NL8006221A

NL8006221A - Werkwijze voor het isomeriseren van glucose tot fructose.

Info

Publication number: NL8006221A
Application number: NL8006221A
Authority: NL
Original assignee: Standard Brands Inc
Priority date: 1979-11-15
Filing date: 1980-11-13
Publication date: 1981-06-16
Also published as: ES496887A0; FR2470798B1; IT1134284B; BE886199A; SU1179933A3; JPS6328598B2; JPS56501630A; DE3043380C2; IN151063B; GB2064542A; WO1981001418A1; CA1156951A; AR221786A1; GB2064542B; ES8202587A1; US4288548A; MX6672E; FR2470798A1; IT8025995A0; DE3043380A1

Description

LS 3592-22 P & C

Werkwijze voor het isomeriseren van glucose tot fructose.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het isomeriseren van glucose in een glucose bevattende vloeistof tot fructose. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het behandelen van een glucose bevattende vloeistof met een ionen-uitwisselend mate-5 riaal, waarna de behandelde vloeistof in contact wordt gebracht met geïmmobiliseerd glucose-isomerase om een deel van de glucose in fructose om te zetten.

De toepassing van enzymen uit microben en fungi, welke enzymen geadsorbeerd of gebonden zijn aan inerte dragers, ter verschaffing van ge-10 immobiliseerde biologische katalysatoren heeft grotendeels oudere methoden verdrongen waarbij oplosbare enzymen of gehele cellen van micro-organismen toegepast werden. In het algemeen verschaffen geïmmobiliseerde enzymen een aantal belangrijke voordelen boven oplosbare of aan cellen gebonden enzymen, in het bijzonder in commerciële systemen voor het uitvoeren van continue 15 omzettingen. Wegens de economie van deze systemen is het van het grootste belang dat de enzymen niet in belangrijke mate gedesactiveerd of gedenatureerd worden door het proces dat wordt toegepast om immobilisatie tot stand te brengen. Het is even belangrijk dat de omstandigheden waaronder de geïmmobiliseerde enzymen toegepast worden, zodanig zijn dat de stabiliteit 2Ό de enzymen gehandhaafd wordt over een tijdsduur die voldoende is om omzetting van grote hoeveelheden substraat mogelijk te maken. Zo kan bijvoorbeeld de aanwezigheid in het substraat van materialen die op de een of andere wijze glucose-isomerase storen of desactiveren, een nadelig effect hebben op de stabiliteit van het geïmmobiliseerde enzym en zijn werkzame 25 levensduur in belangrijke mate bekorten.

In het algemeen worden glucose-houdende vloeistoffen vóór de isomeri-satie gezuiverd volgens gebruikelijke methoden, bijvoorbeeld door de vloeistoffen te behandelen met koolstof en ionen-uitwisselende harsen ter verwijdering van storende materialen en als nevenprodukten gevormde koolhydra-30 ten die glucose-isomerase in een oneconomisch korte tijd zouden kunnen desactiveren of denatureren. Gebleken is echter dat ofschoon deze behandelingen enige verlenging van de werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase verschaffen, de stabiliteit van het enzym niet zo groot is als bij continue werkwijzen voor het isomeriseren van glucose tot fructose ge-35 wenst is.

Het Amerikaanse Reissue-octrooischrift 28.885 heeft betrekking op een enzymatische methode voor het isomeriseren van glucosestropen onder toepassing van oplosbaar glucose-isomerase of celmateriaal dat dit enzym bevat.

80 06 22 1 - 2 -

Dit Amerikaanse Reissue-octrooischrift vermeldt het opnemen van een bron van SO2 in glucose bevattende vloeistoffen tijdens de isomerisatie ter vermindering van de denaturering van het glucose-isomerase en om ongewenste kleurvorming in het gerede produkt tegen te gaan. In dit Amerikaanse 5 Reissue-octrooischrift wordt vermeld dat het de voorkeur verdient oplosbare zouten van zwaveligzuur in de glucose bevattende oplossing te verschaffen voordat de isomerisatie op gang wordt gebracht ten einde de volledige voordelen van hun aanwezigheid te verkrijgen. Ook beschrijft het Amerikaanse Reissue-octrooischrift 28.885 dat werkzame hoeveelheden SO^ 10 voor het tegengaan van ongewenste kleurvorming in het gerede produkt kunnen worden verschaft door de vloeistof door ionen-uitwisselende harsen in de sulfietvorm te voeren.

Het Duitse octrooischrift 2.160.919 beschrijft een werkwijze voor het scheiden van een mengsel van koolhydraten door het mengsel te behandelen 15 met een anionen-uitwisselende hars in de sulfiet- of bisulfietvorm.

In een artikel van Anet in Adv. Carbohydrate Chem., Vol. 19, blz. 212-213 (1964) wordt vermeld dat het tegengaan van niet-enzymatisch bruin worden van voedingsmaterialen door sulfiet ten dele afhangt van het "vangen" van verschillende reactieve tussenprodukten en hun omzetting in carbonyl-20 bisulfietadducten van sulfonzuren.

