintöä ja sopivasti valittua 10 CLEC:ta tai CLEG:ien sarjaa voidaan käyttää myös lääketieteellisissä sovelluksissa. CLEC:tä tai CLEC:ien sarjaa voidaan käyttää esimerkiksi poistamaan komponenttia nesteestä, kuten verestä, tavallisesti muuttamalla komponenttia ja siten muuttamalla se aineeksi, joka ei ole haitallinen yksi-15 lölle, tai jonka normaalit kehon toiminnot voivat poistaa (esim. myrkyttömäksi tekemisen tai hajottamisen kautta maksassa/ munuaiserityksen kautta). Tässä sovelluksessa sopivasti valittu CLEC tai CLEC:t saatetaan yhteen kehon nesteen kanssa, joka neste sisältää muutettavan komponentin 20 tai reaktion, johon komponentti ottaa osaa, reagoivan aineen (tuote tai substraatti), jossa CLEC:eissä oleva entsyymi toimii. Lopputuloksena entsyymi kykenee toimimaan muutettavassa komponentissa tai jonkin toisen aineen kanssa, joka on tuote reaktiosta, johon muutettava komponentti | 25 ottaa osaa. Entsyymin aktiivisuuden vuoksi poistettava komponentti muuttuu suoraan tai reaktion, johon komponentti ottaa osaa, tuote muuttuu (jolloin reaktion jatkuminen käy mahdottomaksi). Tämä voidaan suorittaa siten, että käy-teätään kehon ulkopuolista laitetta, joka käsittää sopivas-30 ti valikoidun CLEC:n tai sarjan CLECrejä ja pidätyslait-teen, joka on valmistettu materiaalista, kuten huokoisesta materiaalista, johon CLEC pidättäytyy, tai putken/ jossa CLECttä on, jolloin yhteys itse komponentin tai nesteessä olevan aineen välillä, joka aine on tuote reaktiosta, johon 35 muutettava komponentti ottaa osaa, on mahdollista,:: 37 Tämä voidaan saada aikaan myös siten, että asetetaan sopiva CT..EC sopivaan ruumiinosaan, kuten vatsakalvoon tai imusolmukkeeseen, josta CLEC pääsisi kehon nesteisiin* Tämä asetus voidaan tehdä kirurgisesti tai injisoimalla 5 CLEC-suspensio. CLEC:n suora injektio verivirtaukseen ei ole sopivaa, koska silloin on veritulpan vaara.
Sopivien CLEC:ien käyttö tällä alueella toimii vaihtoehtona geneettisille menetelmille entsyymikorvaushoi-dossa, jolla korjataan luonnollista vajautta, kuten esim.
10 virtsan liiallisessa fenyyliketonipitoisuudessa.
Taulukossa 3 valaistaan joitakin lääketieteellisiä sovelluksia, joissa CLEC;ejä voidaan käyttää. Suurimmassa osassa näistä tapauksista kehon ulkopuolinen hoito on del-leen tutkimusvaiheessa, mutta niillä eduilla, joita CLEC:t 15 tarjoavat, voidaan saada uusia hoitomuotoja alueilla, joissa aikaisemmin ei ole ollut: vaihtoehtoista· hoitoa.
j | $
J
$ :! j 38
Taulukko 3 Käytetty ent- Poistettava Hoidettu sairaus/pptiläat Viitteet syy mi__aine_ 5 · äspäragi- < asparagilni · leukemia (flsparagiinin, tär- Klein, M,;, Langar, naasi keär: syövän ravintoaineen R, ,. Trends in 3io- poistäminen vahingoittaa leu- technology 4:: 179-- kemiasoluja, jotka eivät voi IBS (1986) ja siinä valmistaa välttamätäntä amino- olevat viitteet) happoa - asparagiinlar normaa- 1i solut voivat valmistaa aspa- Chang. T.M.S., Meth- ragiinia ja siten tämä käsit- ods in Eniymology tsly ei vaikuta niihin.) 137: 444-4.37 (1987) ja siinä: olevat ________ viitteet * heparinaasi · hepariini · hepariinin poisto hemoper- Langer, R., et ai., fuusiopotilaissa, esim. munu- Science 217: 251-253 _____________ aisdialyysi_ (1932) * bilirubii- · bilirubiini - vastasyntyneen keltatauti Lavin, A, , et ai., nioksidaasi Science 230: 543-545 _______________(1985) _ 10 kerhoksi-: * metotrek” · kemoterapiapotilaät Pitt. Λ.Μ., et ai- , peptidaasi saatti fippl. Hiochnm Hio- tecbndl 8: 55-6Θ _____(1983)_ tyrcsinaasi · aromaattiset · maksavaurio. jossa ilmenee ehäng. T.M.S.. Sem, aromihapot patologista aminohappotasojen Liver (Dia. Ser, 6: kohoamista 148 (19861 fenyyli- fenyyliala- virtsan liiallinen fenyyli- ambrus, C.M. et ai., alaniiniam- niini ketcnipitoisuus j a maksavaurio J:. ipharm. L· Εκρ, 15 moniumlyaasi Ther. 224: 598-602 _____ (1983) * monientsyy- · uraa (muu- myrkyttömäksi tekeminen Chang, T.M.S., Meth- misysteemi, tättii gluta- kroonista munuaisvauriota sai- pds in Enzymology
Johon kuulu- miitii- ja raatavissa potilaissa 137 : 444-457 i ! 937) vati ureaasi. muiksi amino- ja siinä olevat 20 giutamaattide hapoiksi ammo- viitteet hydrogenaasi, niakin kau tta.) glukoosi, Chang,. T.M.S., dehydrogenaä- Enzyme Eng 5: 225 si a transa- (1980) 25 lainaasi * arginaaei · arginlini ». sukuparälnen veren liialli- Kfinalas J,J, et ai, , nen arginiinipitoiauus Biochem, Med* 2.7i |._____;__4fi:-55 {1982) _ * gulamaatti- * ammoniakki * maksavaiirio Maugh, T.H.. Science dehydrogenaa- 223: 474-476 (1984) 30 si & amntoni- I akkl _j____________ 39
Erityinen esillä olevan menetelmän sovellus on 'tiepä-riinilyaasisysteemi hepariinin poistamiseksi verestä (Bernstein et ai.. Methods in Enzymol. 137: 515 - 529 (1987)), jota selostetaan alla.
5 Kaikissa kehon ulkopuolisissa laitteissa, joissa perfusoidaan verta, kuten munuaisdialyysissä, jatkuvassa valtimoverisuonten punasolujen suodattamisessa tai kehon ulkopuolisissa kalvohapettimissa, täytyy potilas hepa-rinisoida veren hyytymisen estämiseksi. Potilaan hepa-10 rinisointi johtaa kuitenkin yerenvuotökomplikaatioihin ja uhkaa ihmisen turvallisuutta. Nämä ongelmat kasvavat, kun perfuusioaika pitenee, esimerkiksi kalvohapettimen tapauksessa, ja ne voivat johtaa vakaviin vuotoihin. Kehon ulkopuolisen terapian jälkeen, hepariini voidaan poistaa verestä 15 käyttämällä heparinaasiläitetta kehon ulkopuolisen laitteen ulos virtaavassa nesteessä, joka laite eliminoi kaiken hepariinin verestä, joka palaa potilaaseen, ja siten vältytään nykyisiltä heparinisointiin liittyviltä ongelmilta.
Julkaistussa tutkimuksessa (Langer et ai., Science | 20 217: 261 - 263 (1982)); Bernstein, et ai., Methods in Enzy- j
mology 137: 515 - 529 (1987) ) , kuvataan yksityiskohtaisesti I
ongelmia, joita esiintyy tunnetulla tavalla immoblisoiduis- j sa entsyymeissä, joita käytetään kehon ulkopuolisissa lait- j teissä. Suurin ongelma on se, että tunnetulla tavalla suo- j 25 ritettu immobilisointi johtaa siihen, että entsyymiaktiivi suus yksikkötilavuutta kohden säilyy vähän aikaa, ja siten tarvitaan suuria määriä immobilisoitua entsyymiä tarvitta- | van heparinisoinnin suorittamiseksi. Tämä määrä on liian | suuri ollakseen käytännöllinen ihmisillä käytettäessä. Suu- | 30 ri aktiivisuuden säilyminen yksikkötilavuutta kohden j CLEG:issä, mikä johtuu inertin kantaja-aineen puuttumises- j ta, kiertää tämän ongelman ja tarjoaa käytännöllisen rat- j kaisun hepariinin poistoon ihmisillä. CLEC:n parantunut j pysyvyys vähentää entsyymin irtoamista ristisidotusta ki- j 35 teestä. Tämä on parempi kuin vähemmän pysyvät, tunnetulla j
J
| 40 tavalla immobilisoidut entsyymit, koska immuunivasteet, joita syntyy entsyymivuödon vuoksi, vähenevät. CLEC;n läm-pötilastabiilius estää entsyymin denaturoitumisen, joka johtuu korkeista ohimenevistä lämpötiloista säilytyksen 5 aikana; on todennäköistä, että CLEC voi säilyttää suuren aktiivisuutensa jopa silloin, kun sitä säilytetään huoneenlämpötilassa. Lisäksi CLEC on halvempi ja mukavampi käyttää kuin niiden tavanomaisesti immobilisoidut vastineensa, koska niillä on pidempi työskentely- ja sailytysikä.
10 GLEC-tekniikan lisäsovelluksia: biosensorit CLEC:tä tai CLEC:ien sarjaa voidaan käyttää komponentteina sensoreissa, joihin viitataan biosensoreina, jotka ovat käyttökelpoisia detektoitaessa ja/tai kvantitoi-taessa haluttua analyyttiä nesteessä, kuten ruumiin nes-15 teessä (esim. veri, virtsa), kemiallisessa ja laborato-rioreaktion väliaineessa, orgfaanisessa väliaineessa, kas-vatusvällaineessa ja juomissa. Joissakin tapauksissa ky-* seessä oleva neste voi olla kaasu, kuten alkoholiini ttareis-sa, jotka analysoivat hengitystä (Barzana, E., Klibanov, A.
20 ja Karell, M., MASA Tech Briefs 13:104 (1989)). Tässä GLEC:t saatetaan yhteen analysoitavan nesteen kanssa, josta haluttua analyyttia tutkitaan. Haluttu analyytti voidaan mitata suoraan (esim, veren gluköositaso) tai epäsuorasti (esim. detektoimaila ja kvantitoimalla ainetta, joka on 25 reagoiva aine (tuote tai substraatti) reaktiossa, johon tutkittava analyytti ottaa osaa). Kussakin tapauksessa CLEC pystyy toimimaan änalyytissä tai aineessa, joka on reagoiva aine reaktiossa, johon analyytti myös ottaa osaa. Entsyymin \ aktiivisuus johtaa havaittaviin muutoksiin (esim. muutos j 30 pH:ssa, valon, lämmön tuotto, muutos sähköpotentiaalissa), jotka detektoidaan ja/tai kvantitoidaan sopivilla detek-töintivälineillä (esim. pH-elektrodi, valolle tai lämmölle j reagoiva laite, laitteet sähköisen muutoksen mittaamiseen) j
(Janata, J. et ai., Anal. Chem. 62: 33R ~ 44R (1990)). I
35 Kaikkia välineitä, jotka ovat käyttökelpoisia entsyymikata- j 3 41 lysoidusta menetelmästä johtuvien muutosten havainnoimiseksi, voidaan käyttää. Esillä olevan keksinnön biosensor!, joka sisältää CLECitä tai sarjan GLEC:ejä ja välineen CLEC:n pidättymiseksi,, mikä mahdollistaa CLEG:n(ien) ja 5 halutun analyytin tai nesteessä olevan aineen, joka on reagoiva aine reaktiossa, johon haluttu analyytti ottaa osaa, välisen yhteyden.
Taulukossa neljä valaistaan joitakin biosensoriso-velluksia, joissa GLEG:ejä voitaisiin käyttää. Tällä het-10 kellä näissä sovelluksissa käytetään tunnetulla tavalla immobiiisoituja entsyymejä, mutta ne kärsivät alhaisesta stabiiliudesta, alhaisesta entsyymitiheydestä, lyhyistä elinajoista ja toistettavuuden puutteesta. Näihin esimerkkeihin voidaan helposti soveltaa tässä esille tuotua CLEC-15 tekniikkaa.
] Ί j 42
Taulukko 4 Käytetty entsyymi Havaintojen -teko- sovellus Viite __ kohde__.___ « giukoosioksi- » glukoosi 1 diabeetikot · Daniles, D,, Hdeebsch1 K., 5 daasi Methods in Etymology 137: 4-7 (19Β7Ϊ • Hall. E "Biosensors" Open University Press (1990) Täylyr» Ft., Proceed. Biotechnology Confererice 1989: 275-237 • Anthony et ai.r 1Biosensors, Fundaraenenta1s and Applications" , Oxford University ____________Press f1937) * kreatiinideimi-' 1 kreatiniini « munuaisotpirainto 1 Tabatä, M» et ai-. Anal, naasi Biocbeuj. 134 ϊ 44 (1903) * ureaasi r urea « ir.unuaistoimihtö · Hsuie, G. H et ai., Polyra.
