NL8302333A - Werkwijze voor het isomeriseren van glucose. - Google Patents

Description

VO 14-9^0 * -> ' 6 -Μ- - *

Werkwijze voor het isomeriseren van glucose.

De uitvinding heeft betrekking op enzymatische werkwijzen voor het omzetten van glucose (dextrose) in fructose (levulose).

Het meeste glucose van voedingskwaliteit wordt geleverd als een enzymatisch hydrolysaat van maïszetmeel, d.v.z. de in de handel 5 verkrijgbare maissiroop. In het algemeen wordt glucose 60 tot 80% zo zoet gekwalificeerd als sucrose waardoor het tegen een overeenkomstige lagere prijs wordt verkocht. Het is reeds lang bekend om glucose te isomeriseren tot fructose (dat zelfs zoeter is dan sucrose) onder toepassing van een enzym met glucose-isomeraseaetiviteit, bij voorkeur een 10 enzym dat geïmmobiliseerd is op een inerte drager zoals diëthylamino-ethyl-cellulose, poreus glas of chitine. Gedetailleerde beschrijvingen van de enzymatische omzetting van glucose in fructose waarbij glucose-isomerase wordt gebruikt, kunnen worden aangetroffen in Hamilton, et al. "Glucose Isomerase a Case Study of Enzyme-Catalysed Process Technology”, 15 Tmmdbilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et al.,

Plenum Press, Wew York (197*0, p· 9**· - 106, 112, 115 - 137; Antrim, et al., "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups”,

Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2, Academie Press (1979); Chen, et al., "Glucose Isomerase (a Review)”, Process Biochem., (19Ö0), 20 p. 30 - 35; Chen, et al. "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem. , (i960), p. 36 - hl; Nordahl, et al., "Fructose Manufacture from Glucose by Immobile! Glucose Isomerase”, Chem. Abstracts, Vol. 82, (1975), Abs. Ho. 1103l6tL; en Takasaki, "Fructose Production Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Vol. 82, (1975), Abs. Ho.110316(h); en 25 Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem. Abstracts,

Vol. 81, (197*0, Abs. Ho.76^7^a. Bovendien bestaan vele octrooien met betrekking tot glucose-isomeratie waarvan Amerikaansoctrooischriften 3.6l6.221; Reissue 28.885 (oorspronkelijk 3.623.953); 3.69b.3lh; 3.708.397; 3.715.276 ; 3.788.9*^5; 3.826.71*^ 3.8U3.*^2; 3.909.35**·; 30 3.960.663; k.1hh.127; en U.308.31# representatief zijn.

8302333 - 2 - 4 it

De fructosegehalten die door de isomerisatie van glucose met behulp van glucose-isomerase kunnen worden bereikt, zijn beperkt door hd; evenwicht van de isomerisatiereactie. Bij 65°G ligt het evenwicht van de reactie bij ongeveer 51 gew.$ fructose uit een uitgangssub-5 straat van zuiver dextrose* Wanneer gezuiverde glucosevloeistof als substraat wordt gebruikt (welke tot ongeveer 6 gew,$ non-monosacchari-den bevat) en een redelijke verblijftijd in de enzymreactor wordt aangehouden, is een h-8 - 32.%1 s fructosesiroop het hoogste fructosegehalte dat (op droge basis) met de bovenvermelde bekende procedures kan wor-10 den bereikt. Om siropen met een hoger fructosegehalte te bereiken, moeten fractioneringssystemen worden gebruikt die de kosten van het uiteindelijke produkt in hoge mate verhogen. Bij hogere temperaturen wordt het evenwicht echter gunstiger. B.v. zou een enzymatisch glucose-isomeraseproces, dat bij temperaturen van ongeveer 90 - 1^0°C kan wor-15 den uitgevoerd, gebruikt kunnen worden om direct maxssiropen met hoog fructosegehalte (HFCS) te verschaffen die 53 - 60 gew.$ fructose op droge basis bevatten, waarbij de behoefte aan fractionering en recirculatie wordt geëlimineerd. De neiging van bekende glucose-isomerase-systemen om thermische denaturering te ondergaan met een daarmee ge-20 paard gaande scherpe verlaging van activiteit, heeft tot dusver pogingen om hogere temperatuurregimes te gebruiken teneinde het evenwicht van de isomerisatie verder ten gunste van fructose te verschuiven, gefrustreerd. Bovendien zijn glucose en in het bijzonder fructose gevoelige reducerende suikers die een uitgesproken neiging’ tot de vor-25 ming van ongewenste bijprodukten hebben zoals psicose, gekleurde pro-dukten, kleurvoorlopers, fructosedianhydriden, mannose, tagatose, en zuren wanneer ze verhit worden op de temperaturen die voor de isomerisatie volgens de uitvinding nodig zijn.

Thans is verrassenderwijze gevonden dat door een glucose-isome-30 risatieprocedure uit te voeren binnen bepaalde kritische grenzen van pH en verblijftijd in een enzymreactor zoals bovenstaand gedefinieerd, isomerisatietemperaturen van ongeveer 90°C tot ongeveer 1U0°C effectief kunnen worden gebruikt om direct HFCS-siropen van hoge kwaliteit te verschaffen (d.w.z, met aanvaardbare vorming van bijprodukten), die 35 ongeveer 52 tot ongeveer 60 gev.% fructose bevatten, waardoor de be- 8302333 ψ .- 4 - 3 - hoefte aan kostbare en operationeel complexe fractionerings- en recir-culatiebewerkingen die door bekende glucose-isomerisatieprocessen worden vereist om bet bovenvermelde bereik van bet fructosegehalte te realiseren, wordt geëlimineerd.

5 Volgens de onderhavige uitvinding wordt glucose gexsomeriseerd tot fructose door een werkwijze, waarbij een glucose bevattende vloei-‘stof in contact wordt gebracht met chemisch gestabiliseerde glucose-isómerase bij een temperatuur van ongeveer 90 tot ongeveer 140°C bij een pH van ongeveer 3 tot ongeveer 8 en een voldoende contactduur om 10 een uiteindelijk gehalte in de vloeistof van tenminste ongeveer 53 tot ongeveer 60 gev.% fructose te bereiken, gebaseerd op het totale koolhydraatgehalte zonder sterke vorming van psicose, en/of non-fructose, non-glucosesuikers.

De glucose die volgens de onderhavige uitvinding tot fructose 15 wordt gexsomeriseerd, kan afkomstig zijn van elk van de bekende bronnen voor deze suikers. Om economische redenen zal de glucose gewoonlijk afkomstig zijn van de hydrolyse van cellulose of zetmeel onder toepassing van zuur en/of enzym, bij voorkeur laatstgenoemde, volgens bekende procedures. Glucose bevattende vloeistoffen die op deze wijze zijn ver-20 kregen, zullen gewoonlijk ondergeschikte hoeveelheden polysacchariden, suikeroligomeren, enz. bevatten, afhankelijk van de toegepaste koolhy-draatbron en de gebruikte hydrolysemethode. Korrels van granen zoals mais, milo, tarwe, rogge, en dergelijke, en zetmeelhoudende wortels en knollen zoals aardappelen, broodwortels, penen, cassave (manioc) en 25 dergelijke, zijn uitstekende zetmeelbronnen voor omzetting in het glu-cose-uitgangsmateriaal volgens de uitvinding. In de Verenigde Staten heeft maïszetmeel bijzonder de voorkeur in verband met zijn betrékkelijk geringe kosten en gemakkelijke verkrijgbaarheid. Omdat de produk-tie van glucose van voedingskwaliteit een voordeel is van het gebruik 30 van enzymatische zetmeelhydrolyseprocedures, hebben dergelijke procedures hier de voorkeur. Snzymhydrolysemethoden worden beschreven in de Amerikaanse octrooischriften ^.017.3^3, 3,912.590, 3.922.196, 3.922.197-201 en ^-.28^. 722 waarvan de ihhoud hier door verwijzing opgenomen moet worden geacht.

35 De hier als bron van enzym voor chemische stabilisatie toege- ________ 8302333 a * -Impaste glucose-isomerase kan -worden geïsoleerd uit elk van de bekende glucose-isomerase producerende microörganismen met inbegrip van Streptomyces flavorirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces 5 phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium. Bacillus fructosus, Brevi-bacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoe aesenteroides, en Paracolobactrum aerogenoides. Bovendien kunnen glu-10 cose-isomerases worden gebruikt die voortgebracht worden door de genera flocardia, Micromonospora, Microbispöra, Microellobospora en Arthro-bacter. Streptomyces sp. ATCC 21.175 is een uitstekende bron voor glucose-isomerase voor toepassing in de onderhavige werkwijze. Zoals eerder vermeld kan het voordelig zijn om glucose-isomerase te gebruiken 15 dat stabiliteit bezit bij de betrekkelijk hoge isomerisatietemperatu-ren die hier worden gebruikt, b.v. glucose-isomerase dat geproduceerd wordt door Bacillus stearothermophilus, in het bijzonder stammen gekozen uit de groep bestaande uihBaclllus stearothermophilus ATCC 21.365, NRRL B-3680, ÏÏRRL B-3681 en MRL B-3682, zoals beschreven in het Ameri-20 kaanse octrooischrift 3.826.71^; glucose-isomerase dat geproduceerd is door een microorganisme van het genus Ampullariella, zoals Ampullariella digitata, Ampullariella lob at a, Ampullariella campanulata en Ampullariella reguarlis (Amerikaans octrooischrift ^.308,3^9); glucose-isomerase dat geproduceerd is door Bacillus licheniformis (Euro-25 pese octrooiaanvrage U1213); en glucose-isomerase.dat geproduceerd is door de thermofiles van de genera die beschreven zijn in de Japanse octrooipublikatie 7^-30588.

Behalve de bovenstaand vermelde microörganismen, omvat de onderhavige uitvinding het gebruik van mutanten en varianten daarvan alsmede 30 van genetisch getransfonneerde microörganismen, die daarvan zijn afgeleid door introductie van gemuteerde glucose-isomerasegenen in andere microörganismen, met inbegrip van mesofiele en thermofiele microörga-nismen. De gemuteerde glucose-isomerasegenen, die voor dergelijke toepassing zijn geselecteerd, zijn dié welke glucose-isomerase verschaf-35 fen dat stabiel is bij verhoogde temperaturen, in het bijzonder boven 8302333 4 • « - 5 - 90°C en bij voorkeur tot ongeveer 1U0°C. Dergelijke genen kunnen worden gebruikt door de gebruikelijke technieken die voor mutatie van microorganismen worden toegepast, zoals bestraling of door chemische mutagenen. Anderzijds kunnen geïsoleerde glucose-isomerasegenen, die 5 glucose-isomerase produceren met een matige thermische stabiliteit, zoals b.v. geproduceerd door bepaalde Streptomyces-stammen, in vitro worden gemuteerd. Selectie van de juiste gemuteerde genen wordt gerealiseerd door het gemuteerdegen opnieuw te introduceren in hetzij het oudere organisme hetzij een ander organisme, gevolgd door groei en 10 replicatie van het organisme en testen van de thermische stabiliteit van het resulterende glucose-isomerase.

