SK70898A3 - Spôsob prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu - Google Patents

Abstract

Spôsob prípravyje založený na tom, že sa chránený L- -alanínester spolu s L-glutaminom alebo L-glutamínamidom dáva v reakčnom prostredí na báze organických rozpúšťadiel, miešateľných alebo nemiešateľných s vodou, s prísadou soli alkalických kovov alebo alkalických zemín a ďalších potrebných faktorov, do kontaktu s mikrobiálnou proteázou, voľnou alebo imobilizovanou, pri teplote 20 až 60 °C a hodnote pH 8 až 10. Chránený dipeptid je významnou východiskovou látkou na prípravu L-alanyl-L-glutamínu, ktorý sa vo forme infuznych roztokov používa pri liečení ťažkých pooperačných, traumatických, katabolických, septických a iných stresových stavov.

Description

Spôsob prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl -L-glutamínu

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu všeobecného vzorca I

X - L - alanyl - L - glutamin - Y (I), kde X je chrániaca skupina N-alfa-formylová, N-alfa-fúrylakryloylová, N-alfa-benzoylová, N-alfa-benzoloxykarbonylová, N-alfa-fenylacetylová, N-alfa-terc.-butyloxykarbonylová alebo N-alfa-fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina alebo aminoskupina. Chránený dipeptid je výhodná východisková látka na prípravu voľného L-alanyl-Lglutamínu, ktorý sa vo forme iníuznych roztokov používa pri liečbe ťažkých pooperačných, traumatických, katabolických, septických a iných stresových stavov.

Doterajší stav techniky

Ako je známe, používajú sa syntetické dipeptidy (alebo tripeptidy) ako zložky iníuznych roztokov na parenterálnu výživu. Ide o peptidy tých L-aminokyselin, ktoré sú pre organizmus potrebné, ale ktoré sú v roztoku buď nestále (glutamin) alebo len čiastočne rozpustné (cysteín, tyrozín). V porovnaní s voľnými aminokyselinami sú dipeptidy stálejšie a rozpustnejšie. Pretože biologická dostupnosť peptidov a tým aj ich využiteľnosť v organizme je veľmi dobrá, je možné aplikáciou dipeptidov zvýšiť prísun aminokyselín bez nežiadúcej záťaže organizmu (A. Veselková a spol., Čes. a Slov. Farm. 45, č. 1, str. 14-16, 1996).

Glutamin je v organizme dôležitým donorom dusíka. Hlavne v záťažových stavoch sa jeho spotreba zvyšuje, avšak v mnohých prípadoch jeho prirodzená tvorba nestačí. Prekážkou dodatočného prísunu je však nestálosť glutamínu vo vodnom prostredí a pri sterilizácii iníuznych roztokov jeho rozklad. (P. Fiirst so spol., Proc. Nutr. Soc. 49, 343359,1990). Glutamin sa však môže dodať do organizmu vo forme dipeptidov, z ktorých sa najlepšie osvedčil L-alanyl-L-glutamín, ktorý sa v plazme zdravých probandov rýchlo odbúrava plazmatickou proteázou na alanín a glutamin za rýchlej utilizácie zložiek (Fiirst a spol., citované vyššie; H. Lochs a spol., Metabolism 39, 833-836, 1990). Konvenčná

-2výživová terapia spomenutých stresových stavov však zlyhala a jedinou možnou cestou je dodanie glutamínu do organizmu vo forme infuznych roztokov doplnených alanylglutaminom.

Glutamín aplikovaný vo forme dipeptidu je veľmi stály, nerozkladá sa na nežiadúce produkty a je omnoho viac rozpustnejší než vo voľnom stave, ako sa experimentálne dokázalo (P. Stehle, Klinische Emährung 35, 1991).

Alanylglutamin je možné pripraviť chemickou syntézou (P. Stehle a spol., J. Appl. Biochem, 4, 280-285, 1982), ktorá je však na výrobu vo veľkej miere z mnohých technických, ekonomických i ekologických dôvodov nevýhodná. Ďalej sa podarilo uskutočniť prvú modelovú enzýmovú syntézu alanylglutamínu na výskumné účely pomocou cysteínových proteáz papaínu (z Carica papaya) a ficínu (z Ficus carica). Pomocou týchto rastlinných proteáz sa však alanylglutamin nemôže vo veľkom množstve vyrábať, lebo sú to drahé a ťažko dostupné proteázy, nepoužiteľné na ekonomickú výrobu.

