FI91279C - Menetelmä reaktorissa olevan immobilisoidun entsyymin aktiivisuuden pitämiseksi vakiona - Google Patents

Description

i 91279

MenetelmS reaktorissa olevan immobilisoidun entsyymin ak-tiivisuuden pitSmiseksi vakiona TSma keksinto koskee immobilisoitujen entsyymien 5 teknologiaa. Tarkemmin sanoen t3m&n keksinnOn kohteena on jatkuva menetelmå syOttOvirran glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi glukoosi-isomeraasilla.

Vaikka proteiinin immobilisoinnista voidaan lOytåå esimerkkeja, jotka ovat peraisin 1920-luvun alusta (Nel-10 son, J.M. ja D.I. Hitchcocks, J. Amer. Chem. Soc. 46; 1956 (1921)), voimakas mielenkiinto tahan ilmiOOn on ollut il-meinen viimeiset 25 vuoden ajan. Immobilisointitavat voidaan jakaa neljaan yleiseen luokkaan; (1) sulkeminen kan-tajaan, (2) ristiinsidonta, (3) kovalenttinen sidonta ja 15 (4) adsorptio.

Sulkeminen kantajaan perustuu yleensa sulkemiseen silloitettuihin geeleihin tai kapselointiin onttoihin kui-tuihin, liposomimikrokapseleihin yms. Ristiinsidonta kå-sittaa entsyymin modifioinnin lisaamålia ns. bi- tai moni-20 funktionaalisia ristiinsidontareagensseja, mita seuraa usein adsorptio tai kapselointi. Kovalenttiseen sidontaan, joka on laajimmin tutkittu immobilisointitapa, liittyy entsyymin kovalenttinen sidonta kantajaan funktionaalisten ryhmien avulla, jotka ovat epaoleellisia entsyymin biolo-25 gisen aktiivisuden kannalta. Adsorptio aikaansaadaan yk- sinkertaisesti saattamalla entsyymi kosketukseen adsorp-tioaineen kanssa ja antamalla immonilisaation tapahtua entsyymin ja adsorptioaineen vålisten suhteellisen heikko-jen sidosvoimien vaikutuksesta.

30 Juuri tåtå viimemainittua immobilisointitapaa tama keksinto låhinnS koskee; tåmSn vuoksi tiettyjå adsorptio-periaatteita selvitetaan téydellisemmin seuraavassa. On olemassa laajoja katsauksia sulkemisesta kantajaan, ris-tiinsidonnasta ja kovalenttisesta sidonnasta (kts. esim.

35 Weetal. H.H., ed "Immobilized Enzymes, Antigens, Anti- 2 bodies and Peptides", M. Dekker, New York, (1975) tai Za-borsky O.R. "Immobilized Enzymes" CRC Press. Cleveland, (1973)).

EnsimmSiset adsorptiota koskevat tutkimukset osoit-5 tivat, etta tietyisså tapauksissa adsorptio saattoi johtaa entsyymin osittaiseen tai taydelliseen inaktivoitumiseen. Taman vuoksi on ymmårrettSvåS, etta sopiva adsorptioaine taman keksinnttn toteuttamiseen on sellainen, jolla on suh-teellisen suuri affiniteetti entsyymin suhteen ja joka 10 kuitenkin aiheuttaa mahdollisimman vahån inaktivoitumista.

Immobilisointi adsorptiolla sellaisiin kantajiin kuin alumiinioksidiin, bentoniittiin, kalsiumkarbonaat-tiin, selluloosaan, kollageeniin, ioninvaihtohartseihin, kaliniittiin. Sephadex-hartsiin, piidioksidigeeliin ja 15 titaanilla paailystettyyn ruostumattomaan terakseen on tunnettua.

Vaikka tama keksintG on sovellettavissa laajaan joukkoon adsorboituja entsyymisysteemeja kuten jaijempana selostetaan, se soveltuu erityisesti sellaisten prosessien 20 hyOdyntamiseen, joissa kaytetaan immobilisoitua glukoosi- isomeraasia.