Ook wordt de mogelijkheid omvat dat recombinant DHA-technieken worden gebruikt om glucose-isomerase te verschaffen met een verbeterde thermische stabiliteit, geschikt voor chemische stabilisatie en toe-15 passing in deze uitvinding. Argos, et al. (Biochemistry 18(25): 5698-5703 (1979) laten zien dat bepaalde substituties van alanyl voor glycyl, seryl, valyl en lysyl in enzymen uit mesofiele organismen worden aangetroffen in de overeenkomstige enzymen uit thermofiele organismen. Ferutz (Science, 201, 1187-91 (1978)) laat zien dat de enzymen 20 van thermofiele bacteriën hun extra stabiliteit vooral te danken hebben aan additionele zoutbruggen op het eiwitoppervlak. Zuber (in "Biochemistry of Thermophily", Freidman, S.M., ed,, p. 267 - 285, Academie Press, Jf.ï. 1978) verschaft verder de informatie over de structuur van thermostabiele enzymen. Wanneer derhalve de aminozuurvolgorde en de 25 driedimensionale (tertiaire) structuur van een glucose-isomerase bekend is, is het mogelijk om een verbeterde stabiliteit te ontwikkelen met behulp van mutaties op specifieke plaatsen in het isomerasegen teneinde enzymen te verkrijgen die zodanig ontworpen zijn, dat ze verhoogde hoeveelheden vai die aminozuren bevatten, die stabielere structuren ge-30 ven. JTadat de DHA-volgorde van haar glucose-isomerase is vastgesteld, kan een gensynth.esemiddel worden gebruikt om nieuwe volgorden te gene- . reren, waardoor de thermostabiliteit van het door dergelijke door de mens gemaakte genen geproduceerde glucose-isomerase wordt verhoogd. Voorzien wordt dat dergelijke geconstrueerde enzymen bijzonder bruik-35 baar zullen zijn voor het in de praktijk brengen van de uitvinding.

8302333 t * - 6 -

Omdat glucose-isomerase intracellulair door deze en andere mi-croorganismen wordt geproduceerd, kan een "bron voor glucose-isomerase worden verschaft door eenvoudigweg de cellen te oogsten, en het enzym kan uit cellen worden afgescheiden door op zichzelf bekende technieken, / 5 b.v. celautolyse, openbreken met geluidsgolven, en in een enzymreactor van bekend en conventioneel ontwerp worden toegepast. Bij voorkeur kan het chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase worden geïmmobiliseerd op een inerte drager volgens bekende en conventionele procedures waarneer het niet als gevolg van chemische stabilisatie onoplosbaar is 10 geworden» Materialen en procedures die voor het immobiliseren van enzymen worden gebruikt, zijn bekend en worden beschreven in een aantal publikaties met inbegrip van Wang, et al», Fermentation & Enzyme Technology. John Wiley & Sons, Ine», New York (1979)» p. 318 - 338 en Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3e Ed., John Wiley & 13 Sons, Ine., Wew York (1980), Vol.9, p. llh-8 - 172, waarvan de inhoud hier door verwijzing inbegrepen moet worden geacht. De aanwezigheid van kleine hoeveelheden kobalt , mangaan en magnesiumkationen en/of in water oplosbare zouten van zwaveligzuur, zoals natriumsulfiet, na-triumbisulfiet, magnesiumsulfiet, en/of magnesiumbisulfiet zoals geopen-20 baard in het Amerikaanse Beissue Patent Ho.28.885 teneinde de denatu-rering van het glucose-isomerase gedurende de uitvoering van de werkwijze te verminderen of te. verhinderen, wordt eveneens omvat.

Het is nodig dat de concentratie van koolhydraat in de glucose bevattende uitgangsvloeistof ligt in een gebied van ongeveer 20 tot 25 ongeveer 85, bij voorkeur ongeveer 30 tot ongeveer 50 gew.% wanneer de gewenste resultaten bereikt moeten worden.

Het is ook nodig dat de isomerisatie wordt uitgevoerd bij een pH in het gebied van ongeveer 3 tot ongeveer 8, liever in het gebied van ongeveer ^ tot ongeveer 7 en liefst tussen 5 en 6,5. Uitvoering 30 van de isomerisatie bij een pH die significant beneden of boven het bovenvermelde pH-gebied ligt, zal leiden tot vorming van buitensporige hoeveelheden ongewenste bijprodukten zoals psicose, organische zuren, gekleurde produkten, kleurvoorlopers, fructosedianhydriden en dergelijke.

35 Gevonden is dat de pH voor optimale activiteit van glucose- 8302333 - 7 - isomerase bij hoge temperaturen uitgesproken afneemt. Voor het glucose-isomerase van b.v. Streptomyces rubigenosus, ligt de optimale activiteit bij 25°C bij een pH van 8,6 - 9,2; bij T5°C bij een pH van 6,9 - 7,5 en bij 125°C bij een pïï van 5,6 - 6,2. Wanneer derhalve de isome-5 risatietemperatuur wordt verhoogd, kan de pH van de isomerisatie worden verlaagd om de maximale enzymactiviteit te behouden en bovendien al te sterke bijproduktvorming te vermijden.

Weer een andere noodzakelijke eis van de onderhavige uitvinding ligt in de contactduur van de glucose bevattende uitgangsvloeistof 10 en het chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase. Een dergelijk contact moet binnen het gebied van ongeveer 1 seconde tot ongeveer 5 uren worden aangehouden, bij voorkeur van ongeveer 30 seconden tot ongeveer 1 uur en liefst van ongeveer 2 minuten tot ongeveer 30 minuten om fructoses iroop van aanvaardbare kwaliteit te verkrijgen.

15 De geprefereerde contactduur tussen het chemisch gestabiliseer de glucose-isomerase en de glucose bevattende vloeistof hangt in hoge mate af van de pH waarbij de isomerisatiereactie wordt uitgevoerd. Bij het lager gelegen uiteinde van het pïï-gebied kan een langere contact-dunr worden getolereerd zonder dat al te sterke afbraak van glucose 20 en fructose door vorming van psicose en andere ongewenste afbraakpro-dukten wordt veroorzaakt. Bij het bovenuiteinde van het gebied is een kortere contactduur nodig om de vorming van psicose en kleuren te vermijden. In de praktijk wordt de totale duur dat de glucose bevattende siroop zich op of nabij de uiteindelijke reactietemperatuur bevindt, 25 gerekend als de effectieve contactduur omdat de plaatsvindende suiker-afbraakreacties niet enzymatisch zijn en ongeacht het in contact staan van de vloeistof met het glucose-isomerase plaatsvinden. Daarom is het bij het uitvoeren van isomerisatie boven 90°C belangrijk dat de tijd die vereist is om de glucosevloeistof op de gewenste isomerisatietempe-30 ratuur te brengen (zoals b.v. door de vloeistof vlak voor of tijdens het contact met het isomerase met stoom te mengen) wordt geminimaliseerd en dat wanneer het gewenste fructosegehalte eenmaal is bereikt, daarna snel de vloeistof wordt gescheiden van eventueel actief isomerase en de vloeistof vervolgens zo snel mogelijk wordt afgekoeld tot 35 beneden 90°C en bij voorkeur tot beneden J0°C. Wanneer een oplosbare 8302333 - 8 - vorm van chemisch gestabiliseerd glucose-isomerase wordt gebruikt, zal het nodig zijn.dat dit wordt geïnactiveerd (zoals b.v. door de pH te verlagen tot een gebied waarbij het isomerase wordt geïnactiveerd) voordat de koelstap plaatsvindt teneinde mogelijke teruggaande omzet-5 ting van het in de hoge temperatuur-isomerisatiestap gevormde fructose in glucose te vermijden omdat de isomerisatiereactie vanzelfsprekend reversibel is.

, De maximale omzettingsgraad van glucose in fructose die bereikt kan worden, wordt beheerst door het thermodynamische evenwicht tussen 10 glucose en fructose, dat op zijn beurt afhankelijk is van de temperatuur waarbij de isomerisatie wordt uitgevoerd. Zeer nauwkeurige analyse van evenwichtsmengsels van glucose en fructose heeft de volgende relaties opgeleverd: F = 100 K/(K+1) (1)

15 7SS

1nEC = - 5+273 + ^’3005 ( 2) waarin F het fructosepercentage bij het evenwicht is, gebaseérd op het totale gewicht van glucose en fructose, T de temperatuur (°C) is waarbij de isomerisatie wordt uitgevoerd, en K de glucose over fructose-20 evenwichtsconstante is.

De feitelijke contactduur tussen de glucose bevattende siroop en het isomerase in een reactor kan in het algemeen worden berekend onder verwijzing naar de volgende formule, wanneer een reactor wordt gebruikt die een geïmmobiliseerde vorm van isomerase bevat.

25 Γ F - F Ί t = CV 1n / F°- (3) _ e

kA

waarin t de werkelijke contactduur is; 30 C de concentratie van glucose en fructose is; V het vrije volume van fluïdum in het gepakte bed is (volume van het bed minus het door de geïmmobiliseerde enzymdeeltjes in beslag genomen volume);

Fg de fructosefractie is in het glucose/fructosemengsel bij 35 het evenwicht bij de isomerisatietemperatuur; 8302333 : i - 9 -

Fq de fructosefractie is (gebaseerd op G + F) bij het binnentreden in bet gepakte bed; F de fructosefractie is (gebaseerd op G + F) in de oplossing die het gepakte bed verlaat; 5 k de reactiesnelheidsconstante is voor isomerisatie bij de iso- merisatieomstandigheden; A de isomerase-activiteit in het gepakte bed is.

Waarden van k voor geïmmobiliseerd isomerase, dat bereid is volgens de volgende voorbeelden, variëren van ongeveer 0,07 tot ongeveer 10 5 g uur”1 IGIU~^ bij temperaturen van 90°C tot resp. lUo0C, Dit verband toont de noodzaak om de contactduur bij hogatemperatuur te minimaliseren door gepakte bedden te gebruiken met een boge activiteit per volume-eenheid. Volgens de in de volgende voorbeelden getoonde procedures ge-

O

vormde gepakte bedden kunnen tot 2000 IGIU/cm bevatten hetwelk kan re-15 sulteren in bet bereiken van een 99 ,5$-evenvichtsfructosegehalte in minder dan 1 minuut in een boge temperatuur-reactor wanneer getrapte reactoren worden gebruikt bij verschillende temperaturen en de voeding voor een eerste reactor wordt geïsomeriseerd bij lage temperatuur voordat in een tweede reactor bij boge temperatuur wordt geïsomeriseerd.