In "Die Starke", 26 Jahrg., 1976/Nr. 10, blz. 350-356 (Oestergaard c.s.) wordt aanbevolen om glucose bevattende substraten te filtreren en te behandelen met koolstof en ionen-uitwisselende materialen alvorens continue isomerisaties met glucose-isomerase uit te voeren, ter verwijdering van 25 verontreinigingen die de activiteit van het enzym nadelig kunnen beïnvloeden. Verder wordt in dit artikel vermeld dat een bescherming verschaft kan worden tegen mogelijk schadelijke enzymverontreinigingen in de stroop, die kennelijk tijdens de isomerisatie worden gevormd, door toepassing van een bepaalde reeks kolommen die het geïmmobiliseerde glucose-isomerase bevatten.

30 De uitvinding verschaft een werkwijze voor het behandelen van een glucosehoudend substraat, waardoor de stabiliteit of werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase, dat wordt toegepast om een deel van de glucose in fructose om te zetten, verlengd wordt.

Tevens verschaft de uitvinding een werkwijze voor het behandelen van 35 een glucosehoudend substraat met ionen-uitwisselend materiaal in de bisulfiet/ sulfietvorm, waardoor de stabiliteit of werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase, dat wordt toegepast om een deel van de glucose in fructose om te zetten, verlengd wordt.

Ook verschaft de uitvinding een werkwijze voor het behandelen van een 8006221

* -V

- 3 - glucosehoudend substraat met anionen-uitwisselende hars in de bisulfiet/ sulfietvorm, waardoor de stabiliteit of werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase, dat toegepast wordt om een deel van de glucose in fructose om te zetten, verlengd wordt.

5 Deze en andere aspecten blijken uit de onderstaande beschrijving.

Volgens de uitvinding wordt een glucose bevattende vloeistof behandeld met ionen-uitwisselend materiaal in de bisulfiet/sulfietvorm, waarna de behandelde vloeistof in contact wordt gebracht met geïmmobiliseerd glucose-isomerase om een deel van het glucose in de vloeistof om te zetten 10 in fructose.

Glucose bevattende vloeistoffen worden gewoonlijk bereid door zetmeel volgens een van de drie onderstaande methoden de behandelen. Volgens de eerste methode gebruikt men een zuur bij betrekkelijk hoge temperaturen om het zetmeel te hydrolyseren. Bij de tweede methode wordt eerst zetmeel 15 vloeibaar gemaakt door een behandeling met zuur, waarna versuikering langs enzymatische weg plaatsvindt; volgens de derde methode vindt zowel vloeibaar maken als versuikering langs enzymatische weg plaats. De zuur-enzym-methode en de enzym-enzymmethode worden in de industrie zeer veel toegepast.

20 De stabiliteit of werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glucose- isomerase wordt waarschijnlijk in zeer sterke mate beïnvloed door de kwaliteit van het substraat. De kwaliteit van glucose bevattende vloeistoffen, die op industriële schaal bij het vochtig malen van mais verkregen worden, kan sterk variëren. In het algemeen worden deze vloeistoffen vóór de iso-25 merisatie gezuiverd volgens gebruikelijke methoden, en verder wordt in het Amerikaanse Reissue-octrooischrift 28.885 vermeld dat de aanwezigheid van geringe hoeveelheden SO^ in glucose bevattende vloeistoffen tijdens de isomerisatie de denaturering van oplosbaar of intracellulair glucose-isomerase vermindert en tevens kleurvorming in de gerede stroop tegengaat.

30 Ofschoon de bekende werkwijzen in zekere mate van voordeel zijn, zijn tot nu toe continue isomerisatieprocessen onder toepassing van geïmmobiliseerd glucose-isomerase niet zo doelmatig gebleken als gewenst is ten gevolge van het feit dat het enzym na een betrekkelijk korte gebruiksduur gedesactiveerd wordt.

35 Gevonden werd nu dat wanneer glucose bevattende vloeistoffen, die op gebruikelijke wijze behandeld zijn met koolstof en ionen-uitwisselend materiaal, in contact worden gebracht met een ionen-uitwisselend materiaal in de bisulfiet/sulfietvorm en de aan de contactbehandeling onderworpen vloeistoffen vervolgens geisomeriseerd worden met geïmmobiliseerd glucose- - 4 - isomerase, de stabiliteit of werkzame levensduur van het geïmmobiliseerde enzym aanzienlijk verlengd wordt ten opzichte van de bekende methoden. Deze ontdekking is verrassend gezien het feit dat de concentratie van SO^ in de met hars in contact gebrachte vloeistoffen soortgelijk is aan de concentra-5 tie die volgens de stand van de techniek werkzaam is voor wat betreft het verminderen van de denaturering van oplosbaar of intracellulair glucose-isomerase. Met andere woorden, de verbetering in de stabiliteit van het enzym wordt niet veroorzaakt door uitlogen of verplaatsing van oplosbaar bisulfiet/sulfiet uit het harsbed in de vloeistof.