Suurin osa fruktoosista tuotetaan kaupallisesti isomeroimalla dekstroosia (tarkkelyksesta) fruktoosiksi reaktorissa, jolloin dekstroosiliuos johdetaan immobili-25 soitua glukoosi-isomeraasia sisaitavan kerroksen lapi. Poistovirran fruktoosipitoisuus pidetaan tyypillisesti va-kiona esim. 40-44 %:na saatamaiia virtausnopeutta reakto-rin lapi. Koska immobilisoitu entsyymi tuhoutuu luonnos-taan termisen ja kemiallisen inaktivoitumisen vuoksi, vir-30 tausnopeutta pienennetaan jaksoittaisesti. Kun on saavu-tettu virtausnopeus, jota ei enaa kaytannossa kannata pie-nentaa, immobilisoitu entsyymi korvataan uudella immobilisoitua entsyymia sisåltavålia kerroksella. Koska kolon-nin virtausnopeus sen elinian aikana voi vaihdella esim. 35 vaiilia n. 50-5 g/min, on kaytettåva lukuisia kolonneja 91279 3 låhes muuttumattoman tuotantonopeuden aikaansaamiseksi.

Erityisen hyodyllisiå systeemeja glukoosi-isomeraa-sin immobilisoimiseksi on esitetty US-patenteissa 3 788 945, 3 909 354, 3 110 164, 4 168 250 ja 4 355 117.

5 US-patentissa 3 960 663 kuvataan liukoisen glukoosi-isome-raasin jaksoittainen lisååminen dekstroosisydttdvirran kautta isomerointireaktoriin, joka sisaitaa immobilisoitua glukoosi-isomeraasia. Glukoosi-isomeraasi inunobilisoidaan vahvasti emåksiseen anioninvaihtohartsiin, jonka koko ka-10 pasiteetti on tåytetty liukoisella glukoosi-isomeraasilla.

Kun entsyymi hajoaa, sen adsorptio-ominaisuudet muuttuvat siten, etta inaktiivinen entsyymi irtoaa kantajasta, ja sita esiintyy eluentissa. Patentissa neuvotaan korvaamaan huuhtoutunut entsyymi saattamalla kantaja kosketukseen 15 tuoreen entsyymin kanssa, jonka mfiSrå on riittåva panosta-maan kantajan kokonaan uudelleen. Koska kSytettyS entsyy-mia huuhtoutuu jatkuvasti pois adsorptioaineesta, eluentti on saatettava lisåpuhdistusvaiheeseen siinS epapuhtautena olevan entsyymin poistamiseksi.

20 Tåmån keksinnon soveltaminen johtaa merkittSviin etuihin verrattuna tavanomaisiin reaktioihin seuraavissa suhteissa: (1) operaatioiden yksinkertaistaminen - tarve jaksoittaisesti sååtåå reaktorivirtauksia jéisi pois; (2) pienempi pååomainvestointi - tarvittaisiin pienempiå reak-25 toreita muutaman suuren reaktorin sijasta johtuen vaihte-levien virtausnopeuksien eliminoimisesta; (3) parantunut tuotannon valvonta - voitaisiin saavuttaa suuremmat fruk-toosipitoisuudet lisåamålia liukoisempaa entsyymia reakto-riin tarvitsematta pienentaa virtausnopeuksia; ja (4) pie-30 nentyneen tuotteen jalostuskustannukset - koska erittain hitaat virtausnopeudet ja tastå johtuen pitkat viipymis-ajat eliminoitaisiin, varin ja sivumakujen muodostuminen vahenisi.

Tama keksintd kohdistuu menetelmaan immobilisoidun 35 entsyymin vakioaktiivisuuden yliapitamiseksi reaktorissa 4 adsorboimalla kiinteSMn kantajaan adsorboivissa olosuh-teissa sellainen måara entsyymia, joka edustaa ennalta maarattyå aktiivisuustasoa ja on vahemmån kuin taman kan-tajan maksimikantokyky; ja adsorboimalla lisamaaria ent-5 syymia sanottuun kantajaan ennalta maaratyn aktiivisuus-tason yliapitamiseksi, kun aikaisemmin adsorboidun entsyy-min aktiivisuus laskee sanotun ennalta maaratyn tason ala-puolelle. Entsyymin jaksoittaista lisaamista jatketaan, kunnes kantajan maksimikantokyky on saavutettu. KeksintO 10 on erityisen hyOdyllinen immobilisoidun glukoosi-isomeraa-sin reaktion aktiivisuuden yliapitamisessa, jota reaktiota voidaan kayttaa esimerkiksi fruktoosin valmistuksessa glu-koosista. KeksinnGn mukaiselle menetelmaile glukoosin im-mobilisoimiseksi fruktoosiksi on tunnusomaista se, mita 15 patenttivaatimuksessa 1 esitetaan.