20 Wanneer een getrapt reactorsysteem wordt gebruikt, beeft bet de voorkeur dat een werkwijze wordt toegepast voor bet enzymatisch omzetten van glucose in fructose, waarbij een glucose bevattende uitgangsvloei-stof welke ongeveer 20 tot ongeveer 85 gev.% glucose bevat, in contact wordt gebracht met glucose-isomerase bij een temperatuur van ongeveer 25 20 tot ongeveer 80°C bij een pïï van ongeveer 6,0 tot 9,0 en een con tactduur van ongeveer 0,5 tot ongeveer 2 uren om Uo tot ongeveer ^5 gevr.% van bet in de vloeistof aanwezige glucose om te zetten in fructose, de temperatuur van bet isomerisatiemedium wordt verhoogd tot een waarde van ongeveer 90°C tot ongeveer 1U0°C, de pH van bet isomerisa-30 tiemedium naar behoefte wordt ingesteld tot binnen bet gebied van ongeveer 3 tot ongeveer 8, de fructose bevattende vloeistof in contact wordt gebracht met bet glucose-isomerase gedurende een extra periode van ongeveer 1 seconde tot ongeveer 5 uren om de omzettingsgraad te verbogen tot een waarde van ongeveer 53 tot ongeveer 60 gew.% van bet 35 in de oorspronkelijke glucose bevattende uitgangsvloeistof aanwezige __21 8302333 - 10 - glucose waarbij geen sterke vorming van psicose of andere non-fructose, non-glucosesuikers plaatsvindt. Derhalve kan het gebruik van gepakte bedden met hoog vermogen leiden tot zeer geringe effectieve contact-tijden waardoor op zijn beurt de afbraak van fructose die bij de voor 5 deze uitvinding vereiste hoge temperaturen optreedt, wordt geminimaliseerd.

In de keuze van glucose-isomerase-immobilisatietechnieken, heeft het de voorkeur dat methoden worden gebruikt die kleine, in essentie niet comprimeerbare poreuze katalysatordeeltjes kunnen geven 10 zodat inhibitie van isomerisatiesnelheidsdiffusie-effecten tot een minimum zal worden beperkt.

Anderzijds kan het isomerase worden geïmmobiliseerd in de poriën van een membraan waardoor de glucoseoplossing wordt gedwongen gedurende de hoge temperatuur-isomerisatie als een middel om een goed con-15 tact tussen enzym en substraat te bevorderen waarbij diffusiebeperkin-gen tot een minimum worden teruggebracht. De voor immobilisatie toegepaste drager is bij voorkeur totaal onoplosbaar en inert om al te sterke verontreiniging of afbraak van de glucose/fructose-componenten van de substraatoplossingen te vermijden.

20 In de commerciële praktijk worden fructose bevattende siropen echter niet uit zuivere glucose bereid. Veeleer worden zetmeelhydroly-saten (zoals bereid in de bovenstaand vermelde publikaties) als gluco-sebron toegepast en deze bevatten steeds non-glucose en non-fructose-sacchariden (verder aangeduid als polysacchariden) die afkomstig zijn 25' van een onvolledige hydrolyse van zetmeel, en de reversie van glucose. Deze maken typerend 3 tot 8% van het totale droge gewicht uit als de van zetmeelhydrolyse afkomstige sacchariden. Het is derhalve nodig dat bij het berekenen van de temperatuur waarbij de isomerisatie moet worden uitgevoerd, rekening wordt gehouden met mogelijk in de glucose-30 vloeistof aanwezig polysaccharide alsmede met andere factoren zoals het te bereiken totale gehalte aan fructose op droge basis, de vorming van psicose en andere non-glucose en non-fructoseprodukten tijdens de effectieve contacttijd van de glucosevloeistof en het isomerase. Verbanden voor de berekening van de isomerisatietemperatuur worden onder-35 staand gegeven: 8302333 - 11 -

1 3 Pisg-MC - 273 W

K = 100-F ^ - 10.000 (MfC) 5 ? Qt100-P) l6'

T = de isomerisatietemperatuur in °C

F = het evenwichtsfruct os egehalte (in %, gebaseerd op totaal -glucose + fructose) bij de temperatuur T M = het fructosepercentage op droge basis, dat in het geïsomeri-10 seerde produkt vereist is'

C = het percentage psicose + andere afbraakprodukten die tij- I

dens de effectieve isomerisatiecontacttijd zijn gevormd.

Q = het percentage evenwicht dat tijdens de isomerisatiereactie is bereikt 15 P = het procentuele polysaccharidegehalte van de glucosevloei- stof.

Typerend zal minder dan \% en bij voorkeur minder dan 0,5% psicose en andere afbraakprodukten worden gevormd en kan 99,5% van het evenwicht worden bereikt. Om siropen te bereiden met 55,5% fructose 20 (droge basis), zijn derhalve de volgende isomerisatietemperaturen nodig voor glucosevloeistoffen met de aangegeven polysaccharidegehalten.

Polysaccharide in glucosevloeistof Isomerisatietemperatuur {% droge basis) (°C) 0 95,7 25 1 99,1 2 104,3 3 108,9 4 113,8 6 124,3 30 8 136,1

Het aanvaarde handelsartikel bevat gemiddeld 55,5% fructose op droge basis. De reden hiervoor is dat bij dit fructosegehalte maissi-roop met hoog fructosegehalte (HFCS) even zoet wordt als sucrose op basis van het droge gewicht. Bovendien heeft HFCS met een fructosegehal-35 te van 55,5% stevige erkenning gevonden als het handelsartikel dat uit- 8302333 -12- wisselbaar wordt toegepast als totale of partiële vervanging voor sucrose in vele voedingsproducten en in het "bijzonder in koolzuurhoudende frisdranken. Verwacht wordt dat de consumptie van dit type HFCS in de Verenigde Staten in 19S2 2,9 "biljoen pond zal "bedragen met een groei 5 naar 4,0 biljoen pond in 1983. In verband met de complexiteiten die inherent zijn aan de aflevering, opslag, hoeveelheidsregulering en samenstelling van HFCS in voedingsproducten, bestaat een universele behoefte aan produktuniformiteit van de ene HFCS-producent tot de andere, zodat produkt van verschillende leveringsbronnen uitwisselbaar en gelijktij-10 dig kan worden toegepast. Daarom heeft een fructosegehalte van 55 - 56$ op droge basis een speciale betekenis verkregen als streefgehalte in de technologie die verbonden is met de bereiding van HFCS.

De onderhavige werkwijze verschaft fructosegehalten van tenminste 53$, bij voorkeur tenminste 54$ en liefst tenminste 55$.

15 In plaats van een oplossing te gebruiken die alleen glucose als substraat voor de onderhavige werkwijze bevat, is het desgewenst ook mogelijk om een oplossing te gebruiken van glucose waarin een deel -van het glucose reeds tot fructose is geisomeriseerd. B.v. kan een oplossing van geisomeriseerde glucose die tot 50$ fructose bevat, volgens de 20 onderhavige werkwijze worden behandeld om de fructoseconcentratie te verhogen tot de meer gewenste gehalten boven 50$, en de geprefereerde gehalten van 55 - 56$ en hoger.

Glucose-oplossingen die fructose bevatten in hoeveelheden van minder dan 50 gew.$ koolhydraat, kunnen volgens op zichzelf bekende 25 procedures worden bereid.

Met de bovenvermelde vereisten van glucoseconcentratie, pH en contactduur in gedachte, kunnen bekende glucose-isomerisatieprocessen geschikt worden aangepast om te worden bedreven bij ongeveer 90 tot ongeveer 140°C, bij voorkeur tussen ongeveer 100 en ongeveer 110°C, 30 teneinde de hoge glucose-fructosesiropen volgens de uitvinding te verschaffen.

De thermostabiliteit van glucose-isomerase kan significant worden vergroot door een of meerdere chemische behandelingen waarbij het enzym nog een behoorlijke activiteit behoudt , zoals onderstaand zal 35 worden besproken. Aldus behandeld enzym wordt hier aangeduid als "che- 8302333 * '·* - 13 - misch gestabiliseerd isomerase”.

Chemische stabilisatie van isomerase wordt door een aantal verschillende methoden bewerkt , die tot een verhoogde thermische stabiliteit kunnen leiden. De fundamentele benadering is de introductie van 5 structurele elementen in het enzymmolecuul op zodanige wijze, dat het enzym bestand zal zijn tegen ontvouwen wanneer het boven zijn normale thermische denaturatiepunt wordt verwarmd. Een geprefereerde methode om dit te realiseren is een modificatie van het enzym door chemische substitutie daarop van groepen die polymeriseerbare vinylgroepen be-10 vatten op zodanige wijze, dat laatstgenoemde groepen op verscheidene plaatsen stevig aan het oppervlak van het enzymmolecuul worden bevestigd. Daarna wordt het gemodificeerde enzym gemengd met een of meerdere polymeriseerbare vinylverbindingen in waterige oplossing en wordt het mengsel gecopolymeriseerd om het chemisch gestabiliseerde enzym te 15 vormen waarin het enzym op vele punten stevig is gebonden aan een driedimensionale polymere matrix welke een structuur heeft gevormd met een uiterlijk dat complementair is aan dat van het enzym.

Voorbeelden van dit type stabilisatie worden beschreven door:

Martinek et al. in Biochem. Biophys. Acta 1*85, 1-12 (1977) en Kulys et 20 al. in Biokhimiya, 1*2, No.3, 1*53-59 (1978).

Het is essentieel dat bij het uitvoeren van de bovengenoemde reacties omstandigheden worden vermeden die tot denaturering van het isomerase met daaraan verbonden verlies van activiteit kunnen leiden. B.v. moeten extreme pH- en temperatuurwaarden worden vermeden tijdens de be~ 25 handelingen die voor het uitvoeren van de bovengenoemde reacties nodig zijn.

Voorbeelden van reagentia die gebruikt worden om isomerase te modificeren teneinde polymeriseerbare vinylgroepen daarop te substitueren, zijn acryloylchloride, methacryloylchloride, acroleïne, croton-30 aldehyde, malemauuranhydride, 3,l*-epoxybuteen, acrylzuur-2,3-epoxy- propylester, acrylzuur-2,3-thioglycidylester, 1-allyloxy-3-(N-ethyleen-imine)-2-propanol, acrylzuur-O-succinamide-ester, chloormalexnezuuranhydride, maleinezuurazide, 3-broompropeen, en allylisothiocyanaat. Dergelijke verbindingen zijn in staat om te reageren met de vrije amino-35 groepen van isomerase, b.v. de £-amino groep van lysine groepen.