Živočíšna výroba proteáz je tiež nevýhodná, pretože je drahá a ťažkopádna a je možné tak získavať len niektoré proteázy na špeciálne účely, napríklad pepsín z hovädzích žalúdkov alebo alfa-chymotrypsín z prasačích sliniviek. Naviac nebola v dostupnej literatúre zistená medzi proteázami živočíšneho pôvodu žiadna proteáza, ktorá by bola schopná syntetizovať alanylglutamin.

Pozornosť sa preto obrátila na výskum mikrobiálnych proteáz, ktoré by boli schopné syntetizovať žiadaný dipeptid a ktoré by boli dostupné, lacné a umožňovali ekonomickú výrobu v prevádzkovom množstve. V odbornej a patentovej literatúre nie je doposiaľ známa žiadna mikrobiálna proteáza, ktorá by bola schopná syntetizovať žiadaný dipeptid, t.j. alanylglutamin. Na základe systematického výskumu, predovšetkým dostupných komerčných mikrobiálnych proteáz a mikroorganizmov, sa však podarilo nájsť vhodné proteázy, schopné syntetizovať chránený alanylglutamin.

Podstata vynálezu

Vynález sa teda týka spôsobu prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu všeobecného vzorca I

X - L - alanyl - L - glutamín - Y (I),

-3kde X je chrániaca skupina N-alfa-formylová, N-alfa-furylakryloylová, N-alfa-benzoylová, N-alfa-benzoloxykarbonylová, N-alfa-fenylacetylová, N-alfa-terc.-butyloxykarbonylová alebo N-alfa-fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina či aminoskupina. Podstata vynálezu spočíva v tom, že sa chránený ester L-alanínu všeobecného vzorca II

X-L-Ala-R (Π), kde X je to isté, čo vo vzorci I a R je alkyl s 1 až 3 atómami uhlíka alebo benzyl, spolu s Lglutamínom alebo L-glutaminamidom uvádzajú do styku s voľnou alebo imobilizovanou mikrobiálnou proteázou alebo so zmesami týchto proteáz, v prostredí organického rozpúšťadla miešateľného alebo nemiešateľného s vodou, ktoré zahŕňa alkanoly s 1 až 5 atómami uhlíka, acetonitril, dimetylformamid, dioxán, dimetylsulfoxid, etylacetát, tetrachlórmetán alebo ich zmesi, s koncentráciou 0,5 až 99,5 objemových %, s prísadou solí alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín s anorganickými kyselinami a dvojsódne soli kyseliny etyléndiaminotetraoctovej (EDTA), pri teplote od teploty miestnosti až do 60 C a pri hodnote pH 8 až 10.

Účelne a výhodne sa ako voľné imobilizované mikrobiálne proteázy používajú proteázy, vybrané zo súboru, ktorý zahŕňa proteázu z Aspergillus oryzae, Streptomyces griseus, Vibrio proteolyticus ATCC 15338, karboxypeptidasu Y zo Saccharomyces cerevisiae alebo Saccharomyces coreanus, proteinázu K z Tritirachium album, peptidyl Asp - metaloendopeptidázu z Pseudomonas fluorescens RK-9 (zbierka Výskumného ústavu antibiotík a biotransformácií), a to jednotlivo alebo v zmesi.

Ako prísady do reakčného, resp. kultivačného prostredia sú potrebné soli alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín s anorganickými kyselinami, hlavne sírany, dusičnany, chloridy alebo fosforečnany, a to jednotlivo alebo v zmesi; pri použití niektorých proteáz je účelná prísada chloridu zinočnatého, prípadne prísada L-cysteínu.

Výhody spôsobu podľa vynálezu spočívajú v tom, že výroba mikrobiálnych proteáz, ktorá vychádza z dostupných surovín, je lacná, umožňuje jednoduchú izoláciu enzýmu na jednom mieste pomocou sledu bežných operácií a bežných zariadení. Ňa výrobu dipeptidov stačí napríklad príslušnú proteázu izolovať po kultivácii mikroorganizmu len do formy technického preparátu (nie je potrebná izolácia a purifíkácia až do kyslého stavu), lebo ten sa imobilizuje (napríklad pomocou sieťovacích činidiel, zapolymerovaním do polymémej siete, prípadne väzbou na organické polyméry či porézne anorganické materiály), čím enzým prejde do formy malých tuhých častíc (rovnako je možné použiť priamo rozpustný

-4enzým zachytením do ultrafiltračných membrán) a používa sa opakovane vo vsádzkovom zariadení (napríklad 100 až 1000 x podľa stability enzýmovej aktivity a mechanickej odolnosti imobilizovaného preparátu) alebo v kontinuálne pracujúcom reaktore počas niekoľkých hodín, kedy sa enzýmový materiál musí pre manipulačné straty doplňovať. Po ukončení reakcie sa supematant (reakčná zmes) od imobilizovanej proteázy oddelí a zhromažďuje sa na ďalšie spracovanie.

