SU1523056A3 - Способ изомеризации глюкозы во фруктозу - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к производству фруктозы путем ферментивной изомеризации глюкозы. Цель изобретени  заключаетс  в уменьшении образовани  псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышение содержани  фруктозы в растворе. Способ изомеризации глюкозы во фруктозу предусматривает контактирование исходного раствора с содержанием 40-50 мас.% глюкозы, например гидролизата крахмала, с термически стабилизированной глюкозоизомеразой при PH 6,0-7,0. Процесс изомеризации провод т при 90-115°С мин до превращени  по крайней мере 54-58% глюкозы во фруктозу. Дл  изомеризации глюкозы следует использовать химически стабилизированную глюкозоизомеразу. 1 з.п. ф-лы, 11 табл.

Description

Изобретение относитс  к произ- водству фруктозы путем ферментативной изомеризации глюкозы.

Цель изобретени  .- уменьшение образовани  псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышение содержани  фруктозы в растворе.

Способ изомеризации глюкозы во, фр.уктозу заключаетс  в следующем.

В качестве исходного раствора используют раствор, содержащий 40- 50 мас.% глюкозы, например гидроли- . зат крахмала. Предпочтительными  вл ютс  ферментативные способы получе- ки  гидролизатов, содержащих глюкозу.

Наиболее предпочтительными  вл ютс  способы , которые используют сочетание ферментов, например глюкоами- лазы и фермента, отщепл ющего боковые цепи. Особенно предпочтительными  вл ютс  сочетани  ферментов, способных одновременно превращать ожи- женный крахмал в глюкозу плюс фрук тозу , например сочетание глюкоами- лазы, пуллуланазы и глюкоизомеразы. Этот способ дает возможность получить изомеризованные гидролизаты,

.содержащие48% фруктозы и 50% глюкозы в расчете на сухую массу, ко: торьщ идеально подход т дл  дальнейшего превращени  до 53-60% фруктозы по предлагаемому способу. Можно

: также использовать мембранный процесс дл  удалени  полисахарида из

сл ю

ее о

СП С5

см

гидролизата крахмала, получа  фракции , содержащие глюкозы,более 99%, что  вл етс  идеальным исходным материалом дл  предлагаемого способа. Растворы глюкозы, полученные кристаллизацией из гидролизатов крахмала , также  вл ютс  исходным материалом ,

Глюкозные и/или глюкозо-фруктоз- ные растворы, которые использз мт в качестве исходных материалов, нуж-- но предпочтительно очищатй, на какой- либо стадии их получени  во избежание вредного воздействи  неуглеводных примесей на глюкозоизомеразу и дл  минимизации окрашивани  во врем  температурной изомеризации по предлагаемому способу. Можно использовать неочищенные гидролизаты крах мала, однако, при условии, что будут выполнены услови  их получени , описанные , в патенте США № 4376824.

В случае использовани  раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата дл  предлагаемого способа , можно также использовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризована во фруктозу. Так, например, раствор изомвризованной глюкозы, содержащий вплоть до 52% фруктозы, можно обработать предлагаемым способом дл  повышени  концентрации фруктозы до более желательного уровн  выше 52%, и предпрч- тительно до уровней 55-56% и вьппе.

Растворы глюкозы,, содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.% от углеводородов, можно получить известными способами.

В качестве средства дл  предотвращени  избыточного окрашивани  во врем  высокотемпературной изомеризации можно добавить к глюкозно- фруктозному сырьевому раствору вещества , образующие бисульфит. Предпочтительно исключить кислород из всех растворов, которые могут контактировать с глюкозоизомеразой во врем  высокотемпературной реакции изомеризации дл  того, чтобы свести к минимуму любое окисление фермента , которое могло бы привести к инактивации..

Глюкозоизомеразу, которую исполь- ззтот в качестве фермента или как источник фермента дл  химической стабилизации , можно вьзделить из известных микроорганизмов, вырабатывающих

глюкозоизомеразу, включа ; Strepto- myces flavorires, Streptomyces- achroiaogenesj &treptcmyces. echinatus , Streptomyces albus, Streptomy- ces wedmorensis, Streptoinyces..pha- rochromogenes,. Streptomyces. bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ven ezuelae Acrobacter acro0 genes, Acrotacter cloacae. Bacillus coagulans. Bacillus megateri-um. Bacillus fructosus, Acetobacter oxy- . daiis a Acetobacter suboxydans, .Acetpr bacter roseus, Acetobacter melanoge5 nus, Lacto baclllus fermenti, Lacto- bacillus brevis, Lactobacillus gavo- nli, Lactobacillus lycopersici, Lac- tobacillus mannitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hid0 rophilia, Brevibacterium pentaamino- acidictmi, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, Paracolo- bactrum aerogenoides. . ,. Кроме того, можно использовать

5 глюкоиЗомеразу,, которую вырабатывают род Nocardia, Micromonospora, . Microbispora, Microellobospora и Arthrobacter streptorayces вид АТСС 2il75, Она  вл етс  прекрасньм источником глюкозоизомеразы дл  ис0

5

пользовани  в предлагаемом способе. Кроме того, можно использовать глю- козоизомеразу, котора  обладает стабильностью при относительно высоких тем-. пературах изомеризации, например

глюкозоизомеразу, продуцируемую . Bacillus stearothermophilus, в частности штамм, выбранный из группы, состо щей из Bacillus stearother- Q mophilus АТСС 21365, WRRL В-3680, WREL В-3681 и HRRL В-3682, глюкозоизомеразу , продуцируемую микроорганизмами рода Ampullariella, например Ampullariella digitata,, Mpulla- , riella lobata, Ampullariella compa- nulata И. Mpullariella regularis, глюкозоизомеразу,продуцируемую Bacillus licheniformis, глюкозоизомеразу, продуцируемую Thermophilus,

Кроме вышеуказанных микроорга- нйзмов предлагаемый способ предусматривает использование их мутантов и вариантов. Мутанты-гены глюкозоизомеразы , выбранные дл  такого, применени ,  вл ютс  такими, которые обес- 5 пенивают получение глюкозоизомеразы,

котора  стабильна при повышенных ; температурах, особенно свыше 90 С и предпочтительно вплоть до около

15

., Такие гены можно получить с

помощью обычных методик, которые ис- польззоот дл  мутаций микроорганизмов , например облучением или с помо- щью химических мутагенов. Б другом варианте вьщеленные гены глюкозоизо- меразы, которые продотируют глюкозо- изомеразу промежуточной термостабильности , так, например продуцируемь е некоторыми штаммами Streptomyces, могут быть подвергнуты мутации in vitro. Выбор соответствуюших генов- мутантов либо в родственные, либо в другие микроорганизмы сопровождает- с  реинтродукцией генов-мутантов, с последующим ростом и репликацией микроорганизма и проверкой термостабильности полученной глюкозоизомеразы.

Предполагаетс  также, что дл  по- лучени  глюкозоизомеразы повышенной термостабильности, подход щей дл  химической стабилизации и использовани  в изобретении, можно использовать методику рекомбинантной ДНК, ЕСЛИ аминокислотна  последовательность тримерных (третичных) структур глюкозоизомеразы известна, то можно развить повышенную стабильност с помощью точечкьж специфических мутаций в гене изомеразы дл  получени  ферментов, сконструированных дл  содержани  повышенного количества таких аминокислот, которые придают повышенную стабильность структур.

Предполагаетс , что такие искусственно созданные ферменты должны быть особенно полезны в предлагаемом способе.

Так как г люкозоизомеразу продуци- руют внутриклеточно с помощью тех или иных микроорганизмов, источником глюкозоизомеразы может .быть просто сбор клеток, а затем фермент можно вьщелить из-клеток известными спосо- бами, например клеточньп аутолизисом разрушением ультразвуком, и использовать в ферментаторе обычного известного типа. Предпочтительно, чтобы глюкозоизомеразу или химически стабилизированную глюкоизомеразу можно было иммобилизовать на инертном носителе в соответствии с обычной и хорошоизвестной методикой Материалы и способы, которые исполь- зуют дл  иммобилизации ферментоВ|хорошо известны. Также предусмотрено присутствие небольших количеств катионов кобальта, марганца и магни 

, 5

0 5 О

Q .е Q ,

5

&

и/или водорастворимой соли сернистой кислоты, например сульфита натри , бисульфита натри , сульфита магни , и/или бисульфита магни  дл  снижени  или ингибировани  денатурировани  глюкозоизомеразы во врем  осуществлени  процесса.

Пеобходимо, чтобы концентраци  углеводорода в исходном глюкозосо- держащем сиропе была в интервале 40 - 50% глюкозы по массе.

Необходимо также вести изомеризацию при рН в интервале от около 6,0 до около 7,0 и наиболее предпочтительно между 5 и 6,5. Проведение изомеризации существенно ниже или вьше указанных значент рН приводит к образованию избыточных количеств нежелательных побочных продуктов, напрш ер псикозы; органических кислот , окрашенных продуктов, предшественников окрашенных продуктов, диан- гидридоБ фруктозы и тому подобное.

Бьшо обнаружено, что рН дл  опти-, мальной активности глюкозоизомеразы заметно снгокаетс  при высоких температурах , .Дл  глюкозоизомеразы из Streptomyces rubigenosus оптимальна  активность наблюдаетс  при рН 8,6- 9,2 при 25°С, рН 6,9-7,5 при 75 С и 5,6-6,2 при 125 Cj т.е. с повышением температуры изомеризации рН изомеризации можно дл  поддержани  максимальной активности фермента и, кроме того, дл  предотвращени  образовани  побочных продуктов..

Дл  предлагаемого способа врем  контактировани  предпочтительно ограничено временем, необходимым дл  достижени  конечной концентрации, по крайней мере от около 53 до около 60 мас.% фруктозы в расчете на полное содержание углевода, присутствующего в реакционной смеси. Так как глюкозосодержащий сырьевой сироп может содержать практически одну только глюкозу, т.е. либо мало, либо вовсе не содержать фруктозы, или может содержать .глюкозу нар ду с количествами фруктозы вплоть до около 50%, врем  реакции зависит от природы исходного сиропа..Так эффективным  вл етс  врем  контактировани  10-25 мин.