10 Volgens de uitvinding kunnen een aantal typen ionen-uitwisselende ma terialen gebruikt worden; het enige vereiste is dat deze materialen kunnen worden omgezet in de bisulfiet/sulfietvorm. Voorbeelden van deze materialen zijn anionen-uitwisselend cellulose en Sephadex en anionen-uitwisselende harsen. Harsen verdienen de voorkeur daar men ze eenvoudig in een of meer 15 kolommen kan brengen en de glucose-oplossing hierdoor continu kan voeren. Bovendien kunnen ze betrekkelijk gemakkelijk geregenereerd worden. De bij voorkeur toegepaste harsen zijn van het zwak basische en het sterk basische type. Voorbeelden van sterk basische harsen zijn Dowex 1, 2 en 21K (Dow); Duolite A-101D en A-102 (Diamond Shamrock); Ionac A-535 en A-540 (Ionac) 20 en Amberlite IRA-900 (Rohm & Haas). Geschikte zwak basische harsen zijn bijvoorbeeld Duolite A-6, A-7, A-30B en ES-561 (Diamond Shamrock) en Ionac A-300 (Ionac).

De bij voorkeur toegepaste harsen zijn die waarin de matrix bestaat uit polystyreen en die een betrekkelijk geringe mate van verknoping bezit-25 ten.

Ten einde de hars in de bisulfiet/sulfietvorm om te zetten, verdient het de voorkeur dat de hars zich eerst in de OH-vorm bevindt. Dit kan tot stand worden gebracht door de hars te behandelen met een geschikt hydroxide. Na wassen ter verwijdering van overmaat zouten, kan de hars in contact wor-30 den gebracht met een bron van sulfiet- en bisulfietionen. Men kan oplossingen van zouten gebruiken die een bron van deze ionen verschaffen. Voorbeelden van geschikte zouten zijn natrium- en kaliumsulfiet en natrium- en kaliumbisulfiet. In het algemeen gebruikt men een overmaat van deze zouten om de hars in de gewenste vorm om te zetten ten einde te waarborgen dat de 35 volledige uitwisselingscapaciteit van de hars bereikt wordt. Hierna wordt de hars gespoeld of op andere wijze gewassen ter verwijdering van de overmaat zout.

In oplossingen bestaat een evenwicht tussen de bisulfiet- en sulfiet-ionen. Bij een pH-waarde van circa 7 zijn deze ionen aanwezig in ongeveer 80 06 22 1 * -¾ - 5 - gelijke hoeveelheden, maar bij lagere pH-waarden wordt de bisulfiet-vorm begunstigd. De hier gebruikte uitdrukking "bisulfiet/sulfiet" betekent dus niet dat bisulfiet en sulfiet in de ionen-uitwisselaar aanwezig zijn in bepaalde hoeveelheden maar dat de hars in beide vormen bestaat.

5 De omstandigheden waaronder de glucose bevattende vloeistof met de hars in contact wordt gebracht, kunnen binnen ruime grenzen variëren, maar in representatieve gevallen ligt de pH van de oplossing in het traject van circa 1,0 - 8,0 en bij voorkeur in het traject van circa 3,5 - 6,5. De temperatuur waarbij de vloeistof door een bed of kolom van de hars kan 10 worden gevoerd, kan eveneens uiteenlopen, maar deze temperatuur dient niet zo hoog te zijn dat dit leidt tot een aanzienlijke vorming van afbraakpro-dukten of tot een nadelige beïnvloeding van de werking van de hars. Gebleken is dat de bij voorkeur toegepaste harsen bij temperaturen boven 80 ®C een nadelige invloed ondervinden. Temperaturen in het traject van circa 15 25® - 70 ®C gaven bevredigende resultaten. De temperatuur bedraagt bij voor keur circa 50® - 65®C.

De aanwezigheid van enzym-activatoren is in het algemeen tijdens enzymatische isomerisatieprocessen gewenst. In de industrie worden voor dit doel in representatieve gevallen geringe hoeveelheden zouten, zoals MgSO^ 20 en NaHSO^, vóór de isomerisatie aan het substraat toegevoegd.

Ofschoon de snelheid waarmee de vloeistof door een kolom of een aantal kolommen van de hars wordt gevoerd, niet kritisch is, zijn bevredigende resultaten verkregen bij een stroomsnelheid van circa 10,7 - 28,1 liter per 3 minuut en per m hars. De vloeistof kan door de kolom of de kolommen in 25 bovenwaartse of in benedenwaartse richting gevoerd worden. Daar verschillende installaties voor de produktie van glucose bevattende vloeistoffen onder enigszins verschillende omstandigheden kunnen werken, is de samenstelling van deze vloeistoffen enigermate aan variatie onderworpen. Het is derhalve moeilijk de betrekking tussen de mate van harsbehandeling en de 3Ö toename in de stabiliteit of werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glu-cose-isomerase kwantitatief uit te drukken. Uiteraard dient voor het doelmatig bereiken van de doelstellingen van de uitvinding de hars in contact te worden gebracht met een voldoende hoeveelheid van een bron van bisulfiet-en sulfietionen onder zodanige omstandigheden dat. de behandelde hars niet 35 in een oneconomisch korte tijd wordt uitgeput.

