FR2568586A1 - Procede pour maintenir constante l'activite d'une enzyme immobilisee dans un reacteur - Google Patents
Procede pour maintenir constante l'activite d'une enzyme immobilisee dans un reacteur Download PDFInfo
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Abstract
ON CHARGE AU DEPART UN SUPPORT ADSORBANT D'UNE QUANTITE D'ENZYME INFERIEURE A LA CAPACITE DE CHARGE MAXIMALE DE L'ADSORBANT, ON SUIT L'ACTIVITE DE L'ENZYME ET ON AJOUTE PERIODIQUEMENT DE L'ENZYME FRAICHE AFIN DE MAINTENIR EN CONTINU UN NIVEAU CONSTANT D'ACTIVITE JUSQU'AU MOMENT OU L'ON ATTEINT LA CAPACITE DE CHARGE MAXIMALE DU SUPPORT.
Description
L'invention se rapporte d'une manière générale à la technique des enzymes
immobilisées. Elle concerne plus pr6cisément un procédé pour maintenir à un niveau voulu l'activité d'une enzyme
au cours d'une opération continue de conversion.
Quoique l'on ait décrit des immobilisations de protéines il y a déjà plus de soixante ans (Nelson, J.M. et D.I. Hitchcocks, J. Amer. Chem. Soc. 46:1956 [1921]), le phénomène n'a suscité un -grand intérêt que dans le dernier quart du siècle. Les techniques d'immobilisations peuvent être classées en quatre catégories g6nérales: (1) l'occlusion,(2) la réticulation, (3) la fixation par liaisons
covalentes et (4) l'adsorption.
Les techniques par occlusion sont en général basées sur l'occlusion dans des gels réticulés ou l'encapsulation dans des
fibres creuses, des microcapsules liposomes et des substances ana-
logues. La rêticulation implique la modification de l'enzyme par addition de r6actifsréticulantsbi- ou multi-fonctionnels, fréquemment suivie d'une adsorption ou d'une encapsulation. La fixation par des liaisons covalentes, qui a fait l'objet du plus grand nombre de recherches, comporte la liaison covalente de l'enzyme à un support par l'intermédiaire de groupes fonctionnels qui ne sont pas essentiels à l'activité biologique de l'enzyme. L'adsorption est simplement réalisée par contact de l'enzyme avec un adsorbant, l'immobilisation r6sultant de l'interaction des forces de liaison relativement légères
entre l'enzyme et l'adsorbant.
L'invention se situe plus directement dans ce dernier domaine de l'immobilisation; c'est la raison pour laquelle certarin principes de l'adsorption feront l'objet ci-après d'un développement plus complet. Il existe des études approfondies des techniques d'occlusion, de réticulation et de fixation par liaisonscovalentes (cf. par exemple: Weetal, H.H., ed. "Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides" M. Dekker, New-York, [1975], ou Zaborsky
O.R. "Immobilized'Enzymes"CRC Press, Cleveland, [1973]).
Les études récentes relativement à l'adsorption ont montré que dans certains cas celle-ci pouvait conduire à une désactivation partielle ou totale de l'enzyme. On comprendra donc qu'un adsorbant approprié à l'utilisation dans la pratique de l'invention doit
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avoir une affinité relativement forte pour l'enzyme, mais provoquer
une désactivation minimale.
L'immobilisation par adsorption sur des supports tels que l'alumine, la bentonite, le carbonate de calcium, la cellulose, le collagène, des résines gchangeuses d'ions, la kalinite, le Sephadex,
le gel de silice et l'acier inoxydable revêtu de titane est connue.
Quoique, comme on le verra ci-après, l'invention s'applique une gamme tendue de systèmes enzymatiques adsorbes, elle convient particulièrement à la mise en oeuvre de procédés dans lesquels on
utilise la glucose-isomérase immobilisée.
La plus grande partie du fructose est produite industriel-
lement par isomérisation du dextrose (obtenu à partir de l'amidon) en fructose dans un réacteur dans lequel la solution de dextrose passe sur un lit de glucose-isomérase immobilisée. Habituellement, la teneur en fructose de l'effluent est maintenue à un niveau constant, par exemple à un niveau de 40-44 %, par contr8le du débit
dans le réacteur. Du fait que l'enzyme immobilisée se dégrade natu-
rellement en raison d'une inactivation thermique et chimique, le débit est diminué périodiquement. Lorsqu'on atteint un débit au-delà duquel une nouvelle diminution est inacceptable, on remplace l'enzyme
immobilisée par un nouveau lit d'enzyme immobilisée.