Mater. Sei. Eng. 57: 825-029 (1987) - Köbos, et ai.. Anal. Chem.
_^_ _'__60: 1996-1998 (19S3)_ * läktaattioksi- läktaatti 1 kliiniset sävel- · Blasdel, W,J·. δ Jenkins.
10 daasi ä dehydro- lukset R,Ä.r Anal. Chem. 48(8): 1240 genaasi (1976) • 3agaguchi, Y., et ai., J.
_____Appi, Biocheia 3: 32 (1981) glukoosi“6-pyru- v Glukbosi-6-fok- · diabeetikot ja » ibid gliikbPb£ oks i daasina vaa11icehydroge- faatti, sakkaroosi muut lääketiefceel- naasi ' ja ÄTP lisefc soveilukset ____________ 15 | alkoholidehyd- 1 etanoli δ muut I · hengityksen ana- I 1 Romette, J.L, et ai., j rögenaasi1 alko- alkoholit: etik- lysoijat ja teol- Methods in Enzymplogy 137: holioksidaasi ka-, muurahaisha- liset sovellukset 217-225 (1907) pot » 'Ho, M.H., Methods in Ensymo- ____________logy 137; 271-258 (1987}_ * β - Jruk-tos idaas-i · sakkaroosi 1 teolliset sovei- · Rometta, J.L. et ai,, Meth- lukset ods in Enzymology 137: 217-225 ___________(1967) ___ * kolesteroliok- kolesteroli < kolesterolin “ Satoh» I., Methods in En- 20 aidaasi mittaus gymolpgy 137: 217-225 (1937) *·· katalaasi 1 virceahappo, · valtimon hau- » ibid glukoosioksidaasina koiesteroli rauskovetustauti ja. muu lääketie-teellinen_______________________________ karboksipepti- · metotreksaatti 1 syöpä r ibid glukopöioksidaasina daasi hillihäppöan- hiilidioksidi teolliset, labors- 1 ibid giukoo&ioksidaeaine 25 hydraäsi torio δ ympäristö- '__sovellukset_ L-aminbhappopk- 1 aminohapot 1 iääkötieteelli- 1 ibid glukoosiokaidaaeina aidaasi___________nsn .1a toellinen ^ ·· β-laktamaasi- 1 penisilliini 1 lääketieteelli- .·· Antai et ai. . Bull. Chen.
panisiliinaasi nen_ Soc. Jpn. 60: 4133-4137 (198B)
30 Η 1 emäksinen fos- j 1 fosfaatti | · me K sbol i I t ti seu- j · ibid glukoosioksidaasina II
f a t aas!________rant a_' _____ nitrsatei/nit- 1 nitraatit & nit- · metaboliitti- ja · ibid glukoosioksidaasina r ii tt Iradnktaasi riitit ruuanvaiyar.ta 43 Käytetty entsyymi Havaintojen teko- Sovellus Viite kohde äryylisulfataa- · sulfaatti · metaboliittiseu- ibid glukoosioksidaasina si.............. ranta * sukklnäattide- sukklnaatti * teollinen » ibid glukoosioksidaasina hydrogenaasi__ 5 * bakteeriiusife- FE’iN^ ja kytketyt * jonka Wannlund, J,, et ai., "Lutni- raasi reaktiot moolimäärM an nesenssikokeet: Tulevaisuuden-
Iq-IB^ detektointi näkymiä endokrinologiassa ja mittaamalla foto- kliinisessä kemiassa", toim, nin vapautumista Serio. H. ja Paszagli, H.
1:125 (1932) • Kurkijärvi et ai-. Methods in Enzymology 137: 171-181 ______{1967 j _ » tulikärpäsen ATP ja kytketyt ' ÄTP:n, jonka · Kurkijärvi et ai,. Methods lusife.raasA reaktiot mooli-määrä on in Enzymology 137: 171-181 10"*^, detektointi (1987) mittaartsalla foto- * Hurachi et ai.. Methods in nin vapautumista Enzyraology 137: 260-271 (1988) 1Q ....... -.............. !ist=a^tt............_:;-·Ι ii | $ ] | | 44
Esillä olevan keksinnön menetelmässä, kun se suoritetaan biosensorissa olevien näytteiden analysoimiseksi, on erityisen toivottavaa tuottaa suurin mahdollinen havaittavissa oleva signaali pienimmästä mahdollisesta määrästä 5 substraattia ja katalyyttiä. Tässä suhteessa esille tuotava CLEC-tekniikka on. erityisesti kiinnostava, koska sen avulla päästään suurimpiin mahdollisiin entsyymikatalyyttikonsent-raatioihin annetussa tilavuudessa.
Usein tehdään huomattavasti työtä kiinostukeen koh-10 teenä olevan perusentsyymireaktion kytkemiseksi joko suoraan tai sopivien välituotteiden kautta entsyymien, kuten lusiferaasin, valontuotantoon (Kurkijärvi et. ai., Methods in Enzymol. 137: 171 - 181 (1988) ) . Tämä tehdään, jotta voitaisiin käyttää hyödyksi fotonin detektointilaitteen 15 erisuuntaista herkkyyttä ja tehokkuutta, jonka laitteen avulla voidaan tehdä havaintoja entsyymireaktiotuotteiden femtomoolisista konsentraatioista sopivissa olosuhteissa.
Tätä periaatetta noudattaen on suunniteltu biosensorijär-jestelmiä, käyttäen tunnetulla tavalla immobilisoituja ent-20 syymeja, erilaisten kliinisesti ja muilla tavoin merkittävien substraattien havainnoimiseksi, Valoa tuottavat reaktiot on kytketty koereaktioihin, jotka detektoivat substraatteja, kuten D-glukoosia, L-laktaattia, Li-glutaraaattia ja etanolia, muiden muassa* erittäin alhaisina pitoisuuksi-25 na.
Tämän hakemuksen suhteen, lusiferaasientsyymi, joka on saatu Vibrio harveyi i:s tä, on raportoitu kiteisenä j (Swanson et ai., J. Biol. Chertu 260-, 12.87 - 1289 (1985)).
Tämän lusiferaasin kiteet voidaan ristisitoa glutaarialde-30 hydin tai jonkin muun sopivan reagenssin kanssa CLEC-lusiferaasin muodostamiseksi. Biösensori- ja analyyttisiä käyttötarkoituksia varten ClilC-lusiferaasi tarjoaa monia etuja tunnettuun immobilisoituun entsyymiin verrattuna.
GLEC:ssä koko lusiferaasi-CLEC:n tilavuus voisi koostua va-35 loa emittoivasta entsyymistä. Tunnetussa immobilisoidussaa entsyymisysteemissä kuitenkin "inertti" kantaja-aine ottaa 45 talteen niinkin paljon kilin 95 % kokona!stilavuuäesta, ja kantaja-aine toimii paremminkin entsyymin emittoivan valon absorboijana. Lisäksi CLEC:ien parantuneen stabiiliuden tulisi helpottaa säilytystä huoneenlämpötilassa ja mahdollis-5 taa myös uusia sensorisovelluksia vaativissa olosuhteissa ja kohotetuissa lämpötiloissa.
CLEC-tekniikan lisäsovelluksia - laboratoriöreakti-oita CLEC:ejä voidaan käyttää laboratorioreagensseina 10 pienissä kolonneissa eräprosesseissa, joita voidaan käyttää laborstorioreaktioiden suorittamiseksi. Jotkut näistä laajan kategorian reaktioista ovat taulukossa 5.
46
Taulukko 5 Käytetty entsyymi Katalysoitu reaktio tyyppi.__Viite__ * lipaäelt.; foafolipaaalt ' Stereoselektiiv.in-en syntee- » Zaks,· Ä. fit Klibanov, A, M.
si; käsittää esteröinnin, Proc. Nät. Aca. Sei. USA. 82: träaeesterölhnih·,, äminolyy- 3192-3196 (1985) sin. laktonisbinteja, poly- * Kl.ib.anov. A.M. ÄcC. Chem.
köndensainteja, asyloirmiiV, Rea. 23: 114-120 (1990) ja oksimolyysin ja raseemisten siinä olevat viitteet seosten erotuksen * Wong. C.H., Chsmitraets-
Drganic Chemistry 3:91*111 (1990) ja siinä olevat viit- __tee t_ * estaraatit ’ stereoaslektiivinen syntee- Kovbaysshi et ai.. Tetra si ja erotus hedron Letters Voi 25, #24: 2557-2560 {1984) • Schneider et ai-, Agnew.
Che*. Int. Ed. Engl. 23 {#!): ____64-68 (19B4 )_ » tyrosinaasi 1 fenolien hapetus kinonien · Kazandj ianr R.Z. ja Kli- välmlstamiseksi banov. A.M. j. Am Chem. Sbc ____110: 594-589 (1986)_ . orntöASRir 1 m suhtili- * hiilihydraattien stereos®*· * Kiva et ei- Am. Chem.
sllni latiivinen asylolncl Soc. 110= 584-569 (19B8) t .efesidaasit * hiilivetyjen selektiivinen .♦· Klibanov. A.M. Acc. Chem.
hapatus Res 23.: .114-120 (1990) ja siinä olevat viitteet - muita entsyymejä, joissa ai * stsreoselekciivinen syncee·· - Wong. C.H., Chemisracte- tarvita kb.teki j oitä: isoiiie- si; Organic Chemistry 3:91-111 raasit, lyaasit. aldolaasit, (1"°) ia siinä olevat viit- glykoayylitransferaasit, gly- teet kosidaasit ·«· muita entsyymejä, joihin ei ·. stereoEelektiivineri syntee- - Wong. C.B- chemstrats-ör- tarvitsa lisätä ko~ Leiki joitä; Si ganic Chemistry 3:91-111 flavoentsyymir. pyridoksaäli- (1.990) Ja siinä olevat iit- fösfaattientsyymit. metal- teet ioentsyymit ..........
· entsyymit, joissa tarvitaan * stereoselcktiivinen syntee- * Wong> C.H. chemistrate-br^· kb-tekljäitä: kihaasit (ATP), si ganic Chemistry 3s91-lll oksidoreduktaaait (KAD/P). (1990) ja siinä olevat viit- metyylitransferaasit (SAM), teet
CoA:n tarvitsevat entsyymit, sulfuraasit (PAPS)_ _______________ 47
Schneider et ai. (Agnew, Chem. Int. Ed. Engl. 23 (No. 1) : 64 -68 (1984)) valaisee entsyymien käyttöä or gaanisissa synteeseissä. Porsaan maksa-esteraasia käytettiin muutettaessa meso-esteri kiraaliseksi monoesteriski 5 vesipitoisessa fosfaattipuskurissä.
CLEC-kata1yso itujen reaktioiden edut ovat kolminkertaiset laboratoriokäytössä. Ensinnäkin CLEC pysyy erittäin aktiivisena vaativissa ympäristöissä (esim, vesi-, orgaanisissa, lähes vedettömissä liuottimissa ja niiden seok-10 sissa, sekä korkeissa lämpötiloissa), jotka ovat tyypillisiä laboratoriossa suoritettavia kemiallisia synteeslkökei-ta. Toiseksi CLEC on stabiili työskenneltäessä ja säilytettäessä, mikä on sopivaa jaksottaisille laboratoriokokeille. Kolmanneksi, niiden suuri aktiivisuus yksikkötilävuutta 15 kohden mahdollistaa lyhyemmät reaktioajat ja tarvitaan pienempiä määriä entsyymiä (yksikköä aktiivisuutta kohden). Siten edut, jotka CLEC:t tarjoavat vapaisiin tai immobli-söituihin entsyymeihin verrattuna, antavat orgaanisen kemian kemisteille vaihtoehtoisen, erittäin selektiivisen syn-20 teettisen työvälineen.
Kaikki edellä kuvatuissa tapauksissa, mutta jotka eivät rajoitu niihin, asiantuntija voivat soveltaa tämän keksinnön menetelmää muuttamaan prosessia, jossa käytetään tunnettua immobilisoitua entsyymikatalyyttiä siten, että 2.5. siinä käytetään sopivan entsyymin CLECltä, CLEC:t eivät ainoastaan korvaa tunnettuja immobilisoituja entsyymejä, vaan niitä käytetään myös soluvälitteisissä muutoksissa. Esillä olevaa keksintöä valaistaan nyt seuraavilla esimerkeillä, joiden tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintöä millään ta-30 voin.