Chemická výroba L-alanyl-L-glutamínu pracuje výhradne vsádzkovo, je obmedzená únosným množstvom reakčnej zmesi, používa toxické látky (napr. fosgén), vysoké teploty a tlaky, znečisťuje okolie. Skupiny, ktoré spolu nemajú reagovať, je treba chrániť, napriek tomu môžu nastať nežiadúce reakcie. Pri chemickej výrobe hrozí predovšetkým epimerizácia na chirálnom uhlíku pripravovaného peptidu (vznik racemickej zmesi). Komplikovaná je aj izolácia chráneného peptidu až do čistej formy.

Oproti tomu je spôsob výroby podľa vynálezu realizovateľný v bioreaktoroch jednoduchší, pracuje sa za prijateľných teplôt a tlakov, s bežnými látkami, za zachovania ekologických podmienok. Nenastávajú nežiadúce reakcie na sekundárnych skupinách a predovšetkým nehrozí nebezpečie spomenutej epimerízácie, lebo enzýmy sú prísne stereošpecifické, takže dáva (vzniká) homogénny dipeptid. Systematickým výskumom mikrobiálnych proteáz sa našlo niekoľko mikroorganizmov, produkujúce proteázy schopné syntetizovať chránený alanylglutamín. Sú to proteáza z Aspergillus oryzae (pleseň) a Streptomyces griseus (aktinomyceta), karboxypeptidáza Y zo Saccharomyces cerevisiae alebo Saccharomyces coreanus (kvasinky), proteináza K z Tritirachium album (huba), proteáza z Vibrio proteolyticue (baktérie), peptidyl-Asp-metaloendopeptidáza z Pseudomonas fragi a metaloendopeptidáza z Pseudomonas fluorescens (pseudomonády). Všetky menované proteázy sú endopeptidázy alebo karboxypeptidázy, lebo len tie sú schopné produkovať žiadaný dipeptid. Najvýhodnejšie sú serínové proteázy, lebo pri ich použití sa získa dipeptid za relatívne krátky čas a vo vysokom výťažku. Aj pri enzýmovej príprave je nutné používať chrániace skupiny, ale len pre alfa-aminoskupinu alanínu. Vhodné chrániace skupiny sú uvedené vyššie. Na syntézu sa používa alanín vo forme esteru, čo je už tiež uvedené.

Pri uvedení spôsobu podľa vynálezu sa východiskové zlúčeniny uvádzajú vo vhodnom reakčnom prostredí do styku s niektorou z vyššie uvedených mikrobiálnych proteáz. Reakčné prostredie obsahuje organické rozpúšťadlo miesiteľné alebo nemiesiteľné

-5s vodou a podľa povahy použitej proteázy ďalšie potrebné prísady, napríklad soli, EDTA, tlmivé roztoky, cysteín a ďalšie. Za stáleho miešania sa teplota a hodnota pH udržujú v potrebnom rozmedzí.

Pri práci s imobilizovanou mikrobiálnou proteázou sa reakčná zmes postupne zhromažďuje a potom sa v nej jednorázovým procesom zo vzniknutého derivátu alanylglutaminu odstráni chrániaca skupina buď chemicky (napríklad kontaktnou hydrogenolýzou a pod.) alebo s výhodou enzýmovo, kedy sa využíva schopnosť niektorých amidáz oddelovať chrániace skupiny (penicilamidáza odstraňuje fenylacetylovú skupinu, peptidamidáza odštepuje amidovú skupinu glutaminamidu a pod.). Enzýmová metóda odštepovania chrániacich skupín umožňuje pri voľbe vhodnej chrániacej skupiny zostaviť v prevádzke napríklad sériu dvoch prietokových reaktorov, keď v prvom sa syntetizuje chránený alanylglutamín a v druhom sa odstraňuje chrániaca skupina, takže kontinuálne sa získa priamo žiadaný produkt, ktorý sa izoluje niektorým zo známych postupov, napríklad iontomeničovou chromatografiou, gélovou filtráciou, poprípade hydrofóbnou alebo afinitnou chromatografiou.