Du fait que le débit d'une colonne, au cours de sa durée de service, peut varier par exemple de 50 g/min à 5 g/min, il faut utiliser de nombreuses colonnes pour obtenir une production presque
constante.
Des systèmes convenant particulièrement à l'immobilisation
de la glucose-isomérase ont été décrits dans les brevets des Etats-
Unis 3 788 945, 3 909 354, 4 110 164, 4 168 250 et 4 355 117. Dans le brevet des Etats-Unis 3 960 663, on décrit l'addition périodique de glucose-isomerase soluble dans le courant d'alimentation en
dextrose d'un réacteur d'isomérisation contenant de la glucose-
isomdrase immobilisée. La glucose-isomgrase est immobilisée sur une résine 9changeuse d'anions fortement basique, chargée à la capacité complète par de la glucose-isomérase soluble. Au fur et à mesure que l'enzyme se dégrade, ses propriétés d'adsorption sont altérées au point que l'enzyme inactive est expulsée du support et apparaît
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dans l'éluant. Dans le brevet précité, on propose de remplacer l'enzyme éliminée par contact du support avec de l'enzyme franche
en quantité suffisante pour une nouvelle charge totale du support.
Du fait que l'enzyme usée est éliminée en continu de l'adsorbant, l'éluant doit être soumis à une opération complémentaire de purifi-
cation servant à éliminer l'enzyme contaminante.
Le procédé selon l'invention apporte des avantages importants sur les procédés classiques sur les points suivants: (1) il y a simplification des opérations - il n'est plus nécessaire de régler périodiquement les débits dans le réacteur; (2) les investissements en capitaux sont plus faibles en raison de la suppression des débits variables, on peut remplacer les petits réacteurs par un petit nombre de grands réacteurs; (3) il y a meilleur contr8lede la production - on peut parvenir à des taux plus forts de fructose sans réduire les débits en ajoutant une enzyme plus soluble dans le réacteur; et (4) il y a diminution des frais de purification du produit - parce qu'on supprime les très
longs débits et par conséquent les longues durées de passage condui-
sant à des productions de produits colorésetà des saveurs étrangères.
L'invention concerne un procédé pour maintenir constante l'activité d'uneenzyme immobilisée dans un réacteur par adsorption sur un support solide, dans des conditions appropriées, d'une quantité d'enzyme représentant un niveau d'activité déterminé mais inférieur à la capacité maximale du support; et adsorption de compléments de l'enzyme sur ledit support en quantitéssuffisantes pour maintenir ce niveau déterminé d'activité au fur et à mesure que l'activité de l'enzyme adsorbée au préalable diminue audessous de ce niveau déterminé. L'addition périodique d'enzyme est poursuivie
jusqu'au moment o l'on atteint la capacité maximale du support.
L'invention est particulièrement utile pour maintenir l'activité d'une glucose-isomérase immobilisée dans une réaction et peut donc
être utilisée dans la production du fructose à partir du glucose.
Un facteur important relativement à fl'efficacitéd'unprocédé par enzyme immobilisée réside dans la durée pendant laquelle la charge d'enzyme reste active. Comme on l'a déjà signalé, l'enzyme se dégrade
naturellement au fur et à mesure des opérations. Quoique la deman-
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deresse ne souhaite pas être limitée par une théorie particulière
relativement à la dégradation de l'enzyme, elle pense que la déna-
turation thermique et la dénaturation chimique contribuent à cette dégradation. L'une des solutions à ce problème consiste à diminuer simplement le débit des réactifs sur le système immobilisé au fur et à mesure que son efficacité diminue. Toutefois, comme les d9bits
peuvent varier dans des proportions de 1:10 ou plus, il est néces-
saire d'utiliser une série de colonnes si l'on veut parvenir à une production continue. D'autres solutions ont consisté à suspendre périodiquement les opérations industrielles, à éliminer l'enzyme usde et à recharger par de l'enzyme fraîche; ou bien encore, comme
décrit dans le brevet des Etats-Unis 3 960 663, à introduire pério-
diquement de l'enzyme fraîche au fur et à mesure que l'enzyme usée
est extraite dans l'éluant.
L'invention apporte une solution supérieure à celle décrite ci-dessus en ce que l'on peut introduire de l'enzyme fraîche dans l'installation sans suspendre les opérations, la production peut être maintenue à un niveau constant ou même, si on le désire, elle peut être accrue, et l'éluant est pratiquement exempt d'enzyme usée. Dans le procèd& selon l'invention, au cours de la préparation initiale d'un système immobilisé, l'enzyme est ajoutée au support en quantités inférieures à la capacité maximale de charge de l'adsorbant, c'est-à-dire que le support travaille au-dessous de
sa charge; on maintient alors une production constante en intro-
duisant de l'enzyme fraîche lorsque c'est nécessaire jusqu'au moment
o l'on atteint la capacité de charge maximum du support.