48
Esimerkki 1
Terffiolysiinin kiteytys ja ristisitominen aspartaa-min prekursorin, Ä-Asp-Phe-OMe:n synteesiä varten Kiteytys 5 250 mg termolysiiä Bacillus thermoproteolyticus; sta hankittiin BoehrInger-Mannheim GmbHista ja liuotettiin 4 ml:aan 45-%:ista dimetyylisulfoksidia (DMSQ) ja 55-%:iseen 1,40-M:iseen kalsiumasetaattiin, 0,50-M:iseen natriumkako-dylaattiin, jonka pH oli 6,5. Nämä lähtökonsentraatiot ovat 10 sama kuin mitä Matthews et ai, on kuvannut diffraktioiaa-tuisten termolysiinikiteiden valmistamiseksi (katso, esim. Holmes ja Matthews, J. Mol. Biol. 160: 623 - 639 (1982)). Proteiiniliuos väkevöitiin sitten l ml:ksi Centricon 10 -mikrokonsentraattorlssa. Mikrokiteitä saatiin hyvällä saan-15 nolla tuikekiteytysmeneteimällä, joka nyt tuodaan esille tässä, jossa 1 ml vettä tai 1,40-M:ista kalsiumasetaattia, 0,50-M:ista natriumkakodylaattia, jonka pH on 6,5 injisoi-daan nopeasti jompaan kumpaa edellä kuvatuista termolysii-ni-DMSÖ-liuoksista. Tästä menetelmästä saadaan kuusikul-20 maisten mikrokiteiden suihku, jotka ovat suurin piirtein yhteneviä ulottuvuuksiltaan (noin 10'1 mm pituudeltaan). Termolysiinimikr okiteiden ristisitominen Menettely, jota käytetään tämän keksinnön menetelmän tässä erityisessä esimerkissä, on sovellus, jonka on kuvan-25 put Nakanishi et ai. (BiOtechmplogy 3: 459 - 464 (1985)), jossa menettelyssä termolysiini imeytettiin ensin kantaj a-ainehelmeen, joka koostui ioninvaihtohartsista, Amberlite XAD-7, ja tämän jälkeen se risti,sidottiin glutaarialdehydin kanssa (Quiöchö ja Richards, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 30 52:833 - 839 (1964)). Tässä esimerkissä edellä saadut ter- molysiinin mikrokiteet sentrifugoitiin ja pelletoitiin, ja sakan yläpuolella olevasta neste heitettiin pois. 5 ml 17,5-%:ista teknistä laatua olevaa glutaarialdehyäiä, joka oli 2, 5-%:isessa DMSOrssa, 0,05-M: ssa kalsiumasetaatissa ja 35 0,025-M:ssa natriumkakody1aatissa, jonka pH oli 6,5, lisät- 49 tiin sitten mikrokiteisiin. Seosta inkuboitiin varovasti sekoittaen 37 “Cissa neljä tuntia. Histisidoksen muodosta-misreaktio lopetettiin pesemällä toistaen kiteet 10 ml: n määrillä vettä glutaarialdehydiliuoksen poistamiseksi. Pes-5 tyt ristisidotut termolysiinikiteet muodostavat termolysii-ni-CLEC:n, jota. käytettiin alla katalyyttinä.
Z-fisp-Phe-OMe:n synteesi vesiliuoksessa 5 ml termolysiini-CLEC-suspensiota lisättiin jatkia-vasekoitteiseen eräreaktoriin, joka inkuboitiin 37 °C:ssa. 10 Sentrifugoinnin ja sakan yläpuolella olevan nesteen dekan- toinnin jälkeen vesipitoinen reaktioseos lisättiin CLECreihin. Tämä liuos valmistettiin siten, että sekoitettiin 80 mg Z-L-Asp:tä ja 80 mg L-Phe-OMe-HCl:a 1 ml:ssa vettä, lisäten etikkahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 7,0. 15 HPXjO-analysointia varten otettiin näytteitä. Taulukossa 6 esitetään Z-L-Asp-substraattipiikin HPLG-piikkikorkeus, kun osoitettu reaktioaika oli kulunut, normalisoiden arvoon 1 ajanhetkellä t=0. Koska Z-L-Asp on noeputta "rajoittava tässä reaktiossa, sen poistuman mittaaminen vastaa samaa kuin 20 mitattaisiin tuotteen, Z-L-Asp-L-Phe-QMe, ilmaantumista (Nakanishi et ai., Biotechnology 3: 459 - 464 (1985)). Taulukko 6 käsittää myös jäljelle jääneen rajoittavan Z-L-Asp-substraatin normalisoidun piikin korkeuden sekä arvion reaktion päättymisasteesta. On selvää, että reaktio etenee 25 noin 20 %: iin päättymisestä ensimmäisten 30 sekunnin aikana ja pysähtyy siihen. Tulokset ovat yhteneviä Nakanishi et ai.:n havaintojen kanssa (Biotechnology 3: 469 - 464 (1985)), kun käytetään tunnettua immohilisoitua termo-lysiiniä edellä olevan kaltaisessä vesipitoisessa reak-30 tioseoksessa, ja ne johtuvat Z-L-Asp-L-Phe-OMe-tuotteen niukkaliukoisuudesta vedessä.
50
Taulukko 6
Reaktioaika Piikin korkeus Prosentuaalinen
Aika (sek) (normalisoitu) reaktion etene- 5: nen 0 1,000 30 0,727 27,3 % 60 0,857 14,3 % 120 0,940 6,0 % 10 ISO 0,797 20,3 % Z-Asp-Phe-OMe:n synteesi lähes vedettömässä liuoksessa 5 ml termolysiini-CLEC-suspensiota lisättiin jatku-15 vaseköitteiseen eräreaktoriin, jota inkuboitiin 37 °C:ssa. Sentrifugoinnin ja sakan yläpuolella olevan nesteen dekan-toinnin jälkeen lähes vedetön orgaaninen reaktioseos lisättiin CLECieihin. Tämä liuos valmistettiin siten, että sekoitettiin 80 mg Z^L-Aspia ja 240 mg L-Phe-OMe:ta 1 ml:aan 20 99-%:ista etyyliasetaattia. ja l-%;iseen veteen, HPLC-ana- lysointia varten otettiin näytteitä. Taulukossa 7 esitetään Z-L-Asp-substraattipiikin HPLC-piikin korkeus sen jälkeen, kun osoitettu reaktioaika on kulunut, normalisoituna arvoon 1 ajanhetkellä t = 0, Koska Z-L-Asp On nopeutta rajoittava 25 tässä reaktiossa, sen häviämisen mittaaminen vastaa samaa kuin mitattaisiin tuotteen, Z-L-Äsp-L-Phe-OMein ilmestymistä (Nakanishi et ai.,, Biotechnology 3: 459 - 464 (1985) ) . Taulukko 7 sisältää myös jäljellä olevan rajoittavan Z-L-Asp-substraatin normalisoidun piikin korkeuden sekä arvion 30 siitä, kuinka pitkälle reaktio on edennyt loppua kohden. Tässä tapauksessa reaktio etenee noin 70 %:iin päättymisestä ensimmäisten 30 sekunnin aikana ja pysähtyy siihen. Myös nämä tulokset ovat yhteneviä Nakanishi et ai.:n havaintojen kanssa (Biotechnology 3: 459 - 464 (19855) tunnetulla immo-35 bilisoidulia termolysiinillä lähes vedettömässä reaktio- 51 seoksessa, ja ne ovat johtuvat entsyymin aiheuttamasta tuotteen estosta.
Taulukko 7 5
Reaktioaika Piikin korkeus Prosentuaalinen (sek) (normalisoitu) rektion eteneminen 0 1,000 30 0,323 67,7% 10 60 Ö, 314 68,6% 120 0^ 305 69,5% 180 0,272 72,8%
Esimerkki 2 15 Termolysiinin kiteytys, ristisitominen ja lyofili- sointi ja syntyneen tuotteen ominaisuuksien arvioiminen
Termolysiinin kiteytys
Termolysiini (Diawa Kasei K.K.,. Japani) liuotettiin 20 10~mM:iseen kalsiumasetaattiin (Sigma) pH:ssa 10, konsent-raatioon, joka oli 10,0 % (m/v). Liuoksen pH pidettiin arvossa 10,0 titraamalla 2-M:Isalla NaOHilla. Kun liukeneminen oli tapahtunut täydellisesti, proteiiniliuos litrattiin pH-arvoon 8,0 2-M:xsella HOI:11a. Lisättiin kiinteää kai-25 siumasetaattia siten, että saatiin 1,2 M. sitten lisättiin dimetyylisulfoksidia (Sigma) 30 %:iin asti. Proteiini väke-vöitiin 100 mg/ml:ksi ultrasuodattamalla Amicon-solusekoit-timessa (10 0000 MWCO-kalvo). Väkevoity entsyymi jaettiin tasamääriin ja varastoitiin -70 °C:seen. Termolysiini ki-30 täytettiin lisäämällä 9 tilavuutta demineralisoitua vettä yhteen tilavuuteen väkevöityä (100 mg/rnl) proteiiniliuosta.
Liuos sekoitettiin nopeasti pyörresekoittimessa ja sen annettiin seistä yön yli huoneenlämpötilassa. Kiteet pestiin 10 tilavuudella 10-mM:ista kalsiumasetaattia, jonka pH oli 35 7,0, ja otettiin talteen sentrifugoimalla alhaisella nopeu- j 52 della (10 min kierrosnopeudella 1 500 x G, Beckman GPR -sentrifugi).
Lisäämällä nopeasi:! vettä väkevöityyn (100 mg/ml) termolysiinllluokseen saadaan aikaan kiteiden muodostumi-5 nen, joka tulee näkyviin kymmenen minuutin kuluessa pienitehoisella suurennoksella. Kidekoko riippuu toistettavasi! lopullisesta proteiinikonsentraatiosta. Kolme tilavuutta vettä yhteen tilavuuteen termolysiinikonsentraattia (100 mg/ml) tuottaa 0,5 mm pitkiä, röntgensädediffratkiolaatui-10 siä kuusikulmaisia sauvoja, jotka vastaavat kiteitä, jotka Colmän et ai. kuvasi aikaisemmin (Colman, P.M., Jansonius, J.N. ja Matthews, B.W., J, Biol. 70.: 701 - 724 (1972)), ja jotka me vahvistimme diffraktioanalyysillä. Lisättäessä kymmenen tilavuutta vettä yhteen tilavuuteen proteiinikon-15 sentraattia, syntyneiden kiteiden pituus pienenee 0,05 mm: iin. Nämä mikrokiteet ovat edullisia GLEC-sovelluksissa, koska niillä on taipumus minimoida diffuusio-ongelmia, jotka liittyvät kxdekpkoon (katso esim. Quiocho, F, A. ja Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)). Anne-20 tun proteiinierän sisällä kidekoko oli vastaavasti yhdenmukainen. (Kiteitä, jöiden pituus oli 0,05 - 0,10 mm, käytettiin tässä tutkimuksessa helpottamaan kiteisten suspensioiden tarkkaa pipetoimista), SDS-PAGE: n kartoitus densitomet-rillä osoitti, että kiteytettävän entsyymin puhtaus oli 25 kuusinkertainen, mikä lisää CLECrien spesifistä aktiivisuutta huomattavasti... Kiteytys vähensi CLEC-proteiinin ko-konaisaktiivisuutta 20 %:lla verrattuna liukenevaan termo-lysiiniin, kun dlpeptidisubsstraatin, furyyliakrylQyyli-glysyyli-L-leusiini-amidin (FAGLA) lohkeamista tutkittiin 30 spektrometrisesti alla kuvattavalla tavalla*
Termoly s i i n iki teiden ristisit ominen Termolysiinikiteitä ristisidottiin kolme tuntia huoneenlämpötilassa liuoksessa, jossa oli 12,5 % glutaarial-dehydiä (Sigma), 5 % DMSO:ta ja 50 mM Tris-puskuria, jonka 35 pH oli 6,5. Ristisidotut kiteet pestiin kolme kertaa demi- | j 53 neralisoidussa vedessä ja otettiin talteen äentrifugoimalla alhaisella nopeudella, kuten kuvattiin termolysiinin kiteytyksessä. Entsyymikiteiden kemiallinen ristisitominen stabiloi kidehilaa ja entsyymimolekyy1ien osaa kiteessä 5 riittävästi siten, että CtiBCiejä on mahdollista käyttää käytännössä ympäristöissä, jotka muutoin ovat yhteensopimattomia entsyymitolminnan kannalta. Entsyymiaktiivisuudessa ei ollut mitattavaa eroa ristisidottujen ja ristisito-mattomienh kiteiden välillä, kun niitä tutkittiin (spektro-10 fotometrisesti) seuraamalla dipeptidisubstraatin, FAGLA, (joka on kuvattu alla) lohkeamista. Ennen kaikkea ristisitominen stabiloi CLEC:ejä niin, että ne voidaan lyofilisoi-da, entsyymiaktiivisuuden säilyessä täydellisesti sen jälkeen, kun ne on muodostettu uudelleen vesi-, orgaanisissa 15 ja vesi-orgaanisissa seosliuottimissa, kuten käy ilmi ku viosta 1 ja taulukosta 8, Vaikka kiteyttäminen vähentää 30 %:11a CLEG-proteiinin spesifistä aktiivisuutta verrattuna liukenevaan termolysilniin, CLEC:ien ristisitominen ja lyofilisointi ei heikentänyt enää spesifistä ak-20 tiivisuutta.