Еще одним необходимым требованием предлагаемого способа в случае использов.ани  химически стабилизированного фермента  вл етс  длитель7152

ность контактировани  глюкозосодер- жащего исходного сиропа и химическа  стабильность глюкозоизомеразы..

Предпочтительное врем  контактировани  глюкозоизомеразы или химически стабилизированной глюкозоизомеразы и глюкозосодержащего сиропа зависит в значительной степени от рН, при котором провод т реакцию изомеризации. В нижнем пределе интервала рН врем  Контактировани  может быть более длительным без нежелательного разложени  глюкозы и фруктозы за счет образовани . В верх нем пределе интервала необходимо более короткое врем  контактировани  во избежание образовани  псикозы и окрашивани . На практике, полное врем  пребьюани  глюкозосодержащего сиропа при или около окончательной температуре реакции оцениваетс  как врем  эффективного контактировани , так как происход щие реакции разложени  Сахаров  вл ютс  нефермента- тивными и происход т независимо ,от того, контактирует сироп или нет с глюкозоизомеразой в Поэтому, при проведений изомеризации при температуре свыше 90°С важно снизить врем , необходимое дл  доведени  сиропа глюкозы до нужной температуры изомеризации (например, смешива  сироп с паром непосредственно перед контактированием с изомеразой), а после достижени  нужного уровн  фруктозы быстро отделить сироп от активной изомеразы и затем, как .можно быстрее

охладить сироп до температуры менее 90°С, и предпочтительно до темпера- туры менее 70°С. Если используют растворимую форму глюкозоизомеразы или химически стабилизированной глюкозоизомеразы , необходимо ее инакти- вировать (например, снижением рН до предела, при котором происходит ин- активирование изомеразы) перед стадией , охлаждени  во избежание обратного превращени  в глюкозу фруктозы, образовавшейс  на стадии высокотемпературной изомеризации, так как реакци  изомеризации  вл етс , естественно , обратимой.

Максимальна  степень конверсии глюкозы во фруктозу, которой можно достичь,, определ етс  термодинамическим равновесием между глюкозой и фруктозой, которое, в свою очередь зависит от температуры, при которой

8

провод т изомеризацию. Очень тщательный анализ равновесных смесей глюкозы и фруктозы приводит к следующей взаимосв зи

F 100 К (к +1); (1) 755

Т + 273

+ 2,3005, (2)

где F - % фруктозы при равновесии

в расчете на полный вес глюкозы и фруктозы;

Т - температура проведени  реакции изомеризации;

К - константа равновеси  глюкозы от фруктозы.

I

Реальное врем  контактировани  между глюкозосодержащим сиропом и изомеразой в реакторе можно в об- щем оценить путем сравнени  следующей формулы, если используют реактор содержащий иммобилизованную форму изомеразы

Fe - FO t ,

КА.

(3)

JQ 15 20 25 30

35

Q -с

. ;

где t - действительное врем  контактировани ; С - концентраци  глюкозы и

фруктозы;

У - свободный объем жидкости . в слое насадки (объем сло  минус объем, занимаемый частицами иммобилизованного фермента); F - дол  фруктозы в глюкозе

(фруктозиой смеси при равновесии при температуре изомеризации ) ;

Fg - дол  фруктозы (в расчете на Г + Ф) при поступлении в слой насадки;

F - дол  фруктозы (в расчете на Г Ф) в растворе, наход щемс  в слое насадки; К - константа скорости реакции изомеризации в услови х изомеризации; А - активность изонеразы в слое

насадки.

Значени  К дл  иммобилизованной изомеразы, полученной в соответствии с приведенными далее примерами, нахо- д тс  в интервале от около 0,07 до около 5 г. IGIU при температуpax от 90 до соответственно. Это соотношение показывает необходимость .минимизации времени контактировани  при высоких температурах при использовании слоев насадки с высокой активностью на единицу объема. Слои насадки, -полученные по способу, описанному в дальнейших примерах, могут, содержать вплоть до 2000 i/ . IGIU/мл, что может привести к достижению 99,5%-ного равновесного содержани  фруктозы за менее, чем 1 мин в высокотемпературном реакторе, когда используют постадийные реакторы при различных температурах, и сырье подаваемое в первый реактор, изомери- зугот при низкой темперйтуре перед изомеризацией при высокой температуре во втором реакторе. Когда используют систему постадийньтх реакторов, предпочтительно использовать способ ферментативного превращени  глюкозы во фрзгктозу, который включает контактирование глюкозосодержащего исходного сиропа, содержащего от 40 до 50 мас«% глюкозы, с глюкозоизомера- зой при температуре от 20 до 80°С, при рН от 6,0 до 9,0 и времени контактировани  от 0,5 до 2 ч дл  превращени  от 40 до 45 мас.%; присутствующей в сиропе глюкозы во фруктозу, повыша  температуру изомеризационной среды . от 90 до , устанавлива  нужное значение рН изомеризационной среды Biинтервале от 6,0 до 7,0, осуществл   контактирование фруктозосодержашёго сиропа с глюко- зоизомеразой в течение дополнительного промежутка времени от 10 до 25 мин дл  повышени  степени конверсии от 53 до 60 мас.% глюкозы, наход щейс  в исходном сырьевом глюко- зосодержащем сиропе, причем практически без образовани  псикозы или других Сахаров, которые не  вл ютс  глюкозой или фруктозой. Поэтому, использование высокоактивных слоев насадок может привести к малым эффективным промежуткам времени контактировани , которое, в свою очередь, минимизирует разложение фруктозы, которое происходит при высоких температурах , необходимых дл  проведени  предлагаемого способа.

При выборе методики иммобилизации глюкозоизомеразы предпочтительно, чтобы использовались способы, которые дают возможность получать мел

10

15

3056. 10

кие пористые частицы катализатора с тем, .чтобы ингибированне эффектов диффузии изомеризации было минимальным .

В другом варианте нзомеразу можно иммобилизовать в порах мембраны, через которую пропускают раствор г.пю- козы во врем  высокотемпературной изомеризации, как.средство промоти- ровани  хорошего контакта между ферментом и субстратом, минимизиру  диффузионные ограничени . Носитель, которьй. используют дл  иммобилизации ,  вл етс  предпочтительно, полностью нерастворимым и инертным дл  того, чтобы избежать образовани  нежелательных примесей- или разложени  глюкозных (фруктозных) компонентов растворов субстратов,.

Однако, в коммерческой практике,, содержащие .фруктозу сиропы не изготавливают из чистой глюкозы. Чаще в качестве источника глюкозы используют гидролизаты крахмала. Они посто нно содержат сахариды,.отличные от глюкозы и фруктозы (здесь и далее именуемые полисахаридами), ко торые получаютс  в результате неполного гидролиза крахмала и обратного превращени  глюкозы. Обычно они составл ют от 3 до 8% в расчете на сухую массу в виде сахаридов, полученных гидролизом крахмала. Поэтому необходимо при оценке температуры, при которой следут проводить изомеризацию , учесть все полиса-хариды, содержащиес  в глюкозном сиропе, также как и другие факторы, как полный вес фруктозы в сухом виде, который должен быть достигнут, образование псикозы и других продуктов, которые не  вл ютс  глюкозой или фруктозой, во врем  эффективного времени контактировани  сиропа глюкозы и изомера- зы. Уравнени  дл  расчета температуры изомеризации привод тс  ниже:

20

25

30

35

40

45

50

- 273; (4) (5) (6)

где т -.температура изомеризации,

V- )

F - равновесное содержание фруктозы (% в расчете на

и

полцое содержание глюкозы + фруктозы) при температуре Т; М - % фруктозы в расчете.на сухую массу требуемый в продукте изомеризации; С - % псикозы + других продук-ч тов разложени , образующих- с  во врем  эффективного изо- меризационного времени кон тактировани ;

Q - % равновеси , .достигнутый во врем  реакции изомеризации; Р - % содержани  полисахарида

в глюкoзнo f сиропе Обычно, менее i%, предпочтительно менее 0,5%, псикозы и других продуктов разложени  может образовыватьс , и позтому может быть достигнуто 99,5% равновеси . Поэтому дл  получени  сиропа, содержащего 5555% фруктозы (s расчете на сухую массу), необходимы следующие температуры изомеризации дл  глюкозного сиропа указанной концентрации полисахаридов;

ы в сиы , % в сухую

Температура изомеризации,

°С. ,

95,7 99,1 104,3 108,9 113,8 124,3 136,1

Приемлема  коммерческа  продукци  содержит, в среднем, 55,5% фруктозы в расчете на сзтхую массу. Это так, noTOirty что при этом уровне фруктозы получают кукурузньй сироп с высоким содержанием фрзпктозы, одинаковой сладости с сахарозой по массе в расчете на сухую массу. Кроме того, сироп с содержанием фруктозы 55,5% прин т как коммерческий продукт , который используют взаимозамен емо частично илц полностью вместо сахарозы во многих пищевых продуктах и особенно в газированньк... м гких напитках, ..

Из-за сложностей, сопровождающих поставку, хранение, измерение и включение сиропа в пищевые продукты5 существует обща  потребность в установлении стандарта дл  продуктов.

10

-

is

23056 12

полученных от разных изготовителей, с тем, чтобы продукты из разлизных источников можно было использовать взаимозамен емо и одновременно. Поэтому уровень фруктозы 55-56% в расчете на сухую массу приобретает особое значение как целевой уровень в технологии, св занной с изготовлением сиропа,

В соответствии с предлагаемым способом можно получать уровни фруктозы по крайней мере 5.3%, предпочтительно по крайней мере 54% и более предпочтительно по крайней мере 55%,

Продукт, полученный по этому способу , характеризуетс  также приемлемой окраской, котора , естественно, очень желательна, так как это снижает затраты на очистку.