Bližšie podrobnosti spôsobu podľa vynálezu vyplývajú z nasledujúcich príkladov uskutočnenia, ktoré tento spôsob len ilustrujú, ale nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

V termostatovej nádobke s objemom 50 ml sa pripravilo 30 ml zmesi obsahujúcej 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 10 mM chloridu vápenatého, 10 mM L cysteínu, 0,663 g N-fenylacetyl-L-alanínmetylesteru (0,1 M), 3,5 g L-glutamínu (0,8 M), 5 objemových % etanolu a vodu na celkový objem 30 ml. pH sa za miešania upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 9,5 a po vytemperovaní zmesi na 35 °C sa za miešania pridalo 10 mg karboxypeptidázy Z zo Saccharomyces cerevisiae, čim sa začala reakcia. Reakčná zmes sa intenzívne miešala a počas reakcie sa teplota udržovala pomocou ultratermostatu na 35 °C a pH sa udržovalo pomocou pH-statu na hodnote 9,5. Počas reakcie sa odobrali vzorky s objemom 0,5 ml, v ktorých sa reakcia zastavila pridaním 0,5 ml 2 M kyseliny chlorovodíkovej. Vzorky sa hodnotili kapilárnou elektroforézou spojenou s vyhodnocovacim počítačom. Po 180 min reakcie, kedy sa jej koniec indikoval skoro úplnou spotrebou N-fenylacetyl-L-alanínmetylesteru, našla sa koncentrácia N-fenylacetyl-L-alanyl-6L-glutamínu 26,7 g/1, čo predstavuje konverziu 79,7 % vzťahujúce sa na východiskový acyldonorester.

Príklad 2

Analogicky ako v príklade 1 sa pripravilo 30 ml zmesi, ktorá obsahovala 0,1 M chloridu draselného, 30 mM dusičnanu sodného, 1 mM EDTA, 0,621 g N-benzoyl-Lalaninmetylesteru (0,1 M), 2,61 g L-glutamínamidu (0,6 M), 50 objemových % dimetylformamidu a vodu na celkový objem 30 ml. Za miešania sa pH zmesi upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 9,0 a po vytemperovaní zmesi na 40 °C sa pridalo 1,26 g proteázy z Aspergillus orazae, čo viedlo k začiatku reakcie. Za intenzívneho miešania reakčnej zmesi sa počas reakcie udržiavala teplota pomocou ultratermostatu na 40 °C a pH sa udržiavalo pomocou pH-statu na hodnote 9,0. Analogicky ako v príklade 1 sa z reakčnej zmesi odobrali vzorky a merali sa kapilárnou elektroforézou. Po 5 h reakcie, kedy sa už koncentrácia N-benzoyl-L-alaninmetylesteru udržovala prakticky na rovnakej hodnote, našla sa produkcia N-benzoyl-L-alanyl-L-glutamínamidu 15,6 g/1, čo vzťahujúc sa na východiskový acyldonorester predstavuje konverziu 48,8 %.

Príklad 3

Analogicky ako v príklade 1 sa pripravilo 30 ml zmesi, obsahujúcej 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 50 mM síranu sodného, 4,38 g L-glutamínu (IM), 0,747 g Nbenzyloxykarbonyl-L-alanínmetylesteru (0,1 M), 63 objemových % metanolu a vodu na celkový objem 30 ml. Za miešania sa pH zmesi upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 8,0 a po vytemperovaní zmesi na 30 °C sa za miešania pridalo 15 mg proteázy zo Streptomyces griseus, čim sa začala reakcia. Reakčná zmes sa intenzívne miešala, teplota sa udržiavala pomocou ultratermostetu na 30 °C a pH sa udržiavalo pomocou Ph-statu na hodnote 8,0. Vzorky sa odobrali a merali analogicky ako v príklade 1. Po 120 min reakcie sa nameralo 12,7 g/1 N-benzyloxykarbonyl-L-alanyl-L-glutaminu, čo predstavuje konverziu 39,3 %, vzťahujúc sa na východiskový acyldonorester.