Taulukko 8 - Termolysiinin aktiivisuus
Absorbanssi 345 nm
Aika (min) CLEC Liukeneva entsyymi 25 1 °/ 0 0^ 314 0^315 2 1;0 0;272 0;271 3 3/0 0 j235 0;218 4 5/ 0 0/ 204 Oy, 198 3Q 5 10/ Ö 0;184 0,1.85 6 15/0 0;183 0/184
Liukenevan ja CLEC-termolysiinin entyymiaktiivisuus Liukenevan ja CLEC-termolysiinin katalyyttinen 35 aktiivisuus tutkittiin (Feder, J. ja Schuck, J.M., Bio- 54
chemistry 9: 2784 - 2791 (1970)) hydrolysoimalla salvattu dIpeptidi Substraa11 i,f u ry y 1iakry1Pyy1i-glysyyli-L-leusi i-ni-amidi ( F AG LA) (Schwelzerhall). Amidisidoksen lohkearainen mitattiin spektrofotometrisesti absorbanssin pienenemisenä 5 345 nm:ssa. Alkuperäinen entsyymikonsentraatio oli 10“7 M
Bradfordin proteiinin määrityksen ja Coomassie-värjättyjen SDS-PAGE-geelien densitometrisen kartoituksen perusteella (Pharmacia LKB UltroScan XL). CLEC-entsyymi määritetään uudelleen muodostettuina lyofilisoituloa ristisidottuina 10 termolysiinikiteinä. Liukeneva entsyymi määritetään termo-lysiinioä, joka on väkevöity arvoon 100 mg/ml. Entsyymi lisättiin 5 ml:n reaktiotilavuuteen, jossa oli substraatti. Tasamäärät reaktioseosta poistettiin osoitettuina aikoina, ja absorbanssi mitattiin 345 nm:ssa. CLEC-termolysiini ero-15 tettiin reaktioseoksesta sentrlfugoimalla lyhyen aikaa (Beckman, mikrosentrifugi E) ennen absorbanssin lukemista. Absorbanssi sovettiin näennäiseen ensimmäisen kertaluvun kaavaan ja kc.at/Km laskettiin jakamalla sovitettu arvo enstyymikonsentraatiolla (Multifit 2.0 -suoran sovitusoh-20 jelma Apple Macintosh -tietokoneeseen. Day Computing P.O.
Box 327, Milton, Cambridge CB4 6WL, U.K. (1990)). pH-riippuvuus ja stabiilius
Liukenevan entsyymin pH-optimia ja stabiiliutta verrattiin termolysiini-CLEC: ien vastaaviin arvoihin lohkaise-25 maila dipeptidisubstraatti FAGLA, Tulokset esitetään kuviossa 2 ja taulukossa 9. Sekä liukenevalla entsyymi- että kiteisellä entsyymimuodolla ilmeni maksimiaktiivisuus pH:ssa 7. ChECreillä ja liukenevalla termolysiinillä ilmeni I
lisäksi samanlainen aktiivisuus happamilla pH-alueilla, ja 30 kellonmuotoinen pH-profiili, jonka liukeneva entsyymi antoi, sopi hyvin yhteen julkaistujen tietojen kanssa (Feder, 3. ja Schuck, J.M., Biochemistry 9: 2784 - 2791 - (1970)). Emäksisillä pH-alueilla kiteinen entsyymi kuitenkin säilytti maksimiaktiivisuutensa pH-arvoon 10 saakka, kun taas 35 liukeneva entsyymi oli 75-%risesti aktiivinen pH:ssa 8,5, 55 ja ainoastaan 25“%:isesti aktiivinen pH:ssa 9. pH:ssa 9,5 liukeneva entsyymi Oli täydellisesti inaktiivinen.
Taulukko 9 - Termoiysiinin pH-suora 5 % Ma k s im i ak 11i vi suu s· pH CLEC I. i u k e n e va e n t s y y mi 10 1 5/° 10f250 5j170 2 S/S 9. y. 75.0. 6^070 3 S7° 52,500 39,100 4 S;5 65,000 74, 610 5 7;° 97?500 100,000 15 6 7/5 100,000 98,650 7 8/° 97;500 82,920 8 8/5 95y000 71;910 9 9/° 96,250 24 ,720 10 9/5 95,000 0,000 20 11 10fQ 90,000 0,000
Stabiilius kohotetussa lämpötilassa Voidaan saavuttaa suurempia reaktionopeuksia ja ly-25 hyempiä diffuusioaikoja substraateille ja tuotteille suorittamalla annettu kemiallinen prosessi korkeammassa lämpötilassa, jossa substraattien ja tuotteiden lämpöstabiilius on tavallisesti rajoittavana tekijänä. Entsyymiin perustuvassa katalyysissä useimmiten kuitenkin entsyymiaktii visuu-30 den katoaminen on se tekijä, joka asetttaa käytännössä rajan lämpötilalle, jossa prosessi voidaan suorittaa. CLEC:ien parantuneen stabiiliuden vuoksi entsyymien aktiivisuus on mahdollinen paljon korkeammissa lämpötiloissa kuin mitä on mahdollista liukenevalle entsyymille.
56
Parantunut stabiilius alemmissa lämpötiloissa yksinkertaistaa CLEC-ka talyyttien rutiinomaista pitkäaikaista· säilytystä. Esimerkiksi oli välttämätöntä säilyttää liukenevan termolysiinin väikevöityjä (> 50 mg/mi) liuoksia 5 -80 °C:ssa spesifisenmaksimiaktiivisuuden säilyttämiseksi.
Huoneenlämpötilassa aktiivisuus yleensä hävisi päivässä, Rehydratoitu j a ternrolysi ini -CLEC: e j ä voidaan päinvastoin säilyttää rutiinomaisesti kuukausia huoneenlämpötilassa ilman selvästi havaittavaa aktiivisuuden menetystä. Uudella leen muodostamattomat lyoftlisoidut termolysiinin CLEC:t osoittautuivat elinkykyisiksi epämääräisiksi ajoiksi.
Lämpöstabillius ja kestävyys autolyysiä vastaan osoitettiin termolysiini-CLECteissä sen jälkeen, kun niitä oli inkuboitu 65 °C:ssa viisi perakäistä päivää (kuvio 3 ja 15 taulukko 10), Termolysiinit-CLEC:t säilyttivät maksimiak-tiivisuutensasen jälkeen, kun niitä oli inkuboitu viisi päivää kohotetussa lämpötilassa. Sitä vastoin liukeneva termolysiini menetti 50 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan jo kahden tunnin Inkuboinnin jälkeen ja sen aktiivisuus oli 20 lähes hävinnyt sen jälkeen, kun sitä oli inkuboitu 65 "Crssa 24 tuntia.
Taulukko 10 - Termolysiinin Xämpöstabiilius 65 °C:ssa 25 Aika % Maksimiaktiivisuus (päiviä) CLEC Liukeneva entsyymi 1 0, 000 100,000 100,000 2 0;041 70,000 3 0.083 9S.000 50.000 on J f f 4 0/164 32, 000 5 246 17,000 6 0, 410 97;0 10,000 7 1,000 101,0 2 ,000 8 2,000 97,0 35 / / 9 3,000 94 j, 0 10 4, 000 96,0 11 5, 000 92,0 i 57
Liukenevan ja CLEC-termolysiinin aktiivisuus mitattiin sen jälkeen, kun niitä oli inkuboitu 65 °C:ssa. Liukenevaa termolysiiniä inkuboitiin lÖ-mM:isessa kälsiumasetaatis-* sa, 50-mM: isessa Tris:ssä, jonka pH oli 7,..0,. 65 °Creisessa 5 vesihauteessa. Reaktiotilavuus oli 500 μ'1. Lopullinen prote-iinikonsentraatio oli 10 mg/ml. Tasamäärät poistettiin ajan-hetkellä 0, 1, 2, 4, 6, 10 ja 18 tuntia. Näytteitä tutkittiin SDS-PAGE:n ja FAGLA-lphkeamisen perusteella huoneenlämpötilassa edellä kuvatulla tavalla. Termolysiini-CLEC:ien tapauk-10 sessa 250 pl:aa kidesuspensiota, joka oli 10-mM:isessa kal-siumasetaatissa ja 5Ö-mM:isessa Tris:ssl, inkuboitiin myös 65 °C:eisessa vesihauteessa. Aktiivisuus tutkittiin ajanhet-killä 0, 1, 6, 24, 48, 72, 96 ja 120 tuntia FAGLA-.n lohkeami-sena.
15 Kestävyys ulkoapäin tulevaa proteolyysiä vastaan
Suoritettiin myös kokeita termolysiini-CLEC:n kestävyydestä ulkopäin tulevan proteaasin vaikutusta vastaan, SDS-PAGE- {natriumdodesyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielek-troföreesi) analyysien perusteella todettiin, että kaupalli-20 set entsyymit voivat sisältää huomattavan prosentuaalisen määrän kontaminoivia aineita, joista joillakin voi olla pro-teolyyttinen vaikutus liukeneviin pääentsyymilajeihin. Pakkaamalla entsyymimolekyylit kidehilaan, voidaan olettaa, että CLEC:ssä olevat sisäpuolella olevat entsyymimolekyylit 25 voitaisiin suojata protelyysiltä. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi termolysiini-CLEC:eja ja liukenevaa entsyymivai- j misetta inkuboitiin streptokokkiproteaasin, Pronase®, epäspesifisen proteaasin, joka pystyy hajottamaan useimmat proteiinit vapaiksi aminohapoiksi, läsnä ollessa (Calbiochem 30 1990 Catalog; halolla, CA).
Liukenevaa ja CLEC-termolysiiniä inkuboitiin 50-mM:isessa Tris:ssä, jonka pH oli 7,5, 40 °C:ssa proteaasin,
Pronase®, läsnä ollessa (Calbiochem). Pronase®:n suhde termo-lysiiniin oli 1/40. Termolysiinin autolyysin estämiseksi ja 35 jotta termölysiini ei hajoittaisi proteolyyttisesti pro-naasia, liukenevan entsyymin reaktioon lisättiin EDTA:ta si- 58 ten, että lopullinen kqnsentraatio oli 100 jtlM (EDTA estää termolysiinin aktiivisuuden muttei Pronase® :n)... Osoitettuina aikoina reaktioseoksesta poistettiin tasamäärät ja aktiivisuus tutkittiin spektrofotometrisesti dipeptidisubstraattien, 5 FAGLA, lohkeainisena. Termolysiinin eston, jonka EDTA:n läsnäolo aiheuttaa, vastapainoksi liukenevan entsyymin aktiivisuuden spektrofotometrinen koe suoritettiin 0,5-M:isessa kai-siinnasetaattipuskurissa, jonka pH oli 7,0, ja entsyymikon-sentraatio nostettiin kaksinkertaiseksi. Ristisidottu kitei-10 nen entsyymi tutkittiin edellä kuvatulla tavalla.
Kuten kuviosta 4 ja taulukosta 11 on nähtävissä, liukeneva termolysiini hajosi nopeasti ja menetti kaiken aktiivisuutensa sen jälkeen, kun sitä oli inkuboitu 90 minuuttia. Sitä vastoin termolysiini-CLEC:n aktiivisuuteen ei 15 vaikuttanut neljän päivän inkubointi proteaasin läsnä ollessa. Se että proteolyysillä ei ole lähes mitään vaikutusta on erityisesti kiinnostavaa diagnostisten biosenso-reideiden sovellustapauksissa, joissa sopivan CLEC:n voidaan katsoa toimivan luonnollisesti esiintyvien proteölyyt-.20 tieten entsyymien tuntemattoman joukon, läsnä ollessa. j
Taulukko 11 - Proteaasin kesto
Aika % .Maksimiak tiivis uus Aika {päiviä) CLEG Liukeneva entsyymi (min) 1 d7000 100,0 1ÖD/0 0,000 2 0;D03 25;0 5;000 | 3 O^DIO 17 f 5 15,000 j 4 0^ 021 9,5 30, 000 | 5 0 , 042 9S , 0 3,0 60,000 \ G O, 063 1, 0 9 Οχ 000 j 7 0, 084 101;0 0,0 1 8 1, 000 97;0 | 9 2 ,000 99,0 10 3 ,000 9B? 0 11 A,000 96,0 | j 59
Stabiilisuus orgaanisen liuottimen läsnä ollessa
Jotta entsyymit hyväksyttäisiin käyttökelpoisiksi tasollisiksi katalyyteiksi, niiden täytyy pystyä toimimaan iliiian liiallista sekaantumista valmistusprosessien käytän-5 nön ympäristöön. Erityisesti tällöin käytettäisiin vesipitoisia, polaarisia ja ei-polaarisia orgaanisia liuottimia ja näiden seoksia. Kaupallisissa sovelluksissa vesipitoiset orgaaniset liuotInseökset mahdollistavat tuotteenmuodostuk-sen manipuloinnin, kun käytetään hyväksi tuotteiden ja 10 substraattien keskinäisiä liukoisuuksia.