Du fait que les techniques d'immobilisation par adsorption font intervenir des interactions de charges entre l'enzyme et le support, des interactions hydrophobes entre l'enzyme et le support, etc., le choix d'une combinaison particulière enzyme-support doit être fait empiriquement. Parmi les supports utilisables on citera: 1. des résines de polystyrène basique faibles comme les résines du commerce telles que: Amberlite IRA-93 (de la firme Rohm & Haas), t o2568586 Diaion WA-30 (de la firme Mitsubishi), Diaion WA-11 (de la firme Mitsubishi), Amberlite IR- 45 (de la firme Rohm & Haas); 2. des résines de phenol-formaldéhyde (-N(R) 2) basiques faibles comme les résines du commerce Duolite EA-561 (de la firme Diamond Shamrock), Duolite ES-562 (de la firme Diamond Shamrock), Duolite ES-568 (de la firme Diamond Shamrock); 3. des résines de polystyrène (-N(R)3) basiques fortes comme les résines du commerce XE-352 (de la firme Rohm & Haas), Amberlite IRA-900 (de la firme Rohm & Haas), Amberlite IRA-904 (de la firme Rohm & Haas), Amberlite IRA-938 (de la firme Rohm & Haas), GIA-01 (de la firme Mitsubishi), Diaion PA-308 (de la firme Mitsubishi), Diaion PA-304 (de la firme Mitsubishi), Diaion SA-21A (de la firme Mitsubishi), Sumitomo Resin (de la firme Sumitomo Co. Ltd, Japon); 4. des adsorbants variés pour enzymes comme les produits du commerce: DEAE-Sephadex (dextrane dérivé et réticulé de la firme Pharmacia), DEAE-Glycophase (verre poreux contr8lé revêtu d'hydrate de carbone et dérivé - de la firme Pierce Chemical Co.), QAE-Glycophase (base forte du même type que ci-dessus), DEAE-Biogel A (billes de gel d'agarose dérivé et réticulé de la firme Bio Rad), Selectacel DEAE- cellulose Grannular de la firme Brown Co., Vistec D2 et D3 (Grannular DEAE-cellulose de viscose de la firme Viscose Groupe Ltd), DEAE Sephacel (billes de DEAE-cellulose de la firme Pharmacia), billes de DEAE- Cellulose (brevet des Etats-Unis 4 090 022), billes de DEAE-Cellulose (de la firme Polytechna, Tchécoslovaquie), verre poreux contrôlé de la firme Corning Glass et alumine, titane, zircone poreuses contrôlées de la firme
Corning Glass.
De préférence, on utilisera des supports qui sont gchan-
geurs d'anions faiblement basiques. On préfère les supports de type
DEAE Sephadex ou DEAE-Cellulose.
On peut adsorber sur ces supports des enzymes très variées; le support particulier peut être choisi facilement par le spécialiste en la matière avec une expérimentation minimale. On utilisera de préférence des enzymes telles que la glucose-isomêrase, la glucoamylase, l'aminoacylase, l'invertase, la B-glucanase, la
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glucose-1-oxydase et la glucose-2-oxydase.
Si l'immobilisation est basée uniquement sur une attrac-
tion électrostatique, il est possible que les produits de conjugai-
son se dissocient lorsqu'on fait varier la force ionique, le pH ou la température du mélange de réaction. Il est préférable de choisir une enzyme qui se fixe avec une haute affinité sur le support si l'on veut minimiser ces effets. On peut cependant accroître la charge de la protéine par une modification chimique, comme Solomon et Levine l'ont fait pour l'amyloglucosidase (Biotechn. Bioeng.
16:1161 [1974]). La glucose-isomérase constitue une enzyme particu-
lièrement appropriée à la mise en oeuvre de l'invention.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids, sauf mention contraire. On trouvera dans ces exemples des détails spécifiques
relativement à une combinaison particulière enzyme/support.
Exemple 1
Dans cet exemple, on décrit l'addition périodique d'une glucose-isomgrase soluble, partiellement purifiée, dans un réacteur d'isomérisation contenant un support chargé en partie dans des conditions telles que l'on maintient une vitesse d'isomérisation
constante et à un niveau élevé pendant 19 semaines supplémentaires.