Príklad 4

a) príprava čiastočne izolovanej technickej proteázy z Vibrio proteolyticus ATCC 15338

Kultúra uvedeného kmeňa sa udržiavala na šikmých agaroch so zložením:

Nutrient Agar Difco 3,1 %

7Difco agar chlorid sodný pH 7,0

0,5 % 2,2 %

Kultivácia prebiehala pri 28 °C na rotačnom trepacom stroji s počtom otáčok 240 min'¹ v 500 ml varných bankách plnených 100 ml kultivačného média so zložením:

sacharóza 4 % com-steep liquor (CLS) 4 % hydrogénfosforečnan dvojsodný dodekahydrát 0,5 % síran amónny 0,5 % síran draselný 0,1% chlorid vápenatý 0,1 % síran horečnatý heptahydrát 0,05 % chlorid sodný 2,0 % pH 7,0

Banky I. generácie sa očkovali sterilné kľučkou zo šikmého agaru a kultivácia I. generácie prebiehala 24 h. Pri očkovaní 1 % inokula z baniek I. generácie prebiehala kultivácia Π. generácie tiež 24 h. O.D. na konci kultivácie bola 5,4 a hodnota pH bola 7,9. Obsah baniek sa odstredil pri 5000 g počas 30 min, čím sa záskal číry nahnedlý supematant s proteázovou aktivitou 0,28 mg azokaseinu/min/ml. Supematant sa zahustil na rotačnom vákuovom odparovači vybavenom výkonnou rotačnou olejovou vývevou pri 25 °C zhruba

5,5 x, pričom sa dosiahla proteázová aktivita zahusteného supematantu 0,65 mg azokazeínu/min/ml.

b) príprava dipeptidu

Analogicky ako v príklade 1 sa namiešalo 10 ml zmesi, obsahujúcej po prepočte na výsledný objem 30 ml 0,1 M chloridu draselného, 10 mM chloridu vápenatého, 1 mM chloridu zinočnatého, 1 mM EDTA, 0,2385 g N-formyl-L-alanínpropylesteru (50 mM), 5,256 g L-glutamínu (1,2 M), 20 objemových % propanolu a vodu. Po vytemperovaní zmesi na príslušnú teplotu a úprave pH 2 M hydroxidom sodným na príslušnú hodnotu sa za miešania pridalo 20 ml zahusteného supematantu kultúiy Vibrio proteolyticus ATCC 15338, čím sa začala reakcia, pri ktorej bola teplota intenzívne miešanej zmesi udržiavaná pomocou ultratermostatu na 40 °C a pH sa udržiavalo pomocou pH-statu na hodnote 9,5.

-8Pri analogickom odbere a analýze vzorkov ako v príklade 1 sa po 3 h reakcie našlo 7,2 g/1 N -formyl-L-alanyl-L-glutamínu pri konverzii 58,7 %, vzťahujúc sa na východiskový acyldonorester.

Príklad 5

a) príprava imobilizovanej proteázy

V 50 ml nádobke sa sférické častice organického kopolyméru metakrylaldehyddivinylbenzén s obsahom 11,8 hmotnostných % metakrylaldehydových skupín s priemerom 150 až 300 pm v stechiometrickom pomere aktivovali hexametyléndiaminom a s množstvom 2 g sa miešali pomocou magnetického miešadla v 30 ml vody s 2 g proteinázy K z Tritirachium album v prítomnosti 1,6 ml 50 objemových % glutaraldehydu pri teplote miestnosti počas 6 h. Po reakcii sa imobilizované častice od supematantu oddelili dekantáciou a dôkladne premyli vodou. Získalo sa 5,4 g vlhkej hmoty imobilizovanej proteinázy K s špecifickou aktivitou 4,3 pmol L-leucínu/min/mg vlhkej hmoty (ďalej len j/min/mg - proteázová aktivita bola 0,11 mg azokazeínu/min/mg vlhkej hmoty). Pri pôvodnej aktivite proteinázy K 13,7 j/min/mg preparátu (0,37 mg azokazeínu/min/mg) to predstavuje výťažok imobilizácie zhruba 85 %.

