JPS6240289A - 固定化フラクトシルトランスフエラ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シェフロース１分子にフラクトース１〜４分
子が結合した構造からなるフラクトオリゴ糖を製造する
固定化酵素に関し、より詳しくは４級化ピリジン環を分
子中に有する陰イオン交換性高分子化合物からなる担体
に、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
物菌体を担持させるにあたり、フラクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を、フラクトオリゴ糖の収率の最も高い範
囲に調整することによりフラクトオリゴ糖の生産　　　
　　　　Ｉ性を高め、フラクトオリゴ糖の連続法による
工業的生産を可能にする固定化フラクトシルト長ンスフ
ェラーゼおよびその製造法に関する。

本発明に係る固定化フラクトシルトランスフェラーゼに
より製造されたフラクトオリ１糖は・難　　　　　　　
ｉう蝕性低カロリー甘味料としての用途がある。（特開
昭５６−１５４９６７号、特開昭５７−１２９７３号、
特開　　　　　　Ｌ昭５８−４００６５号）また、フラ
クトオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖促進物質でもあり、
（特開昭５８−２０１９８０号）食品、医薬、飼料等の
分野への広い用途が期待されている。

〔従来の技術〕

フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物と
しては、オーレオバシデイウム・プルランス・バラエテ
ィ・メラニゲナムＡ−８株（ＦＥＲＭ　Ｐ−５８８５）
やアスペルギルス・ニガーＡＣＥ−２−１株（ＡＴＣＣ
２０６１１）等が見出され、またアスパラガス、キクイ
モ等の植物起源の酵素も見出されている。（特開昭５８
−１６２２９２号）工業的なフラクトオリゴ糖の製造方
法としては、上記微生物菌体又はその破砕物、抽出酵素
、菌体を含む培養液を、適当なシュクロース濃度、　ｐ
Ｈ１温度条件下で、シェフロースと混合、攪拌反応させ
る、いわゆる回分法が実施されている。（特開昭６０−
２７３９５号等） また製造コストの有利性を考慮すると、固定化酵素を用
いる連続法が好ましく、微生物菌体をゲル状アルギン酸
塩内に包括固定化する方法（特開昭５８−１６２２９２
号）やβ１．３−１．６グルカンと硫酸アルミニウム又
はアルミニウム化合物で菌体を固定化する方法（特開昭
６０−４１４９７号）のような包括法によるフラクトシ
ルトランスフェラーゼ活性を有する菌体の固定化法が提
案されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

フラクトオリゴ糖を連続法によって製造するに際し、固
定化酵素をカラムに充填し、高濃度の糖液を通液する場
合には、固定化酵素にかなりの物理的強度が要求される
。一般に、ゲル包括法によって得られた固定化酵素は、
比較的強度が小さく高濃度糖液を基質とするような反応
に際して工業的規模のカラムに充填した場合、充分な通
液性を示さないことが知られている。

本発明者らは、工業的規模のカラムに充填した場合に充
分な通液性を示し、物理的強度が優れた酵素触媒の製造
法として、４級化ピリジン環を分子中に有する陰イオン
交換性高分子化合物と酵素や酵素含有微生物菌体とを反
応させた後、架橋剤で処理し成形体とする方法を開示し
た。（特公昭５５−３６３１８号）この方法は触媒重量
当たりの酵素活性が充分高いことも優れた特徴の一つで
ある。

しかしながら、この方法で、フラクトシルトランスフェ
ラーゼ活性を有する微生物菌体を固定化すると酵素活性
の高い触媒が得られるにもかかわらず、適正な条件下で
シェフロースと作用させても、シェフロースに微生物菌
体を直接作用させた場合に比して、フラクトオリゴ糖の
収率が低いという問題が判明した。