Purification de l'enzyme soluble On filtre un lot de 1460 ml d'un bouillon de fermentation de Streptomyces rubiginosus et on remet les cellules en suspension
dans 730 ml d'eau déminéralisée et on filtre à nouveau deux fois.
On redisperse les cellules dans 1460 ml d'eau déminéralisée. On règle le pH de la dispersion à 6,5 par HCl dilué, et on ajoute 10 mg de lysozyme et 1700 ppm de produit du commerce Variquat (un chlorure de dimêthylalkylbenzylammonium). On soumet le mélange à incubation de 3,6 h à 40 C avec agitation modérée à la partie supérieure afin d'extraire l'isomérase soluble des cellules. On sépare l'enzyme soluble des débris cellulaires par filtration et on détermine une activité à l'analyse de 18 UIGI/ml (cf. Lloyd, N.E., Khaleeluddin,
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K. et Lamm, W.R. (1972), Cereal Chem. 49, 544 pour la description
du mode opératoire d'analyse. L'unité internationale de glucose-
isomérase est défînie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation du D-glucose en D-fructose à la vitesse de 1 pmol/ - min dans les conditions spécifiées (pH 7,0, 60 C, 2,0 M de glucose,
0,2 M de Mg+, 0,001 M Co, tampon maleate de sodium 0,2 M).
Supp2rtlpour l'immobilisation Le support basique faible utilisé pour immobiliser la
glucose-isomdrase soluble est une DEAE-cellulose granulaire (GDC).
Le procèdé général de préparation de ce produit dans lequel on agglomère de la cellulose broyée et une matière de charge par une matière plastique puis on fait réagir la cellulose avec le chlorure de diéthylaminoethyle qui lui confère des propriétés basiques faibles est décrit dans le brevet des Etats-Unis n 4 355 117 au nom de
la demanderesse.
Plus précisément, on mélange 16,31 kg de cellulose broyée C-100 de la firme International Filler Corp. et 10,87 kg d'alumine calcinée de la firme Reynolds RC-20 avec 27,18 kg de polystyrène à haute résistance au choc de la firme Hammond Plastics sur un laminoir à 200 C jusqu'à fusion de la matière plastique et jusqu'à homogénéité. La matière composite cellulosique granulaire est recueillie, broyée par de multiples passes au travers d'un broyeur
à marteauc et tamisée jusqu'à obtention d'une fraction à des dimen-
sions de particules de 0,177 à 0,42 mm. On disperse la matière tamisée (16,31 kg) dans une solution de sulfate alcalin constituée de 16,76 kg de sulfate de sodium, 2,17 kg d'hydroxyde de sodium et 53,6 1 d'eau. On chauffe la dispersion à 40 C et on ajoute sous agitation à l'aide d'une pompe doseuse au débit de 115 ml/min (durée d'addition environ 1 h) 6,41 kg d'une solution aqueuse à 50 % de
chlorhydrate du chlorure de diéthylaminoëthyle. On agite la disper-
sion pendant encore 30 min, on ajoute 3,26 kg de NaOH à 50 % puis encore 6,41 kg de chlorhydrate de chlorure de diéthylaminoéthyle à % comme cidessus. On chauffe la dispersion à 60 C, on.dilue par 57 1 d'eau, on règle à pH 4,5 par HCl et on lave sur un tamis à ouverture de mailles de 0,250 mm. On redisperse la GDC, on règle
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à pH 7,0-7,5 et on essore sur un tamis à ouverture de mailles
de 0,250 mm.
On mesure la capacité d'adsorption du support de la manière suivante: à 100 ml d'enzyme soluble on ajoute 2,63 g du support en matières sèches. COn règle à pH 7,0 et on agite la disper- sion modérément pendant 5 h. On suit l'adsorption par filtration de parties aliquotes à intervalles périodiques et mesure de l'activité
de l'isomgrase soluble.
Les résultats sont rapportés ci--après: Temps!.h Activité soluble1 IUGIIml % adsorbé
0 18,0 O
0,25 12,7 29,4
1 5,8 67,8
2 2,5 86,1
3 1,2 93,3
4 0,4 97,8
0 100
La capacité d'adsorption du support pour l'isom5rase soluble, telle que mesurée est donc d'environ 584 UIGI/g sur
matières sèches.