Liukoisella termolysiinxllä ja termolyslini-CLECreillä oli huomattavasti erilainen stabiilisuus orgaanisten liuottimien läsnä ollessa. (Taulukko 12. ) Liukenevan entsyymin konsentraatiot, joita voitaisiin inkuboida or-15 gaanisessa liuottimessa, rajoittui siten, että maksimiarvo oli 10 mg/ffll. Tätä suuremmilla arvoilla tapahtui nopea ter-molysiinin saostuminen orgaanisen liuottimen lisäämisen jälkeen.. Termolysiini-CLEC:n konsentraatioita rajoitti sitä vastoin ainoastaan kiteiden tarvitsema tilavuus. Liukeneva 20 termolysiini säilytti suurimman aktiivisuutensa (75 %} asetonissa inkuboinnin jälkeen, ja heikoimman aktiivisuutensa (36 %) tetrahydrofuraanissa. Kun liukenevaa entsyymiä oli inkubpitu yksi tunti asetonitrillin tai diöksaanln läsnä ollessa, se menetti noin 50 % alkuperäisestä aktxivxsuudes-25 taan. CLEG-termolysiini säilytti enenmmän kuin 95 % maksi-miaktiivisuudestaan sen jälkeen, kun sitä oli inkuböxtu kaikkien tutkittavien orgaanisten aineiden kanssa.
Taulukko 12 30 % Maksimlaktxivisuus
Liukeneva entsyymi CLEC Asetonitrilli 42 102
Dioksaani 66 97
Asetoni 75 99 35 THF* 36 96 *Tetrahydrofuraani il 60
Stabiilius orgaanisissa liuottimissa
Termolysiini-CLEC:ien tai liukenevia termo-lysiinivalmisteita inkuboitiin 50-%; isissä (v/v) annettujen orgaanisten liuottimien liuoksissa. 100 μΐ suspensiota, 5 jossa oli termolysiini-CLEC:ejä (10 mg/ml) 10-mM:isessa Trisissä, jonka pH oli 7, laitettiin 1/16 unssin lasias-tiaan. Vastaava tilavuus osoitettua orgaanista liuotinta lisättiin ja seosta sekoitettiin pyörresekoittimessa lyhyen aikaa. 20 μΐ liukenevaa termolysiiniä (100 mg/ml) laimen-10 nettiin 80 pl:aan 0,015-mjM:ista Tris-puskuria, jonka pH oli 7,0 1/16 unssin lasiastiaan. 100 pl:n tilavuus orgaanista liuotinta lisättiin sitten proteiiniliuokseen ja sekoitettiin lyhyesti pyörresekoittimessa. CLEC:tä ja liukenevaa entsyymiä inkuboitiin orgaanisen liuottimen läsnä ollessa 15 yksi tunti 40 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen entsyymiaktiivisuus tutkittiin dipeptidisubstraatin, FAGLA, lohkeamisena kuvatulla tavalla.
Alhaisten vesikonsentraatioiden ei uskota suosivan kehittymistä välituotetiloihin entsyymin denäturoitumiSpö-20 lulla. CLEC:eissä tämä rakenteellisen liikkuvuuden rajoitus saadaan molekyylien välisten yhteyksien ja entsyymiosan molekyylien, jotka muodostavat kidehilan, välillä olevien ristisidösien avulla, eikä niinkään sen vuoksi, että väliaine on lähes vedetöntä. Tämän tuloksena entsyymit sietävät 25 välituotteen vesi-orgaanisia liuotinkonsentraatioita hel posti, kun ne on formuloitu CLEC:einä, mitä ei aikaisemmin ole havaittu entsyymien yhteydessä (katso taulukko 12). Tämä löyty avaa kokonaan uusia alueita hyödynnettäviksi synteettisessä kemiassa, entsyymikatalyysiä käyttäen.
30 Jopa lähes vedettömissä orgaanisissa liuottimissa entsyymien rutiinikäyttöä on kuitenkin vaikeuttanut niiden taipumus muodostaa huonosti määritettyjä suspensioita, joihin liittyy kasautumis- ja muita aggregoitamisongelmia. Tämä ominaisuus tekee näistä valmisteista jo luonnostaan 35 ei-kiinnostavia suuren mittakaavan teollisiin prosesseihin.
Sitä vastoin CLECrt ja kidehilassa olevat entsyymiösat pysyvät monodispersseinä kaikissa näissä liuottimissa.
61
Vertailu mulliin inunobilisointimenetelmiin
Joitakin käyttökelpoisia katsauksia entsyymien immo-bilisointimenetelmistä on ilmestynyt kirjallisuudessa (Maugh, T.H., Science, 223: 474 - 476 (1984)); Tramper, J., 5 Trends in Biotechnology 3: 45 - 50 (1985)). Näissä entsyymi esiintyy aina pienenä osana immobilisoidun partikkelin kokonaistilavuudesta, suurimman osan ollessa inerttiä kantaja-ainetta. Kantajalaine kasvattaa keskimääräistä vapaata polkua, joka on immobilisoidun entsyymipartikkelin ulkopuo-10 lella olevan liuottimen ja entsyymin aktiivisten kohtien välillä, pahentaen diffuusio-ongelmia (Quiocho, F.A. ja Richards, F.M., Biochemistry 5: 4062 - 4076 (1967)).
CLEG: ssä ristisidoksellinen kidematriksi toimii itse kantaja-aineena, jolloin kantaja-ainetta ei tarvita. Tämän 15 tuloksena entsyymin konsentraatio CLEC:ssä on lähellä teoreettista päkkausrajaa, joka voidaan saavuttaa annetun kokoisilla molekyyleillä, ylittäen reilusti tiheydet, joita voidaan saavutte edes väkevöidyissä liuoksissa. Koko CLEC koostuu aktiivisesta entsyymistä, ja siten diffuusioon 20 liittyvä entsyytnireaktionopeuksien pieneneminen, joka yleensä havaitaan tunnetulla tavalla immobilisoiduilla entsyymeillä, suhteessa liuoksessa oleviin entsyymeihin, minimoituu (katso kuvio 1), koska keskimääräinen vapaa polku substraatille ja tuotteelle aktiivisen entsyymin ja vapaan 25 liuottimen välillä lyhenee CLEC:eillä huomattavasti (verrattuna tunnetulla tavalla immobilisoiturhin entsyymi-kanta ja-ainepartikkelerhih) , On tärkeä huomata, että entsyymissä CLECteissä on itsestään monodisperssi, ja se voidaan ottaa talteen yksinkertaisesti manipuloimalla CLEC-partik-30 keleita, kuten suodattamalla, sentrifugoimalla tai dekan-toimalla liuotin.
62
Esimerkki 3 E lastaa s in kiteytys, ristisidosten muodostaminen ja lyofilisdinti sekä syntyneen tuotteen ominaisuuksien tutkiminen 5 Elastaasin kiteytys
Lyofilispitua porsaan haimaelastaasla (Serva) liuotettiin Ö,l-M:iseen natriumasetaattiin, joka pH oli 5,0 siten, että konsenträatioksi tuli 5 mg/ml (m/v), huoneenlämpötilassa. Sauvanmuotoiset elastaasikiteet oli silmin nähtävis-10 sä yhden minuutin kuluessa proteiinin täydellisestä sqlva-toitumisesta. Kiteytysliuos siirrettiin 4 0C: seen ja kiteytys Oli tapahtunut täydellisesti yön aikana. Kiteet otettiin taiteen sentrifugoimalla aikaisemmin kuvatulla tavalla.
15 Elastaasikiteiden ristisitominen 200 μΐ: n tilavuus elastaasikiteitä lisättiin 1,3 ml;aah 5,77-%:ista glutaarialdehydiä ja 1,5-M:iseen natriumasetaattiin, jonka pH oli 5,0. Kiteitä ristisidottiin tunti varovasti sekoittaen (sekoituslevy). Ristisidosten 20 muodostamisen jälkeen kiteet pestiin kolme kertaa 15 ml: 11a 0,.2-M*ista Tris-puskuria, jonka pH oli 8,0. Elastaasi-CLEC lyofliisoitiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Liukenevan ja CLEC-elastaasin entsyymiaktiivisuus Liukenevan ja CLEC-elastaasin katalyYttinen aktiivi-25 suus tutkittiin spektrofotometrisesti mittaamalla sub-straattisuksinyyli - (Ala )3-p-nitröanidilin hydrolyysiä (Bachem) [Bieth, et ai., Biochem. Med. 11: 350 - 357 f (1974)] (taulukko 13, kuvio 5). Lohkeamista seurattiin ab-sorbanssin nousuna 410 nm: ssä. Alkuperäinen substraattikon-30 sentraatio oli 2 x 1Ö'4, Entsyymikonsentraatio li 2,8 x 10*v M, CLEC tai liukeneva entsyymi lisättiin 5 ml:n reaktioti-lavuuteen, jossa oli substraattia 0,2-M:ssa Tris-puskurissa:, jonka pH oli 8,0. Kuten aikaisemmin kuvattiin, CLEC-entsyymi poistettiin reaktioseoksestä ennen absorbanssin 35 mittaamista.
63
Taulukko 13 - Elast.aasiaktiiv.isu.us
Absorbanssi 40 0 nm; _ Aika f®in) CLEC Liukeneva entsyymi 5 1 °;0 O;000 0;000 2 °;5 ' 0 / 103 0,205 3 :i;° 0^195 0,390 4 2/ 0 0, 3 66 0, 672 10 5 3/ 0 0; 523 0 ,923 6 4/° 0,657 1,098 7 5/° 0/7ΘΟ 1, 227 8 6r° 0/888 1, 326 9 V° Ö.974 1,393 10 1070 1,170 1,512 11 15/Q 1/36 5 1/586 20 Kestävyys uikopäin tulee proteolyysiä vastaan
Kokeet elastaasi-CLEC:n kestävyydestä proteaasin vaikutukselle suoritettiin myös samanlaisissa olosuhteissa kuin mitä kuvattiin termolysiinille (esimerkki 2). Liukenevan ja CLEC-entsyyniin aktiivisuutta proteaasin kanssa inku-25 boinnin jälkeen tutkittiin nitroanilidisubstraatin hydro-·· lyysin suhteen edellä kuvatulla tavalla (taulukko 14 ja kuvio 6).
64
Taulukko 14 ~ Elastaasin kesto proteolyysiä vastaan % M a k s imi aktiivi suu s g Aika CLEC Liukeneva entsyymi 1 0|0 ioo;o ioo/o 2 10j0 53;0 3 2 0^.0 32^0 4 30,0 101,0 18,0 1 Π * / * 5 4S;0 11;0 δ 60^0 102^0 8;0 7 120^0 101^0 3;0 8 180;0 103^0 2;0 15
Esimerkki 4
Esteraasin kiteytys, ristisidosten muodostaminen ja lyöfilisointi ja syntyneen tuotteen ominaisuuksien 20 tutkiminen
Esteraasin kiteytys
Kuten tässä tuodaan esille, sian maksaesteraasin 30 mg/ml ammöniumsulfaattisuspenslota (Fluka) liuotettiin 0, 25-M:iseen kalsiumasetaattiin, jonka pH oli 5,6, huoneen-25 lämpötilassa. Esteraasikiteet olivat silmin nähtäviä muutamien minuuttien kuluttua sen jälkeen, kun oli lisätty kalsiumasetaattiliuos. Kiteytysliuoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa, ja kiteytyminen oli tapahtunut täydellisesti yön aikana. Kiteet otettiin talteen sentrifugoimal-30 la aikaisemmin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Esteraasikiteiden ristisitominen
Kuten tässä on tuotu esille, 300 μΐ:n tilavuus este-raasikiteitä lisättiin 5 ml:aan liuosta, jossa oli 12,5-%: ista glutaarialdehydiä ja 0, 5-M:ista natriuinasetaat-35 tia, jonka pH oli 5,5. Kiteitä ristisidottiin yksi tunti 65 sekoittaan varovasti (sekoituslevy). Ristisidosten muodostamisen jälkeen kiteet pestiin kolme kertaa 15 ml:11a 0,5-M:ista kalsiumasetaattia, jonka pH oli 6,3. Esteraasi-CLEG lyofilisoitiin aikaisemmin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
5 Liukenevan ja GLEC-esteraas±n entsyymiaktiivisuus
Liukenevan j ä CLEC-esteraasin katalyyttinen aktiivisuus tutkittiin spektrofotometrisesti seuraamalla sub-straattl-p-nitrofenyyliasetaatin fFluka} hydrolysoitumista (taulukko 15 ja kuvio 7). Lohkeamista seurattiin nousevana 10 absörbanssina 400 nnussa. Alkuperäinen substraattikonsen-traatio oli .0,001 %. Entsyymikonsentraatio oli 1 x 10“e M. CLEC- tai liukeneva entsyymi lisättiin 5 ml:n reaktiotila-vuuteen, joka sisälsi substraatin 0,25-M:isessa kal-siumaSetaatissa, jonka pH oli 6,3. Kuten aikaisemmin kuvat-15 tiin esimerkissä 2, CLEC-entsyymi poistettiin reaktioseok-sesta sentrifugoimalla ennen absorbanssin mittaamista.