.ji 8302333 - 1¾ -

Weer andere verbindingen die in staat zijn om te reageren met de vrije carbonzuurgroepen van isomerase, kunnen worden gebruikt om gemakkelijk polymeriseerbare vinylgroepen daarop te substitueren zoals aan de deskundigen duidelijk zal zijn.

5 Voorbeelden van vinyl verb indingen die gecopolymeriseerd kunnen worden met het gemodificeerde isomerase, zijn natriumacrylaat, natrium-methacrylaat, acrylamide, hydroxyethylmethacrylaat, acryloylpiperidi-ne-lj—spiro-2’-(1' ,3’-dioxacrylopentaan), 1 -acryloyl-h-piperidon, en acryloylmethoxyamine. In het algemeen hebben in water oplosbare mono-10 meren of monomeermengsels die zullen resulteren in de wateroplosbare polymeren (indien gepolymeriseerd in afwezigheid van verknopingsmidde-len) de voorkeur.

Typerend worden difunctionele vinylverbindingen in het monomeer-mengsel opgenomen (0,1 - 5% van het totale monameergehalte) om verkno-15 pingsplaatsen te verschaffen die tot een driedimensionaal polymeernet-werk leiden. Geschikte verbindingen zijn ΪΓ,ΪΓ’-methyleen-bis-acrylamide en ethyleenglycoldimethacrylaat..Wanneer deze worden gebruikt, vormt het gepolymeriseerde mengsel een onoplosbare gel die leidt tot immobi-lisatie van het isomerase.

20 Gewoonlijk in vinylpolymerisaties toegepaste initiatiesystemen zijn geschikt zoals aramoniumpersulfaat plus natriumbisulfiet, water-stofperoxyde plus ijzer(II)sulfaat, kaliumsulfaat plus Ν,ϋΤ,ΙΠ ,£P-te-tramethyl-ethyleendiamine, en riboflavine (plus licht).

Anderzijds kan noncovalente binding aan de driedimensionale 25 polymeermatrix voldoende zijn om de gewenste stijfheid aan het isomera-semolecuul te verschaffen en daardoor een significante verhoging van de thermostabiliteit te bewerken. Dit kan geschieden wanneer isomerase mechanisch wordt ingevangen binnen een verknoopte polymeergel. In'dit sreval is het niet no die dat het isomerase wordt gemodificeerd door be-30 vestiging van een vinylverb inding daaraan voorafgaande aan de polymeri-aatiestap. De concentratie van de gel moet echter groter zijn dan ongeveer 30 gev.$ voordat significante stabilisatie optreedt en gels van ongeveer 50$ concentratie hebben de voorkeur. Monomeren die in staat zijn om polymeergels te geven die elektrostatische en waterstofbindin-35 gen kunnen vormen met het isomerase, zijn nodig zoals b.v. natriumacry- 8302333 - 15 - laat, natriummethacrylaat, acrylamide, en hydroxyethylmethacrylaat.

Voorbeelden van stabilisatie door opname in gels worden·*-gegeven door Martinet et al. in Biochem. Biophys. Acta ^85, 13-28 (197T) en Kulys et al. ia J. Solid Phase Biochem., 3, 95 - 105 (1978).

5 Een derde methode van stijf maten van isomerase is intramole- oulaire verknoping die in staat is om extra thermostabiliteit te verlenen.

Voorbeelden van een dergelijke stabilisatie worden besproken door Torchilin et al. in Biochem. Biophys. Acta, 522, 277-283 (1978), 10 Martinek et al. in J. Solid Phase Biochem., 2, 3^3-85 (1977) en Torchilin et al. in Biochem. Biophys. Acta, 568, 1-10 (1979).

Geschikte verknopingsmiddelen voor toepassing in de onderhavige , uitvinding omvatten difunctionele verbindingen die in staat zijn tot reactie met aanhangende functionele groepen aan het enzymmolecuul.

15 Meestal zijn dergelijke functionele groepen aminogroepen, in het algemeen primaire aminogroepen die kunnen reageren met een grote verscheidenheid van functionele groepen zoals carbonzuur, sulfonylhalogenide, aldehyden, isocyanaten, propiolaten en dergelijke.

De verknopingsmiddelen omvatten derhalve dicarbonzuuranhydriden 20 zoals barnsteenzuuranhydride en adipinezuuranhydride; de overeenkomstige dialdehyden zoals glyoxal, succinaldehyde en glutaaraldehyde; onverzadigde verbindingen zoals acroleine en crotonaldehyde, diolpropio-laten zoals ethyleenglycolbispropiolaat, propyleenglycolbispropiolaat en hexamethyleenglycolbispropiolaat; en disulfonylhalogeniden zoals 25 benzeen-1,3-disulfonylchloride; naftaleen-1,5-disulfonylchloride en tolyl-2,U-disulfonylchloride.

Omdat het enzym zure groepen bevat die met aminen kunnen reageren (of gemaakt kan worden dat het enzym dergelijke groepen bevat), kunnen dan bovendien difunctionele aminen als verknopingsmiddelen voor 30 de onderhavige uitvinding worden toegepast. Deze omvatten b.v. diami- nen die tot 12 koolstof at omen bevatten, b.v. fenyleendiamine, butyleen-diamine, hexyleendiamine, oetyleendiamine, pentyleendiamine, ethyleen-diamine en dodecyleendiamine.

De hoeveelheid verknopingsmiddel kan aanzienlijk variëren, waar-35 bij de verhouding van enzym tot verknopingsmiddel varieert van onge- 8302333 - 16 - veer 0,1 tot ongeveer 0,0001. Ce methode om de vereiste binding te bewerken, zal in zekere mate afhangen van de aard van het gekozen verkno-pingsmiddel en het enzym. In het algemeen zullen de reagentia worden opgelost in een geschikt inert oplosmiddelmedium en zal de reactie 5 plaats moeten vinden bij redelijk lage temperaturen om een nadelige beïnvloeding van het enzym dat voor hoge temperaturen gevoelig kan zijn, te vermijden. Gewoonlijk hebben reacties bij of nabij kamertemperatuur de voorkeur en worden water of waterige oplosmiddelen als reactiemedium toegepast.

10 Behalve de substitutie van polymer is eerbare vinylgroepen op het enzymmolecuul en daarna volgende polymerisatie volgens de eerder beschreven methoden, omvat een verdere uitvoeringsvorm de condensatie van een voorgevormd polymeer met het isomerase door de vorming van intermoleculaire covalente bindingen waarbij een gestabiliseerd mole-15 cuul wordt gevormd. B.v. kunnen polypeptiden zoals in de natuur voorkomende eiwitten en hydrolyseprodukten daarvan in reactie worden gebracht volgens bekende technieken voor de vorming van· peptidebanden met glucose-isomerase onder vorming van een gestabiliseerd enzym. De aldus geproduceerde produkten kunnen in water oplosbaar zijn, maar kun-20 nen in water onoplosbaar worden gemaakt door verknopingsmiddelen te gebruiken zoals glutaaraldehyde en het resulterende verknoopte enzym-systeem is gewoonlijk zelfs nog stabieler. De peptidevormingsreacties worden volgens bekende methoden uitgevoerd, b.v. door carbodiïmiden te gebruiken.

25 Desgewenst kan van het aanvankelijke enzym een derivaat worden gemaakt om een gewenste functionaliteit in het molecuul te brengen in verband met de condensatie met het voorgevormde molecuul. Voor een carboxyfunctionaliteit kan een vrij amino bevattend enzym b.v. in reactie worden gebracht met een dicarbonzuur om een omzetting te verkrij-30 gen in een carboxy bevattend enzym.

Door in de bovenstaand vermelde uitvoeringsvorm te gebruiken voorgevormde polymeren kunnen alle polymeren zijn die het vereiste type en de vereiste hoeveelheid functionele groepen bevatten, b.v. amino of carboxygroepen, voor de beoogde reacties. De voorkeur hebben polypepti-35 den zoals natuurlijke eiwitten, b.v. chitosan, gistprotexne en derge- 8302333 - π - lijke, alsmede mengsels; en. amino bevattende polymeren zoals polyethy-leenimine. Gewoonlijk vormen de geprefereerde voorgevormde polymeren in water oplosbare produkten en beeft bet de voorkeur dat deze onoplosbaar worden gemaakt door reactie met verknopingsmiddelen, b.v. glu-5 taaraldebyde en andere zoals eerder zijn beschreven.

In alle bovenstaand vermelde methoden voor bet modificeren van bet enzym is bet essentieel dat verzekerd wordt dat voldoende chemische functionaliteit, b.v. amino of carboxygroepen, aanwezig is om een significante graad van bet gewenste resultaat te realiseren.

10 Wanneer bet voorgevormde polymeer dat met bet enzym moet reage ren, wordt gekozen, is b.v. vereist dat bet polymeer groepen bevat die kunnen reageren met de op bet enzymmolecuul beschikbare groepen. Derhalve zal een eiwit met daaraan hangende carboxygroepen worden gekozen voor reactie met aan bet enzym hangende aminogroepen. Bovendien 15 zal-een redelijk aantal reactieve groepen aanwezig moeten zijn op de gekozen reactiecomponenten om een bevestiging op meerdere punten van de reactiecomponenten te verzekeren teneinde een significante stabilisatie te realiseren. De bepaling van de aard en. bet aantal van dergelijke reactieve groepen voor de respectieve reagentia, is vanzelfspre-20 kend op zichzelf bekend.

Weer een andere methode waardoor de thermostabiliteit van enzymen kan worden vergroot, is een wijziging van de oppervlaktestructuur op chemische wijze zonder een behoorlijk activiteitsverlies te veroorzaken. Zich aan het oppervlak bevindende aminogroepen kunnen b.v. wor-25 den geamidineerd (Ludwig, M.L. en Hunter, M.J., Meth. Enzymol. 11, 595 - 60k (1967)) of geguanidineerd (Kimmel, J.E., Meth. Enzymol. 11, 58h - 589 (196T)) om substituenten te vormen die sterk lijken op arginine. Melkzuurdehydrogenase en verscheidene andere eiwitten zijn gestabiliseerd (zie Tuengler, F. en Pfleiderer, G., Biochem. Biophys.

30 Acta, 28k, 1-8 (1977); Minotani, N., et al., Biochim, Biophys. Acta, 581, 33^ - 3M (1979); en Cupo, P., et al., J. Biol. Chem., 255» 10828 - 10833 (198Ο)).

De activiteit van het oplosbare isomerasepreparaat werd vastgesteld zoals beschreven door Lloyd et al. in Cereal Chemistry, ^-9, Ho.5» 35 blz.5^ - 553 (1972). Een IGIU is de hoeveelheid isomerase die 1 micro- 8302333 - 18 - mol glucose cmzet in fructose per minuut in een oplossing die 2 mol •3 ο ·3 glucose per 1 dm , 0,02 mol MgSO^ per dm , en 0,001 mol CoCl^ per dm bevat bij een pH van 6,85 (0,2 M natriummaleaat) en een temperatuur van 60°C, indien met de bovenstaand vermelde methode bepaald.