paatekija maaritettaessa immobilisoidun entsyymin avulla suoritettavan prosessin tehokkuutta on sen ajan pi-tuus, jonka entsyymipanos såilyy aktiivisena. Kuten ylia mainittiin entsyymi hajoaa luonnostaan, kun prosessi jat-20 kuu. Vaikka ei haluta sitoutua mihinkaan maarattyyn teo-riaan siita, kuinka entsyymit hajoavat, arvellaan etta seka terminen etta kemiallinen denaturoituminen ovat hajo-amiseen vaikuttavia tekijOita.

Erås ratkaisu tahan ongelmaan on ollut yksinker-25 taisesti pienentaé reagenssien virtausta immobilisoidun systeemin lapi, kun systeemien tehokkuus laskee. Mutta koska virtausnopeudet voivat vaihdella kertoimella 10 tai enemmånkin, on vaittamåtbnta kayttaa kolonnisarjaa jatku-van tuotannon aikaansaamiseksi. Muita ratkaisuja ovat ol-30 leet systeemin operaatioiden keskeyttaminen jaksoittaises- ti, kaytetyn entsyymin poistaminen ja uudelleenpanostus tuoreella entsyymilia: tai kuten US-patentissa 3 960 663 on esitetty, tuoreen entsyymin lisaaminen jaksoittaisesti, kun kaytetty entsyymi huuhtoutuu eluenttiin.

35 Taman keksinndn mukaisesti ongelma ratkaistaan ta- 5 91279 valla, joka on parempi kuin yllå selostetut sikåli, etta tuoretta entsyymiå voidaan lisåtå systeemiin keskeyttåmåt-ta operaatiota, tuotantoa voidaan pitaå muuttumattomalla tasolla tai haluttaessa sitå voidaan lisåtå ja eluentti on 5 oleellisesti vapaa kåytetysta entsyymistå.

Tama keksinto kohdistuu menetelmaan, jossa immobi-lisoidun systeemin alkuperåisen valmistuksen aikana entsyymiå lisåtåan kantajaan måarå, joka on pienempi kuin ad-sorptioaineen maksimikantokyky, ts. kantaja alikuormite-10 taan; muuttumaton tuotanto yllåpidetåån siten syottamålla tuoretta entsyymiå tarpeen mukaan siihen saakka, kunnes saavutetaan kantajan maksimikantokyky.

Koska adsorptioon perustuvaan immobilisointitek-niikkaan vaikuttavat entsyymin ja kantajan våliset varaus-15 vuorovaikutukset, entsyymin ja kantajan våliset hydrofobi- set vuorovaikutukset jne. kulloisenkin entsyymikantaja-yhdistetåån valinta on mååritettåvå kokeellisesti. Kåytto-kelpoisia kantajia ovat: 1. Heikosti emåksiset polystyreenihartsit, kuten: 20 Amberlite IRA-93 (Rohm & Haas), Diaion WA-30 (Mitsubishi),

Diaion WA-11 (Mitsubishi), Amberlite IR-45 (Rohm & Haas); 2. Heikosti emåksiset (-N(R)2)fenoli-formaldehydi-hartsit, kuten: Duolite EA-561 (Disunond Shamrock), Duolite ES-562 (Diamond Shamrock), Duolite ES-568 (Diamond Sham- 25 rock); 3. Sekalaiset entsyymiadsorbentit, kuten: DEAE-

Sephadex (derivoitu silloitettu dekstraani - Pharmacia), DEAE-Glycophase (huokoisuudeltaanvalvottu lasi, joka on påållystetty hiilihydraatilla ja derivoitu - Pierce Chemi- 30 cal Co), QAE-Glycophase (yllå mainitun vahvasti emaksinen vastine), DEAE-Biogel A (derivoituja, silloitettuja aga-roosigeelihelmiå - Bio Rad), Selectacel DEAE-selluloosa Grannular. Brow Co., Vistec D 2 ja D 3 (Grannular DEAE-selluloosa viskoosista - Viscose Group Lts.), DEAE-Sepha-35 cel (helmimåinen DEAE-selluloosa - Pharmacia), DEAE-sellu- 6 loosahelmet (US-patentti 4 090 022), DEAE-selluloosahelmet (Polytecha, Tsekkoslovakia), valvotusti huokoinen lasi (Corning Glass) ja valvotusti huokoinen alumiinioksidi, titaanioksidi, sirkoniumoksidi (Corning Glass).