Taulukko 15 - Esteraasiaktiivisuus
Absorbanssi 400 nm Aika (min) CLEC Liukeneva entsyymi 1 0,0 Oy 000 0;000 2 0;5 Oy 770 Oy 252 3 1,0 0,128 0.297 25 ' / / 4 2, 0 Oy 2 08 Oy 337 5 3, 0 Q y 2 6 0 Oy. 34 6 € 5, 0 Oy 324 Oy 353 7 7, 0 Oy 353 Oy 359 8 10.0 0,369 0,368 30 ' f f
Kestävyys ulkoapäin tulevalle proteolyysille
Esteraasi-GLEC:n kestävyyttä proteaasin vaikutuksille tutkittiin myös samanlaisissa olosuhteissa kuin mitä 35 kuvattiin termolysiinille (esimerkki 2). Liukenevan ja 66 CLEC-entsyymin aktiivisuus proteaasin kanssa inkuboinnin jälkeen tutkittiin substraatin, p-nitrofenyyliasetaatin hydrolysoitumisen suhteen edellä kuvatulla tavalla (taulukko 16 ja kuvio 8).
5
Taulukko 16 - Esteraasin kestävyys proteolyysiä vastaan % Maksimiaktiivisuus 10 Aika (min) CLEC liukenevat entsyymit 1 °;° 100; 0 100/0 2 68,0 3 ·2·Ρ/$ 47,0 15 4 30,0 99,0 25/0 5 45;° 20/0 6 60/0 97/0 16/0 7 120; ° 94; 0 10/0
8 iÄP/0 91/ 0 6.0 I
20 |
Esimerkki 5 \ \
Lipaasin kiteytys, ristisidosten muodostaminen ja j \ 25 lyofilisointi ja syntyneen tuotteen ominaisuuksien arvioiminen
Lipaasin kiteytys \
Kuten tässä on tuotu esille, lipaasientsyymi \ tGeotrichum candidum) kiteytettiin höyryäiffuusion avulla j 30 vesiliuoksesta, jossa oli 20 mg/ml proteiinia 50-mM:isessa j
Tris-puskurissa, jonka pH oli 7 ja joka sisälsi 8 % am- I
moniumsulfaattia. Kaksoispyramidiset kiteet oli silmin näh- j täviä sen jälkeen, kun niitä oli inkuhoitu 20 - 30 päivää j huoneenlämpötilassa* Kiteet otettiin talteen sentrifugoi- j 35 maliä aikaisemmin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. j ;i 67
Lip a as i ki te i den ristisi tominen
Kuten tässä on tuotu esille, lipaasikiteet lisättiin liuokseen, jossa oli 12,5-%:ista glutaarialdehydiä ja SO-mMjista Tris-puskuria, jonka pH oli 5,6. Kiteitä risti-5 sidottiin yksi tunti. Ristisidosten muodostamisen jälkeen kiteet pestiin kolme kertaa 15 ml:11a 50-mM:ista Tris-pus-kuria, jonka pH oli 7,0. Lipaasi-CLEC lyofilisoitiin aikaisemmin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
liukenevan ja CLEC-lipaasin entsyymiaktiivisuus 10 Liukenevan ja CLEC-lipaasin katalyyttinen aktiivi suus tutkittiin spektrofotometrisesti seuraamalla substraatin, p-nitrofenyyliasetaatin hydrolysoitumista ( taulukko 17 ja kuvio 9 ), Lohkeamista seurattiin nousevana äbsorbanssina 400 nitussä. Alkuperäinen substraattikonsenträatxö oli 15 0,005 %. Entsyymikonsentraatio oli 1,5 x 10's M. CLEC ja liukeneva entsyymi lisättiin 5 ml:n reaktiqtiiavuuteen, joka sisälsi substraatin 0,2-M:ssa Tris-puskurissa, jonka pH oli 7,0, huoneenlämpötilassa. Kuten aikaisemmin kuvattiin esimerkissä 2, CLEC-entsyymi poistettiin reaktioseok-20 sesta sentrifugoimalla ennen absorbanssin mittaamista.
Taulukko 17 - Lipaasiaktixvisuus Absorbanssi 400 nm 25 Aika (min) CLEC Liukeneva entsyymi 1 0;o 0, 000 0,000 2 1;0 0,013 Ö, 021 3 5,0 0,094 0,116 4 10;0 0,164 0,186 30 5 15,0 0,248 0; 258 6 3 0,0 0,3 46 0,357 7 45,0 0,407 0,,420 8 60,0 0,461 0,459 8 50,0 0,497 0,502 35 1 | 68
Esimerkki 6
Lysotsyymin kiteytys, ristisidosten muodostaminen ja lyofilisointi sekä syntyneen tuotteen ominaisuuksien arvioiminen 5 Lysotsyymin kiteytys
Seuraamalla Blake, C.C.F. et ai.:n menetelmää. Nature 196: 1173 (1962), 200 mg lyofilisoitua kananmunan-valkuaisen lysotsyymiä (Boehringer Mannheim) liuotettiin 2,5 ml:aan 0,04-M:ista natriumasetaattipuskuria, jonka pH 10 oli 4,7, huoneenlämpötilassa. Proteiinin solvatoitumisen jälkeen 2,5 ml 10-%:ista natriumkioridia lisättiin lysot-Syymlliuokseen tipoittain, sekoittaen. Kiteytysliuoksen annettiin seistä yön yli huoneenlämpötilassa, ja kiteytyminen pii päättynyt 48 tunnissa. Kiteet otettiin talteen 15 sentrifugoimälla aikaisemmin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Lysotsyymikiteiden ristisitominen
Kuten tässä on kuvattu, 500 μ1:η tilavuus lysotsyy-mikiteitä lisättiin 10 irti: aan 24-%:ista glutaariaidehydiä 20 ja 50-mM:iseen Tris-puskuriin, jonka pH oli 5,6 ja joka sisälsi 20 % natriumkloridia. Kiteitä ristisidottiin 20 minuttia varovasti sekoittaen (sekoituslevy). Ristisidosten muodostamisen jälkeen kiteet pestiin kolme kertaa 50 ml :11a 20-mM:ista kalsiumasetäattia ja 50-mM:isella kaliumklori-25 dllla, jonka pH oli 5,3. Lysotsyymi-CLEC lyofilisoitiin aikaisemmin esimerkissä 2 kuvatulla tävälla.
Liukenevan ja CLEG-lysotsyymin entsyymiaktiivisuus Liukenevan ja CLEC-lysotsyymin katalyyttinen aktiivisuus tutkittiin mittaamaila substraatin, 4-metyyliumbel--30 liferyyli-N-astyyli-kitriosidin(Fluka) hydrölysoitumisno-peutta (Yang, Y. ja Hamaguchi, K. J. Biochem. 8: 1003 -1014 (1980) (taulukko 18 ja kuvio 10). 4-metyyliumbellife-ronin vapautumista seurattiin fluprimetrisesti (Perkin Elmer Model LS-50). Alkuperäinen substraattikonsentraatio 35 li 1,42 x 10"3. Entsyymikonsentraatio oli 3 x 10*7. CLEC- ja 69 liukeneva entsyymi lisättiin 2 ml:n reaktiotilavuuteen, joka sisälsi substraattia 20-mM:isessa kalsiumasetaatissa ja 50-mM:isessa kaiiumkloridissä, jonka pH oli 5/3, 42 °G:ssa, 4-metyyliumbeiliferonin määrä määritettiin fluo-5 rimetrisesti mittaamalla fluoresenssin intensiteettejä 450 nm:ssä, suorittaen viritys 360 nm:ssä. Pitkittäinen leveys sekä viritykselle että emissiolle oli 10 mm. Kuten aikaisemmin esimerkissä 2 kuvattiin, CLEC-entsyymi poistettiin reaktioseoksesta sentrifugoimalla ennen fluoresenssin mit-10 taamista.
Taulukko 18 - Lysotsyymiaktiivisuus
Fluoresenssi
Aika (min) CLEC Liukeneva entsyymi 3- 5 1 0, 000 0, 000 0, ooo 2 10,000 Aj400 18,900 3 30,000 10,500 29,400 4 60,000 27,500 44,800 5 90,000 33,800 51,700 20 6 120,000 4 5,900 59,800
Esimerkki 7
Asparaginaanin kiteytys, ristisidosten muodostaminen ja lyofilisointi ja syntyneen tuotteen ominai-25 suuksien arviointi
Asparaginaasin kiteytys
Grabner et ai,:n [US-patentti 3 664 926 (1972)] kuvaaman menetelmän muunnelman mukaisesti 25 mg lyofilisoitua asparaginaasia (Worthington) liuotettiin 500 pl;aän 30 50-mM:ista natriumfosfaattipuskuria, jonka pH oli 7,2.
Liuos jäähdytettiin 4 °C:seen ja pH säädettiin arvoon 5,0 1-M:isella etikkahapolla. Kylmää (.20 °C) etanolia lisättiin sitten tipoittaid asparaginaasiliuokseen siten, että lopullinen konsentraatio oli 33 %. Liuosta inkuboitiia 35 4 °C:ssa. Kiteytyminen oli päättynyt 48 tunnissa^ Kiteet $ $ 70 otettiin talteen sentrifugaimalla aikaisemmin kuvatulla tavalla.
äsparaginaasikiteiden ristisitominen Kuten tässä on tuotu esille, asparaginaasikiteiiä 5 ristisidottiin liuoksessa, jossa oli 7,5-%:ista glutaarial-dehydiä 50-mM:isessa natriumfosfaattipuskurissa, jonka pH oli 5,6. Ristisidpsten muodostamisen jälkeen kiteet pestiin viidesti 15 ml:11a 50-mM:ista Tris-puskuria, jonka pH oli 7,0. Asparaginaasi-GLEG:t iyofilisoitiin aikaisemmin esi- 10 merkissä 2 kuvatulla tavalla.
Liukenevan ja CLEC-asparaglnaasin entsyymiaktiivisuus
Liukenevan ja CLEG-asparaginaasin katalyyttinen aktiivisuus tutkittiin spektrofotometrisesti mittaamalla am- 15 moniumionirt kehitystä kytketyssä entsymaattisessa reaktiossa, joka on kuvattu alla (kaikki reagenssit hankittiin BoehrInger Mannheimilta) (taulukko 19 ja kuvio 11).
asparaglnaasi 20 L-ÄSparagiirji ...............> asparaatti · * g lu takaat tidethydrogenaasi * NRDH t «-ketoglvtaraatti -1 · ........> giutamllnihappo * »ÄD+ 25 NADH:n hapettuminen mitattiin pienenevänä absorbanssina 340 nm:ssa. Alkuperäinen NADH-könsentraatio oli 1,4 mg/ml. As-paragiinikonsentraätio oli 10"3 M. Alfa-ketoglutaraattikon-sentraatio oli 10'4 M, Glutamaattidehydrogenaasikonsentraa-tio oli 10’7 M. AsparaginaasikonsentraatiD oli 2,3 x 10'8 M.
30 Kuten aikaisemmin esimerkissä 2 kuvattiin, CLEC-entsyymi poistettiin reaktioseoksesta sentrifugoimalla ennen absor-banssin mittaamista.