Учитыва  указанные требовани  рН и времени контактировани -)известный способ изомеризации глюкозы можн© соответствзтощим образом приспособить к работе при температуре от около 90 до 115°С и предпочтительно от около 100 до около 110°С дл  получени  высококонцентрированных глюкозо-фрз ктознь х сиропов.

При желании с учетом использова- НИН раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата дл  предлагаемого способа, можно также исдользовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризо- вана во фруктозу. Так, например, раствор изомеризованной глюкозы, содержащий вплоть до 50% фруктозы, можно обработать в соответствии с предлагаемым способом, дл  повьппе- ни  концентрации фруктозы до более желательных уровней выше 50% и предпочтительно до уровней 55-56% и ( вьше.

25

30

35

Растворы глюкозы, содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.% углевода, можно получить известными способами.

Учитыва  вышеизложенное требование к концентрации гJюкoзы, рН и времени контактировани , известные способы изомеризации глюкозы можно соответствующим образом приспособить дл  работы в интервале температур от около 90 до около П5 С,предпочтительно между около 100 и около ПО С, дл  получени  сиропа с высоким содержанием глюкозы-фруктозы.

Термостабильность глюкозоизомера . зы может быть существенно повьшена за счет одной или более химических обработок фермента с сохранением его приемлемой активности. Обрабо- тайный таким образом фермент называют химически стабилизированной изомеразой,.

I Химическую стабилизацию изоме- |разы осуществл ют р дом различных способов, которые могут привести к повышению термостабильности. Основное достижение состоит во введении структурных элементов в молекулу фермента таким образом, чтобы фермент был устойчивым к раскрытию при нагревании выше его обычной точки термоденатурировани . Предпочтительным способом дл  осуществлени  этого  вл етс  модификаци  фермента химическими замещени ми на нем фрагментов, содержащих поли- меризуемые винильные группы, таким образом, чтобы последние были прочн присоединены к поверхности молекулы фермента в нескольких местах. После этого модифицированный фермент смешивают с одним или более полимеризу ёмыми,винильными соединени ми в водных растворах и полученную смесь со- полимеризУют до образовани  химически стабилизированного фермента, в котором фермент прочно св зан во многих точках с трехмерной полимерной матрицей, котора  образовала структуру, соответствующую по форме структуре фермента.

Важно при проведении вышеописанных реакций, чтобы услови , которые привод т к денатурированию изомеров с последующей потерей активности, бьши обойдены. Так например, следуе избежать экстремальных значений рН температур во врем  JBo6b X манипул ций , необходимых дл  проведени  вы- шезгказанных реакций.

Примерами реагентов, которые используют дл  модификации изомеразы дл  замещени  полимеризуемых ванильных групп на ней,  вл ютс  акрило- хлорид, метакрилохлорид, акролеин, кротоновый альдегид, малеиновый ангидрид , 3,4-эпоксибутен, 2,3-эпокси пропид сложный эфир акриловой кислоты , 2,3-тиоглицидиловЫй сложный зфи акриловой кислоты, 1.-аллилокси-3(К- этш1енимин)-2-пропанол, 0-сукциними довьш сложный эфир акриловой кисло0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ты, ангидрид хлормалеиновой кислоты, азид малеиновой кислоты, 3-бромпро- пен и аллилнзотиоцианат. Такие соединени  могут взаимодействовать со свободными аминогруппами изомеразы, например эпсилонаминогруппой дизино- вого фрагмента.

Другие соединени , которые могут взаимодействовать со свободными группами карбоновых кислот ийрмеразы, могут быть использованы дл  замещени  легко полимеризуемых винильных фрагментов на ней.

Примерами винильных соединений, которые можно сополимеризовать с мрдифициро ванной изомеразой,  вл ютс  акрилат натри , метакрилат натри , акриламид, оксиэтилметакрилат, акрилоилпиперидин 4-спиро-2 -(1, 3- диокмакрилопентан), 1-акрилоил-4- пиперидин и акрилоилметоксиамин. Обычно, предпочтительными  вл ютс  растворимые мономеры или смеси мономеров , которые дают в результате водорастворимые полимеры.

Обычно бифункциональные виниловые соединени  включают в смесь мономеров -дл  введени  сшивающих центров, .что приводит к тримерной полимерной сетке. Подход щими соединени ми  вл ютс  W,N -метокси-бис-акриломид и этиленгликольдиметакрилат. Если используют эти соединени , полимеризу- ема  смесь образует нерастворимый гель, который привод т к иммобилизации изомеразы.

Системы инициаторов, которые обычно исггользуют при полимеризации винильных групп, могут быть персульфатом аммони  плюс бисульфат натри ,1 перекись водорода плюс сульфат железа, сульфат калк  njnoc N,N,N jN -тетраметштэтилендиамин и рибофлавин.

В другом варианте нековалентное присоединение к трехмерной полимерной матрице может быть достаточным дл  придани  нужной жесткости молекуле изомеразы, и тем самым осуществлени  заметного повьшзени  термостабильности . Это может произойти,- если изомеразу механически включают в сщитый полимерный гель. В этом случае нет необходимости в том, чтобы модифицировать изомеразу присоединением к ней. винильных групп перед .стад.ией полимеризации. Однако, концентраци  гел  должна быть выше.

чем около 30 мас.% перед тем, как произойдет заметна  стабилизаци  и предпочтительна  концентраци  гел  около 50%. Требуютс  мономеры, способные образовьшать по лимерные ге- йи, которые могут образовывать электростатические и водородные св зи с изомеразой, как, например, акри- лат натр  , метакрилат натри , акри амид и оксиэтшшетакриЛат.

Третьим способом отверждени  изомеразы  вл етс  внутримолекул рна  сшивка, котора  может повысить термостабильность.

Нодход щие сшивающие агенты дл  использовани  в изобретении включают бифункциональные соединени , ко торые способны взаимодействовать с подвешенными, функциональными группа ми молекулы фермента.. Чаще всего такими функциональными группами  вл ютс  аминогруппы, обычно первичные аминогруппы, которые могут взаимодествовать с широким кругом функцио - нальных групп, таких как карбоновые кислоты, сульфонилгалиды, альдёги- , ды, изоцианаты пропиолаты и тому подобные. ..

Так, сшивающие агенты .включают ангидриды дикарбоновьгх кислот, как  нтарный а:нгидрид, и адипиновый. . ангидрид, соответствующие диаль- дегиды такие, как глиоксаль, сукцинальдегид и глутаральдегид.; такие ненасыщенные соединений как акролеин и кротональдегид, такие : диолпропиолаты, как этиленгликоль- биспропиолат, пропиленгликольбиспро

пиолат, и гексаметиленгликольбйс-

пропиолат, и дисульфонилгалидыутакие , как бензол-1,3-дисульфонил- хлорид; нафталин-1,5-дисульфонил- хлорид и толил-2,4-дисульфонилхлорид . . : V

Кроме того, так как фермент содержит или может быть получен так, что содержит кислотные группы, взаимодействующие с аминами, именно 6ифункци ональные амины можно использовать в качестве сшивающих агентов дл  целей изобретени . Они включают, например, диамины, содержащие вплоть до 12 атомов углерода, например нилендиамин, бутилендиамин, гекси- , лендиамин, октилендиамин, пентилен- диамин, этилендиамин и додецилендиа- мин.

о

0

5

5

0

5

Количество сшивающего агента мо- i жет существенно измен тьс , причем отношение фермента к сшивающему агенту находитс  в интервале от около 0,1 до около 0,0001. Способ осуществлени  нужтлого св зьшани  в некоторой степени определ етс  природой выбраннбго сшивающего агента и ферментом . Вообще, реагенты нужно раствор ть в подход щем инертном растворителе и реакцию следует вести при достаточно низких температурах, чтобы избежать вредных воздействий на фермент, который .может быть чувст- вительньм к высоким температурам, Обьгчно, предпочтительна реакци  при комнатной температуре или. околонее, а. в качестве реакционной среды используют воду или водные растворители ..

Кроме замещени  полимеризуемых винильных групп на молекуле фермента . и последующей полимеризации в соответствии с описанными ранее спот собами дальнейший вариант включает конденсацию предварительно получ - ного полимера с изомер-азой путем образовани  внутримолекул рных кова- лентных св зей дл  получени  стаби- .лизированной молекулы. Так, например ,- полипептиды, такие . как встречающиес  в природе протеины и про-. дукты их.гидролиза, можно подверг- . нуть взаимодействию, использу  известные методики дл  создани  пептидной св зи с глюкоизомеразой до получени  стабилизированного фермента . Полученные таким образом продутс- ты могут быть Водорастворимыми, но им можно придать свойство не раствор тьс  в- воде, использу  такие смешивающие .агенты, как глутаральдегид , и обычно полученна  сшита  ферментна  система еще более стабильна.

При желании исходный фермент можно преобразовать, включив нужную . функциональную группу в молекулу в цел х конденсации с ранее полученной молекулой. Так, дл  введени  карбоксильной функциональной группы фер- .мент, содержащий свободную амнно- группу, следует подвергнуть взаимодействию с дикарбоновой кислотой дл  превращени  в ферментj содержащий карбоксильную группу.

Предварительно полученными полимерами , которые следует использовать в описанном ранее варианте, могут

10

15

20

быть любые, которые содержат нужный тип и количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп дл  проведени  нужной реакции. Предпочтительными  вл ютс  полипептиды, такие как природные протеины, например хитозан, дрожжевой протаин и тому подобные, так- же как и смеси; и полимеры, содержащие аминогруппы, такие как полиэти- ленимин. Обычно предпочтительные предварительно полученные полимеры образуют водорастворимые продукты и предпочтительно придать им нерастворимость за счет взаимодействи  со сшивающими агентами, напри- мер. глутаральдегидом и другими описанными ранее соединени ми.