Analytische methoden Bepaling van de SO^,-concentratie

Het zwaveldioxidegehalte in de vloeistoffen werd als volgt bepaald:

Een monster van 50 - 60 g van de vloeistof werd nauwkeurig in een schaaltje 8006221 - 6 - afgewogen en kwantitatief overgebracht in een Kjeldahl-kolf van 800 ml, waarbij men 300 ml gedestilleerd water gebruikte. Men voegde 10 ml geconcentreerd fosforzuur toe, gevolgd door 1 g natriumbicarbonaat. De kolf werd direkt verbonden met een standaard-Kjeldahl-destillatie-apparaat en 5 men destilleerde circa 250 ml vloeistof over in een Erlenmeyer-kolf, die 25 ml water en 10 - 12 ml 0,8 %'s natriumhydroxide-oplossing bevatte. Na afloop van deze destillatie zuurde men het destillaat aan met fosforzuur en voegde 2 ml zetmeelpasta als indicator toe. De oplossing werd daarna met 0,0625N jodiumoplossing getitreerd (1 ml equivalent aan 0,002 g SC^) 10 tot een blauwe kleur gedurende 1 minuut aanhield. Het percentage SO^ op droge basis werd als volgt berekend: _titer (ml) x 0,002 rocen ^ ~ Gewicht monster (g) x % droge stof

Bepaling van de stabiliteit (halve levensduur) van geïmmobiliseerd glucose- isomerase 15 Men bracht een hoeveelheid geïmmobiliseerd glucose-isomerase met een enzymactiviteit van 1000 IGIU (International Glucose Isomerase Unit) in een van een mantel voorziene glazen kolom (2,5 x 30 cm) die op gebruikelijke wijze was uitgerust. Alvorens in de kolom te worden gebracht, werd het geïmmobiliseerde enzympreparaat met de substraatoplossing onder verlaagde 20 druk geroerd ter verwijdering van opgesloten lucht. Het substraat, dat gevormd werd door een van lucht bevrijde, glucose bevattende vloeistof die verkregen was door enzymatisch vloeibaar maken en versuikeren van maïszetmeel, werd continu door de kolom gevoerd onder de hieronder in Voorbeeld I genoemde omstandigheden. Men nam dagelijks monsters van het kolom-25 effluent en bepaalde de stroomsnelheid, de pH bij kamertemperatuur en het percentage fructose.

De halve levensduur van het geïmmobiliseerde glucose-isomerase werd bepaald door de betreffende waarden in de onderstaande formule in te vullen en ΐ en in een grafiek uit te zetten: I - I K E, (e~°'0934t/t) 30 in -2. -

I - I CR

e

At = Verandering in tijd (uren) I = Mate van isomerisatie van in reactor gevoerd materiaal, F/F + G); ° F en G zijn de concentraties van fructose resp. glucose (g/ml) I = Mate van isomerisatie van reactoreffluent, F/(F + G) 35 i * I in evenwichtstoestand (0,514 bij 65®c)

e -1 _1 = Aanvankelijke reactiesnelheidsconstante, g (G + F) uur IGIU

= Totale hoeveelheid enzym in de reactor (IGIU) 8006221 - 7 - "C = Halve levensduur van enzym (uren) R = Stroomsnelheid (ml/uur)

Bepaling van de activiteit van geïmmobiliseerd glucose-isomerase

De activiteit (IGIU) van geïmmobiliseerd glucose-isomerase werd be-5 paald volgens de methode die wordt beschreven in het Amerikaanse octrooi-schrift 4.111.750.

De uitvinding wordt nader beschreven in de onderstaande, niet-beper-kende voorbeelden.

VOORBEELD I

10 Dit voorbeeld beschrijft de toepassing van een zwak basische anionen- ' uitwisselende hars in de bisulfiet/sulfietvorm bij het uitvoeren van de onderhavige werkwijze.

Men bracht 1760 ml van de anionen-uitwisselende hars "Duolite ES-561" (zwakke base) in een kolom met een inwendige diameter van 8 cm en een 15 hoogte van 39 cm. Ter activering van de hars voerde men de onderstaande stappen uit; bij elke stap werden de toegepaste materialen in bovenwaartse richting door de harskolom gevoerd.

1) De harskolom werd teruggespoeld met gedeioniseerd water ter verwijdering van fijne harsdeeltjes.

20 2) Men voerde 3500 ral van een 7 %'s HCl-oplossing met een snelheid van 10 ml/min. door de kolom.

3) Men spoelde de harskolom met circa 6000 ml gedeioniseerd water totdat de pH van het effluent groter dan 4 was.

4) Men voerde 3000 ml van een 4 %’s NaOH-oplossing met een snelheid van 25 10 ml/min. door de kolom.

5) Men spoelde de harskolom met gedeioniseerd water totdat de pH van het effluent minder dan 10 bedroeg.

6) Men voerde 4600 ml IN NaHSO^ met een snelheid van 10 ml/min. door de kolom.

30 7) Men spoelde de harskolom met gedeioniseerd water totdat de pH van het effluent circa 5,5 bedroeg.