71
Taulukko 19 - Äsparaginaasiaktiivisuus
Absorb.an.ssi 34 0 nm Liukeneva g Aika (min) CLEC entsyymi 1 0;0 1;000 1;000 2 1?0 0 j8 67 0; 825 3 3^0 0^ 739 0 ^ 684 4 S;0 0^603 0^ 538 10 5 10; 0 Qj 502 0^406 6 15;0 0^449 0;338 7 30;0 0f328 0^199 8 4 5^0 0 f 211 0^187

Claims (17)

1. Encsyymikide, joka on xistisidottu monifunktio-naalisella ristisidosaineella, t u n n e t t u siitä, 5 että sen resistenssi eksogeeniselle proteolyysille Pronase™-proteaasilla on sellainen, että ristisidottu entsyymikide säilyttää vähintään '91 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan, kun sitä on inkuboitu kolme tuntia sellaisessa pitoisuudessa Pronase™“proteaasia, joka saa entsyymin liukoisen, 10 ristisitomattoman muodon, joka kiteytetään mainitun risti-sidot tavan entsyymikiteen muodostamiseksi, säilyttämään korkeintaan 6 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan samoissa olosuhteissa, jolloin entsyymi valitaan joukosta: (a) pyridoksaalifosfäättientsyymit, metallientsyy-15 Iitit, CoÄrta vaativat entsyymit ja sulfuraasit (PAPS) ; (b) termolysiini, nitrilaasi, aminosyklaasi ja hydantoinaasi; (c) elastaasi, aminopeptIdaasi, asparaginaasi, glutaxninaasi, argihaasi, Ursaasi, alkalifosfataasi, lipaa- 20 si, edullisesti fosfolipaasi, beeta-laktamaasi, ACL-hydro-laasi, L-ACT-hydrolaasi, aryylisulfataasi, glykosidaasiy edullisesti beeta-galaktosIdaasi ja beeta-fruktosidäasi, penisillliniasylaasi, antidaasi, edullisesti penisilliini-amidaasi, aminohappoesteraasi, 5-fosfodiesterääsi, nukle- 25 aasi ja kreatliiiideiminaasi,': (d) äminphappodehydrogenaasi, formaatit idehvdro-genaasi, laktaattidehydrogenadsi, glutamaattidehydroge-naa- s:i, hydroksisteroididehydrogenaasi, glukoosi-5~pyruvaat- | tidehydrogenaasi, sukkinaattidehydrogenaasl, glukoos idehyd-30 rogenaasi, katalaasi, superoksididismutaasi, peroksidaasi, lusiferaasi, tyrosinaasi, flavoentsyymi, nitraatti/nit— riitti -reduktaasi, oksidoreduktaasi (NAD/P), oksIdaasi ja lyaas i; (e) kinaasi (ATP), edullisesti kreatiinikinaasi, 35 transaminaasi , glykosyylitransf erääsi ja metyyli trans f e- raasi {SAM); 7 3 (f) L-tryptofaanisyntetaasi ja striktodiinisyn-tetaasi; ja (g) esteraasi,
2. Korsbunden enzymkristall enligt patentkrav 1, kanne tecknad av att enzyme t är termolysin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ristisidottu ent-5 syymxkide, tunnettu siitä, että entsyymi on ter- molysiini.
3. Korsbunden enzymkrista 11 enligt patentkrav· 1, kanne tecknad av att enzymet är el as t as.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ristisidottu entsyymi kide, t u n n e t t u siitä, että entsyymi on ©lastaasi .
4. Korsbunden enzymkristall enligt patentkrav 1, kannet eckn ad av att enzymet är asparaginas.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ristisidottu ent syymi kide, t u n n e t t u siitä, että entsyymi on aspara-ginaasx.
5. Korsbunden enzymkristall enligt patentkrav 1, kanne tecknad av att enzymet är lipas. 6-. korsbunden enzymkristall enligt. patentkrav 1, 10 kanne tecknad av att oxidas är alkoholoxidas, glukos-oxidas, bilirubinoxidas, laktatoxidas, koles teroloxidus eller L-aminooxidas och/eller lyas är aldolas, L-aspartat~ 4-dekarboxylas, fenylalaninammoniumlyas, karboxylanhydras, nitrilhydratas, L-aspartas, fumaras eller heparinas. 15 7, Korsbunden enzymkristall enligt nägot av paten tkraven 1 - 6, kanne tecknad av att kristallen är en mikrokristall vars diameter är ungefär 10'1mm.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ristisidottu entsyymikide, t u n n e t t u siitä, että entsyymi on 11- 15 paasi.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ristisidottu entsyymikide, t u n n ett ti siitä, että öksidaasi on alkoholioksidaasi, glukoosioksidsasi, bilirubiinioksidaa-si, laktaattioksidaasi, kolesteroli o ks i d a a s i tai L-amino~ 20 öksidaasi ja/tai lyaäsi on aldoiaasi, L-aspartaatti-4-dekarhoks ylaa s i, fenyylialaniiniammoniumlyäasi, karboksyy-lianhydraasi, nitriilihydrataasi, L-aspartaasi, fumaraasi tai heparinaasi,
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen ris- 25 tisidottu entsyymikide, t u n n e t t u siitä, että kide on mi kr o kide, jonka halkaisija on noin 10”J mm.
8. Korsbunden enzymkristall enligt nägot av pa tent kraven..1 - 6, kanne t ecknad av att molförhällandet 20 enzyiri: Pronase™-proteas är 1:40.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen ristisidottu entsyymikide, tunnettu siitä, että entsyymi: Pronase^-proteaasi-moolisuhde on 1:40.
9. Korsbunden enzymkristall enligt nägot av pa ten tkraven 1-6, kanne tecknad av att korsbindnings-ämnet är glutaraldehyd. 10. Änordning, k anne tecknad av att den omfat-25 tar en korsbunden enzymkristall enligt nägot av patentkraven. 1 ~ 6 och ett fästhaiIningsmedel för den korsbundna enzymkristallen, varvid fasthällningsmedlet bestär av ett material som möjliggör en kontakt mellan den korsbundna enzymkrista11en och substxatet till vilket enzymet verkar, 30 och varvid substratet är närvarande i en vätska.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen ristisidottu entsyymikide,: tunnettu siitä, että ris- tisidosaine on gluiäraldehydi.
10. Laite, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisen ristisido- 35 tun entsyymikiteen ja pidätysvälineen ristisidotulle entsyymikiteelle, jolloin pidätysväline koostuu materi- aalista, joka mahdollistaa yhteyden ristisidotun entsyymi-kiteen ja substraatin välillä, johon entsyymi vaikuttaa, ja jolloin substraatti on läsnä nesteessä.
11. Biosensor för att detektera en önskad analyt i en vätska, kannet eeknad av att den omfattar a) en korsbunden enzymkristall enligt nägot av pa-tentkraven 1 - 6, varvid det närvarande enzymet verkar pä 35 den önskade analyten eller pä ett reagerande Imne i reak- ] tionen i vilken den önskade analyten deltar; och j b) fasthällningsmedel for den korsbundna enzymkri-stallen, varvid fasthällningsmedlet toestär av ett material sohi möjliggör en kontakt .melian den korsbundna enzymkri-Stallen och vätskan.,· varviά vätskan innehäller endera: 1) 5 analyten pä vilken enzymet verkar, eller 2) ett reagerande ämne i reaktionen 1 vilken analyten deltar.
11. Biosensor! halutun analyytin toteamiseksi nes- 5 teestä,: t annettu siitä, että se käsittää a) jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisen ristisidotun entsyymi kiteen, jolloin läsnä oleva entsyymi vaikuttaa haluttuun analyyttiin tai reagoivaan aineeseen reaktiossa, johon: haluttu analyytti osallistuu; ja 10 b) pidätysvälineen ristisidotulle entsyymikiteelle, jolloin pidätysväline koostuu materiaalista, joka mahdollistaa yhteyden ristisidotun entsyymikiteen ja nesteen välillä, jolloin neste sisältää joko (1} analyytin, johon entsyymi vaikuttaa, tai 2} reagoivan: aineen reaktiossa, 15 johon analyytti osallistuu.
12. Biosensor enligt patentkrav 11, kä n n e t e ok -nää av att den dessutom omfattar detektiansmedel.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen biosensori, t u n n e t t u siitä, että se lisäksi käsittää toteamis-välineet.
13. Biosensor enligt patentkrav 11, k ä n n e t e c k -10 nad av att den korsbundna enzymkristallen är en lucifer- askristall, varvid luciferas verkar pä den önskade analyten eller pä en produkt i reaktionen i vilken den önskade analyten deltar, och fasthällningsmedlet: bestär av ett material som möjliggör kontakt mellan den korsbunna lucife-15 rasenzymkristalleri ooh vätskan, varvid vätskan innehäller endera 1) analyten, pä vilken lueiferaset verkar, eller 2) produkten i reaktionen i vilken analyten deltar.
13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen biosensori, 20. annettu siitä, että ristisidottu: entsyymikide on lusiferaasikide, jolloin lusiferääsi vaikuttaa haluttuun analyyttiin tai tuotteeseen reaktiossa, j ohon haluttu analyytti osallistuu, ja pidätysväline koostuu materiaalista, joka mahdollistaa yhteyden ristisidotun lusiferaasi-25 kiteen ja nesteen välillä, jolloin neste sisältää joko -(.1.). analyytin, johon lusiferaasi vaikuttaa, tai 2) tuotteen reaktiossa, johon analyytti osallistuu.
14. Användning av en biosensor enligt patentkrav 11, 12 eller 13 för att detektera en önskad analyt i en 20 vätska, kännetecknad av att den önskade analyten är glukos, kreatin, urea, laktat, glukos-6-fosfat, sackaros, ATP, etanoi, ättiksyra, myrsyra, kolesterol, urinsyra, me-totrexat, köldioxid, aminosyra, fosfat, penisillin, nit- ; rat, nitrit, sulfat eller suckinat.
14. Patenttivaatimuksen 11, 12 tai 13 mukaisen biösehsorin täyttö halutun analyytin toteamiseksi nestees- 30 tä, tunnettu siitä, että haluttu analyytti on glukoosi, kreafeiniini, urea, laktaatti, glukoosi-fi-fosta a tti , sakkaroosi, ATP, etanoli, etikka-happo, muurahaishappo, kolesteroli, virtsahappo, metotreksaatti, hiilidioksidi, aminohappo, fosfaatti, penisilliini-, nitraatti, 35 nitriitti, sulfaatti tai. sukkinaatti.
15. Anordning utanför kroppen med vilken en kompö- nent i en vätska ändras, kännetecknad av att den omfattar a} en korsbunden enzymkristall enligt nägot av patentkraven 1 - 6, varvid det närvarande enzymet verkar 30 pä den önskade komponenten eller pä ett reagerande ämne i reaktionen i vilken den önskade komponten deltar; oeh b} fasthällningsmedel för den korsbundna enzymkri-staiIen, varvid fasthällningsmedlet bestär av ett material som möjliggör en kontakt mellan den korsbundna enzymkri-35 stallen och vätskan, varvid vätskan innehäller endera 1) j j komponenten pä vilken enzymet yerkar, eller 2) ett reage-rande änme i I'eaktionen i vilken komponenten del tar.
15. Kehon ulkopuolinen laite käytettäväksi nesteen komponentin muuttamisessa, tunnettu siitä, että se käsittää a) jonkin patenttivaatimuksista 1 - 6 mukaisen 5 ristisidotun .entsyymikiteen, jolloin läsnä oleva entsyymi vaikuttaa haluttuun komponenttiin tai reagoivaan aineeseen reaktiossa, johon komponentti osallistuu,* ja b) pidätysyälineen ristisidotulle entsyymikiteelle, jolloin pidätysvällne koostuu materiaalista, joka mahdol- 10 listaa yhteyden ristisidotun entsyymikiteen ja nesteen välillä, jolloin neste sisältää joko (1) komponentin, johon entsyymi vaikuttaa, tai 2) tuotteen reaktiossa, johon kom-ponentti os a11istuu.
16. Anordning för användning för framställning av en önskad produkt, kännetecknad av att den innehaller 5 ett enzym enligt den form som den korsbundna enzymkristallen enligt nägot av patentkraven 1-6 är i och ett fast-hällningsmedel för den korsbundna enzymkristallen.
16. Laite käytettäväksi valitun tuotteen tuottami- 15 seksi, tunnet t u siitä, että se sisältää entsyymin, joka on jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukaisen ristisidotun entsyymikiteen muodossa ja pidätyövälineen ristisidotulle e nt s yymi kit eelie.