Во всех описанных способах модификации ферментов существенным  вл етс  условие, чтобы достаточное количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп, имелось в наличии дл  дости- 25 жени  заметного уровн  искомого результата ,,

Так, например, при выборе предварительно полученного полимера, ко- . торый должен взаимодействовать с ферментом, требуетс ,чтобы полимер содержал группы, которь е могут реа- гировать с доступными группами молекулы фермента. Так, протеин с подвешенными карбоксильными группами следует выбирать дл  взаимодействи  с подвешенными .аминогруппами фермента . Кроме того, должно сутцествоватв разумное количество реакционноспособ- ных групп у выбранного реагента, чтобы обеспечить множество точек присоединени  реагентов дл  достижени  существенной стабилизации.

Еще один способ, С помошью которого можно повысить термостабильность фермента, состоит в химическом изменении структуры поверхности без заметных потерь-активности. Так, по- верхностные аминогруппы можно ами- дировать или гуанидировать до получени  заместителей, сильно напомина - ющих аргинин, Лактикдегидрогеназа и некоторые другие протеины были стабилизированы, Один IGIU  вл етс  количеством нзомеразы, которое превращает 1 микромоль глюкозыво фруктозу в течение 1 мин в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на 1 л, 0,02 моль MgSO на 1 л и 0,001 моль ,

30

35

40

45

50

55

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

CoCl на 1 л при рК 6,85 (0,2 М ма- леат натри ) и при температуре при определении вышеуказанным способом .

Пример 1. Демонстрирует пр мую изомеризацию глюкозы при высоких температурах до достижени  композиции, содержащей 55,5% фруктозы в расчете на сухую массу, при использовании двухстадийной системы изомеризации.

Растворимую глюкозоизомеразу по- Л лучают по способу, аналогичному способу, oпиcaннo 9y в патенте США № 3788945.

Вид Streptomyces rubigencsus, полученный из S, rubigenosus АТСС 21175, выращивают подводной аэробной ферментацией на среде следующего состава, мас.%:

Декстроза9,0

Сироп замоченной

кукурузы (тверда 

часть)1,6

Диаммонийфосфат 0,08

Сульфат марганца 0,06

Противовспенивающий агент (Плурс- .

ник PZ-61)0,003

Указанную среду стерилизуют при

в течение 45 мин, охлаждают и. устанавливают рН 6,8-7,0, Ее иноку- лр1руют 14 об,% икокулюмом, содержащим затравочный ферментер, полученный с помощью S, rubigenosus варианта , указанного выше„ Ферментацию провод т в.асептических услови х при 30 С в течение около 60 ч при аэрации. S, rubigenosus АТСС 21175 можно также использовать дл  иноку- лиров.ани  и получени  изомеразы, В этом случае используют среду следующего состава, мас,%:

Декстроза0,24

Сироп замоченной

кукурузы , Стверда 

часть)1,5

Сорбитол1,6

,02

Диаммонийфосфат 0,56

Ксилоза .1,0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из S, rubigenosus. Затем полученный экстракт фильтруют до получени  раствора сырой неочищенной глюкозоизоме- разы.

Неочищенную глюкозоизомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе,

121° С

10

20

25

фильтрованием и промывкой адсорбированного продукта, Ogl М NaCl раствором дл  удалени  примесей,-а затем, десорбиру  путем контактирозани  с 0,45 М раствором TSaClj рН всех растворов поддерживают при 7,5 во врем  стадий очистки Раствор частично .очищенной изомераэы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами 95% этанола при О G до осаждени  изомеразы. Добавл ют перлитный фильтр, твердую часть выдел ют фильтрованием и сушат воздухом до получени  растворимого препарата изо- ,г меразы, содержащега 2500 IGIU/r. Удельна  активность препарата изомеразы составл ет 40 IGIU/мг протеина , .

Низкотемпературный () реактор изомерации приготавливают, набива  иммобилизованную изомеразу, подготовленную по способу патента CD1A. №3788945, в стекл нную колонку диаметром до 2,54 см до получени  сло  5 см по высоте, содержащего 20000 IGIU .активности, В .верхнем пространстве над слоем насадки устанавливают термометр и располагают стекл нные шарики дл - сведени  к минимуму мертвого объема,:насколько это возможно Колонка имеет впускное и выпускное отверстие и окружена . рубашкой Дл  циркул оди, воды из., .. термостата , ., , . ,

Высокотемпературный реактор (ЭЗ с) подготавлршают таким: же образом ,, использу .иммобилизованную изомеразу , полученную адсорбцией очищенной изомеразы. на .ДЕАЕ-целлюлозе Слой насадки содержит 97000 IGIU и имеет высоту 15 см

Один IGIU представл ет .собой количество изомеразы, которое превращает 1 мкмоль глюкозы во фруктозу за 1 мин в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на 1 л,. 0,02 ммоль MgSO. на 1 ли 0,001 моль CoCl. на 1 л при рН 6.,85 (0,2 М малеата натри ) и при температуре 60°С.

Раствор, содержащий глюгсозу, под готавливают, раствор   кристаллическую глюкозу в деминерализованной воде до получени  раствора, содержа- щего 48% сухого вещества по массе. Активирующий и стабилизирующий агенты раствор ют в растворе глюкозы до получени  25 мМ натрийметабисульфи- та, 5 мМ сульфата магни  и 0,1 мМ

30

35

40

45

50

55

0

0

5

г

0

5

0

5

0

5

хлористого кобальта рН раствора устанавливают 6,8 гидроокисью натри .

Первую стадию низкотемпературной изомеризации провод т при 70 С, прокачива  вышеуказанный раствор глюкозы через низкотемпературный реактор со скоростью 3,7 мл/мин. Первые 2500 мл раствора, поступающего из реактора, сливают, а поток поступающий из реактора после этого,, собирают дл  использовани  на второй высокотемпературной стадии. При высокотемпературной изомеризации раст- вор, полученный при изомеризации при 70°С, прокачивают через вы- сокотемпературньй реактор, подготовленный , как описано выше, со скоростью 5 мл/мин, поддержива  температуру в реакторе 93°Со Врем  контактировани  раствора в высокотемпературном реакторе с иммобилизованным ферментом составл ет около 12 миНо ° Полное врем , в течение которого раствор находитс  при температуре 93 С внутри реактора, составл ет около 18 мин. Полученный раствор охлаждают в лед ной бане немедленно . после того, как он поступает из высокотемпературного реактора и рН его устанавливают 4,.0. Поток, вытекающий Из высокотемпературного реактора , в течение первого часа сливают.

Изомеризованный раствор глюкозы,, полученный из реакторов, работающих при 70 и 93°С, анализируют на содержание , углев.одрв и окраску, полученные результаты сравнивают- с аналогичными результатами, полученными дл  неизомеризованного раствора ГЛ50КОЗЫ, как показано в табл. 1.

Полученные результаты показывают , что содержание фруктозы 55,5% можно достичь при содержании псико- зы менее 0,5 мас.%. Окраска - менее, чем 5 (CI RF х 100),

Содержание углеводов определ ют по. способу Е-61, а окраску по способу F-14, стандартных аналитических методов МетЪег companies of the Corni Refine.rs Association, Corn Refiners Association, Inc., 1001 Connecticut Avenue,Washington,. D.С. 20036

Значени  окраски, полученные по способу F-14, умножают на 1-00 и привод т в ви,це (CIRF к 100).

Пример 2с, Иллюстрирует получение содержащего фруктозу продукта с содержанием фруктозы 55,2%,

получейного из глюкозосодержащего раствора, состо щего, главным образом , из очищенного гидролизата кукурузного крахмала,

Гидролизат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в патенте США № 3644126 (ожижение ) и патенту США № 3280006 (оса-, харивание), Осахаренный сироп очищают по способу патента США № 3834940 до получени  продукта, содержащего 95,3% глюкозы в расчете на сухую массу и 50% полного содержани  твердой части. Добавл ют достаточное количество кристаллической глюкозы дл  доведени  полного содержани  глюкозы до 87,1% в расчета на,сухую массу. Полученный таким образом раствор имеет следующий состав :

Полное содержание сухого вещества, % 42,4 Глюкоза, % в расчете на сухую массу97,1

Фруктоза, % в расчете на сухую массу0,1

Полисахарид, % в расчете на сухую массу 258 Псикоза, % в расчете ка сухую массу0,0

NaHSOj, мМ , - 50,0. MgSO, мМ 5,0. ,СоС1, , I .. 0,1

РН - 6,8

Высокотемпературный реактор подготавливают , как описано в примере 1, он содержит 147500 IGIU в слое 16,5 см высоты. Температуру поддерживают 97,4°С. Вышеуказанный раствор прокачивают через слой насадки со скоростью 4,4 мл/мнн. Первые 50 мл потока, вытекающего из реактора, сливают, а поступающий из реактора после этого поток отбирают на анализ. Полученные результаты представлены ниже в сравнении с составом неизомеризованного раствора глюкозы (табл. 2)..

Полученные результаты показывают , что можно получить уровень фруктозы болев 55% при образовании лишь 0,2% псикозы. Более сильное окрашивание продукта в этом примере св зано с тем, что всю изомеризацию провод т при высокой температуре (97,) в противоположность двухстадийному способу примера 1, где больша  часть фруктозы была образована при более низкой темпера- туре (т.е. при 70°С и окрашивани  удалось избежать, благодар  исполь- зованию двухстадийного реактора. Тем не менее, окрашивание составило величину менее 13 (CIRF «100).

П р и м е,р 3, Демонстрирует получение продукта с содержанием фрук- Q тозы 55,3% в расчете на сухую массу из глюкозосодержащего раствора, состо щего из очищенного гидролизата кукурузного крахмала плюс кристаллическа  глюкоза, при использовании 5 двухстадийной систеьа изомеризации , причем на второй стадии используют коммерчески доступную иммобилизованную глюкозоизомеразу.