b) príprava dipeptidu

Do reaktora s objemom 50 ml vybaveného kotvovým miešadlom s počtom otáčok 150 min*¹, ktoré udržiavalo častive biokatalyzátora v dokonalom nadnášani, minimálne ich mechanicky poškodzujúc, a ktoré zaisťovalo dokonalé premiešavanie reakčnej zmesi, sa dalo 4,5 g vlhkého katalyzátora (približne 19000 j/min/30 ml, t.j. na pracovný objem raektora) a pridalo sa vždy 30 ml zmesi, obsahujúcej 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 10 mM chloridu vápenatého, 50 mM fosforečnanu tridraselného monohydrátu, 0,663 g N-fenylacetyl-L-alanínmetylesteru (0,1 M), 5,256 g L-glutamínu (1,2 M), 30 objemových % etanolu a vodu na celkový objem 30 ml. pH zmesi sa vždy upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 9,7. V miešanom reaktore prebiehala vždy vsádzkovo reakcia v styku s imobilizovanou proteinázou K za udržiavania teploty pomocou ultratermostatu na 28 °C a pH pomocou pH-statu na hodnote 9,7 počas 60 až 80 min. Po reakcii sa reakčná zmes vždy odtiahla násoskou, vybavenou fritou proti úniku častíc, a zhromažďovala na ďalšie spracovanie.

-9Týmto spôsobom sa uskutočnilo 120 opakovaných vsádzkových konverzií; pri analogickom odbere a meraní vzorkov ako v príklade 1 bola priemerná produkcia Nfenylacetyl-L-alanyl-L-glutamínu 29,8 g/1, čo predstavuje priemernú konverziu východiskového acyldonoresteru približne 90 %. Špecifická aktivita imobilizovanej proteinázy klesla po 120 opakovaných vsádzkových konverziách, t.j. asi po 140 h prevádzky, na 3,9 j/min/mg vlhkej hmoty, čo reprezentuje operačný polčas biokatalyzátora asi 950 h.

Priemyselné využitie

Chránené deriváty L-alanyl-L-glutamínu, pripravené pomocou mikrobiálnych proteáz spôsobom podľa vynálezu, sú výhodnými východiskovými látkami na prípravu dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu, ktorý sa vo forme infiíznych roztokov používa na liečenie ťažkých pooperačných, traumatických, katabolických, septických a iných stresových stavov.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu všeobecného vzorca I

   X - L - alanyl - L - glutamín - Y (I), kde X je chrániaca skupina N-alfa-formylová, N-alfa-íurylakryloylová, N-alfa-benzoylová, N-alfa-benzyloxykarbonylová, N-alfa-fenylacetylová, N-alfa-terc.-butyloxykarbonylová alebo N-alfa-fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina alebo aminoskupina, vyznačujúci sa t ý m, že sa chránený ester L-alaninu všeobecného vzorca Π

   X-L-Ala-R (H), kde X je to isté, čo vo vzorci I a R je alkyl s 1 až 3 atómami uhlíka alebo benzyl, spolu s Lglutamínom alebo L-glutaminamidom uvádzajú do styku s voľnou alebo imobolizovanou mikrobiálnou proteázou alebo so zmesami týchto proteáz, v prostredí organického rozpúšťadla miešateľného alebo nemiešateľného s vodou, vybraného zo súboru, ktorý zahŕňa alkanoly s 1 až 5 atómami uhlíka, acetonitril, dimetylformamid, dioxán, dimetylsulfoxid, etylacetát, tetrachlórmetán alebo ich zmesi, s koncentráciou 0,5 až 99,5 objemových %, s prísadou solí alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín s anorganickými kyselinami a dvojsodné soli kyseliny etyléndiaminotetraoctovej, pri teplote miestnosti až do 60 °C a pri hodnote pH 8 až 10.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa ako voľné alebo imobilizované mikrobiálne proteázy používajú proteázy, vybrané zo súboru, ktorý zahŕňa proteázu z Aspergillus oryzae, Streptomyces griseus, Vibrío proteolyticus ATCC 15338, karboxypeptidázu Y z Saccharomyces cerevisiae alebo Saccharomyces coreanus, proteinázu K z Trítirachium album, peptidyl-Asp-metaloendopeptidázu z Pseudomonas fragi alebo metaloendopeptidázu z Pseudomonas fluorescens.

   -113. Spôsob podľa nároku la 2, vyznačujúci sa tým, že sa ako soli alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín s anorganickými kyselinami používajú sírany, dusičnany, chloridy alebo fosforečnany, a to jednotlivo alebo v zmesi.
3. 4. Spôsob podľa nároku laž 3, vyznačujúci sa tým, že reakčné prostredie obsahuje prísadu chloridu zinočnatého.
4. 5. Spôsob podľa nároku laž 3, vyznačujúci sa tým, že reakčné prostredie obsahuje prísadu cysteínu.