5 De werkwijze volgens de uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I

Dit voorbeeld toont een directe isomerisatie van een glucose bevattende oplossing welke in overwegende mate bestaat uit een gezui-10 verd maiszetmeelhydrolysaat, teneinde een samenstelling te verkrijgen met 55*5% fructose op droge basis, waarbij een tweetrapsisomerisatie-proces werd toegepast» Eerst werd een lage temperatuurisomerisatie bij 70°C uitgevoerd waarbij het produkt van deze reactie werd gebruikt als voeding voor een tweede hoge temperatuur-reactor (105,2°C) welke een 15 chemisch gestabiliseerd isomerase bevatte. Het chemisch gestabiliseerde isomer as e is een isomerase waarin het enzym covalent gebonden is aan een oplosbaar polymeer en daarna onoplosbaar is gemaakt onder vorming van een geïmmobiliseerde katalysator.

Het hydrolysaat werd bereid uit maïszetmeel met werkwijzen zo-20 als beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.611.126 (vloeibaar-making) en het Amerikaanse octrooischrift 3.280,006 (saccharificatie). De gesaccharificeerde vloeistof werd gezuiverd volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.83I.9I0 waarbij een produkt werd verkregen dat 95,3% glucose op droge basis bevatte. Er werd voldoende kristallijn glucose 25 toegevoegd om het totale glucosegehalte op 97,&l op droge basis te brengen. De resulterende oplossing had de volgende samenstelling: totaal aan droge stof (%) 50,2 glucose (% droge basis) 97*6 fructose {% droge basis) 0,0 30 polysaccharide (% droge basis) 2,1 psicose (% droge basis) 0,0

HaHS03 (mM) 50,0

MgSOj^ (mM) 5,0

CoCl2 (mM) 0,1 35 pH 6,8 8302333 - 19 -

De lage temperatuur-isomerisatie werd uitgevoerd bij 70°C, waarbij de bovengenoemde substraatoplossing door de lage temperatuur-reac-tor werd gepompt met een stroomsnelheid van 3,2 cm /minuut. De lage temperatuur (T0°C) isomerasereactor werd geconstrueerd door op DEAE-5 cellulose geïmmobiliseerde isomerase (bereid volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.788.9^-5) te pakken in een glazen kolom met een diameter van 2,5 cm, welke voorzien was van een inlaat en een uitlaat alsmede van een mantel voor de circulatie van water vanuit een thermostaat. De kopruimte boven de pakking bevatte een thermometer en was voor het 10 overige gevuld met glazen korrels om de dode ruimte voor zoveel als praktisch mogelijk is, tot een minimum te beperken. De reactor bevatte voldoende gexmmobiliseerde isomerase om 20.000 IGIU te verschaffen en •3 het gepakte bed had een hoogte van ongeveer 15 cm. De eerste 1000 cm-1 die uit de reactor kwam, werd weggeworpen. Het daarna naar buiten tre-15 dende effluent werd verzameld om te worden gebruikt in de tweede hoge temperatuur-isomerisatie.

De chemisch gestabiliseerde katalysator die in de hoge tempera-tuur-reactor werd gebruikt, werd op de volgende wijze bereid.

Een species van Streptomyces rubigenosus, afgeleid van 20 13. rub.igenosus ATCC 21175 werd door ondergedompelde aerobe fermenta tie gekweekt op een medium met de volgende samenstelling: gew.% dextrose 9,0 maisweekwater (vaste stoffen) 1,6 25 diammoniumfosfaat 0,08 mangaansulfaat 0,06 antischuim (Pluronic PL-61) 0,003

Het medium werd gedurende 1*5 minuten bij 121°C gesteriliseerd, gekoeld en ingesteld op een pH van 6,8 - 7,0. Het werd geënt met lh% 30 (v/v)van een entmateriaal, omvattende de inhoud van een entfermentor bereid met de bovenstaand vermelde £3. rubigenosus variant. Fermentatie werd uitgevoerd onder aseptische omstandigheden gedurende ongeveer 60 uren bij 30°C met beluchting bij 0,65 wm. S_. rubigenosus ATCC 21175 kan ook worden gebruikt voor het enten en produceren van isomerase in 35 welk geval media met de volgende samenstelling werden gebruikt: 8302333 - 20 - gew.$ dextrose 0,2^ maisweekwater (vaste stoffen) 1,5 sorbitol 1,6 5 kobaltchloride 0,02 diammoniumfosfaat 0,56 xylose 1,0

Glucose-isomerase werd geëxtraheerd uit het S* rubigenosus door toevoeging van 0,35$ Maquat MC 1^12 (Mason Chemical Co.), en 10 10 dpm kippeëilysozyme en agitatie gedurende 5 uren bij !+0°C, pH 6,3 - 6,6. Het mengsel werd daarna gefiltreerd om een oplossing te verkrijgen van ruw, ongezuiverd glucose-isomerase.

Het ruwe isomerase werd gezuiverd door adsorptie op DEAE-cellu-lose (bereid volgens Amerikaans octrooischrift 3.823.133), filtratie 15 en wassen van het geadsorbeerde produkt met 0,1 M NaCl-oplossing om verontreinigingen te verwijderen en vervolgens desorptie van het iso- . merase door contact met 0,^5 M ETaCl-oplossing. De pH van alle oplossingen werd gedurende de zuiveringstrappen op 7,5 gehouden. De daardoor verkregen oplossing van partieel gezuiverd isomerase werd gemengd 20 met 3 volumehoeveelheden 95$'s ethanol bij 0°C om het isomerase te precipiteren. Er werd een perliet-filterhulpmiddel toegevoegd, de vaste stoffen werden door filtratie gewonnen en aan de lucht gedroogd om een oplosbaar isomerasepreparaat te verkrijgen dat 2500 IGIU/g bevatte.

Het gezuiverde isomerase werd opgelost in 1 mM MnCl2 om een op- ... . 3 ..

25 lossing te verkrijgen die 10 mg isomerase per cm bevatte bij kamertemperatuur en het mengsel werd gefiltreerd om het filterhulpmiddel te verwijderen. De specifieke activiteit van dit preparaat bedroeg 37,3 IGIU/mg eiwit,

Men verkreeg een oplossing van een oplosbaar polyaminepolymeer 30 door 39,0 g chitosan (Kytex van Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19899) op te lossen in 30 dm^ 0,08 ïï HC1. Wanneer de oplossing was gerealiseerd, werd de chitosanoplossing op een NaCl-gehalte van 0,5 M gebracht door de toevoeging van 380 g HaCl en de resulterende oplossing werd met 8 H NaOH op een pH van 6,15 ingesteld. Tenslotte werd de chi-35 tosanoplossing gefiltreerd door een Whatman type 3 papierfilter om on- 8302333 * - 21 - oplosbaar materiaal te verwijderen* Aan de 13 dm° 0,3#'s chitosan in

O

0,5 M NaCl bij pH 6,15 werd toegevoegd: 100 cm oplosbare isomerase welke 100.000 ÏGIU activiteit bezat, 197,6 g xylitol (van Sigma Chemical Co.), en 0,619 g CoClg.öH^O. Deze oplossing werd gedurende 2 uren 5 geroerd waarna 6,2k g tf-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodixmide (van Sigma Chemical Co.) werd toegevoegd om op meerdere punten de carboxyl-groepen van isomerase covalent te binden aan de aminogroepen van chito-

O

san. Na 2 uren.bij kamertemperatuur werd 15,6 em° van een 50^’s (w/w) glutaaraldehydeoplossing (van Eastman Kodak) ingesteld op een pH 6,0 10 met 8 N NaOÏÏ, aan de reactie toegevoegd om het covalent gebonden iso-merase-chitosancomplex onoplosbaar te maken. Na 15 minuten werd 2

O

dm van een 1 M fosfaatoplossing met een pH 8,0 toegevoegd om breken van de gel nadat deze door de glutaaraldehydetoevoeging was gevormd, te vergemakkelijken. Het resulterende onoplosbaar gemaakte isomerase-15 chitosan werd gewassen met gedeïoniseerd water terwijl het zich op ' een Buchner vacuumfilter bevond,. Dit preparaat liet men vervolgens gedurende een nacht aan de lucht drogen bij kamertemperatuur, waarna men het maalde en zeefde tot een afketingengebied van 0,25 - 1,7 mm.

De droge katalysator had een uitgedrukte activiteit van 3Ök IGIU/g.

20 De reactor op 105,2°C werd op de volgende wijze geprepareerd.

Een portie van de katalysator van 13 g werd in substraat gesuspendeerd en onder een laboratoriumvacuum bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten ontlucht. De ontluchte suspensie werd gebruikt om een 1,5 x 20 cm bed te vervaardigen in een van een mantel voorziene glazen kolom.

25 Het gepakte bed bevatte h992 IGIIJ.

Uit de eerste traps-70°C isomerisatie bereid substraat werd ingesteld op een pH van 6,75 en verdund tot k2t0% droge stoffen. Dit substraat werd daarna door de hoge temperatuur-reactorkolom gepompt

O

onder een overdruk van 69 kPa en met een stroomsnelheid van 1,96 cm0/ 30 minuut gedurende 30 minuten bij 60°C. De temperatuur binnen de kolom werd gevolgd met een thermometer welke zich direct boven het bed bevond, en omgeven was door 0,5 cm glazen korrels om het dode volume tot een ππ nimum te beperken voorzover dat mogelijk was. De kolomtempe-ratuur werd vervolgens snel verhoogd door olie uit een met een thermo-35 staat op 106°C gehouden bad door de mantel te circuleren.

8302333 - 22 -

Het effluent van de kolom werd onderzocht met een opnamepolari-meter welke gekalibreerd was op het aflezen van. 50 tot 5&1 fructose. Nadat de kolomtemperatuur een waarde van 105,2°C had bereikt, en wanneer het fructosegehalte van het effluent het gewenste niveau had be-5 reikt, werd het effluent verzameld en onmiddellijk gekoeld in een ijs-bad. De pH werd door de toevoeging van 1 M citroenzuur ingesteld op U ,90. Effluent werd verzameld totdat het schijnbare fructoseniveau beneden 55% daalde.

Uit de T0°C en de 105,2°C reactors verkregen geïsomeriseerde IQ oplossingen werden geanalyseerd op; koolhydraatsamenstelling en kleur en de resultaten werden vergeleken met een gelijksoortige analyse uitgevoerd aan de niet gelsomeriseerde substraatoplossing, zoals wordt getoond in de volgende tabel.