Immobilisation initiale de l'enzyme sur la GDC La GDC servant de support est partiellement chargée par l'isomgrase soluble, à environ 25 % de sa capacité, comme décrit ci-après: on disperse 14,8 g (matières sèches) de GDC dans l'eau déminéralisée et on règle à pH 7,0-7,1. On désaère la dispersion sous le vide de la trompe à eau à température ambiante pendant min puis on jette sur une colonne de verre à double enveloppe
de 2,54 cm de diamètre et 30,48 cm de longueur Ace Glass Adjusta-
chrom équipée d'un fond de verre fritt6. Le lit est garni sur une hauteur de 9 cm. Sur le sommet du lit, on place des billes de verre (10,7 cm) afin de répartir le courant. La GDC est chargée par pompage de 145 ml (2 600 UIGI) d'isomérase soluble en courant
descendant sur le lit au débit de 1 ml/min et à température ambiante.
On ne trouve pas d'activité soluble mesurable au-dessous du lit.
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Mesure de l'activité de l'isomérase immobilisée On règle à 61 C l'eau de la double enveloppe de la colonne. On commence à faire passer en courant descendant au travers du lit d'isomgrase immobilisée, au débit de 0,4 ml/min, une solution à 50 % de dextrose cristallisé à pH 7,8, contenant 5 mM de MgSO4 et mM de NaHSO3. On fait fonctionner la colonne pendant 16 h. On prélève un échantillon de l'effluent pour analyse et on détermine l'activité immobilisée par l'équation suivante:
I - I
e o E = RC In t kf Ie I dans laquelle Et = activité immobilisée totale en UIGI R = débit en ml/h C = concentration en monosaccharide en g/ml kf = constante de vitesse de réaction à 61 C (0,019 g/UIGI/h) I = degré d'isomérisation de l'effluent concentration en fructose concentration en monosaccharide I = I de l'alimentation = O pour le dextrose cristallisé I = I à l'équilibre = 0,510 à 61 C e Le degré d'isomérisation, I, est mesuré par polarim9trie de la manière suivante: on dilue des échantillons de l'alimentation et de l'effluent de la colonne à 20 fois le volume initial par de l'eau déminéralisée et on maintient au repos pendant 1 h pour arriver a l'équilibre de la rotation. On procède aux mesures de rotation sur un polarimètre Perkin Elmer modèle n 241 à 25 C avec une source de mercure à une longueur d'onde de 576 nm. On règle l'instrument à zéro en plaçant de l'eau dans la cellule et on procède aux mesures de rotation en degrés de l'alimentation et de
l'effluent dilués.
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rotation de l'alimentation - rotation de l'effluent AI= x facteur g de monosaccharide/ml d'alimentation ou (2) d'effluent dilué avec AI = I - I o D facteur = L(lad] - af]) D = facteur de dilution (5 ml + 100 ml) = 20 L = longueur de la cellule du polarimètre = 1 dm lad] - [af] = variation de la rotation spécifique pour la conversion de dextrose pure en fructose pure, la mesure à
la lumière du mercure donne le résultat de 167,33.
Facteur = 0,1195.
L'activité immobilisée déterminée par cette méthode d'analyse est de 1548 UIGI, ce qui indique que sur les 2 600 UIGI d'activité soluble chargée sur le support, on retrouve 60 % en
activité immobilisée.
Isomérisation et addition ú_riodique d'enzyme On règle à pH 7,8 une solution à 50 % d'hydrolysat d'amidon de mais contenant 95 % de dextrose sur matières sèches, mM de MgS04 et 5 mM de NaHSO3 et on commence à faire passer en
courant descendant au travers du lit d'isomérase immobilisée à 610 C.
Le débit initial au travers de la colonne est calculé à partir de l'équation 1 et réglé de manière à donner un taux de conversion en fructose d'environ 44 %. Ce débit d'environ 17 ml/h est maintenu constant, sauf durant la mesure de l'activité immobilisée. La teneur en fructose de l'effluent est mesurée essentiellement par la méthode
utilisée pour déterminer le degré d'isomérisation.
% de fructose = 100 Id
d étant la teneur en monosaccharide de l'effluent exprimée en frac-
tions des matières sèches totales.
La teneur en fructose tombe progressivement en 16 jours jusqu'à 40 % environ; à ce moment,on procède à la première addition d'enzyme soluble. Une mesure de l'activité immobilisée indique qu'il faut environ 800 UIGI pour retrouver l'activité perdue et ramener
à 44 % le taux de conversion en fructose.