Men bracht de geactiveerde hars in twee kolommen met een inwendige diameter van 8 cm en een hoogte van 39 cm en voerde twee monsters gezuiverde, glucose bevattende oplossing (met koolstof behandeld en met hars 35 gedeioniseerd), bereid volgens de enzym-enzymmethode, met een snelheid van circa 1 ml/min. in bovenwaartse richting bij kamertemperatuur door de kolommen (invoer-pH 4,5).

Men bepaalde de koolhydraatsamenstelling van de glucose bevattende oplossingen vóór en na behandeling met de harsen; de resultaten zijn in de 40 ondei^taande^ Tabel A gegeven.

04 - 8 - Φ to Γ' 0 ' *· +j o o o o u

G

M

Cm «-“Si VO 04 +j in ο o vo ο» ai I + - - - s w -in oo η οι oi M (¾

'd Q

h a) a) -p -d ·η G r-l in GO ·Η Λ 3 Μ <U Ö Φ — Α Α οι Μ ^ - μ φ ^ σι ο- τΐη G Φ D> I «· *> « *· Φ ,G ο 04 η 04 ηη &> Μ ft GO) Ό Ο •Ρ 1¾ ω G ft ιη α) ο 0 Η γ-4 ω ω ft ω α) 0 Μ Dl — <* -Η (Ö 04 φ 5 -Ρ ^ Ρ1 Ό -Ρ GO) HG-h φ in 04 οι ηη m φ G ο ο >. «· *- C-Pi pp 'S* ηη

Eh+jg φ -Ρ σι σι σι<η

(d CD ft X

> G Φ

Φ 0 Q

Λ G

Φ (d m 0 Φ o Ό G P _ Η Φ -i Ό Φ

Dl φ τΐ Η Η Μ —' ίΰ fd G Φ Φ Φ Φ Φ Φ G ιη η η ftft ·η >Φ ο * *·φφ Μ-ϊ & Η ο ο Λ Λ Φ φ φ G Μ Φ ω Μ 4-) -Ρ -Ρ Di ·Η >ι φ Η φ φ 0 <Ρ Η Dl Φ ·Η ·Η -Ρ Φ Φ S G G Φ Μ G Φ 0 & <! Ό 0 0 Ρ -Ρ Α Φ

0 S

Ή 0 0 Μ -Ρ Λ ιη ο •η ιρ φ ο ο -Ρ η ιη /—> 'D Ό ^ Ή

Dl Η Di Ή I Φ G Φ G Φ ιη 0 η φ ·η ό φ η Η G 1-4 G θ' > φ φ φ φ

Di Ό Α <ZS Α Μ Μ G G Φ G Φ 0 0 Η Φ Λ Φ Λ 0 0 Ό Λ Α Ό Ό ri φ φ ιη φ φ ω G Η Λ Μ Η Λ Μ Ό Ό Ό 0 Φ 0 Φ Η Η G Ρ G .G Μ G Α ΦΦ φ -Ρ Φ -Ρ φ Φ Φ φ G Φ -Ρ G Φ -Ρ ftft ρ οσίφοσίφ φφ Φ U'-'SU-'S Λ Λ Ρ ιη G ί

0 · · · · Η CN

S 4 < CQ CQ ^ ~ L0 Ο «Η 80 06 22 1 > —5».

- 9 -

Uit de bovenstaande tabel blijkt dat de behandeling van de oplossingen met hars geen effect had op de koolhydraatsamenstelling hiervan, vergeleken met de controlemonsters.

Glucose-isomerase werd geïmmobiliseerd op DEAE-cellulose volgens de 5 werkwijze die wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.909.354; twee van een mantel voorziene kolommen werden met het geïmmobiliseerde enzympreparaat gevuld.

De voor isomerisatie toegepaste omstandigheden waren als volgt: Temperatuur - 65 °c 10 Glucoseconcentratie van substraat - 50 % op droge basis

Stroomsnelheid - 0,42 ml/min.

MgS04 . 7H20 - 0,005 M

NaHS03 - 0,005 M

pH bij 25®G bij kolominlaat - 7,8 15 Men voerde met hars (Duolite ES-561) behandelde en onbehandelde glu cose bevattende oplossingen afzonderlijk door de kolommen. De resultaten zijn in de onderstaande Tabel B gegeven.

TABEL B

Effect van de behandeling van glucose bevattend substraat met 20 Duolite ES-561 op de stabiliteit van geïmmobiliseerd glucose-isomerase _Substraat_

Controle Met hars behandeld

Aanvankelijke kolomactiviteit (IGIÜ) 1066 1065

Halve levensduur van geïmmobiliseerd 25 glucose-isomerase (uren) 288 696

Uit de bovenstaande gegevens blijkt dat behandeling van een glucose bevattende oplossing met een hars in de bisulfiet/sulfietvorm de werkzame levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase sterk verbetert.

VOORBEELD II

30 Dit voorbeeld beschrijft de bereiding en toepassing bij de onderhavige werkwijze van een sterk basische anionen-uitwisselende hars in de bisulfiet/ sulfietvorm.

Men bracht 960 ml "Amberlite IRA-900"-hars in een kolom met een inwendige diameter van 8 cm en een hoogte van 39 cm. Voor het activeren van de 35 hars werden de onderstaande stappen uitgevoerd; bij elke stap werden de materialen in bovenwaartse richting door de harskolom gevoerd.