17. Menetelmä: aspartaamln tuottamiseksi, t u n -20 n e t t u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) yhdistetään kaksi peptidiä ja patenttivaatimuksen 2 mukainen ristisidottu termolyslinikide, jolloin ensimmäisen peptidin kaava on Z-L-Asp ja toisen peptidin kaava on L-Phe-OMe, olosuhteissa, jotka sopivat näiden 25 kahden peptidin kondensoimiseen ristisidotun termolysiini-kiteen toiminnan kautta, jolloin muodostuu osittain suojattu dipeptidi, jolla on kaava Z-L-Asp-L-Phe-OMe, jossa Z on bentsyylioksikarbonyyliryhmä, ja b) poistetaan bentsyylioksikarbonyyliryhmä dipepti-30 dista, jolloin muodostuu aspartaarni. X. Enzymkristsl 1 som är korsbunden ined ett multi-funktionellt korsbindnirigsäinne , kannet et k τι a d av att 5 den är resistant mot exogen proteolys av Pronase™-proteas, sä att den korsbundna enzymkristalien bevarar strains cone 91% av sin ursprungliga aktivitet nar den har in-kuberats tre timinar i en sddan koncentration av Pronasew^ proteas som fär den lösliga icke korsbundna formen av en-10 zymen, som kristalliseras för att erhdlla nämnda enzym som: är korsbunden, att bevara högst 6% av sin ursprungliga ak-tiyitet under samrna förhällanden, varvid enzymet väljs ur en grupp som utgors: av: (a) pyridoxalfosfatenzymer, metallensymer, enzymer IS som kräver CoA och sulfuras (PAPS); (b) termolysin, nitrilas, aminosyklas och hydanto- inas; (c) elas.tas, aminopeptidas:i asparaginas, glutami- j nas, arginas, ureas, aikaiifosfatas, lipas, fördelaktigt 20 fosfolipas, beta-laktamas, ACL-hydrolas, L-ACT-hydrolas, arylsuifatas, glykosidas, fördelaktigt beta-galaktpsidas och beta-fruktosidas, penisillinacylas, amidas, fördelak-tigt penisillinamidas, aininosyraes teräs, 5'-fosfodieste-ras, nukleas och kreatindeiminas; 25 (d) aminosyradehydrogenas, formatdehydrogenas, | laktatdehydrogenas, glutamatdehydrogenas, hydroxisteroid- ΐ dehydrogenas, glukos-6-pyruvatdehydrogenas, suckinatdehyd-rogenas, glukosdehydrogenas, katalas, superoxiddisinutas, peroxidas, luciferas, tyrosinas, flavoenzym, nitrat/- | 30 nitrit-reduktas, oxidoreduktas (NAD/P), oxidas och lyas; (e) kxnas (ATP), fördelaktigt kreatinas, transami-nas, glykosyltransferas och metyltransferas (SAM); (f) L-tryptofansyntetas och striktodinsyntetas; och 35 (g) esteras.
17. Förfarande för att framställa aspartam, k an ne teoknad av att det omfattar följande steg, i vilka 10 a) tvä peptider och en termolyskristall enligt pa~ tentkrav 2 förenas, varvid formeln för den första peptiden är Z-L-Asp och den andra peptiden är L-Phe-OMe, i förhäl-landen som lämpar sig för kondensation av dessa tvä peptider gehom verkning av den korsbundna termolysinkristallen, 15 varvid det bildas en delvis skyddad dipeptid som har formeln z-L-Asp-D-Phe-OMe i vilken Z är en foenzyioxikarbonyl-grupp, och b) benzyloxikarbonylgruppen avlägsnas fr an dipep-tiden varvid det bildas aspartam. *
FI930454A 1990-08-03 1993-02-02 Ristisidottuja entsyymikiteitä ja niiden käyttö uutena entsyymien immobilisointimuotona FI120099B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56228090A 1990-08-03 1990-08-03
US56228090 1990-08-03
US9105415 1991-07-30
PCT/US1991/005415 WO1992002617A1 (en) 1990-08-03 1991-07-30 Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI930454A FI930454A (fi) 1993-02-02
FI930454A0 FI930454A0 (fi) 1993-02-02
FI120099B true FI120099B (fi) 2009-06-30

Family

ID=24245600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI930454A FI120099B (fi) 1990-08-03 1993-02-02 Ristisidottuja entsyymikiteitä ja niiden käyttö uutena entsyymien immobilisointimuotona

Country Status (26)

Country Link
EP (2) EP0861888B1 (fi)
JP (2) JPH05508549A (fi)
AT (2) ATE240391T1 (fi)
AU (1) AU662104B2 (fi)
BR (1) BR9106732A (fi)
CA (1) CA2087730C (fi)
CZ (1) CZ12393A3 (fi)
DE (2) DE69133258T2 (fi)
DK (2) DK0861888T3 (fi)
ES (2) ES2263187T3 (fi)
FI (1) FI120099B (fi)
HK (2) HK1012411A1 (fi)
HU (2) HUT65904A (fi)
IE (1) IE912767A1 (fi)
IL (1) IL99046A (fi)
LT (1) LT3366B (fi)
LV (1) LV10304B (fi)
MD (1) MD1592B2 (fi)
NO (1) NO930360L (fi)
PT (1) PT98564B (fi)
RU (1) RU2124052C1 (fi)
SG (1) SG70966A1 (fi)
SK (1) SK283185B6 (fi)
TJ (1) TJ210R3 (fi)
UA (1) UA27035C2 (fi)
WO (1) WO1992002617A1 (fi)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932212A (en) * 1996-05-24 1999-08-03 Altus Biologics, Inc. Crosslinked protein crystal formulations and their use as catalysts in organic solvents
AU4738197A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Altus Biologics Inc. Crosslinked protein crystals as universal separation media
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
ATE397013T1 (de) 1997-09-05 2008-06-15 Altus Pharmaceuticals Inc Kohlenhydrat-vernetzte glykoproteinkristalle
US6500933B1 (en) 1997-09-05 2002-12-31 Altus Biologics Inc. Methods of preparing carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
US6979561B1 (en) 1998-10-09 2005-12-27 Gilead Sciences, Inc. Non-homogeneous systems for the resolution of enantiomeric mixtures
GB9823334D0 (en) 1998-10-23 1998-12-23 Darwin Discovery Ltd Enzyme coupling
US20020182201A1 (en) * 2001-02-16 2002-12-05 Guiyi Zhang-Sun Matrix stabilized enzyme crystals and methods of use
US7241272B2 (en) 2001-11-13 2007-07-10 Baxter International Inc. Method and composition for removing uremic toxins in dialysis processes
DK1699921T3 (da) * 2004-01-01 2010-02-01 Council Scient Ind Res Fremgangsmåde til fremstilling af tværbundne proteinkrystaller
ES2314646T3 (es) 2004-03-22 2009-03-16 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Composiciones farmaceuticas por via de productos que contienen lipasa , en particular de pancreatina, que contienen tensioactivos.
EP1809320B1 (en) 2004-10-14 2010-07-21 Altus Pharmaceuticals Inc. Compositions containing lipase; protease and amylase for treating pancreatic insufficiency
RU2413532C2 (ru) 2005-07-29 2011-03-10 Зольвай Фармасьютиклз Гмбх Способ получения стерилизованного порошкообразного панкреатина
US11266607B2 (en) 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US9198871B2 (en) 2005-08-15 2015-12-01 Abbott Products Gmbh Delayed release pancreatin compositions
US10072256B2 (en) 2006-05-22 2018-09-11 Abbott Products Gmbh Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample
JP5248676B2 (ja) 2009-05-22 2013-07-31 サンヨー食品株式会社 不斉酸化反応を有する蛋白質複合体およびその製造方法
EP2478005B1 (en) 2009-09-15 2014-11-12 Ajinomoto Althea, Inc. Protein a crystals and cross-linked crystals and methods of use thereof
WO2012026493A1 (ja) * 2010-08-26 2012-03-01 アイシン精機株式会社 酵素結晶固定化電極及び酵素結晶固定化電極の製造方法、並びに酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池及びバイオセンサー
DK3003358T3 (da) * 2013-06-07 2021-06-21 Allena Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og anordninger til dialyse
WO2016126970A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Abbvie Inc. Pharmaceutical compositions and methods of use thereof to treat pancreatic enzyme insufficiency
DK3638293T3 (da) * 2017-06-15 2023-11-06 Univ Chicago Sammensætninger til behandling af cancer
WO2023194615A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Need4Health B.V. Method for determining insulin dosage

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3664926A (en) 1970-02-26 1972-05-23 Merck & Co Inc Crystallization of l-asparaginase
DE2801238C2 (de) 1977-01-27 1986-06-05 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern
US4373023A (en) * 1980-10-14 1983-02-08 Massachusetts Institute Of Technology Process for neutralizing heparin
DE3381980D1 (de) * 1982-04-23 1990-12-13 Wako Pure Chem Ind Ltd Verfahren zur halbsynthese von menschlichem insulin und dazu zu verwendende alkalische protease.
US4411996A (en) * 1982-06-30 1983-10-25 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
WO1985003247A1 (en) * 1984-01-20 1985-08-01 Eye Products Limited Partnership Method for cleaning contact lenses
FR2566798B1 (fr) * 1984-06-27 1986-12-12 Centre Nat Rech Scient Membrane porteuse de la luciferase pour le dosage de l'atp et son procede de production
US4650758A (en) * 1984-09-21 1987-03-17 Cetus Corporation Stabilization of enzymes useful in the production of glucosone and other enzymatic processes
JPS6317691A (ja) * 1986-07-09 1988-01-25 Agency Of Ind Science & Technol アスパルテ−ム製造用固定化酵素
FI85285C (fi) * 1988-05-13 1992-03-25 Stabra Ag Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2199933T3 (es) 2004-03-01
MD1592B2 (ro) 2001-01-31
HK1012411A1 (en) 1999-07-30
LV10304A (lv) 1994-10-20
LT3366B (en) 1995-07-25
DK0550450T3 (da) 2003-09-08
HU9300275D0 (en) 1993-04-28
LV10304B (en) 1995-06-20
CA2087730C (en) 1999-07-20
FI930454A (fi) 1993-02-02
FI930454A0 (fi) 1993-02-02
NO930360L (no) 1993-04-02
JP2004000230A (ja) 2004-01-08
IL99046A0 (en) 1992-07-15
WO1992002617A1 (en) 1992-02-20
ATE323158T1 (de) 2006-04-15
EP0550450B1 (en) 2003-05-14
HK1023362A1 (en) 2000-09-08
RU2124052C1 (ru) 1998-12-27
ES2263187T3 (es) 2006-12-01
IL99046A (en) 1998-09-24
IE20040113A1 (en) 2004-05-05
EP0861888B1 (en) 2006-04-12
SK5993A3 (en) 1993-07-07
DE69133258D1 (de) 2003-06-18
HUT65904A (en) 1994-07-28
EP0550450A1 (en) 1993-07-14
SG70966A1 (en) 2000-03-21
DE69133521D1 (de) 2006-05-24
AU8315491A (en) 1992-03-02
NO930360D0 (no) 1993-02-02
CA2087730A1 (en) 1992-02-04
BR9106732A (pt) 1993-08-17
JPH05508549A (ja) 1993-12-02
TJ210R3 (en) 1998-11-14
ATE240391T1 (de) 2003-05-15
PT98564B (pt) 1999-01-29
SK283185B6 (sk) 2003-03-04
PT98564A (pt) 1992-06-30
DE69133521T2 (de) 2006-12-07
DK0861888T3 (da) 2006-08-14
LTIP1077A (en) 1995-04-25
AU662104B2 (en) 1995-08-24
EP0861888A1 (en) 1998-09-02
DE69133258T2 (de) 2004-03-18
UA27035C2 (uk) 2000-02-28
HU211521A9 (en) 1995-11-28
CZ12393A3 (en) 1993-10-13
IE912767A1 (en) 1992-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120099B (fi) Ristisidottuja entsyymikiteitä ja niiden käyttö uutena entsyymien immobilisointimuotona
US5618710A (en) Crosslinked enzyme crystals
IE83874B1 (en) Use of crosslinked crystals as a novel form of enzyme immobilization
JPH0533997B2 (fi)
Guilbault Immobilized enzymes as analytical reagents
Vrbova et al. Biosensor for determination of starch
Simonian et al. A tryptophan-2-monooxygenase based amperometric biosensor for L-tryptophan determination: use of a competitive inhibitor as a tool for selectivity increase
Rai et al. Production of D-amino acids using immobilized D-hydantoinase from lentil, Lens esculenta, seeds
Chen et al. The changes of circular dichroism and fluorescence spectra, and the comparison with inactivation rates of angiotensin converting enzyme in guanidine solutions
Minato et al. Characterization of Ustilago Ribonuclease U2 Effects of Chemical Modification at Glutamic Acid-61 and Cystine-1 and of Organic Solvents on the Enzymatic Activity
US5279945A (en) Method for the enzymatic determination of aspartame
NZ264042A (en) Crosslinked crystalline immobilized protein, biosensor containing the crosslinked protein crystal
IE85134B1 (en) Use of Crosslinked Crystals as a Novel Form of Enzyme Immobilization
JPS6210159B2 (fi)
Wu et al. Modification of maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase with fluorescein isothiocyanate
LIU ISOLATION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE
JPH0428353B2 (fi)
JPS5995886A (ja) Ｌ−トリプトフアンアミノペプチダ−ゼ及びその製造方法
JPS6019499A (ja) ペプチダ−ゼ活性の測定法
JP2003210163A (ja) 耐熱性ｌ−アミノ酸酸化酵素

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120099

Country of ref document: FI

MA Patent expired