Par conséquent, on ajoute 40 ml d'enzyme (720 UIGI) à 126 ml de la solution à 50 % de dextrose cristallisé contenant des sels dont il a été question ci dessus. On fait passer l'alimen- tation de la colonne vers la solution de dextrose contenant l'enzyme et on fait couler au debit de 0,3 ml/min jusqu'à épuisement. On
constate que l'effluent sortant de la colonne au cours de l'opéra-
tion d'adsorption de l'enzyme ne contient pas d'isomérase soluble
(mesure par incubation de l'effluent pendant 16 h à 61 C et déter-
mination de l'augmentation de la teneur en fructose). On poursuit l'alimentation par la solution de dextrose cristallisé pour mesurer
l'augmentation de l'activité immobilisée. On revient à l'alimen-
tation par l'hydrolysat d'amidon de mais et on constate que dans
l'effluent, le taux de fructose est revenu à 44 %.
Cette séquence d'opération dans laquelle on laisse la teneur en fructose de l'effluent tomber progressivement à 40 % environ, on fait passer à l'alimentation par une solution de dextrose
cristallisé pour détermination de l'activité immobilisée, on intro-
duit des compléments d'enzyme soluble dans le courant d'alimentation
en dextrose, on mesure à nouveau l'augmentation de l'activité immo-
bilisée et on revient à l'alimentation par l'hydrolysat d'amidon de maïs est poursuivie pendant 17 semaines. Pendant les 10 semaines restantes de l'opération, on modifie la séquence en supprimant la mesure de l'activité immobilisée avant et après l'addition de l'enzyme. On procède alors à l'addition périodique d'une quantité constante d'enzyme soluble. Pendant ce temps, la teneur en fructose varie uniquement entre les limites arbitraires de 40--44 %, le débit étant maintenu constant. Naturellement, des limites plus étroites pourraient être fixées mais nécessiteraient des additions plus
fréquentes d'enzyme soluble.
Après 7,5 semaines d'opération, on a doublé l'activité
enzymatique dans la colonne sans effet significatif sur les opéra-
tions autres que la possibilité d'opérer à un débit plus rapide pour obtenir 40-44 % de fructose. Apres 13 semaines d'opération, on
12 - 568586
abaisse la teneur en sels de l'hydrolysat d'amidon de mals à I mM
de MgSO4 (contre 5 mM) et 2 mM de NaHSO3 (contre 5 mM).
Au bout de 20 semaines, une analyse de l'effluent prélevé au cours de la charge par l'enzyme indique une fuite de l'activité soluble. La dernière addition d'enzyme faite avant cette fuite a
porté l'enzyme totaleadsorbge à un niveau de 649 UIGI/g, c'est-à-
dire proche de la capacité mesurée à l'origine, de 684 UIGI/g. Les fuites augmentent au cours des opérations subséquentes de charge, ceci bien que l'enzyme fraîche soit adsorbée en quantité suffisante pour maintenir le taux de conversion du fructose à plus de 40 %. Le fait que l'enzyme soit encore adsorbée après que la capacité mesurée à l'origine ait été dépassée indique qu'une petite quantité d'enzyme
inactive peut avoir été d9sorbge.
On trouvera dans le tableau I ci-après les chiffres des productions de fructose et des additions d'enzyme pendant les 27 semaines d'opération. La quantité de fructose produite est
exprimée en grammes de sirop de fructose à 43 %, en matières sèches.
La production réelle hebdomadaire de fructose a été normalisée en
production de fructose à 43 %.-
TABLEAU I
ADDITIONS D'ENZYME ET RESULTATS DE L'ISOMERISATION
Addition Accumulation Fructose Accumulation de fructose, Efficacité de Semaine d'enzyme, d'enzyme moyen, g de produit à 43 % l'enzyme, UIGI/g UIGI UIGI % de matières sèches en fructose à 43%
1 2600 2600 43,7 2059 1,26
2 42,5 3606 0,72
3 720 3320 39,1 4851 0,68
4 42,3 6533 0,51
43,1 8292 0,40
6 41,6 9891 0,34
7 39,8 11298 0,29
8 3200 6520 39,5 12379 0,53
9 44,7 15293 0,43
44,6 18302 0,36
11 43,5 20476 0,32
12 43,6 22789 0,29
13 470 6990 41,1 24856 0,28
14 940 7930 41,4 26764 0,30
44,3 29322 0,27
16 40,4 31298 0,25
17 940 8670 43,4 33733 0,26
18 40,7 35433 0,24
19 940 9610 43,2 37949 0,25
940 10550 42,7 40162 0,26
21 42,0 42264 0,25
22 940 11490 43,3 44497 0,26
23 41,9 46730 0,25 Ln o' 24 940 12430 41,9 48811 0,25 co 44,5 51011 0,24 Ln 26 43,0 52737 0,24 Co
27 770 13200 41,1 54528 0,24
14 2568586
Exem2le 2 Cet exemple décrit le chargement sur colonne dans lequel on utilise une glucose-isomérase soluble à haute pureté pour le
chargement partiel initial du support et pour les additions subsg-
quentes. Les opérations sur colonne sont les mêmes que dans l'exemple, le debit d'alimentation de l'hydrolysat d'amidon de mais est maintenu constant et on procède à l'introduction par le conduit d'alimentation,
périodiquement, d'enzyme soluble dans une solution de dextrose cris-
tallisé. On maintient ainsi le taux de conversion en fructose entre 40-44 % pendant 14 semaines. L'hydrolysat d'amidon de mais raffiné à 45 % de matières sèches utilisé à l'alimentation contient environ % de dextrose, 1,5 mM de MgSO4 et 2,0 mM de NaHSO3. Le pH du liquide d'alimentation est maintenu aux environs de 7,8, donnant un effluent à pH 7,5; la température du lit d'enzyme immobilisée est
maintenue à 60 C.