1) Men voerde 3000 ml van een 4 %'s NaOH-oplossing met een snelheid van 10 ml/min. door de kolom.

2) Men spoelde de harskolom met circa 5000 ml gedeioniseerd water met 40 een snelheid van 10 ml/min.

80 06 22 1 - 10 - 3) Men voerde 3000 ml IN NaHSO^ door de kolom.

4) Men voerde 5000 ml gedeioniseerd water met een snelheid van 10 ml/min. door de kolom ter verwijdering van overmaat NaHSO^.

Men bracht de geactiveerde hars in een kolom met een inwendige dia-5 meter van 8 cm en een hoogte van 39 cm, en voerde een glucose bevattende oplossing (verkregen door vochtig malen van mais op commerciële schaal) met een snelheid van circa 6 ml/min. door het bed. Na de behandeling met de hars werd de vloeistof gefiltreerd door "Millipore" (poriëngrootte 0,45 ja) ter verwijdering van microbiële verontreiniging die in de kolom 10 gevormd kan zijn. Men voerde isomerisatieproeven uit volgens de in Voorbeeld I beschreven methode. De resultaten zijn in de onderstaande Tabel C gegeven.

TABEL C

Effect van de behandeling van glucose bevattend substraat met 15 Amberlite IRA-900 op de stabiliteit van geïmmobiliseerd glucose- isomerase _Substraat

Isomerase Controle Met hars behandeld

Aanvankelijke kolomactiviteit (IGIU) 920 918 20 Halve levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase (uren) 321 702

De stand van de techniek leert dat het opnemen van een geringe hoeveelheid van een bron van SC>2 in het glucose bevattende substraat tijdens de isomerisatie met glucose-isomerase de denaturering van het enzym ver-25 mindert. Zo vermeldt het Amerikaanse Reissue-octrooischrift 28.885 dat SO^-gehalten van 0,02 - 0,3 % (op droge basis) in het glucose bevattende substraat de werkzame levensduur van glucose-isomerase verlengt. Men voerde een proef uit (Voorbeeld III) ten einde te bepalen of de door de onderhavige werkwijze verschafte, verbeterde stabiliteit van geïmmobiliseerd 30 glucose-isomerase het gevolg is van de aanwezigheid van oplosbaar bisul-fiet/sulfiet, dat uit de kolom of het bed van het ionen-uitwisselende materiaal wordt "uitgeloogd".

VOORBEELD III

• Dit voorbeeld_beschrijft de mate van "uitlogen" van oplosbaar blonder opneming 35 sulfiet/sulfiet/in een oplossing, die plaatsvindt wanneer een glucose bevattende vloeistof door een ionen-uitwisselende hars in de bisulfiet/ sulfietvorm wordt gevoerd.

Een bed van een sterk basische anionen-iotwisselende hars (Amberlite IRA-900) in een kolom met afmetingen van circa 125 cm bij circa 1,5 cm, 40 werd in de bisulfiet/sulfietvorm omgezet door hierdoor tweemaal het bed- 8006221 - 11 - volume 1 M NaHSO^ met een stroomsnelheid van 4,3 ml/min. te voeren- Vervolgens werd het bed gespoeld met 1 maal het bedvolume gedeioniseerd water met dezelfde stroomsnelheid- Een glucose bevattende oplossing, en wel een gezuiverd, volgens het enzym-enzymproces verkregen maiszetmeelhydrolysaat 5 met een gehalte aan droge vaste stof van 45 % en met een glucosegehalte van circa 93 % (op basis van de droge stof), werd met een stroomsnelheid van 4,2 ml/min. door het bed gevoerd. De temperatuur van de kolom werd op 60®C gehouden en de pH van de oplossing bedroeg 5,5, bepaald bij kamertemperatuur. Men voerde de glucose bevattende oplossing continu gedurende 10 120 uren door de kolom en bepaalde periodiek het SO^-gehalte van het effluent.

De uit de hars in oplossing "geloogde" hoeveelheden oplosbaar bisulfiet/sulfiet op verschillende tijdstippen waarop monsters werden genomen, zijn in de onderstaande Tabel D vermeld, uitgedrukt in de SO^-con-15 centratie (op basis van de droge vaste stof) op de verschillende tijdstippen.

TABEL D

Tijstippen waarop monsters uit SC^-conc. in effluent effluent werden genomen (uren) (%, droge basis) 20 18 0,026 42 0,032 66 0,060 90 ' 0,010 114 0,007 25 uit de gegevens in de bovenstaande tabel blijkt dat de hoeveelheid in de oplossing opgenomen bisulfiet/sulfiet niet meer dan circa 0,06 % (SO^-concentratie) bedroeg. Het blijkt dus dat de behandelde hars niet kan dienen als bron van voldoende SO^ om de waargenomen toename in de stabiliteit van geïmmobiliseerd glucose-isomerase (ten opzichte van de volgens bekende 30 methoden bereikte stabiliteit) te veroorzaken.