そこで本発明者らは、物理的強度が優れ、且つシェフロ
ースとの反応で、フラクトオリゴ糖収率　′の高い、固
定化フラクトシルトランスフェラーゼについて鋭意研究
を行った結果、固定化酵素の活性が高すぎると、フラク
トオリゴ糖収率が低下することを見出した。これは従来
の固定化酵素活性を高くする研究とは全く逆の方向であ
って、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微
生物菌体を不活性物質で希釈し、適正な酵素活性になる
ように、酵素活性を調整す慝ことが重要であることを見
出し、本発明を完成するに至った。

〔問題を解決するための手段〕および〔作用〕本発明は
、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物
菌体と、４級化ピリジン環を分子中に有する陰イオン交
換性高分子化合物との反応生成物の架橋され、成形され
た固定化酵素であって一該固定化酵素のフラクトシルト
ランスフェラーゼ活性が、乾燥固定化酵素１ｍｇあたり
０．０５なしζし２０単位であることを特徴とし、更に
、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物
菌体と、他の不活性物質と、４級化ピリジン環を分子中
に有する陰イオン交換性高分子化合物とを反応させた後
、多官能性架橋剤で処理し、成形し、乾燥して製造する
ことを特徴とする。

本発明で使用できるフラクトシルトランスフェラーゼ活
性を有する微生物菌体としては、１アスペ−１、Ｆ　Ｅ
　ＲＭ−Ｐ４Ｏ１０等）、ペニシリウム属（ぺ　　　　
　　　、ニルギルス属（アスペルギルス・ニガーＡＣＥ
−２二シリウム・ニグリカンス等）、フザリウム属（フ
ザリウム・リニｌＡＭ５００８等）、ブレオスボリウム
属（ダレオスボリウム・カキＩＡＭ５０１１等）、オー
レオバシディウム属（オーレオバシデイウム・プルラン
ス・パル・メラニゲナム　Ａ−８Ａ　Ｔ　ＣＣ２０６１
２等）、ロドトルラ属（ロドトルラ・グルチニス等）、
ピヒア属（ビヒア、ミソ等）、ハンセヌラ属（ハンセヌ
ラ・ミソ等）、キャンディダ属（キャンディダ・トロピ
カリス等ン゛等のカビ、酵母等のフラクトシルトランス
フェラーゼ活性を有する微生物菌体がある。

本発明における不活性物質とは、フラクトオリゴ糖を分
解せず、更に微生物菌体のフラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を阻害しないものである。

具体的には、バクテリア、カビ、酵母、放線菌などの不
活性微生物菌体が挙げられる。またケイソウ土、シリカ
、セライト、アルミナ等の無機物、セルロース、デンプ
ン、デキストリン、アルギン酸ソーダ、カルボキシメチ
ルセルロース、プルラン、キトサン、カゼイン、ゼラチ
ン、アルブミン等の天然生産物、ポリビニルアルコール
、酢酸セルロース、ポリアクリル酸塩、ポリアミド、ボ
リウレクン等の合成高分子などが挙げられる。

しかしながら、不活性物質を多量に添加すると、不活性
物質の種類によっては担体の成形性が悪くなり、製品の
物理的強度も低下する。これを補うためにこれら不活性
物質を選択わたり、また２種以上を組合せて使用する。

一般的に不活性微生物菌体は良好な不活性物質であるが
、不活性微生物菌体の種類によっては、その添加量によ
って成形性を悪くするものもある。このような場合には
、この不活性微生物菌体と上記無機物−天然生産物、合
成高分子などの組合せによって目的とする固定化酵素を
得ることができる。

本発明に係る乾燥固定化酵素とは、フラクトシルトラン
スフェラーゼ活性を有する固定化酵素をフラクトシルト
ランスフェラーゼ活性を低下させない程度に比較的低温
で乾燥したものであり、湿潤固定化酵素を約３０〜８０
℃で１５〜２０時間乾燥すれば、はぼ一定の含水率に達
する。