Растворнмз ю глюкозоизомеразу g дл  реактора первой стадии получают и очищают по способу, описанному в примере 1. Удельна  активность зто- го препарата составл ет 40,9 IGIU/мг . протеина. Всего 25000 IGIU этого 5 фермента иммобилизуют, адсорбиру  на 10 г Ватман ДЕ-23 ДЕА-Е-целлюлозе Этот иммобилизованный фермент используют дл  приготовлени  реактора на 70 ( в стекл нной колонке диаметром 0 2,54 см с рубашкой, как описано в примере 1, Высота сло  насадки составл ет 13 см.

Субстрат дл  этого реактора подготавливают точно так же., как и в примере 2, и он имеет следующий состав:

Полное содержание сухого веашства, % 50,2 Глюкоза, % в расчете на сухую массу 97,6 Фруктоза, % в расчете на сухую массу Полисахарид, % в расчете на сухую массу 2,4 Псикоза0,0

KaliSO, , мМ50,0

MgSO, мМ5,0

CoCli0,1

рН6,8

Низкотемпературную изомеризацию провод т при 70°С, прокачива  вьш1е- тсазанньй раствор субстрата через низкотемпературный реактор со скоростью потока 3,2 мл/мин. Первые 1000 мл поступающих из реактора сливают. Поток se, поступающий после этого,собирают дл  использовани  на второй ста-, дин высокотемпературной изомеризации .

5

0

0,0

5

0

5

Фермент5- который используют дл  получени  высокотемпературного .реактора ,  вл етс  коммерчески доступной иммобилизованной изомеразой.

Этот фермент, Maxaz yme GI, иммобилизованный , парти  К-12467, вначале измельчают в ступке дл  уменьшени  размера частиц. Затем измельченный фермент пропускают сквозь стандартное сито 20 мешей, а ту часть5, котора , удерживаетс  ситом 60 мешей, суспендируют в субстратv и деаэрируют в услови х лабораторно го вакуума при 60°С в течение 60 ми Затем деаэрированную суспензию используют дл  приготовлени  сло  насадки 1,5к39 см в стекл нной колонке с рубашкой. Слой насадки содержи 5200 IGIU.

Субстрат, полученньй на первой стадии 70 С изомеризации, довод т до рН 6,5 и разбавл ют до содержани  сухой части 42,6%. Затем полученный субстрат прокачивают через колонку со скоростью потока 5 мл/ми при 60°С в течение 30 мин. Температуру внут.ри колонки контролируют термометром, расположенным непосредственно над слоем насадки и окруженным стекл нными шариками 0,5 MM диаметром дл  сведени  к минимуму мертвого объема, насколько это возможно. Затем температуру колонки быстро повьшают за счет циркул ции воды из термостатированной при 97,8°С бани через рубашку . Когда температура колонки достигает 97°С5 скорость потока субстрата снижают до 2,0 мл/мин. При этой скорости потока врем  контак-тировани  субстрата с иммобилизованным ферментом составл ет около 22 мин, а полное врем  пребывани  раствора внутри реактора при составл ет около 35 мин,

Поток, вытекак ций из колонки, контролируют записывающим пол риметром , откалибреванным на значени  уровн  фруктозы от 50 до 58%. Когда содержание фруктозы в вытекающем из колонки потоке достигает нужного уровн , зтот вытекающий поток собирают и охлаждают немедленно в лед ной бане о рН устанавливают 4,0, добавл   1 М лимонную кислоту. Вытекающий поток собирают до тех пор, пока содержание фруктозы не падает ниже 55%.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов при 70 и §7., анализируют на содержание углеводов-и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными дл  раствора неизомери- зованного субстрата, как показано в табл. 3.

Полученные результаты показывают , что уровень фруктозы 55,3% можно достичь, сохран   содержание пси- козы менее 0,4 мас.% в расчете на сухую массу.

Пример 4. Демонстрирует пр мую изомеризацию глюкозы при высокой температуре до получени  композиции, содержащей 55,8% фруктозы, при условии , что вторую стадию изомеризации провод т на иммобилизованной изомера- зе, полученной из вида .Arthrpbacter.

Штамм Arthrobacter citraus выращивают в услови х подводной аэробуой ферментации на среде следующего сос- тава, мас.%:

Ксилоза1,5

BHI (мозгова  питательна  среда). 4,2 Дрожжевой экстракт 0,1 Хлористьй натрий 0,2 Казеинова  аминокислота0 ,5 Сульфат магни 0.024 рН 6,9-7,2 Ферментацию провод т в асептичес- ких услови х при 30 С в течение

44 ч. Клеточную массу собирают центрифугированием промывают 0,85%-нь1м хлористым натрием и снова центрифугируют . При этом получают 76 г кле-

точной массы при полной активности изомеразы 10260 IGIU.

Глюкозоизомеразу экстрагируют из 45 г клеточной массы, суспендиру  клетки в 25 мл воды, содержащей 900 мг лизоцима куриного  йца и 250 мг сухих шариков поверхностно- активного ВТС-835 (Оникс Кемикал Ко), устанавлива  рН 7,0, инкубируют . 16 ч при 45°С„ Затем полученную суспензию центрифугируют и собирают надосадочную жидкость. Нераство- римьй .материал повторно суспендируют в 250 мл 0,1% Тритон Х-100

(Сигма Кемикал Ко), рН 7,0 и инкубируют в течение 8 ч при 45°С. Эту суспензию центрифугируют, и надосадочную жидкость объедин ют с жидко25

стью, полученной при первом центрифугировании .

Объединенные экстракты концентрируют и очищают ультрафильтрацией с Амикон 401  чейкой с перемешиванием , использу  мембрану УМ-30. Остаток дважды фильтруют с двум  5-кратными объемами 0,2 мм CoCl, 1 мМ MgSO раствором при рН 7,0. Конечньй остаток после ультрафильтрации содержит всего 3115 IGIU. Этот фермент используют дл  получени  иммобилизованной чзомеразы путем адсорбции на ДЕАЕ-целлюлозе по способу патента США 3788945. К раствору добавл ют всего 4,0 г Ватман ДЕ-23, рН устанавливают 7,0 и полученную суспензию перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре .

Полученный нерастворимый фермент собирают фильтрованием, про- мывают водой. Часть промытого иммобилизованного фермента суспендиру- ют в субстрате, деаэрируют при 60° в течение 60 мин и используют дл  приготовлени  сло  насадки 1,5 х13 см в высокотемпературном реакторе .

Субстрат дл  реактора приготавливают по способу примера 1 на первой стадии () изомеризации. Этот субстрат имеет следующий состав;

Полное содержание

сухого вещества, % 42,6

Глюкоза, % в расчете

на сухую массу46,9

Фруктоза, % в расчете

на сухую массу52,3

Полисахарид, % в расчете

на сухую массу0,8

Псикоза0,0

NaHSO,, мМ50,0

MgS04, мМ5,0

CcCl, J-iM0,1

рН6,7

Этот субстрат прокачивают через реактор, при 60°С в течение 30 мин со. скоростью потока 6 мл/мин. Зате температуру колонки быстро повышают до 97,8 С, скорость потока снижают до 2 мл/мин и вытекающий поток контролируют, как в предьздущем примере. Вытекающий поток собирают в лед ную баню и устанавливают рН 4,0 1 М лимонной кислотой.

10

15

20

25

2305626

Поток, вытекающий из реактора 97,, субстрат, полученный на первой стадии (70 с) изомеризации и исходный раствор-декстрозы, который используют в качестве субстрата дл  реактора, работающего при 70°С, анализируют на содержание углево- дов и окраску.

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Полученные результаты показывают , что можно получить 55,8% фрукто- зь при сохранении уровн  псикозы ниже 0,2%, а окраску ниже 6 (CIRFKlOO),

Пример 5. Демонстрирует применение двухстадийной системы изомеризации, в которой реактор второй стадии используют при температуре выше ЮО С дл  получени  продукта с содержанием фруктозы 55,5%.

Субстрат дл  реактора второй стадии получают в реакторе первой стадии точно так, как описано в примере 3, и рН устанавливают 6,6 Иммобилизованна  изомераза дл  реактора второй стадии представл ет собой изомеразу Maxazyme-. GI (иммобилизованна ), которую измельча- 3Q ют и просеивают, как описано в примере 3. Полученный фермент суспендируют в субстрате, деаэрируют при 60°( и используют дл  получени  1,5x40,5 см сло  насадки в высокотемпературном реакторе. Полна  активность изомеразы составл ет 5820.IGIU. Субстрат прокачивают через .реактор при скорости потока 6 мл/мин всего в течение 60 мин. Затем температуру колонки повышают до 102 С, скорость потока субстрата снижают .до 3 мл/мин.

Б этих услови х врем  контактировани  субстрата со слоем фермента составл ет около 16 мин, а полное врем  пр ебывани  при 102°С составл ет около 24 мин.

Поток, вытекающий из колонки, собирают и анализируют, как описано в примерах 3 и 4. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Получают продукт, который при сое- держании фруктозы 55,5%, содержит только 0,2% псикозы.

Пример 6. Демонстрирует непосредственную изомерацию глюкозо- содержащего раствора, состо щего преимущественно из очищенного гидро- лизата кукурузного крахмала, с полу35

40

50

55

чением композиции с содержанием 55,5 масД фруктозы в расчете на сухую массу, если используют двух- стадийный процесс изомеризации. Вначале провод т изомеризацию при низкой температуре (70°С) и продукт этой реакции используют в качестве сырь  во втором высокотемпературном реакторе (ЮЗ.) содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабилизированна  изомера- за  вл етс  изомераЗОЙ, в которой фермент ковалентно св зан с раство- римьм полимером, а затем превращен в нерастворимый дл  получени  иммобилизованного катализатора.