Tabel A

15 Samenstelling van substraatoplossingen geïsomeriseerd bij 70°C en 105,2°C.

Behandeling van de Koolhydratensamenstelling Kleur oplossing (gew.$ op asvrije, droge basis) (CIKFX1Q0) fructose glucose psicose polysaccharide 20 _ _____ niet geïsomeriseerd 0 97,6 0 2,k 0,5 geïsomeriseerd bij 70°C 51,3 0 2,3 0,7 geïsomeriseerd bij 105,2°c 55,5 M,6 0,3 2,6 1U,1 25 De resultaten tonen dat 55,5% fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte werd gehouden beneden 0,U gew.$ op droge basis en de kleur < 20 (CIRF X 100).bedroeg.

Voorbeeld II

Dit voorbeeld toont de directe isomerisatie van een glucose be-30 vattende oplossing (welke een gezuiverd maiszetmeelhydrolysaat plus kristallijn glucose omvat) bij hoge temperatuur teneinde een samenstelling te verkrijgen welke 55,2% fructose bevatte op droge basis, waarbij een tweetrapsisomerisatie werd gebruikt, waarin de tweede trap gebruikmaakte van een chemisch gestabiliseerd isomerase, dat samenge-35 steld was uit glucose-isomerase dat gecompleteerd was met polyethyleen- 3302333 - 23 - imine waarbij bet complex onoplosbaar werd gemaakt door behandeling met glutaaraldehyde.

Bereiding van gestabiliseerd isomerase:

Men bereidde op de in voorbeeld I beschreven wijze een oplos-5 baar glucose-isomerase. Het gezuiverde isomerase werd opgelost in 1 mM MhCl_ teneinde een oplossing te verkrijgen welke 9 mg isomerase per 3 cm bevatte bij kamertemperatuur en het mengsel werd gefiltreerd om q filterhuljmiddel te verwijderen» Man voegde 60 cni 10$ 's (w/v) PEI-6 (polyethyleenimine, molecuulgewicht 600, pH 8; Dow Chemical Company) 3 10 en 3 g xylitol toe aan 300 cm van de enzymoplossing en roerde de re- 3 sulterende oplossing gedurende 15 minuten» Men voegde 10 cm 2,5 M glutaaraldehyde toe en roerde het mengsel gedurende 2 uren bij kamertemperatuur. Het onoplosbaar gemaakte enzym werd door filtratie gewonnen, met water gewassen en gedurende een nacht in een conveetieoven 15 bij 37°C gedroogd. Men won 12,8 g geïmmobiliseerd isomerase dat ongeveer 775 IGIU/g bevatte, na het drogen. Men suspendeerde 12 g van het geïmmobiliseerde enzym in het substraat, ontluchtte onder vacuum gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en gebruikte het resulterende materiaal voor het prepareren van een hoge temperatuur-reactor met een 20 diameter van 1,5 cm.

Het substraat voor de reactor werd in de eerste trap van de tweetrapsisomerisatie bereid op de in voorbeeld I beschreven wijze. Dit substraat had de volgende samenstelling: totaal aan droge stof ($) b2,6 25 glucose ($ droge basis) k6,h fructose ($ droge basis) 51,3 polysaccharide ($ droge basis) 2,3 psicose ($ droge basis) 0,0

HaHS03 (mM) 0 30 MgSO^ (mM) 50

CoCl2 (mM) 0,1 pH 6,75

Het substraat werd gedurende Ij-5 minuten bij 60°C door de reac- q tor gepompt met ongeveer 5 cm /minuut. De kolomtemperatuur werd daarna 1 8302333 tot 101,6°C verhoogd en de stroomsnelheid verlaagd tot 2 cm^/minuut.

Λ V

- 2k -

Een terugdruk van 83 kPa werd op de kolom aangelegd om koken van het substraat te verhinderen. Het effluent werd onderzocht met een opname-polarimeter, welke gekalibreerd was op het af lezen van 50 tot 58% fructose. Effluent dat meer dan 55$ fructose bevatte, werd verzameld in 5 een ijsbad en met 1,0 M citroenzuur op een pH van 1(-,0 ingesteld.

Het effluent uit de hoge temperatuur-reactor, het substraat uit de eerste trap-reactor en de oorspronkelijke glucose bevattende oplossing die als substraat voor de eerste trap-reactor was gebruikt, werden geanalyseerd op koolhydratensamenstelling en kleur, De resultaten 10 zijn samengevat in de volgende tabel.

Tabel B

Samenstellingen van oplossingen uit eerste en tweede trap isomerisaties

Behandeling van de Koolhydratensamenstelling Kleur

_ oplossing (gev.$ op asvrije, droge basis) (CIRF

1? X100) fructose glucose psicose polysaccharide .

niet geisomeriseerd 0 97,6 0 2tk 0,5 geisomeriseerd bij 70°C 51,3 k6,b 0 2,3 0,7 20 geisomeriseerd bij 101,6°C 55,2 1(-2,1 0 2,7 51,7

De resultaten tonen dat 55,2# fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,2 gew.$ bleef op droge basis.

Voorbeeld III

A_ Dit voorbeeld toont de directe isomerisatie van glucose tot 57,2$ fructose door een tweetrapsisomerisatieproces, waarbij de eerste reactor op 70°C was en de tweede (hoge temperatuur)-reactor op 110,U°C was. Het in de hoge temperatuur-reactie toegepaste chemisch gestabiliseerde isomerase was een isomerase waarin het enzym covalent gebonden was aan een oplosbaar polymeer en daarna onoplosbaar was gemaakt onder vorming van een geïmmobiliseerde katalysator.

Het substraat en zijn omzetting door de eerste traps-reactor bij 70°C zijn beschreven in voorbeeld I.

De in de hoge temperatuur-reactor bij 110,U°C toegepaste gelmmo-biliseerde katalysator is eveneens in voorbeeld I beschreven.

8302333 - 25 -

De 110,U°C reactor werd geprepareerd op de volgende wijze. Een katalysatorportie van 28, b g werd gesuspendeerd in een substraat en onder laboratoriumvacuum gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur ontlucht. De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het vervaardigen van 5 een 2,5 x 12,U cm bed in een glazen kolom met mantel. Het gepakte bed bevatte 10.885 IQIU.

Uit de eerste traps-70°C-isomerisatie bereid substraat werd op een pH van 6,1)-7 ingesteld en verdund tot h230% droge stof. Dit substraat werd daarna gedurende 30 minuten met een temperatuur op 60°C 10 door de hoge temperatuur-reactorkólom gepompt onder een druk van 83 kPa

O

en met een stroomsnelheid van 3,38 cnr/minuut. De temperatuur binnen de kolom werd gevolgd met een thermometer welke zich direct boven het bed bevond en omringd werd door 0,3 cm glazen korrels om het dode volume zoveel mogelijk tot een minimum te beperken. De kolomtempera-15 tuur werd daarna snel verhoogd door een olie uit een met een thermostaat op 111°C gehouden bad door de mantel te circuleren.

Het effluent uit de kolom werd onderzocht met een opnamepolari-meter, welke gekalibreerd was op het aflezen van 50 tot 5&% fructose. Nadat de kolomtemperatuur een waarde van 110,^°C had bereikt en wanneer 20 het fructosegehalte van het effluent het gewenste niveau had bereikt, werd het effluent verzameld en onmiddellijk in een ijsbad gekoeld.

De pH werd door de toevoeging van 1 M citroenzuur ingesteld op h ,0.

Uit de 70°C en de 110,U°C reactors verkregen geisomeriseerde oplossingen werden geanalyseerd op koolhydratensamenstelling en kleur 25 en de resultaten werden vergeleken met een soortgelijke analyse uitge-voerd aan de niet geisomeriseerde substraatoplossing, zoals in de vol- · gende tabel wordt getoond.

8302333 -26-

Tabel C

Samenstellingen van substraatoplossingen geïsomeriseerd bij T0°C en 110,^°C.

Behandeling van de Koolhydratensamenstelling Kleur

oplossing (gev.# op asvrije, droge "basis) (CIEF

fructose glucose psicose polysaccha- ride niet geïsomeriseerd 0 99»2 0 0,8 0,6 geïsomeriseerd "bij 1Q jooc 52,3 hó,9 0 0,8 0,7 geïsomeriseerd hij 110,k°C 57,2 1M,5 0,3 1,0 19,8

De resultaten tonen dat 57,2# fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,½ gew.# op droge basis werd gehouden en de 15 kleur (CIRFX100) beneden 20 bleef,

Voorbeeld IV

Dit voorbeeld toont de directe isomerisatie van een glucose bevattende oplossing, welke in overwegende mate bestaat uit een gezuiverd maiszetmeelhydrolysaat, teneinde een samenstelling te bereiken 20 met 56,3# fructose op droge basis, waarin een tveetrapsisomerisatiepro-ces werd toegepast. Eerst werd een lage temperatuur-isomerisatie bij 70°C uitgevoerd waarbij het produkt van deze reactie gebruikt werd als voeding voor een tweede hoge-temperatuur-reactor (103,3°C), welke een chemisch gestabiliseerd isomerase bevatte. Het chemisch gestabiliseer-25 de isomerase was een isomerase, waarin het enzym samen met een beschermend eiwit in reactie was gebracht (zoals het van gist afkomstige beschermende eiwit).

De lage temperatuur-isomerisatiestap, met inbegrip van een beschrijving van substraat en experimentele omstandigheden, wordt getoond 30 in voorbeeld l).

Het in de hoge tamperatuur-reactor toegepaste chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase-enzym werd op de volgende wijze bereid. Oplosbaar glucose-isomerase voor chemische stabilisatie werd bereid en gezuiverd met de in voorbeeld I beschreven methode. De specifieke acti-35 viteit van het preparaat bedroeg ongeveer <+0 IC-IU/mg eiwit. Men ver- 8302333 - 27 - kreeg een “beschermend eiwit uit bakkersgist door de volgende procedure. Aan 1229 g natte koek van bakkersgist werd 1000 g water en 500 g tolueen toegevoegd. Het mengsel werd gedurende een nacht bij kamertemperatuur geroerd en daarna op 85°C verwarmd, en gedurende ongeveer 30 minu-5 ten op die temperatuur gehouden. Het mengsel werd gefiltreerd op een buchner-trechter. Vrijwel alle tolueen bleef achter met de onoplosbare celresten, terwijl het waterige filtraat oplosbaar gistextract bevatte. Het waterige filtraat werd in volume verminderd tot 2j6 g (op een roterende verdamper, i+0°C), waarna Ui g trichloroazijnzuur onder roeren 10 werd toegevoegd. Het neergeslagen gisteiwit werd verzameld, daarna opnieuw opgelost in 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0). Ha klaring door

O

filtratie werd de oplossing behandeld met 900 cm"1 aceton (ongeveer 3 volumehoeveelheden). Het neerslag werd verzameld, opgelost in 0,01 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0), en de resulterende oplossing werd ge-15 dialyseerd tegen 0,01 M natriumfosfaatbuffer. Het resulterende produkt (150 cm^) was gemerkt beschermend eiwit, verkregen uit bakkersgist.