5 On edullista kåyttåå DEAE Sephadex tai DEAE-sellu- loosatyyppisia kantajia.

Suuri joukko entsyymejå voidaan adsorboida yllå mainituille kantajille; alaan perehtynyt voi helposti va-lita kulloisenkin kantajan ilman kohtuutonta kokeilua. On 10 edullista kåyttåa sellaisia entsyymejå kuin glukoosi-iso-meraasia, glukoamylaasia, aminoasylaasia, invertaasia, β-glukanaasia, glukoosi-l-oksidaasia ja glukoosi-2-oksidaa-sia.

Jos immobilisaatio perustuu pelkåståån såhkostaat-15 tiseen vetovoimaan, konjugaateilla on mahdollisuus disso-sioitua, kun reaktion ionivahvuus, pH-arvo tai låmpotila vaihtelee. Nåiden vaikutusten minimoimiseksi on edullista valita entsyymi, joka sitoutuu halukkaasti kantajaan. Vaihtoehtoisesti on mahdollista lisåtå proteiinin varausta 20 kemiallisella modifioinnilla, kuten Solomon ja Levine te-kivåt amyloglukosidaasilla (Biotech, Bioeng. 16:1161 (1974)).

Esimerkki 1

Tamå esimerkki kuvaa osittain puhdistetun, liukoi-25 sen glukoosi-isomeraasin ajoittaista lisååmistå isomeroin-tireaktoriin, joka sisålsi osakapasiteetiltaan entsyymillå tåytettyå kantajaa, sillå tavoin, ettå olennaisesti muut-tumaton isomerointinopeus såilyi kohotetulla tasolla 19 lisåviikkoa.

30 Liukoisen entswmin puhdistus 1460 ml:n Streptomyces rubiginosus-kåymislientå suodatettiin ja solut suspendoitiin uudelleen 730 ml:aan ionivaihdettua vettå ja suodatettiin kahdesti uudelleen. Solut lietettiin uudelleen 1460 ml:aan ionivaihdettua vet-35 tå. Lietteen pH såådettiin arvoon 6,5 laimealla HCl:lla ja 91279 7 10 mg lysotsyymiS ja 1700 ppm Variquat-valmistetta (dime-tyylialkyylibentsyyliammoniumkloridi) lisattiin. Seosta inkuboitiin 40 °C:ssa 3,6 tuntia varovasti ylhaåltåpain sekoittaen liukoisen isomeraasin uuttamiseksi soluista.

5 Liukoinen entsyymi poistettiin solujatteista suodattamalla ja sen mååritettiin sisåltavån 18 IGIU/ml. Maaritysmene-telmSn kuvauksen suhteen ks. Lloyd, N.E., Khaleeluddin, K. ja Lamm, W.R. (1972), Cereal Chem. 49, 544. Kansainvalinen glukoosi-isomeraasiyksikkO maariteliaan siksi entsyymimaa-10 rfiksi, joka katalysoi D-glukoosin muuttumisen D-fruktoo-siksi nopeudella 1 pmol/min måaritellyissa olosuhteissa (pH 7,0, 60 °C, 2,0-M glukoosi, 0,2-M Mg**, 0,001-M Co** ja 0,2-M natriummaleaattipuskuri).

Immobilisoinnissa kaytettv kantaia 15 Heikosti emaksinen kantaja, jota kaytettiin liukoi sen glukoosi-isomeraasin immobilisointiin, oli raemainen DEAE-selluloosa (GDC). Yleinen valmistusmenetelma, jolla jauhettu selluloosa ja painonlisaysaine agglomeroidaan muovin kanssa ja sen jaikeen selluloosa muutetaan dietyy-20 liaminoetyylikloridilla ominaisuuksiltaan heikosti emaksi- seksi on kuvattu US-patentissa 4 355 117, jonka haltija on Nabisco Brands, Ins.