本発明に係るフラクトシルトランスフェラーゼの活性測
定法および酵素活性の表示法は下記の通りである。

マクルベインｉ街液（ｐＨ５，０）　２．Ｏｎ＋１に酵
素液１ｍｌを混合し、固定化酵素の場合には緩衝液３ｍ
ｌに固定化酵素の適量を添加し、２５％（Ｗ／Ｖ）シェ
フロース溶液２．ｈ＋１を加えて、４０℃で１時間反応
させる。反応の停止は、１０分間の煮沸処理によって行
う。反応液中に生成したＧＦｔ（シェフロースにフラク
トースが１分子結合したフラクトオリゴ糖）を高速液体
クロマトグラフ法で定量し・反応液中に６０分間で１μ
ｓ＋ｏｌｅのＧＦｔを生成する酵素量をもってフラクト
シルトランスフェラーゼ活性１単位とする。

本発明においては、固定化酵素のフラクトシルトランス
フェラーゼ活性が適正に調整されていることが重要であ
る。酵素活性は乾燥固定化酵素１ｍｇあたり０．０５〜
２０単位、好ましくは１〜１０単位である。酵素活性が
０．０５単位／１ｍｇ以下ではフラクトオリゴ糖の生産
性が低く、２０単位を越えると転移が進みすぎてフラク
トオリゴ糖の収率が低下する。

本発明で担体に供される４級化ピリジン環を有する陰イ
オン交換性高分子化合物とは、ビニルピリジン又はその
誘導体に対し、これと共重合しうる芳香族ビニル化合物
、エチレン系不飽和化合物、ジエン系不飽和化合物から
選ばれた１種以上の単量体を共重合させて得られた共重
合体にピリジン環の窒素原子を４級化せしめる試剤を作
用させて製造した水に不溶であるが、親水性の大きな反
応　　　　　　１性高分子を相称する。具体的には、ビ
ニルピリジン−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、
ビニルピリジン−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼ
ン共重合体、ビニルピリジンーポリエチレング　　　　
　　：リコールジメタクリレート共重合体、ビニルピリ
ジン−メチレンブロック共重合体、ビニルピリジ　　　
　　艷′−メタクリ″酸メチ″ブ０・り共重合体等を／
゛ｔロゲン化アルキル又はジハロゲン化アルキル等の４
級化試剤と反応させることにより得られた４級化ピリジ
ン環を有する陰イオン交換樹脂である。

本発明に使用する多官能性架橋剤は、分子内にタンパク
質中のアミノ酸残基の官能基と反応しうる２またはそれ
以上の官能基を含むものが好ましい。具体的には、グル
タルアルデヒド又はポリアクロレイン、ジアルデヒドデ
ンプン等のジアルデヒド、又はポリアルデヒド類、シア
ノゲンプロマイド等のシアノゲンハロゲニド類等が挙げ
られる。

その池水酸基、カルボキシル基、フェノール基、メルカ
プト基等の反応性官能基と反応しうる化合物として、酸
無水物、エポキシ化合物、イソシアネート化合物などが
使用できる。

次に本発明の固定化フラクトシルトランスフェラーゼの
製造法およびこれを用いたフラクトオリゴ糖の製造につ
いて順次説明する。

フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物を
得るには、適当な培地、例えばシュクロース５．０％、
ペプトン１．０％、肉エキス０．７％、食塩０．３％を
含有する培地に、それぞれの微生物の至適温度すなわち
２５〜３５℃で２４〜９６時間培養し、培養終了後、濾
過又は遠心分離により菌体を得る。得られた菌体は、そ
のまま冷蔵保存するか、又は凍結保存や凍結乾燥して保
存することができる。