Purification de la glucose-isomfrase soluble On extrait un bouillon de fermentation de Streptomyces rubiginosus et on libère la glucoseisomgrase soluble des cellules comme décrit dans l'exemple 1 mais on ne sépare pas les cellules du bouillon et on les lave avant extraction. On purifie une portion de 2 350 ml de l'extrait filtré par fractionnement sur une colonne de DEAE-cellulose granulaire. Cette DEAE-cellulose granulaire est la même qui a servi de support pour l'enzyme immobilisée de l'exemple 1. Pour la préparation de la colonne, on équilibre 300 g de GDC en matières sèches dans du tampon au tris 10 mM et on coule la suspension dans une colonne de chromatographie de 5,08 cm en formant un lit uniforme. On lave la colonne avec 2 1 de tampon mM au tris au débit de 10 ml/min ou jusqu'à ce que le pH de
l'effluent soit de 7 environ.
La solution d'enzyme contenant 29,3 UIGI/ml est intro-
duite dans la colonne en courant descendant au débit de 5 ml/min.
Apres introduction de l'enzyme, on lave la colonne avec 3,5 1 de
NaCl 0,1 m dans du tampon au tris 10 mM à pH 7 au débit de 10 ml/min.
On suit la teneur en enzyme des fractions d'effluent par absorption dans l'ultraviolet et mesure de l'activité enzymatique. On recueille
1 5 2568586
les fractions contenant plus de 20 UIGI/ml (900 ml) pour purificationcomplémentaire par ultrafiltration. On les soumet à ultrafiltration sur une membrane Amicon XM-100 dans une cellule Amicon 407 agitée sous une pression manométrique d'azote de 7 bars. Le produit retenu dans l'ultrafiltre contient 800 UIGI/ml d'enzyme à environ 50 % de pureté. LSuú2ppour l'immobilisation On introduit dans une colonne de verre comme décrit dans
l'exemple I de la GDC servant de support (7,75 g en matières sèches).
On charge ce support d'enzyme purifiée à environ 25 % de sa capacité
par pompage en courant descendant d'une solution de dextrose cris-
tallisé à 50 % (pH 7,8, 5 mM de MgSO4, 5 mM de NaHSO3) contenant 136 ml de l'enzyme purifiée diluée dans le rapport de 1:40 (2720 UIGI) au débit de 0,4-0,7 ml/min. On ne trouve pas d'enzyme soluble dans
l'effluent. On poursuit le passage de la solution de dextrose cris-
tallisé (pH 7,8, 5 mM de MgS04, 5 mM de NaHS03) pour l'analyse et on règle la température de l'eau de la double enveloppe de la colonne
de manière que la température du lit soit de 60 C.
Mesure de l'activité immobilisée L'activité immobilisée déterminée par la méthode de mesure de l'exemple 1 est de 1 686 UIGI pour une expression de l'activité
basée sur une activité de 62 % de l'enzyme adsorbée.
Isomérisation et addition reriodigLe d'enzyme On commence à faire passer l'hydrolysat d'amidon de mais au travers du lit d'enzyme immobilisée et on règle le débit de
manière à atteindre un taux de conversion du fructose de 40-44 %.
Le débit est maintenu constant à environ 0,35 ml/min pendant la durée de l'essai. Lorsque le taux de conversion du fructose diminue dans le cours du temps à la suite de la dégradation de l'enzyme, on ajoute une
fraction aliquote de 20 ml d'isomérase soluble purifiée, diluée, conte-
nant 434 UIGI à une solution de dextrose cristallisé à 50 % (pH 7,8,
16 2568586
mM de MgSO4, 5 mM de NaHS03) et on pompe la solution au travers du lit au débit d'environ 0,4 ml/min. Après l'adsorption, on revient à l'alimentation par l'hydrolysat d'amidon de mais. On trouvera dans le tableau II ci-après les résultats obtenus à l'isomérisation en fonction des additions d'enzyme. Comme dans l'exemple 1, on maintient un taux de conversion essentiellement constant du fructose à un débit constant au moyen d'additions périodiques d'isomérase soluble.