Tarkemmin sanoen seos, jossa oli 16,3 kg C-100-jau-hettua selluloosaa (International Filler Corp.) ja 10,9 kg 25 kalsinoitua alumiinioksidia (Reynolds RC-20), seostettiin 27,2 kg:n kanssa iskunkestoista polystyreenia (Hammond Plastics) 200 °C:n telamyllylia, kunnes muovi oli sulaa ja seos homogeeninen. Raemainen selluloosayhdistelma jaåhdy-tettiin, jauhettiin johtamalla useita kertoja vasaramyllyn 30 lapi ja seulottiin niin ettS saatiin 40-80 U.S. Standard-meshin jae (halkaisija 0,18 - 0,42 mm). Seulottu materiaa- 11 (16,3 kg) lietettiin alkaliseen sulfaattiliuokseen, . joka sisalsi 16,8 kg natriumsulfaattia, 2,2 kg natriumhyd- roksidia ja 53,4 1 vetta. Liete kuumennettiin 40 °C:seen 35 ja 6,42 kg dietyyliaminoetyylikloridin hydrokloridin 50- 8 %:ista vesiliuosta annosteltiin lietteeseen sekoittaen ja nopeudella 115 ml/min (lisåysaika n. Ih). Lietettå sekoi-tettiin vielå 30 minuuttia, 3,3 kg 50-%:ista NaOH:a lisåt-tiin ja toiset 6,42 kg dietyyliaminoetyylikloridin hydro-5 kloridin 50-%:ista vesiliuosta annosteltiin kuten yllå. Liete kuumennettiin 60 °C:een, laimennettiin 56,8 1:11a vettå, pH såådettiin arvoon 4,5 HCl:lla ja se pestin 60 meshin (0,25 mm) ravistusseulalla. GDC lietettiin uudel-leen, pH såådettiin arvoon 7,0 - 7,5 ja vesi poistettiin 10 60 meshin (0,25 mm) seulalla.

Sarjan adsorptiokyky mitattiin seuraavasti: 100 ml:aan liukoista entsyymiå lisåttiin 2,63 g kuivaksi laskettua kantajaa. pH såådettiin arvoon 7,0 ja lietettå sekoitettiin varovasti 5 tuntia. Adsorptiota seurattiin 15 suodattamalla nåytteet mååråtyin aikavålein ja mittaamalla liukoisen isomeraasin aktiivisuus.

Aika. h Liukoinen aktiivisuus IGIU/ml % adsorboitunut 0 18,0 0 20 0,25 12,7 29,4 1 5,8 67,8 2 2,5 86,1 3 1,2 93,3 4 0,4 97,8 25 5 0 100

Kantajan mitattu kapasiteetti liukoisen isomeraasin suhteen oli siten n. 584 IGIU/g kuivaksi laskettuna. Entsvvmin alkuimmobilisointi GDC-kantaiaan 30 GDC-kantaja tåytettiin osakapasiteetiltaan n.

25-%risesti, liukoisella isomeraasilla seuraavasti. GDC (14,8 g kuivaksi laskettuna) lietettiin ionivaihdettuun veteen ja pH såådettiin arvoon 7,0-7,1. Lietteestå poistettiin ilmaa vesisuihkupumpun alipaineella huoneenlåmpo-35 tilassa 60 minuutin ajan ja se kaadettiin halkaisijaltaan 9 91279 2,5 cm:n ja 305 cm pitkåån vaipalla varustettuun Ace Glass Adjustachrom<S>-lasikolonniin, jossa oli sintrattu lasipoh-ja. Kerros pakattiin 90,0 mm paksuksi. Lasihelmiå asetet-tiin kerroksen påålle (10 cm) virtauksen jakamiseksi ta-5 saisesti. Entsyymi adsorboitiin GDCrlle pumppaamalla 145 ml (2600 IGIU liukoista isomeraasia virtauksena alaspåin kerroksen lapi nopeudella 1 ml/min ja huoneen lampotilas-sa. Mitattavaa liukoista aktiivisuutta ei kulkenut kerroksen lapi.

10 Immobilisoidun isomeraasiaktiivisuuden måårittåmi- nen

Kolonnia ymparoivå vesivaippa temperoitiin 61 °C:een. Kiteisen dekstroosin 50-%:ista liuosta, jonka pH-arvo oli 7,8 ja joka sisålsi 5 mM MgS04:a ja 5 mM 15 NaHS03:a alettiin ajaa immobilisoitua isomeraasia sisåltå-vån kerroksen låpi ylhååltå alasvirtausnopeudella 0,4 ml/min. Ajoa jatkettiin kolonnissa 16 tuntia.