VOORBEELD IV

Dit voorbeeld beschrijft het effect van het opnemen van toenemende hoeveelheden natriumbisulfiet in een glucose bevattende oplossing op de stabiliteit van geïmmobiliseerd glucose-isomerase.

35 Men bereidde geïmmobiliseerd glucose-isomerase door een oplossing van

Streptomyces sp. glucose-isomerase te adsorberen aan DEAE-cellulose, als beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.788.945. Het geïmmobiliseerde preparaat bezat een activiteit van 384,4 IGIU per gram, op droge basis. Men bereidde een substraatoplossing, en wel een gezuiverd, volgens het 40 enzym-enzymproces verkregen hydrolysaat van maïszetmeel, dat circa 93 % - 12 - glucose (op droge basis) bevatte. Vóór de uiteindelijke instelling van de pH werden verschillende hoeveelheden natriumbisulfiet aan porties van de substraatoplossing toegevoegd; deze porties werden afzonderlijk door kolommen van het geïmmobiliseerde enzym gevoerd onder de onderstaande isomeri-5 satie-omstandigheden:

Substraat-concentratie 50 % (d.s.)

Temperatuur 68,8 ®C

pH 7,25 bij 27 ®C

Stroomsnelheid 0,45 ml min * 10 MgSO^_ 0,005 M in substraat C0CI2 0,0005 M in substraat

Enzym Prop van 1,6 g geïmmobiliseerd glucose-isomerase, gemengd met 3,2 g chemisch cellulose 15 Bedrijfstijd -200 uren SO_-concentraties in substraat 0,06, 0,10, 0,30, 0,50 en 1,00 (%, d.b.)

De resultaten zijn in de onderstaande Tabel E gegeven:

TABEL E

20 Effect van variërende concentraties SO^ in glucosesubstraat op stabiliteit van geïmmobiliseerd glucose-isomerase

Substraat- SC^-conc. Halve levensduur vein portie (%, d.b.) geïmmobiliseerd _ _ glucose-isomerase 25 1 0,06 210 2 0,10 213 3 0,30 285 4 0,50 347 5 1,00 398 30 Uit de gegevens in de bovenstaande tabel blijkt dat een toename van de SC>2-concentratie in de glucose bevattende vloeistof van 0,06 % tot 1,0 % leidt tot een onaanzienlijke toename in de halve levensduur van het enzym. Behandeling met hars in de bisulfiet/sulfietvorm verhoogt de SC^-concentratie in de glucose bevattende vloeistof met circa 0,01 - 0,06 %, 35 zoals uti Voorbeeld III blijkt. Het zal derhalve duidelijk zijn dat de sterke verbetering in de halve levensduur van het enzym bij behandeling van de glucose bevattende vloeistof met hars in de bisulfiet/sulfietvorm, niet het gevolg is van het "uitlogen" van het SC^ uit de hars die dan wordt opgenomen in de glucose bevattende vloeistof. Ofschoon de reden voor de 40 verbetering niet volledig duidelijk is, kan het zijn dat door de behande- 8 0 06 22 1 __5*.

- 13 - ling met hars het effect van bepaalde niet-geidentificeerde enzym-inactiva-toren, die in de glucosestropen aanwezig kunnen zijn, opgeheven of tegengegaan wordt, hetgeen resulteert in een toegenomen halve levensduur van het enzym.

5 VOORBEELD V

Dit voorbeeld beschrijft de toepassing van een sterk basische anionen-uitwisselende hars in de bisulfiet-sulfietvorm bij glucose-isomerisatie-reacties die werden uitgevoerd met twee typen geïmmobiliseerd glucose-isomerase.

10 Men bracht "Amberlite IR-900" in de bisulfiet/sulfietvorm, welke hars geactiveerd was volgens de in Voorbeeld II beschreven werkwijze, in 3 vier kolommen van 60 cm bij 2,5 cm. Elke kolom bevatte circa 0,235 dm hars. De kolommen werden in serie geschakeld en op een temperatuur van circa 40 + 2°C gehouden. Een in de handel verkrijgbare glucose bevattende 15 oplossing, die verkregen was door enzymatisch vloeibaar maken en versuike-ren, werd met een snelheid van 12 - 16 ml/min. door de harskolommen gevoerd.

Men voerde isomerisatieproeven uit volgens de in Voorbeeld I beschreven werkwijze onder toepassing van twee verschillende typen geimmobili-20 seerd glucose-isomemse. De resultaten zijn in de onderstaande Tabel F vermeld.