Гидролизат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в патенте ОМ № 3644126 (ожижение) и № 328000 (осаживание). Осахарен- ный сироп очищают по способу патента США № 3834940 до получени  продукта содержащего 95,3% глюкозы . в расчете па сухую массу. Добавл ют достаточное количество кристал- лической глюкозы дл  доведени  полного содержани  глюкозы до 97,6% в расчете на еухую массу. Полученный раствор- имее т следующий состав: Вещества сукого всего , % .50,2 Глюкоза, % в расчете на сухую массу 97,6 Фруктоза,, % в расчете на сухую массу0,0 Полисахариды., % в. расчете на сукую массу 2,4 Лейкоза, % в расчете на сухую массу 0,0 NaHSOj, 1 50,0 MgS04., мМ : 5,0 ,

CoClj, 1

0,1

рН6,8

Низкотемпературную изомеризацию провод т при 70 С, прокачива  раствор вьшеуказанного субстрата через низкотемпературньй реактор со скоро- стью потока 3,2 мл/Мин. Низкотемпературный реактор () изомеразы вьшолнен путем уплотнени  изоме- разы, иммобилизованной на ДЕАЕ- целлюлозе в стекл нную колонку диаметром 2,54 см, снабженную входным и выходным отверсти ми с рубашкой дл  циркул ции в оды., из термостата. В верхней части под насадкой имеетс  термометр, а остальное пространство заполн етс  стекл нными

шариками дл  снижени  мертвого пространства насколько это возможно. Реактор содержит достаточное количест- во изомеразы дл  обеспечени 

20000 IGIU и слой насадки имеет высоту около 15 см. Первые 1000 мл, поступающие из реактора, сливают. Вытекающую после этого жидкость собирают дл  использовани  на второй стадии высокотемпературной изомеризации .

Химически стабилизированный катализатор , который .используют в высо- 5 котемпературном реакторе, получают следующим образом.

Вид Streptomyces rubigenosus, по- лученньн из S. rubigenosus АТСС 21175, выращивают подводной аэробной фермен- Q тацией на среде следующего состава, мас.%:

Декстроза9,0

Сироп замоченной кукурузы (тверда  часть) - 1,6 5 Диаммонийфосфат0,08

Сульфат марганца 0,06 Антивспенивающий агент (Плуроник PL-61) 0,003

0 Указанную среду стерилизуют при 121°С в течение 45 мин, охлаждают и устанавливают рН 6,8-7,0. Среду ино- кулируют 14% (.мае./мае.) инокулюма, содержащего затравочный фермент, полученной из S. rubigenosus. Ферментацию в.едут в асептических услови х при 30°С в течение около 60 ч при аэрации 0,65 ллгт (процентное соотно- . шение объемов в минуту). Дл  иноку- Q лировани  и получени  изомеразы можно также использовать S. rubigenosus. АТСС 21175, но в этом случае исполь-. зуют среду следующего состава, мас.%: Декстроза0,24

Сироп .замоченной кукурузы (тверда  часть) },5 Сорбитол1,6

Хлорид кобальта. 0,02 Диаммонийфосфат 0,56 Ксилоза1 0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из S. rubigenosus, добавл   0,35% Maguat МС1412 (Мейсон Кемикал Ко.) и 10 ч. на млн лизоцима куриного  йца , и перемешива  в течение 5 ч при 40 С, рН 6,3-6,6, Затем полученную смесь фильтруют до получени  раствора сырой неочищенной глюкозо- изомеразы.

5

29

Неочищенную изомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе с пес™ ледутщей фильтрацией и промывкой адсорбированного продукта 0,1 М раствором NaCl дл  удалени  примесей, а затем десорбируют изомеразу, подверга  ее контактированию с 0,45 М раствором NaCl. рН всех растворов поддерживают 7,5 на всех стади х очистки. Раствор частично очищенной изомеразы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами 95%-ного этанола при О С дл  осаждени  изомеразы.

Твердую часть вьще.л ют фильтрование и сушат воздухом до получени  растворимого препарата изомеразы, содер жащего 2500 IGIU/r.

Очищенную изомеразу раствор ют в 1 мМ MnGl до получени  раствора, содержащего 10 мг изомеразы на 1 мл при комнатной температуре и полученную смесь фильтруют дл  удалени  фильтра.

Удельна  активность этого препарата составл ет 37,3 lGIU/мг протеина . .

Раствор растворимого полиаминно- го полимера получают, -раствор   39,0 г хитозана в 13 л 0,08 н. НС1. После растворени  раствор хитозана довод т до 0,5 М в KaCl, добавл   380 г NaCi, и рН полученного раствора устанавливают 6,15 8 н. NaOH. . Хит03ановый раствор фильтруют.че-. рез, фильт.р бумаги Батман 3 дл  удалени  нерастворимого материала. К 13 л 0,3%. хитозана в 0,5 К NaCl при рН 6,1;5 добавл ют 200 мл растворимой изомеразь, содержащей 100000 IGIU активности, 197,6 г . ксилитола и 0,619 г CoClg -611,0. Полученный раствор перемешивают в тчение 2 ч, после чего 6,24 г 1-этил 3-диаметиламинопропилкарбодиимида добавл ют дл  ковалёнтного св зывани  во множестве точек карбоксильных групп изомеразы с аминогруппами хитозана. Спуст  2 ч при комнатной температуре 15,6 мл 50%-ного тлута- ральдегидного раствора устанавливают . рН 6,0 с помощью З н. NaOH и добавл ют в реакцию дл  придани  нерастворимости ковалентносв занном комплексу изомераза-хитозан. Спуст  15 мин 2 л 1 М фосфатного раствора при рН 8,0 добавл ют дл  облегчени  разделени  гел  после того, как он образовалс , при добавлении глутар

2305630

альдегида. Полученный нерастворимый изомераза-хитозан промьшают деиони- зированной водой на вакуумном фильтре Бюхнера. Полученньш препарат далее сушат на воздухе в течение ночи при комнатной температуре, затем .измельчают и просеивают сквозь сито 12-60 мешей. Сухой катализатор облаJQ дает выраженной активностью 384 IGIU/r,

Порцию катализатора (13 г) суспендируют в субстрате и деаэрир тот в услови х лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин.

1Ц Суспензию, в которой удален воздух, используют дл  подготовки сло  1,5 IS 20 см насадки в стекл нной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит .4992 IGIU,

Субстратj полученный иа первой стадии при 70 С изомеризации, довод т до рН -6,5, и разбавл ют до содержани  сухого вещества 42,0%. Затем этот субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного ре20

25

актора под давлением при скорости потока 1,96 мл/мин при в тече

ние 30 мин Температуру в колонке контролируют тepмoмeтpo, располо- женньм- непосредственно над слоем и окруженным 0,5 см сТ-екл нными шариками дл  минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Затем темпе- .ратуру колонки быстро повышают за счёт циркулирующего через рубашку масла из термостатированной при Юб С бани.

Вытекающий из колонки поток контролируют на пол риметре, откалибро- ва-нном на значении от 50 до 58% фруктозы . После того, как температура в колонке достигает 105,2°С, и когда содержание фрук тозы в вытекающем потоке достигнет нужного уровн , вытекающий поток отбирают и немедленно охлаждают в лед ной бане. рН устанавливают 4,9, добавл   М .лимонную кислоту. Вытекающий поток собирают до тех пор, пока относительный уровень фруктозы не падает ниже 55%.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов 70 и 05,2°С, -анализируют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналопиными данными дл  неизомеризованного раствора субстрата (табл. 6),

Полученные результаты показывают , что 55,5% фруктозы достигают

31

при содержании псикозы менее

0,5 мас,% в расчете на сухую массу,

а окраска менее 20 (CIRFxlOQ).

П р и и е р 7. Демонстрирует пр мую изомеризацию раствора, содер- жашего глюкозу (состо щего из очищенного гидролизата кукурузного крахмала плюс кристаллическа  глюкоза), при высоких температурах дл  достижени  состава, содержащего 55,2% фруктозы в расчете на сухую массу, в случае, когда используют двухста- дифную изомеризацию, причем на второй стадии используют химически стабилизированную изомеразу, состо щую из -глюкозоизомеразы, закомплексованной с полиэтиленимином, причем этот комплекс превращен в нерастворимый за счет обработки глутаральдегидом.

Получение стабилизированной изо- меразы.

Растворима  глюкозоизомераза была получена, как описано в примере Г. Очищенную изомеразу раствор ют в . 1 мМ MnClg до. получени  раствора, содержащего 9 мг изомеразы на 1 мл, при комнатной температуре и полученную смесь отфильтровывают дл  удалеии  фильтра, 60 мл 10% мае./объем (PEI-6). полизтиленимИн MB 600, рН 8, и-3 г ксилитола добавл ют к 300 мл раствора фермента, полученный раствор перемешивают в течение 15 мин, 10 мл 2,5 М глутаральдегида добавл ют., и полученную смесь пе-ре- мешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворимый фермент вьщел ют фильтрованием, промывают водой и сушат в течение ночи при 37°С, 1258 г иммобилизованной изомеразы , содержащей около 775 IGIU/r, вьщел ют после сушки, 12 г иммобилизованного фермента суспендируют в субстрате, деаэрированном в вакууме в течение 60 мин при комнатной температуре и используют в высокотемпературном реакторе с диаметром 1,5 см,

Субстрат дл  этого реактора получают на первой из двух стадий изомеризации , как описано в примере 1. Состав субстрата следующий;

Полное содержание

сухого вещества, % 42,6

Глюкоза, % в расчете

на сухую массу46,4

Фруктоза, % в расчете

на сухую массу51 ,.3

-

32

Полисахарид, % в расчете на сухую массу 2,3 Псикоза, % в расчете на сухую массу0,0 NaHSOj, мМО , мМ .50 CoCl,, мМ0,1 рН6,75

10

15

20

30

Субстрат прокачивают через реактор при 60 С в течение 45 мин со скоростью около 5 мл/мин. Затем температуру колонки повыщают до 101,6°С, а скорость потока снижают до

2мл/мин. Вытекающую жидкость контролируют записьшающим пол риметром, откалиброванным на значени  от 50 до 58% фруктозы. Вытекающий поток,

3котором содержание фруктозы пре- выщавт 55%,собирают в лед ную баню и устанавливают рН 4,0 с помощью 1,0 М лимонной кислоты,

, Поток, поступающий из высокотем- пературного реактора, субстрат из 25 реактора первой стадии и исходный содержащий глюкозу раствор, который используют в качестве субстрата дл  первой стадии реактора, проанализировали на содержание углеводов в композиции и на окраску. Полученные результаты приведены в табл, 7,

Полученные результаты.показывают , что достигают уровн , фруктозы 55,2%, поддержива  уровень псикозы ниже 0,2 мас.% в расчете на сухую массу.