Ec = ψ ln ~ J°

k. I. - I

20 jossa Et = immobilisoitu kokonaisaktiivisuus IGIU-yksi- koisså R = virtausnopeus, ml/h C = monosakkaridivåkevyys, g/ml kf = reaktion nopeusvakio 61 °C:ssa (0,019 g/IGIU/h) 25 I = poistovirran isomeroitumisaste = f r uktoos ivåkevws monosakkaridivåkevyys I0 = syottovirran 1=0 kiteiselle dekstroosille Ιβ = I tasapainossa 0,510 61 °C:ssa 30

Isomeroitumisaste I mitattiin polarimetrisesti seu-raavasti: Kolonnin syottovirtaus ja poistovirtausnåytteet 10 laimennettiin 20-kertaisesti ioninvaihdetulla vedellå ja pidettiin paikallaan 1 tunti kiertokulman tasapainon saa-vuttamiseksi. Kiertokulmamittaukset tehtiin Perkin Elmer Model 241-polarimetrilia 25 °C:ssa elohopeaiahteen aallon-5 pituudella 576 nm. Instrumentti nollattiin kåyttåen ken-nossa vetta ja kiertokulmalukemat asteina otettiin laimen-netusta syGttGvirrasta ja poistovirrasta.

syGttGvirran poistovirran 10 kiertokulma “ kiertokulma ΔΙ = ( - ) x kerroin (2) g monosakkaridia/ml laimennettua syGttGvirtaa tai poistovirtaa 15 jossa Δΐ = I - I0

D

kerroin = - L( [“„] - [«,] ) D = laimennuskerroin (5 ml ---> 100 ml) = 20 20 L = polarimetrin kennon pituus = 10 cm [«d] - [“f] ominaiskiertokulman muutos, puhtaan-dekstroosin konversiolle puhtaaksi fruktoosiksi: mitattuna elohopealampulla = 167,33 kerroin = 0,1195 25

Taiia menetelmailå maaritetty immobilisoitu aktii-visuus oli 1548 IGIU osoittaen, etta kantajaan panostetus-ta 2600 IGIUrsta liukoista aktiivisuutta 60 % oli muuttu-nut immobilisoiduksi aktiivisuudeksi.

30 Isomerointi ia aioittainen entsvvmin lisavs 50-%:nen maissitarkkelyshydrolysaatin liuos, joka sisalsi dekstroosia 95 % kuiva-aineista 5 mM MgS04:a ja 5 mM NaHS03:a, såadettiin pH-arvoon 7,8 ja sita alettiin ajaa immobilisoidun isomeraasikerroksen lapi ylhaaita alas 35 61 °C:ssa. Alkuvirtaus kolonnin lapi laskettiin yhtaiGsta 1 ja se saadettiin aikaansaamaan n. 44 %:n fruktoosikon-versio. Tata n. 17 ml/h:n virtausta pidettiin muuttumatto- 91279 11 mana paitsi immobilisoidun aktiivisuuden tutkimisen aika-na. Poistovirran fruktoosipitoisuus mitattiin olennaisesti samalla menetelmaiia, jolla isomeroitumisaste måaritet-tiin.

5 fruktoosi-% = 100 Id jossa d = poistovirran monosakkaridipitoisuus ilmoitettuna murto-osana kaikista kuiva-aineista.

Fruktoosipitoisuus putosi våhitellen 16 paivan ai-kana n. 40 %:iin, jolloin tehtiin ensimmainen liukoisen 10 entsyymin lisays. Immobilisoidun aktiivisuuden maaritys osoitti, etta tarvittiin n. 800 IGIU-yksikk6a menetetyn aktiivisuuden taydentamiseen ja fruktoosikonversion nosta-miseen 44 %:iin. Nain olien 40 ml entsyymia (720 IGIU) lisattiin 126 ml:aan 50-%:ista kiteisen dekstroosin liuos-15 ta, joka sisalsi suoloja kuten ylia. Kolonnin syOttii muu-tettiin entsyymia sisaitavåksi dekstoosiliuokseksi ja sen annettiin virrata nopeudella 0,3 ml/min, kunnes se oli kulunut loppuun. Poistovirran, joka otettiin kolonnista entsyymin adsorptioprosessin aikana, ei havaittu sisalta-20 van lainkaan liukoista isomeraasia (maaritettiin inkuboi-malla poistovirtaa 16 tuntia 61 °C:ssa ja mittaamalla kas-vanut fruktoosipitoisuus). Kiteisen dekstroosin liuosta jatkettiin sitten sy6tt5na immobilisoidun lisaaktiivisuu-den maarittamiseksi. SyOttO muutettiin takaisin maissi-25 tarkkelyshydrolysaatiksi ja poistovirran fruktoositaso palautui 44 %:iin.