8006221 0 - 14 - G _ 0 Ό Η ·Π 0 ·Ρ

ra -P

01 0 g LD Lf) •P 01 O - *· 5 p O cm ·<-4 cm *p PM Μ O m O ro ri <D ii 'n n ro

P 8 al G

10 Md)

G ai OP

0 -H OP

G I O ^ O dl P 01 G 0

(0 O M

G P

d) Η P ^

Λ O' Ό P

0 01 0

01 Ό Ö P

•PM 0 _ P

oi <u > Ό ^

Pd) d) M

Λ οι rl 0) d) -p <u 01

,Μ rp 0 ra P

Μ ·Ρ > ·Ρ M P1 n m ro 0 Λ η h 0 co cm n ^ PO P -P S co m cm io

rag Λ Λ O

3 o ai

ö -p d) g -P

d) ra Ό 1 i 0 01 M -P d) ra ra ra

U Ö Ό Ö1 O

0 0 P 0 a a g c p >1 0 P rp P P PQ > Ö>

P

P 0

M 0 P

P J5 -P

ra 4-i 0

Λ 4-) 00 00 O O

P Ö | -P H ^ o o ft 01 P 8 > D O o o o

t> O 'P H **4 rH

iJ Ό Η P CD

H G -P O O H

(¾ 0 -p W P — si 4J 0 §4 Ρ P — ~ P -p ra ra

> Η Μ M

0 -p p p Λ Λ Λ Λ

P

0 -P -P -P

01 ra 0 0 0 e ^ a O 0 Ό 43 Ρ Ό ö! H O» H- iP G 0 G d) O) ft -p Ό -P Ό

O H C ip C

Ü 0 P 0 P

0 8 Ό Λ Ό 43 0 M G 0 G 0 O P Λ P Λ G > -P 43 43 pp p 0 0 01 00 ra

>0 ΡΗΛΜ H 43 M

•P ΜΟΡΟ P

iJ)M4 Ρ M G 43 MP 43 ΰ p 01 4-> 0 4.) 0

•Pp Λ G 0 4-) G 0 -P

HOI p O Ö> 0 O BI 0 0\ mu'— a a Ό -P G 0 P ·Ρ sa -p -p P G Ή Ή ra ·ρ *ρ 0 ·ρ mm T3 43 43 43 Ο Ο (3 0 (0 01 01 Ρ Ά Μ ·Ρ . Η >0 fti Ο ft Ο Ö 00 000 000 .ρ·ρϋΐω οι μ οι μ ϋ ·ΡΡ Ρ Ό Ρ Ρ Ό Ρ 001 Η Μ 0 0 Μ Μ 0 Ο Μ Μ 0 Ο 44 Μ ·Ρ 0 8 8 00Ο1Ο 00010 44 Ρ Λ 8 >ι & 800 800 Η ί ΟΟΝ Ν Ο 01 Η 01 Ο 01 Η 01 8 οι -Ρ -Ρ w-PGG'-'M-PGflr-, Β·ρ 0 0 ·Ρ Η Η Ρ 'd* •PHHP'd’ •PI 0 0 I -Ρ Η Ρ If) I Η Η Ρ in 00 S S 0 Λ Φ Αί η 0430AJco trim coco enen αιοο·ρ · woo-p · Ο OglMGi 0 I I Ρ ΟΙ 0o 00 00 ο a w 0 ο u8wd)o ftp >ft >ft p -p < s σ> p-Prtjacrs

Sh oS oSh0H(3 · h d) w 3 · EH&aEM JSEh CD tuQ "fn CD tr> Q ~ m m o in o

rH tH CN

8006221 __s - 15 -

Uit de gegevens in de bovenstaande tabel blijkt dat door behandeling van een glucose bevattend substraat met een sterk basische anionen-uitwis-selende hars de levensduur van geïmmobiliseerd glucose-isomerase, dat bereid is volgens verschillende methoden, doelmatig verlengd wordt.

5 De uitvinding wordt niet beperkt door de bovenbeschreven uitvoerings vormen, aangezien binnen het raam van de uitvinding talrijke wijzigingen mogelijk zijn. Evenmin wordt de uitvinding beperkt door de hier gebruikte uitdrukkingen.

8006221

Claims

1. Werkwijze voor het enzymatisch isomeriseren van glucose in een glucose bevattende vloeistof tot fructose, met het kenmerk dat men de vloeistof behandelt met een ionen-uitwisselend materiaal in de bisulfiet/ 5 sulfietvorm en de behandelde vloeistof in contact brengt met geïmmobiliseerd glucose-isomerase onder omstandigheden waarbij isomerisatie van glucose plaatsvindt, waarbij een deel van de glucose in fructose wordt omgezet.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat men als ionen-10 uitwisselend materiaal een anionen-uitwisselend materiaal in de bisulfiet/ sulfietvorm toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat men als ionen-uitwisselend materiaal een zwak basische anionen-uitwisselende hars in de bisulfiet/sulfietvorm toepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat men als ionen- uitwisselend materiaal een sterk basische anionen-uitwisselende hars in de bisulfiet/sulfietvorm toepast.

5. Werkwijze volgens conclusied 1-4, met het kenmerk dat men de glucose bevattende vloeistof met de hars behandelt bij een pH in het traject 20 van circa 1,0 - 8,0.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk dat men de glucose bevattende vloeistof met de hars behandelt bij een pH in het traject van circa 3,5 - 6,5.

7. Werkwijze volgens conclusies 1-6, met het kenmerk dat men de 25 glucose bevattende vloeistof met de hars behandelt bij een temperatuur beneden circa 80®C.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk dat men de glucose bevattende vloeistof met de hars behandelt bij een temperatuur in het traject van circa 25® - 70®C.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk dat men de glucose bevattende vloeistof met de hars behandelt bij een temperatuur in het traject van circa 50® - 65®C. 80 0 6 22 1