ｉｉ、−二″の１゛ ｉで得られたフラクトシルトランスフェラーゼ活性を有
する微生物菌体と不活性物質とを混合する。フラクトシ
ルトランスフェラーゼ活性を有する菌体と不活性物質と
の混合重量比は、微生物菌体の保有するフラクトシルト
ランスフェラーゼ活性に依存する。培養によって得られ
る菌体のフラクトシルトランスフェラーゼ活性は、菌株
、培養条件等によって異なるが、１０〜１０００単位／
ｍｇの菌体活性を有している。菌体の活性が例えば１０
００単位／ｍｇのときは、フラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有する菌体と不活性物質との混合重量比はフ
ラクトオリゴ糖収率が高くなる触媒活性となる条件を選
択し、１：２〜１０００が好ましい。不活性物質は１種
類に限らず、他の不活性微生物菌体と天然生産物などを
配合、して使用する。また、使用するフラクトシルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する菌体の酵素活性が適正であ
れば、更に不活性物質を併用する必要はない。

フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物菌
体と不活性物質の混合方法は特に限定はなく、水に懸濁
して混合しても、乾燥状態で混合してもよい。

４級化ピリジン環を分子中に有する陰イオン交換性樹脂
と反応させる際には、使用する樹脂の形態は粒径０．０
１ｍｍ以下の微粉末状が好ましく、また樹脂は酸性が強
いため、樹脂の水分散液をｐＨ５，０〜７．０に調整し
たものを使用するとよい。樹脂の水分散液は、菌体混合
物の水懸濁液中に添加するか、或いは乾燥状態のまま樹
脂の水分散液を添加混合する。菌体混合物と陰イオン交
換性樹脂との混合割合は乾燥重量比で１：０．０５〜ｌ
：１が導光である。混合時間は常温（５〜３０℃）で、
１時間以内である。

また、不活性物質を樹脂の添加後に混合することもでき
る。

かくして得られた反応物は、多官能性架橋剤添加前に、
含水率を２５〜８０％になるように調節することが好ま
しい。この水分含量の調節は、一度スプレー乾燥法や溶
剤乾燥法により乾燥した後、水を加えて水分調節するか
、又は遠心分離機やフィルタープレスにより親水する。

次に多官能性架橋剤を添加し、混合、攪拌する。

混合時の温度は、５℃〜３０℃が好ましい。成形機にか
ける前に架橋剤の反応が進みすぎないように時間を調節
する。架橋剤の添加量は、不活性物質の種類により任意
の量とする。架橋剤溶液のｐＨは酵素の活性と架橋の効
果を考慮して調整されるべきものであるが、ｐ）１４　
、０〜ｐＩ（８，０に調整するのが適当である。

酵素固定化物の成形方法は固定化酵素の所望する最終形
態に応じた成形機により成形する。触媒の最終形態とし
ては、好ましくは長円形又は円形粒子状であり、そのサ
イズは０．１ｍｎ＋〜１ｃｍの平均厚さ及び直径を有す
るものがよい。本発明の好ましい成形方法は、前記湿潤
固定化物を０．１ｍｍ〜ＩＣｌ１１のスクリーンを有す
る押出機で成形する方法である。この場合の押出機は特
に限定された特殊な構造を必要とするものではなく、一
般的成形用押出機が充分適用できる。この成形物をさら
に回転式整粒機等により、粒状化することもできる。

以上のようにして得られた成形物は、速やかに乾燥させ
る必要がある。乾燥は３０℃〜８０℃、１５分〜２０時
間で送風乾燥するのが好ましいが、乾燥方式は静置状態
での棚式乾燥機でも、流動状態での流動層乾燥機でも差
し支えない。

かくして得られた乾燥固定化酵素は、場合によっては、
篩分けして粒径を揃える。

ｉｉｉ　、フーク　第１ゴの１１゛ ｉｉで得られた固定化酵素をシュクロースに作用させて
フラクトオリゴ糖を製造するには、固定化酵素をカラム
に充填し、シュクロース溶液を通液する方法が最も実用
的である。その場合、シュクロース溶液として２０〜７
０％（ｗ／ｗ）濃度のものを用い、ｐＨ５゜５〜７．５
、温度３０〜６０℃の条件で通液することが好ましい。