Tata jarjestysta, jossa annettiin poistovirran fruktoositason våhitellen laskea n. 40 %:iin, muutettiin kiteisen dekstroosin sybttOliuokselle immobilisoidun ak-30 tiivisuuden maarittamiseksi, lisattiin liukoista entsyymia dekstroosisydttOvirran mukana, mååritettiin lisååntynyt immobilisoitu aktiivisuus ja muutettiin takaisin maissi-tarkkelyshydrolysaatin sydtOlle, jatkettiin 17 viikon ajan. Kokeen jåljellå olevien 10 viikon ajaksi jårjestystå 35 muutettiin jåttaen pois immobilisoidun aktiivisuuden maa- 12 ritys ennen entsyymin lisåystå ja sen jålkeen. Tåmån jål-keen lisåttiin ajoittain vakiomåårå liukoista entsyymiå. Tånå aikana fruktoosin annettiin vaihdella vain mielival-taisesti asetettujen rajojen 40-44 % vålilla pitåen vir-5 tausnopeus vakiona. Tietenkin voitaisiin asettaa tiukemmat rajat, mikå tekisi vålttåmåttomåksi liukoisen entsyymin useammin tapahtuvat lisåykset.

7,5 viikon kåyton jalkeen entsyymiaktiivisuus ko-lonnissa kaksinkertaistettiin ilman merkittavaå vaikutusta 10 muihin toimintoihin kuin ettå se salli suuremman virtaus-nopeuden 40-44 %:sen fruktoosin saavuttamiseksi. 13 viikon kåyton jalkeen suolojen taso maissitarkkelyshydrolysaatti-syotosså pudotettiin 1 mM:in MgS04 (5 mMzsta) ja 2 mM:in NaHS03 (5 mMzsta).

15 Viikon 20 kohdalla poistovirran tutkiminen, joka tehtiin entsyymisyoton aikana, osoitti jonkin verran liukoisen aktiivisuuden vuotamista. Viimeinen entsyymilisays, joka tehtiin ennen vuodon tapahtumista, saattoi adsorboi-tuneen kokonaisentsyymin arvoon 649 IGIU/g eli låhelle 20 alunperin mitattua 684 IGIU/g:n kapasiteettia. Vuoto kas-voi seuraavien syottooperaatioiden aikana, vaikka riittå-våsti tuoretta entsyymia adsorboitui fruktoosikonversion pitåmiseksi yli 40 %:n. Se seikka, ettå entsyymiå oli yhå adsorboitunut sen jålkeen, kun alunperin mitattu kapasi-25 teetti oli ylitetty, osoitti, ettå jonkin verran inaktii-vista entsyymiå saattaa desorboitua.

Taulukkoon I on koottu fruktoosituotanto ja entsyy-milisåykset 27 viikon kokeen ajalta. Tuotettu fruktoosi-måårå on ilmaistu grammoina 43 %:ista fruktoosisiirappia 30 kuivaksi laskettuna. Viikottaiset todelliset fruktoosin tuotantotulokset normalisoitiin 43-%:isen fruktoosin tuo-tannoksi.