Men bereidde een 0,6% chitosanoplossing door 2k g chitosan (Kytex van Hercules Inc., Wilmington, Delaware) op te lossen in U dm^ 0,08 H HC1. De oplossing werd met 8 H HaOH ingesteld op een pH van 6,2, gefil-20 treerd door een Whatman type 3 filtreerpapier, daarna gedialyseerd tegen 16 dar gedeióniseerd water. Men bracht in een U00 cnr beker ongeveer 100.000 IGIIT oplosbaar glucose-isomerase-enzym (gemengd met filter-hulpmiddel), 1 g xylitol, en 100 cm*5 (2/3) van het uit bakkersgist verkregen beschermende eiwit. Aan dit mengsel werd 2,14· mg MgSO^.ÏH^O en 25 2*4- microliter molaire kobaltchlorideoplossing toegevoegd. Het mengsel werd gefiltreerd om filterhulpmiddel te verwijderen waarna de oplossing werd geconcentreerd (roterende verdamper, ongeveer l0°C) tot een 3 vrijwel droge toestand m een 2 dm rondbodemkolf. Aan de kolf werd

O

vervolgens 800 cnr chitosan toegevoegd (pH 6,2). Het mengsel werd daar-30 na geconcentreerd (roterende verdamper, ongeveer 1+0°C) tot een nagenoeg droge toestand en 6140 microliter 50% glutaaraldehydeoplossing (pH ingesteld op 6,5) werd toegevoegd. Het mengsel werd gedurende een nacht in een koude kamer bewaard. De gel werd daarna uit de kolf verwijderd en door een zeef gedwongen met mazen van 0,59 mm en in de oven 35 gedroogd bij ongeveer 37°C). Het gedroogde enzympreparaat werd gezeefd 8302333 - 28 - om fijne deeltjes (kleiner dan 0,177 mm) te verwijderen waarna het gebruikt werd (8,9' g van het eindprodukt) voor de hoge temperatuur-isome-risatie.

De 103,3°C reactor werd op de volgende, wij ze geprepareerd. Het 5 bovenstaand vermelde glucose-isomerasepreparaat (8,9 g) werd in substraat gesuspendeerd en gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur onder laboratoriumvacuum ontlucht. De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het vervaardigen van een 1,5 x 29 cm bed in een glazen kolom met mantel.

10 Uit de eerste traps-70°C isomerisatie bereid substraat werd op een pH van 6,75 ingesteld en verdund tot 12,0% droge stof. Dit substraat werd daarna gedurende 30 minuten bij een temperatuur van 60°C door de hoge temperatuur-reactorkolom gepompt met een stroomsnelheid van ongeveer 1,5 cm^/minuut. De temperatuur binnen de kolom werd i 15 gevolgd met een thermometer welke zich direct boven het bed bevond, en omringd was door glazen korrels (diameter 0,5 cm) om het dode volume te minimaliseren. De kolomtemperatuur werd daarna snel verhoogd door een olie uit een met een thermostaat op 104°C gehouden bad door de mantel te circuleren.

20 Het effluent uit de kolom werd onderzocht met een opnamepolari- meter welke gekalibreerd was op het aflezen van 50 tot 5&% fructose.

O

Fracties van ongeveer 5 cmr werden verzameld totdat er 55% of meer fructose werd geproduceerd op welk moment het experiment werd beëindigd. Gedurende de verzameling van monsters werd het effluent onmiddel- 25 lijk gekoeld in een ijsbad en werd de pH ingesteld op ongeveer ^,0 door toevoeging van molair citroenzuur (0,1 cur) en daarna verdund HG1.

Geïsomeriseerde oplossingen, die uit de 70°C en de 103,3°C reactors waren verkregen, werden op koölhydratensamenstelling en kleur geanalyseerd. De resultaten worden vergeleken met soortgelijke analyse, 30 uitgevoerd aan de niet gelsomeriseerde substraatoplossing zoals in de volgende tabel wordt getoond.

8302333 - 29 -

Tabel D

Samenstellingen van substraatoplossingen gexsomeriseerd bij 70°C en 103,3°C.

Behandeling van de Koolhydratensamenstelling Kleur

^ oplossing (gew.$ op asvrije, droge basis) (CIRF

fructose glucose psicose polysaccha- ride niet gexsomeriseerd 0 97*6 0 2,^ 0,5 gexsomeriseerd bij 10 70°C 51,3 0 2,3 0,7 gexsomeriseerd bij 103,3°C 56,3 Ui,5 0,1 2,2 3U,0

De resultaten tonen dat 56,3$ fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,2 gew.$ op droge basis werd gehouden.

15 Voorbeeld V

Dit voorbeeld toont de directe isomerisatie van een glucose bevattende oplossing, welke in overwegende mate bestaat uit een gezuiverd maiszetmeelhydrolysaat met een lage zoutconcentratie, teneinde een samenstelling te bereiken met 55, U$ fructose op droge basis, waar-20 bij een tveetrapsisomerisatieproces werd gebruikt. Eerst werd een lage temperatuur-isomerisatie bij 70°C uitgevoerd, en het produkt van deze reactie werd als voeding gébruikt voor een tweede hoge temperatuur-reactor (112,6°C), welke een chemisch gestabiliseerd isomerase bevatte.

Het chemisch gestabiliseerde isomerase was een isomerase, waarin het 25 enzym op meerdere punten covalent gebonden was aan een oplosbaar polymeer, waarna het onoplosbaar was gemaakt om een geïmmobiliseerde katalysator te vormen.

Het hydrolysaat werd bereid uit maiszetmeel volgens werkwijzen als beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.6UU. 126 (vloeibaar-30 making) en het Amerikaanse octrooischrift 3.280.006 (saccharificatie).

De gesaccharificeerde vloeistof werd gezuiverd volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.83^.9^0 waarbij een produkt werd verkregen dat 93,8$ glucose op droge basis bevatte. Er werd voldoende kristallijne glucose toegevoegd om het totale glucosegehalte op 96,9$ op droge basis te bren-35 gen. Be resulterende oplossing had de volgende samenstelling: 8302333 ^ | _ é _______ ____—1— w * - 30 - totaal aan droge stof {%) 50,3 glucose (% droge basis) 9^,9 fructose (% droge basis) 0,1 polysaccharide (% droge basis) 3,1 5 psicose ($ droge basis) 0,0

HaHS03 (mM) 2,5

MgSOj^ (mM) 2,5

CoClg (mM) 0,1 pH 6,8 10 De lage temperatuur-is omerisatie wordt uitgevoerd bij ?0°C, door de bovenstaand vermelde substraat oplos sing door de lage tempera-tuur-reactor te pompen die beschreven was in voorbeeld I, met een a 3 stroomsnelheid van 2,5 cm /minuut. De eerste 1000 cm die de reactor verliet, werd weggeworpen. Het effluent dat daarna naar buiten trad, 15 werd verzameld om in de tweede hoge temperatuur-isomerisatie te worden gebruikt.

De in de hoge temperatuur-reactor toegepaste chemisch gestabiliseerde katalysator werd op de volgende wijze bereid- Oplosbaar glu-cose-isomerase werd bereid eüugezuiverd met de methode zoals beschre-20 ven in voorbeeld I. De specifieke activiteit van dit preparaat bedroeg ongeveer bO IGIU/mg eiwit. Een oplossing van oplosbaar polymeer, een polyamide, werd verkregen door h-8,U g chitosan (Kytex van Hercules Inc., Wilmington, Delaware.19899) op te lossen in 15 dm^ 0,08 II HC1. Wanneer de oplossing was gerealiseerd werd de chitosanoplossing op een 25 HaCl-gehalte van 0,.5 M gebracht door de toevoeging van U38 g HaCl waarna de verkregen oplossing op een pH van 6,1 werd ingesteld met behulp van 8 H HaOH. De chitosanoplossing werd daarna gefiltreerd door een Whatman type 3 papierfilter om onoplosbaar materiaal te verwijderen.

Aan de 15 dm^ 0,3$ chitosan in 0,5 M HaCl bij pH 6,1 werd toegevoegd: 30 520.cm^ oplosbaar isamerase dat ongeveer 602.000 IGIU activiteit bevat te, 236 g xylitol (van Sigma Chemical Co.), en 3,07 g MnClg.UHgO, Deze oplossing werd gedurende 2 uren geroerd waarna 7,^4 g 1-ethyl-3-dime-thylaminopropylcarbodiïmide (van Sigma Chemical Co.) werd toegevoegd om op meerdere punten de carboxylgroepen van isomerase covalent te bin-35 den aan de aminogroepen van chitosan. Ha 2 uren bij kamertemperatuur 8302333 - 31 - * „a* o werd 15,5 cm van een 50%' s (w/w) glutaaraldehydeoplossing (van Eastman Kodak Chemical Co.), met 8 Ή UaOH ingesteld op een pH van 6,0, aan de reactie toegevoegd om het covalent gebonden isomerase-chitosancomplex

O

onoplosbaar te maken. Fa 15 minuten werd ^ dmJ van een 1 M fosfaat-5 oplossing met een pH van 8,0 in het onoplosbare is omeras e-chitos an gemengd. Het geïmmobiliseerde isomerase-chitosan werd gewassen met ge-deïoniseerd water terwijl het zich op een buchner-vacuumfilter bevond dat Whatman type 3 filtreerpapier bevatte. Het preparaat werd aan de lucht gedroogd, gemalen en gezeefd tot een afmetingengebied van 0,25 10 tot 1,J mm. De droge katalysator had een uitgedrukte activiteit van 803 IOIü/g.

De 112,6°C reactor werd op de volgende wijze geprepareerd. Een katalysatorportie van 7,0 g werd gesuspendeerd in het substraat en gedurende 6θ minuten bij kamertemperatuur onder laboratoriumvacuum ont-15 lucht. De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het vervaardigen van een 1,0 x 1*0 cm bed in een glazen kolom met mantel. Het gepakte bed bevatte 5621 IGIU.

Uit de eerste traps-70°C isomerisatie bereikt substraat werd op een pH van 6,55 ingesteld en met gedeïoniseerd water verdund op k2tQ% 20 droge stof, waardoor ook de zoutconeentraties werden verlaagd tot 2,1 mM HaHSO^ en 2,1 mM MgSO]^. Dit substraat werd daarna gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 60,0°C door de hoge temperatuur-reactor-kolom gepompt onder een overdruk van 83 kPa met een stroomsnelheid van 8 cmJ/minuut. De temperatuur binnen de kolom werd gevolgd met een 25 thermometer welke zich direct boven het bed bevond, en door zand tot aan de temperatuurschaal werd omringd om het dode volume zoveel mogelijk te minimaliseren. De kolomtemperatuur werd daarna snel verhoogd door een olie uit een met een thermostaat op ongeveer 114°C gehouden bad te circuleren. De kolomtemperatuur werd verhoogd tot 112,6°C en de 5 30 stroomsnelheid verlaagd tot 1,89 cur/min.