この反応条件で得られるフラクトオリゴ糖の収率、組成
は固定化酵素の使用量と反応液の反応器通過速度を調節
することにより調整することができる。

以下、本発明の実施例を示すが、実施例に記載の固定化
酵素のフラクトシルトランスフェラーゼ活性は、前述の
活性測定法により測定、算出したものである。

〔実施例１〕 （１）固定化酵素の調製 ４級化（スチレン−２，ビニルピリジン−ジビニルベン
ゼン）ランダムコポリマー（アニオン交換容量３．２ミ
リモル当量／ｇ）を特公昭５５−３６３１８号の実施例
１に示した方法によって調製した。この樹脂５０ｇを２
５０ｍ　ｌの水に懸濁分散させ、０．１Ｎ　−ＮａＯＨ
でｐｏ’ｒ、ｏに調整した。

アスペルギルス・ニガーＡＣＥ−２−１Ａ　Ｔ　ＣＣ２
０６１１株をブイヨン２％、シュクロース５％の組成を
有する培地１０ｍ１に１白金耳植菌し、２８℃で２４時
間培養したものを種母培養液とした。

２１ジャーファーメンタ−にシュクロース１５％、酵母
エキス３．６％を含む培地１Ｎを入れ、１２０℃で３０
分間殺菌後、上記種母培養液１０ｍ１を植菌し、　　　
　　　：２８℃で４８時間培養した。通気攪拌条件は２
４０ｒｐｍ、Ｑ、５ｖｖｍであった。培養終了後、培養
液を遠心分離し凍結乾燥した。フラクトシルトランスフ
ェラーゼ活性７１０単位／ｍｇを有する菌体３０ｇを得
た。

上記凍結乾燥菌体１０ｇと乾燥酵母（和光純薬■製）４
０ｇ、セルロースパウダー（東洋科学■製３０Ｍ−１０
０Ｍ）　　１５０ｇを乳鉢中で充分混合した。そこへ前
述の樹脂懸濁液２００ｍ　ｌを加え、充分に混合した後
、遠心ｔａ　（三隅理（ＩＪＩＩＩＳ　Ｙ　Ｋ　−３８
００）　ニヨり脱水した。次に２５％ゼラチン（和光純
薬■製）水溶液１００ｍ１及び卵アルブミン（和光純薬
■製）１０ｇを添加し充分に混合した。

１０％グルタルアルデヒド水溶液１００ｍ１を添加し混
合した後、１ｍｍφのスクリーンを有する一軸式前面押
出成形機を使用し常温で押出成形した。得られた成形物
を送風乾燥機にて、４０℃、３時間乾燥した。乾燥品を
篩分けして２０−４８メツシユのものを製品とした。こ
のようにして得られた固定化酵素のフラクトシルトラン
スフェラーゼ活性は６．４単位／ｍｇであった。

（２）連続的酵素反応 前項ｉ’ｉＭ！！！！！シタ固定化酵ｆｆ１１０ｇヲ１
００ｍ１（Ｄ蒸溜水の入ったビーカーに入れ、約１時間
膨潤。脱気させた後、５０℃に保温した直径２２ｍｍ、
高さ１５０＋＋ｕａのジャケット付ガラスカラムに充填
し、直ちにカラム上部より５０重量％のシェフロース水
溶液（ｐＨ６，０）を２５ａ＋１／時の流速で連続的に
供給し、反応を開始した。カラム下部より反応液を採取
し、その反応液組成を高速液体クロマトグラフィーによ
り分析し、その結果を第１表に示した。

なお、フラクトオリゴ糖はＣＦ２　、ＣＦ３　　（シュ
クロースにフラクトース２分子が結合したフラクトオリ
ゴ糖）、ＣＦ、（シュクロースにフラクトース３分子が
結合したフラクトオリゴ糖）の総計である。