TABLEAU II
ADDITIONS D'ENZYME ET RESULTATS DE L'ISOMERISATION
Addition Accumulation Fructose Accumulation de fructose, Efficacité de Semaine d'enzyme, d'enzyme, moyen, g de produit à 43 %, l'enzyme, UIGI/g UIGI UIGI % bases sèches de fructose à 43 %
1 2720 2720 33,5 1608 1,69
2 434 3154 41,3 3149 1,00
3 434 3588 42,9 4756 0,75
4 3588 43,6 6117 0,59
434 4022 42,3 8236 0,49
6 4022 43,1 9664 0,42
7 434 4456 41,6 11240 0,40
8 434 4890 41,0 12924 0,38
9 4890 41,9 14585 0,34
434 5324 45,1 16366 0,33
11 5324 43,2 18152 0,29
12 434 5758 42,1 19535 0,29
13 5758 42,4 21108 0,27
14 5758 38,7 22624 0,25
ul Co Un OO
Claims (17)
1. Procédé pour maintenir constante l'activité d'une enzyme immobilisée dans un réacteur, caractérisé en ce-que: a) on adsorbe sur un support solide, dans des conditions appropriées, une quantité d'enzyme représentant un niveau d'activité déterminé, inférieur à la capacité maximale d'adsorption dudit support; et b) on maintient ledit niveau déterminé d'activité au fur et à mesure que l'activité de l'enzyme adsorbée à l'origine diminue au-dessous de ce niveau en adsorbant des compléments de l'enzyme sur ledit support.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en outre en ce que l'on suit par analyse l'activité enzymatique avant
d'adsorber des compléments d'enzyme.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce
que le support est une matière adsorbante échangeuse d'anions faible-
ment basique.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support faiblement basique consiste en l'un des produits du commerce Amberlite IRA-93, Diaion WA-30, Diaion WA-11, Amberlite IR-45, Duolite ES-561, Duolite ES-562, Duolite ES-568, DEAE Sephadex, DEAE Glycophase, QAEGlycophase, Selectacel DEAE-cellulose, Vistec
D2, Vistec D, DEAE-Sephacel, ou billes de DEAE-Cellulose.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que
le support consiste en DEAE Sephadex ou DEAE cellulose.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,
caractérisé en ce que la quantité d'enzyme représente d'environ 1 à
% de la capacité maximale de charge du support.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que
la quantité d'enzyme représente d'environ 10 à 50 % de la capacité.
8. - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que
la quantité d'enzyme représente environ 25 % de la capacité.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8
dans lequel on suit l'activité de l'enzyme en déterminant périodi-
quement la quantité de produit formée par l'enzyme.
19 2568586
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9,
dans lequel on ajoute les compléments d'enzyme en poursuivant la
réaction de l'enzyme immobilisée.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les compléments d'enzyme sont introduits dans le courant d'alimen- tation.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11,
dans lequel l'enzyme est une aminoacylase, une invertase, une 8-
glucanase, une glucose-l-oxydase, une glucose-2-oxydase, une gluco-
amylase, ou une glucose-isomérase.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que
l'enzyme est la glucose-isomérase.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le produit formé est le fructose et le courant d'alimentation contient
du dextrose.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14,
caractérisé en ce que l'enzyme peut être retenue par un adsorbant ionique aussi bien sous une forme ayant l'activité enzymatique que
sous une forme inactive.
16. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la glucose-isomérase immobilisée est mise en contact avec une solution de dextrose de manière à produire en continu du
fructose à un taux de conversion de 40-44 %.
17. Procédé selon la revendication 16, mis en oeuvre en continu, caractérisé en ce que: a) on adsorbe sur le support solide, dans des conditions appropriées,
une quantité de glucose-isomérase capable de former un produit conte-
nant 40-44 % de fructose, ladite quantité représentant environ 25 % de la capacité de charge maximale dudit support; b) on suit la formation du produit contenant 40-44 % de fructose; et c) on adsorbe sur le support des compléments de glucose-isomérase de manière à maintenir la formation d'un produit contenant 40-44 % de
fructose lorsque le pourcentage de fructose formé par la glucose-
isomérase adsorbée au préalable tombe au-dessous de 40 %.
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