Het effluent uit de kolom werd onderzocht met een opnamepolari-meter, die gekalibreerd was op het aflezen van 50 tot 58% fructose.

JTadat de kolomtemperatuur een waarde van 112,6°C had bereikt en wanneer het fructosegehalte van het effluent het gewenste niveau had bereikt, 35 werd het effluent verzameld. De pH werd onmiddellijk ingesteld op k,0 8302333 - 32 - door de toevoeging van 1 M citroenzuur. Effluent werd verzameld totdat het schijnbare fructosegehalte daalde beneden 55%-

Uit de T0°C en de 112,6°C reactors verkregen geisomeriseerde oplossingen werden geanalyseerd op koolhydratensamenstelling en kleur 5 en de resultaten werden vergeleken met een soortgelijke analyse, uitgevoerd aan niet geisomeriseerde substraatoplossing, zoals in de volgende tabel wordt getoond*

Tabel E -

Samenstellingen van substraatoplossingen geisomeriseerd 10 bij T0°C en 112,6°C

Behandeling van de Koolhydratensamenstelling Kleur

oplossing (gew.% op asvrije, droge basis) (CIEF

fructose glucose psicose polysaccha- ride 15 niet geisomeriseerd 0 96,9 0 3,1 0 geisomeriseerd bij 70°C 51,V ^5,9 0 2,7 0 geisomeriseerd bij 112,6oC 55,k k2,0 0,1 2,5 8,5 20 De resultaten tonen dat 55,k% fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,2 gev.% op droge basis werd gehouden en de kleur beneden 9 bleef (CIEFX100).

Voorbeeld VI

Dit voorbeeld toont een directe isomerisatie van een glucose 25 bevattende oplossing, welke in overwegende mate bestaat uit een gezuiverd maiszetmeelhydrolysaat met lage zoutgehalten, teneinde een samenstelling te bereiken met 5^,8% fructose op droge basis, met een buitengewoon laag psicosegehalte (minder dan 0,1% en een kleur (minder dan 2 CIBFX100)), waarbij een tweetrapsisomerisatieproces werd gebruikt, 30 De eerste (lage temperatuur) reactor was op J0°C en de tweede (hoge temperatuur) reactor was op 105,8°C, Het in de hoge temperatuur-reactor toegepaste chemisch gestabiliseerde isomerase was een isomerase waarin het enzym op meerdere punten covalent gebonden was aan een oplosbaar polymeer en daarna onoplosbaar was gemaakt om een ge Immobiliseerde 35 katalysator te vormen.

8302333 5- ^ / - 33 -

Het substraat en zijn omzetting door de eerste trapsreactor bij JQ°C was als beschreven in voorbeeld V.

De in de hoge temperatuur-reactor bij 105,8°C toegepaste geïmmobiliseerde katalysator was zoals beschreven in voorbeeld V.

5 De 105,8°C reactor werd op de vólgende wijze geprepareerd. Een katalysatorportie van 5,63 g verd gesuspendeerd in substraat en gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur onder laboratoriumvacuum ontlucht. De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het vervaardigen van een 1,0 x 32 cm bed in een glazen kolom met mantel. Het gepakte bed 10 bevatte ^521 IGIU.

Uit de eerste traps-70°C isomerisatie bereikt substraat werd op een pH van 6,5 ingesteld en met gedeïoniseerd water verdund tot b2,Q% droge stof, waardoor ook de zoutconcentratie werd verlaagd tot 2,1 mM MgSO^ en 2,1 mM NaHSO^. Dit substraat werd daarna gedurende 10 minuten 15 bij een temperatuur van 60,0°C door de hoge temperatuur-reactorkolom gepompt onder een overdruk van 69 kPa en met een stroomsnelheid van 8 cm^/minuut. De temperatuur binnen de kolom werd gevolgd met een thermometer welke zich direct boven het bed bevond en door zand werd omgeven tot aan het begin van de temperatuur schaal om het dode volume zo-20 veel mogelijk te minimaliseren. De kolomtemperatuur werd daarna snel verhoogd door een olie uit een met een thermostaat op ongeveer 107°C gehouden bad door de mantel te circuleren.

Het effluent uit de kolom werd onderzocht met een opnamepolari-meter, die gekalibreerd was op het aflezen van 50 tot 58# fructose.

25 Nadat de kolomtemperatuur een waarde van 105,8°C had bereikt en wanneer het fructosegehalte van het effluent het gewenste niveau had bereikt, werd het effluent verzameld. De pH werd onmiddellijk ingesteld op b,90 door de toevoeging van 1 M citroenzuur.

Uit de 70°C en de 105,8°C reactors gelsomeriseerde oplossingen 30 werden op koolhydratensamenstelling en kleur geanalyseerd en de resultaten werden vergeleken met een soortgelijke analyse, uitgevoerd aan de niet gelsomeriseerde substraatoplossing, zoals in de volgende tabel wordt getoond.

8302333 -* t-

- 3** -Tabel F

Samenstellingen van substraatoplossingen geisomeriseerd hij T0°C en 105,8°C

Behandeling van de Koolhydratensamenstelling Kleur

_ oplossing (gew.$ op asvrije, droge hasis) (CIBF

^ X100) fructose glucose psicose polysaccharide niet geisomeriseerd <0,1 96,9 0 3,1' 0 geisomeriseerd bij 10 70°C 51Λ 1*5,9 0 2,7 0 geisomeriseerd bij 105,8°C 5l*,8 1*2,3 <0,1 2,8 1,8

De resultaten tonen dat 5**,8# fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,1 gew,% op droge basis werd gehouden en de 15 kleur bleef beneden 2 (CIRPXIOO).

8302333

Claims (18)

1. Werkwijze voor het isameriseren van glucose tot fructose, waarbij een glucose bevattende uitgangsvloeistof in contact wordt gebracht met chemisch gestabiliseerde glucose-isamerase bij een temperatuur van ongeveer 90 tot ongeveer 1U0°C bij een pH van ongeveer 3 tot ongeveer 5. en een voldoende contacttijd om een uiteindelijk gehalte in genoemde vloeistof te bereiken van tenminste ongeveer 53 tot 60 gew.% fructose, gebaseerd op het totale koolhydratengehalte zonder sterke vorming van psicose en/of andere non-fructose, non-glueosesuikers.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de glucose bevattende 10 vloeistof wordt verkregen uit de hydrolyse van maïszetmeel.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de glucose bevattende uitgangsvloeistof wordt verkregen door isomerisatie van een maïszetmeel hydrolysaat tot een fructosegehalte tot ongeveer 52% 3 gebaseerd op het totale koolhydratengehalte, 15 *<·. Werkwijze volgens een der conclusies 1 tot 3, waarin de bron voor het glucose-isomerase een microorganisme is, gekozen uit de groep Streptomyces species, mutanten, varianten en genetische modificaties daarvan.

5. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 3, waarin de bron 20 voor het glucose-isomerase een microorganisme is, gekozen uit de groep bestaande uit Streptomyces sp. ATCC 21175; mutanten, varianten en genetische modificaties daarvan.

6. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 3, waarin de bron voor het glucose-isomerase een microorganisme is, waarin een gemuteerd 25 glucose-isomerasegen is geïntroduceerd, welk gemuteerd gen glucose-isomerase met hoge thermische stabiliteit verschaft.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 5, waarin het glucose-isamerase een thermisch stabiel glucose-isomerase is.

8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, waarin het thermisch stabie-30 le glucose-isomerase verkregen is uit Bacillus stearothemophilus.

9. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, waarin het thermisch stabiele glucose-isomerase verkregen is uit Bacillus licheniformis. 8302333 i -3 6 -

10. Werkwijze volgens conclusies 6 of 7, waarin het thermisch stabiele glucose-isomerase verkregen wordt uit een thermofiel organisme uit de genera Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermomono spora of Fs eudonocardia..

11. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, waarin het thermisch stabie le glucose-isomerase wordt verkregen uit een microorganisme van het ge-nus .Ampullariella.

12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-11, waarin een in water oplosbaar zout van zwaveligzuur in het isomerisatiemedium aanwe- 10 zig is in een hoeveelheid welke enzymdenaturering belemmert.

13. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-12, waarin de glucose bevattende uitgangsvloeistof ongeveer 30 tot ongeveer 50 gew.% koolhydraten bevat. 1U. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-13» waarin de glu-15 cose bevattende uitgangsvloeistof in contact wordt gebracht met chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase bij ongeveer TOO tot ongeveer 110°C. T5. Werkwijze volgens een van de conclusies T - 1U, waarin de pH van het isomerisatiemedium op ongeveer 5 tot ongeveer 6,5 wordt gehou-20 den.

16. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 - 15» waarin de con-tactduur ongeveer 2 minuten tot ongeveer 30 minuten bedraagt.

17. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 - 16, waarin het chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase in een geïmmobiliseerde vorm 25 wordt toegepast.

18. Werkwijze volgens conclusie 17» waarin het chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase wordt geïmmobiliseerd op diëthylaminoëthyl-eellulose.

19· Werkwijze volgens een van de conclusies 1 - 18, waarin als eer-30 ste stap de glucose bevattende uitgangsvloeistof in contact wordt gebracht met glucose-isomerase bij een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 80°C, een pH van ongeveer 6 tot 9 en een contactduur van ongeveer 0,5 tot ongeveer 2 uren teneinde tot ongeveer 52 gev.% fructose gebaseerd op het totale koolhydratengehalte in genoemde vloeistof, te 35 bereiken, en als tweede stap de temperatuur van het isomerisatiemedium 8302333 - 37 - wordt verhoogd tot een waarde van ongeveer 90°C tot ongeveer 1kO°C, terwijl de pH zonodig wordt ingesteld tot hinnen het gebied van ongeveer 3 tot ongeveer 8; en de fructose bevattende vloeistof in contact wordt gebracht met chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase geduren-5 de een voldoende extra tijdsperiode om het fructosegehalte te verhogen tot een waarde van ongeveer 53 tot ongeveer 60 gev.%.

20. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 - 19» waarin de geproduceerde fructose-glucosesiroop wordt gekoeld tot een temperatuur beneden ongeveer 80°C.

21. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-20, waarin het iso- merisatiemengsel wordt gekoeld tot een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 80°C nadat het enzym van contact met het isomerisatiemeng-sel is verwijderd. 8302333