反応開始時から２３日間、固定化酵素の崩壊、目づまり
による流量低下環の異常現象は見られなかった。反応終
了後、固定化酵素を抜き出して残存活性を測定し、固定
化酵素の活性半減期を算出したところ２３日であった。

第　　　１　　　表 〔比較例１〕 固定化酵素の調製にあたり、乾燥酵母、セルロースパウ
ダーを使用せず、フラクトシルトランスフェラーゼ活性
を有する菌体２００ｇを使用した以外は実施例１と同様
にして固定化酵素を得た。得られた固定化酵素のフラク
トシルトランスフェラーゼ活性は２９．６単位／ｍｇで
あった。実施例１と同様にして連続的酵素反応を行い、
その結果を第２表に示した。

第　　　２　　　表 〔実施例２〕 セルロースパウダーと乾燥酵母に代えて放線菌の一種で
あるストレプトミセス・ファエロクロモジエネス（市販
のグルコースイソメラーゼ活性を有する菌体）　１９０
ｇを使用した以外は実施例１と同様にして固定化酵素を
得た。得られた酵素のフラクトシルトランスフェラーゼ
活性は７．２単位／ｍｇであった。

得られた固定化酵素の連続的酵素反応の結果を第３表に
示した。

第　　　３　　　表 本実施例においても、実施例１と同様に良好な結果が得
られ通液性の異常などは見られなかった。

〔実施例３〕 実施例１において、凍結乾燥菌体２ｇ、乾燥酵母（和光
純薬■製）４０ｇ、セルロースパウダー（東洋科学＠８
３０メツシュ〜１００メツシュ）　１５８ｇを１ｙの水
に懸濁した。この懸濁液に実施例１で用いた樹脂懸濁液
１５０ｎ＋１を加え、室温（２０〜２５℃）で３０分間
攪拌した。さらに１％ポリアクリル酸ソーダ液１５０１
を加え、攪拌を続けた。３０分後に遠心分離器により脱
水を行い、湿潤固定化菌体を得た。

次いで、２５％ゼラチン（和光純薬■ｌ！り水溶液１０
０＋ｎｌを添加し、乳鉢中で充分に混合した。１０％グ
ルタルアルデヒド水溶液１００ｍ１を添加し、混合した
後、実施例１と同様にして成形、乾燥を行い製品２１０
ｇを得た。得られた固定化酵素のフラクトシルトランス
フェラーゼ活性は、１．２単位／ｍｇであった。実施例
１と同一の条件で連続的酵素反応を行った結果を第４表
に示した。

第　　　４　　　表 〔効果〕 本発明により、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を
適正に維持し、しかも機械的強度の大きい固定化酵素が
得られ、難う触性低カロリー甘味料として、或いはビフ
ィズス菌増殖促進物質として、食品１．医薬、飼料等の
分野への広い用途を有するフラクトオリゴ糖を効率よく
、連続的に製造することが可能になった。更に、本発明
固定化酵素は乾燥品であり、保存、運−に際しても有利
である。

特許出願人　電気化学工業株式会社 （外１名） 代理人　弁理士　　鈴　木　定　子 弟１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　　　　　　　識別記号ＣＩｚ　日
　　　ｌ：１８ノ 庁内整理番号 手続補正書 昭和６１年５月ｇ日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微
   生物菌体と、４級化ピリジン環を分子中に有する陰イオ
   ン交換性高分子化合物との反応生成物の架橋され、成形
   された固定化酵素であって、該固定化酵素のフラクトシ
   ルトランスフェラーゼ活性が、乾燥固定化酵素１ｍｇあ
   たり０．０５ないし２０単位であることを特徴とする固
   定化フラクトシルトランスフェラーゼ。
2. （２）フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微
   生物菌体と、他の不活性物質と、４級化ピリジン環を分
   子中に有する陰イオン交換性高分子化合物とを反応させ
   た後、多官能性架橋剤で処理し、成形し、乾燥すること
   を特徴とする固定化フラクトシルトランスフェラーゼ。