Пример 8, Демонстрирует пр мую изомеризацию глюкозы до 57,2% фруктозы путем двухстадийной изомеризации , в которой первый реактор работает при 70°С, а второй (высокотемпературный ) реактор функционирует при IIО,4°С. Химически стабилизированна  изомераза, которздо используют в высокотемпературной реакции,  вл етс  изомеразой, в которой фермент ковалентно св зан с растворимым полимером, а затем полимер превращен в нерастворимый дл  получени  иммобилизованного катализатора.

Субстрат и его конверси  в реакторе первой стадии при 70 С бьти описаны в примере 1,

№.мобилизованный катализатор, ко- торьй используют в высокотемпературном реакторе при 110,4 С, также бып описан в примере 1,

Реактор на 110,4 С подготавливают следующим образом. Порцию ката35

40

45

50

55

33

лизатора 28,4 г суспендируют в субстрате и деаэрируют в услови х лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин. Деаэрированную суспензию используют дл  получени  сло  насадки 2,5 Д12,4 см в стекл нной колонке с рубашкой . Слой насадки содержит 10,885 IGIU.

Субстрат, полученный на первой стадии (70°С) изомеризации, довод т до рН 6,47 и разбавл ют до 42,0% сухого вещества. Затем полученный субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением и при скорости потока 3,38 мл/мин при температуре 60°С в течение 30 мин. Температуру -в колонке контролируют с пом.ощью термометра , расположенного непосредст- венно над слоем и окруженного 0,3 с стекл нными шариками дл  минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Затем температуру колонки быстро повьшают за счет циркул ции через рубашку масла из термостатиру емой при бани.

Поток, вытекак.гаий из колонки, контролируют с помощью записьшающе- го пол риметра, откалиброванного на значени  уровн  фруктозы от 50 до 58%. После того, как температура, ко лонки достигает ПО,4°С и когда содержание фруктозы в вытекающем потоке достигает нужного уровн , вытекающий продукт собирают и немедленно охлаждают на лед ной бане. Значение рН устанавливают 4,0, до- бавл   1 М лимонную кислоту.

йзоме-ризованные растворы, полу- ченные из реакторов 70 и ПО,, анализируют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнивает с результатами анализов, проведенных дл  раствора неизомёри- зованного субстрата (табл. 8). . Полученные результаты показывают , что 57,2% фруктозы достигают пр содержании псйкозы ниже 0,4 мас,% в расчете на сухую .массу, а окраска (CIRFxIOO). ниже 20. Пример 9. Демонстрирует пр мук, из.омеризацию содержащего глюкозу раствора, содержащего очищенный гвдролизат кукурузного крахмала дл  получени  композиции 56,3% фруктозы в расчете на сухзпо массу, если используют двухстадийный процесс изо2305634

меризации. Вначале провод т низкотемпературную изомеризацию при 70 С, продукт, полученньй на этой стадии, используют в качестве сырь  на второй высокотемпературной стадии в реакторе с температурой 103,3 С, .содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабили Q зированна  изомерава представл ет собой изомеразу, в которой фермент подвергнут совместной реакции с за- щитньш протеином (таким, какой получают из дрожжей).

15 Низкотемпературна  стади  изомеризации ,, включа  описание субстрата и экспериментальные услови , представлена в пршчере 1.

Химически стабилизированный фероп мент глюкозоизомераза, использо.ван- ный в высокотемпературном реакторе, получают следующим образом. Растворимую глюкозоизомеразу дл  химической стабилизации получают и очйша25 ют по способу, описанном в приме- ре 1. Удельна  активность этого препарата составл ет около 40 IGIU/мг протеина. Защитный протеин -получают из пекарскюс дроз(жей следующим обра0

5

зоМо к 1229 г элажных пекарских дрожт жей добавл ют 1000 г воды и 500 г толуола. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение около 30 мин. Полученную смесь фильтруют на воронке Бгохнера. Почти

весь толуол остаетс  с нераствори- мьми осколками клеток, тогда как водный экстракт содержит растворимый экстракт дрожжей. Водный фильтрат упариваюх до объема 276 г (роторный испаритель, 40°С), затем при перемешивании добавл ют 4 г трифторуксус- ной кислоты. Осажденный дрожжевой протеин собирают, затем повторно раствор ют в О,I М натрийфосфатном

буфере (рН 7,0). После осветлени  фильтрованием полученный раствор обрабатывают 900 мл (около -3 объемов ) ацетона. Осадок собирают, раствор ют в 0,0} М натрийфосфатном буфере (рН 7,0), а оставшийс  раствор диализуют против 0,01 М натрийфос- фатного буфера. Полученньтй продукт (150 мл) считают защитным протеином, полученным из пекарских дрожжей.

° 0,6%-ный раствор хитозана получают, раствор   24 г хитозана в 4 л 0,08 н. НС1. рН раствора устанавливают 6,2 8 н. NaOH, фильтруют че35

рез фильтровапьн5то бумагу Ba-Ji MaH 3, провод т диализ против & л деионизированной водыс В химический стакан объемом 400 мл помещают около 100000 IGIU растворимой глюкозоизо- меразы-фермента (в смеси с фильтром), 1 г ксилитола и 100 мл (2/3) защищенного протеина, полученного из пекарских дрожжей. К этой смеси добавл ют 2., 4 мг MgS04 и 24 мкл мол рного раствора хлористого кобальта . Полученную смесь фильт.руют дл  удалени  фильтра, а затем раствор концентрируют (роторный испаритель, ) почти досуха в двухлитровой круглодонной колбе. Затем в эту колбу- добавл ют 800 мл хитозана (рН 6,2). Полученн ую смесь, концентрируют почти досуха и добавл ют 640 мкл 50%-ного раствора глутар- альдегида(рН устанавливают 6,5). Полученную смесь хран т в холодной йомнате в течение ночи. Затем гель удал ют из колбы и продавливают сквозь сито 30 мешей,. сушат в су- шильн ом шкафу примерно при 37°С, Высушенный прецарат фермента npoce- ивают дл  удалени  мелких частиц, а затем используют (8,9 т конеч-ного продукта) дл  изомеризации в высоко- . температурном реакторе.

. Реактор дл  работы при 103,3 С подготавливают следующим образом. Полученную ранее глгбкозоизомеразу (8j9 г) суспендируют в субстрате и деаэрируют в услови х лабораторного вакутма при комнатной темпера- .. туре в течение около 30 мин. Деаэрированную суспензию используют дл  риготовлени  сло  насадки 1,5 х и29 см в стекл нной колонке с рубашкой . Субстрат, полученньй на первой стадии изомерации при , довод т до рН 6,75 и разбавл ют до содержа- ни  42,6% сухого Вещества, Затем полученный субстрат прокачивают через высокотемпературную колонку со скоростью потока около 1,5 мл/мин-при температуре 600°G в течение 30 мин. Температуру внутри колонки констро- лируют термометром, расположенным непосредственно над слоем и окруенным стекл нными шариками (0,5 см диаметром) дл  минимизации мертвого объема. Температуру колонки резко повьш1ают за счет циркул ции через рубашку колонки масла из термоста- тирова-нной при 104 С рубашки.

15

, .

23056 ,36

Поток, вытекающий из колонки, контролируют с помощью записьюающего пол риметра, откалиброванного на . значени  от 50 до 58% фруктозы.

Собирают фракции по 5 мл до тех пор, пока не полз чают значени  содержани  фруктозы 55% или выше, после чего эксперимент заканчивают. Воврем  1Q. отбора образцов полученный на выходе продукт немедленно охлаждают в лед ной бане, и рН устанавливают примерно 4,0, добавл   1 М раствор лимонной кислоты (о, мл), затем разбав- 15 ленную НС1.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов 70 и 103,3°С, анализируют на содержание углеводов и окраскуо Полученные результаты 2Q сравнивают с аналогичными данными дл  неизомеризованного раствора субстрата (табл. 9).

Полученные результаты показыва5

0

5

0

5

0

5

ют, что достигают уровн  56,3% фруктозы при содержании псикозы менее 0,2 мас.% в расчете на сухую массу.

Пример 10. Демонстрирует непосредственную изомеризацию рйст- вора, содержащего глюкозу, которьй состоит .из очищенного гидролизата кукурузного крахмала с небольшой концентрацией соли, дл  достижени  композиции 55,4% фруктозы в расчете на сухую массу при использовании . процесса двухстадийной изомеризации. Вначале провод т низкотемпературную изомеризацию при 70°С, полученный продукт используют в качестве сырь  во втором высокотемпературном (112,6°С) реакторе, содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабилизированна  изоме- раза представл ет собой изомеразу, в которой фермент ковалентно св зан с растворимым полимером во множестве точек, а затем продукт превращён в нерастворимый дл  получени  иммо- билизо.ванного катализатора.

Гидролизат получают из кукурузно-. го крахмала по способу, описанному в патенте-США IJ 3644126 (ожижение) и патенте США N« 3280006 (осахаривание). Сироп очищают по способу патента CDIA Р 3834940 дл  получени  продукта , содержапшго 93,8% глюкозы в расчете на сухую массу. Добавл ют достаточное количество кристаллической глюкозы дл  доведени  полного содержани  глюкозы 96J9% в расчете на

ухую массу. Полученный раствор имеет

ледующий состав:

Всего сухого вещает- i ва, %50j3

Глюкоза, % в расчете . на сухую массу 96,9 Фруктоза, % в расчете на сухую массу0,1.

Полисахариды, % в расчете на сухую массу 3,1 Псикоза, % в расчете на сухую массу..,

NaHSOj, мМ MgSO, мМ CoCl;,, мМ

рн

2

0,0 2,5 2,5 ОИ 6,0

Низкотемпературную изомеризацию i провод т при 70 С, прокачива  вышеуказанный раствор субстрата через низкотемпературный реактор, который описан в примере 1, со скоростью 2,5 мл/мин. Первые 1000 мл, поступающие из реактора, сливают. После этого поступающий из реактора про- . дукт используют на второй стадии высокотемпературной стадии изомеризации .

Хим.ически стабилизированный катализатор , используемый в высокотемпературном реакторе, приготавливают следующим образом. Растворимую глю- козоизомеразу подготавливают и очищают по способу примера 1. Удельна  активность этого препарата составл ет около 40 1СГи/мг протеина. Раствор растворимого полимера, полиамин получают, раствор   48,4 г хитозана в 15 л 0,08 н. НС1. После растворени  хитозановый раствор довод т до 0,5 М в NaCl, добавл   438 г NaCl, и рН полученного раствора устанавливают 6,1 с помощью 3 Но NaOH. Затем хитозановьй раствор фильтруют через бумажный фильтр Ватман 3 дл  удалени  нерастворимого материала.

К 15 л 0,3% хитозана в 0,5 М NaCl при рН 6,1 добавл ют 520 мл растворимой изомеразы, содержащей около 602000 IGIU активности, 236 г кси- литола и 3,07 г . Этот раствор перемешивают в течение 2 ч, после чего 7,44 г 1-этил-З-д-иметил- аминопропилкарбодиимида добавл ют дл  ковалентного св зывани  во множестве точек карбоксильных групп изомеразы с аминогрупами хитозана. Через 2 ч при комнатной температуре в реакционную среду добавл ют 15,5 м

50% (мае./мае.) раствора глутар- альдегида с установленным значением рН 6,0 .с помощью 8 н. NaOH, дл  реакции, в результате которой кова- лентный изомераза-хитозан комплекс становитс  нерастворимым. Спуст  15 мин 4 л 1 М фосфатного раствора при рН 8,0 .смещивают с нерастворимым продуктом изомераза-хитозан. . . Иммобилизованную изомеразу-хитозан промьгоают деионизированной водой на бюхнеровском вакуумном фильтре с фильтровальнон бумагой Батман 3.

5 Полученный продукт сушат на воздухе, измельчают и просеивают сквозь сито в интервале 12-60 мешей. Сухой катализатор обладает выраженной активностью 803,IGIU/r.

Q Реактор на 112,6 С подготавливают следующим образом. Порщло катализатора (7,0 г) суспендируют в субстрате и деаэрируют в услови х лабораторного вакуума при комнатной

5 температуре в течение 60 мин. Деаэрированную взвесь используют дл  получени  сло  насадки 1, см в стекл нной колонке с рубашкой. Слой васадкк содержит 5621 IGIU.

рН сз бстрата, полученного на первой стадии изомеризации при 70 С, устанавливают 6,55 и субстрат разбавл ют деионизированной водой до содержани  42,0% сухого вещества, что также снижает концентрацию соли до 2,1 мМ дл  NaHSOj и 2,1 мМ дл  MgSO.

Затем полученный субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением в течение 10 мин со скоростью потока 8 МЛ/НИН при 60°С. Температуру в колонке контролируют с помощью термометра , расположенного непосредственно над слоем и окруженного песком вплоть до температурной шкалы дл  минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Температуру колонки резко повышают за счет циркул ции масла из термостатированной при 112,6°С бани, скорость потока снижают до 1,-89 мл/мин.

Вытекающий из колонки поток контролируют с помощью записывающего пол риметра, откалибро анного на значени  от 50 до 58% фруктозы. После того, как температура в колонке достигает 112,6 С, а содержание фруктозы в вытекающем потоке достигает

0

5

0

5

0

5

3915

нужного уровн , вытекающий поток собирают . рН немедленно устанавливают 4,0, добавл   1 М лимонную кислоту . Вытекающий поток Собирают до тех пор, пока уровень фруктозы не падает ниже 55%

Изомеризованные растворы, полученные при 70 и 112,, анализируют на содержанке углеводов и окраску , полученные, результаты сравнивают , с аналогичными результатами, полученными дл  раствора неизомеризо- ванного йубстрата (табл. 10).

Полученные результаты, показьюа- ют, что 55,4% фруктозы можно достичь при сохранении уровн  псикозы ниже 0,2 мас.% в ра;счете на сухую массу при окраске менее 9. (CIEFrlOO).

Пример И, Демонстрирует непосредственную изомеризацию глю- козосодержащего раствора, состо щего главным образом, из очищенного гидро лизата кукурузного крахмала с низким содержанием солей дл  достижени  композиции с 34,8% фруктозы в расчете на сухую массу при чрезвычайно ,/ низком содержании псикозы (менее 0,1%) и окраске менее 2(CIRF)t 100),; при использовании двухс тадийного процесса. Первый.(низкотемператур- ньй) реактор функционирует при 70 С, а второй (высокотемпературньй) реактор - при 105, Химически стабилизированна  изомераза, которую используют в высокотемпературном реакторе, представл ет собой изо- меразу, в которой ферме.нт ковалентно св зан с растворимым полимером во множестве тоЧек, а затем этот продукт превращен в нерастворимый дл  получени  иммобилизованного катализатора . .

Субстрат и его превращение в реакторе на первой стадии при 70 С описаны в примере 5.

Иммобилизованный катализатор, который используют в высокотемпературном реакторе при 105,, такой, как описан в примере 5.

Реактор на 105,8°С подготавливают следующим образом. Порцию катализатора 5,63 г суспендируют в субстрате и деаэрируют в услови х лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин. Деаэрированную взвесь используют дл  получени  1,01(32 см сло  насадки в

0

5

056

0

5

0

5

0

5

40

стекл нной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит 452 IGIU. и .

Субстрат, полученный на первой стадии при изомеризации, довод т до рН-6,5 и разбавл ют деиони- зированной водой до достижени  42,0% сухого вещества, что, в свою очередь, снижает концентрацию сода до 2у.мМ дл  MgSOj и 2,1 мМ дл  ; HaHSO. Затем такой субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением со скоростью потока 8 мл/мин, в течение 10 мин при 60°С. Температуру внут- . ри колонки контролируют термометром,; расположенным непосредственно над слоем насадки и окруженным песком до начала тег-шературной шкалы дл  минимизации, насколько это возможно, мертвого объема. Затем температуру колонки резко повьппают за счет циркул ции через рубашку масла из термостатированной при около 107 с бани,

Поток, вытекающий из колонки, кбнтролируют с помощью записывающего/ пол ригчетра, откалиброванного в интервале значений от 50 до 58% фрук-/ тозы. После того, как температура колонки достигает 105,8 с и когда содержание фруктозы в выход щем потоке достигает нужного уровн , этот вытекающий поток собирают. Его рН немедленно устанавливают 4,9, добавл   1 М лимонную кислоту.

Изомеризованньй раствор из реакторов функционирующих при 70 и 105,, анализируют на состав углеводородов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными дл  раствора неизомеризованного субстрата (табл. 1Л)..

Полученнь е результаты показьша- ют, что можно достичь содержани  фруктозы 5458%, сохран   уровень псикбзы менее 0,1% в расчете на сухую массу, а окраску менее 2 (CIRFJflOO).

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   К Способ изомеризации глюкозы во фруктозу, включающий контактирование исходного раствора с содержанием 40 - 50 мас.% глюкозы с., термически стабильной глюкозоизоме- разой при рН 6,0-7,0 и последующее охлаждение изомеризованного раство41

   pa, отличающийс  тем, что, с целью уменьшени  образовани  псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышени  содержани  фруктозы в растворе, контактирование исходного глюксаосодержаще- го раствора с термически стабилизированной глюкозоизомеразой провод т

   -

   1523056. при 90-115°С и 10-25 мин до превращени  по крайней мере 54-58% глюкозы во фруктозу.

   2, Способ по п. 1,отлича- ю щ и и с   тем, что используют химически стабилизированную глюкозо- изомерйзу,

   Т а б л и ц а 1

   43

   152305644

   Таблица 4

   Обработка раствора } Состав углеводов, мас,%, в расчете

   на беззольную сухую массу

   Фрук- I Глю Пси- Поли- Окраска трза I коза коза саха- (CIKFxlQO)

   РИД

   Неизомеризованный О 99,2 О 0,8 0,6

   Изомеризованный

   при ,3 46,9 О 0,8 0,7

   Изомеризованный

   прн 97,8 С 55,8 43,8 0,2 0,2 5,7

   Таблица 5

   Обработка раствора j Состав углеводов, мас.%, в расчете

   на беззольную сухую массу

   Фрук- I Глю- Пси- Поли- Окраска тоза Гкоза коза саха- (CIRFiflOO)

   РИД

   Неизомеризованный О 97,6 О 2,4 0,5

   Изомеризованный

   при 70 С51,3 . 46,4 О 2,3 0,7

   Изомеризованный

   при 102°С55,5 42,0 0,2 . 2,343,6

   Таблицаб

   Обработка раствора } Состав углеводов, мас.%, в расчете

   на беззольную сухую массу

   Фрук- Глю- I Пси- Поли- Окраска тоза I коза | коза | саха- (CIRFiflOO)

   РИД

   О 97,6 О 2,4 51,3 . 46,4 О 2,3 55,5 41,6 0,3 2,6

   0,5 0,7 14,1

   47

   О96,9 О3,1

   51,4 45,9 О2,7

   55,4 42,0/ 0,1 2,5

   152305648

   Таблица 10

   О О 8,5

   Таблица 11