91279 13

Taulukko I

_Isomeroinnin ja entsyymin lisayksen yhteenveto_

Viikko Entsyymin Entsyymin Keskim. Kertynyt Entsyymin lisays kertyma fruk- fruktoosi g tehokkuus IGIU IGIU toosi-% 43 %:ista IGIU/g

kuivaksi 43%:ista F

_____laskettuna__ 5 1 2600 2600 43,7 2059 1,26 2 42,5 3606 0,72 3 720 3320 39,1 4851 0,68 4 42,3 6533 0,51 5 43,1 8292 0,40 10 6 41,6 9891 0,34 7 39,8 11298 0,29 8 3200 6520 39,5 12379 0,53 9 44,7 15293 0,43 10 44,6 18302 0,36 15 11 43,5 20476 0,32 12 43,6 22789 0,29 13 470 6990 41,1 24856 0,28 14 940 7930 41,4 26764 0,30 15 44,3 29322 0,27 20 16 40,4 31298 0,25 17 940 8670 43,4 33733 0,26 18 40,7 35433 0,24 19 940 9610 43,2 37949 0,25 20 940 10550 42,7 40162 0,26 25 21 42,0 42264 0,25 22 940 11490 43,3 44497 0,26 23 41,9 46730 0,25 24 940 12430 41,9 48811 0,25 25 44,5 51011 0,24 30 26 43,0 52737 0,24 27 770 13200 41,1 54528 0,24

Esimerkki II

35 Tåmå esimerkki kuvaa kolonniin tapahtuvaa tåyttoå, jossa liukoinen glukoosi-isomeraasi, jota kåytetaån aluksi kantoaineen osittaiseen tåyttåmiseen ja myohempiin lisåyk-siin, on erittåin puhdasta. Kolonnitoiminnat olivat samoja kuin esimerkisså I siinå mielesså, ettå maissitarkkelys-40 hydrolysaattisyoton virtausnopeus pidettiin muuttumattoma-na ja liukoisen entsyymin ajoittaiset lisåykset kiteisen 14 dekstroosin liuoksessa tehtiin syottolinjaa pitkin.

Fruktoosikonversiota pidettiin tåten valillå 40-44 % 14 viikon ajan. 45 % kiintoaineita sisåltåva puhdistettu maissitårkkelyshydrolysaattisyotto sisalsi n. 95 % deks-5 troosia, 1,5 mM MgS04:a ja 2,0 mM NaHS03:a. Tulovirran pH såådettiin arvoon n. 7,8 poistovirran pH-arvon 7,5 aikaan-saamiseksi; immobilisoitua entsyymiå sisåltåvån kerroksen låmpotila såådettiin 60 °C:seen.

Liukoisen qlukoosi-isomeraasin puhdistus 10 Streptomyces rubiginosus-kåymisliemi uutettiin liukoisen glukoosi-isomeraasin vapauttamiseksi soluista kuten esimerkisså I paitsi, ettå soluja ei erotettu liernes tå ja pesty ennen uuttoa. 2350 ml:n osa suodatetusta uutteesta puhdistettiin fraktioimalla raemaista DEAE-sel-15 luloosaa sisåltåvåsså kolonnissa. Raemainen DEAE-selluloo-sa kolonnisssa oli samaa materiaalia kuin immobilisoidun entsyymin kantaja esimerkisså I. Kolonnin preparoimiseksi 300 g kuivaksi laskettua GDC:tå tasapainotettiin 10 mM Tris-puskurissa ja suspensio kaadettiin 5 cm:n kromatogra-20 fiakolonniin tasaisen kerroksen muodostamiseksi. Kolonni pestiin 2 litralla 10 mM Tris-puskuria 10 ml/min virtauk-sella tai kunnes poistovirran pH oli n. 7.

Entsyymiliuos, joka sisålsi 29,3 IGlu/ml levitet-tiin kolonniin virtauksena ylhååltå alas virtausnopeudella 25 5 ml/min. Kun entsyymi oli levitetty, kolonni pestiin 3,5 litralla 0,1-M NaCl 10 mM Tris-puskurissa, jonka pH oli 7,0 virtausnopeudella 10 ml/min. Poistovirtajakeiden ent-syymipitoisuutta seurattiin ultraviolettiabsorbanssilla ja entsyymimåårityksellå. Jakeet, jotka sisålsivåt enemmån 30 kuin 20 IGIU/ml, keråttiin yhteen (900 ml) lisåpuhdistusta vårten ultrasuodatuksella. Yhteenkeråtyt jakeet ultrasuo-datettiin Amicon XM-100-membraanilla sekoitetussa Amicon 407-kennossa 6,9 N/cm2!n N2-paineessa. Ultrasuodattimelle jåånyt osuus sisålsi 800 IGIU/ml n. 50 %:isesti puhdasta 35 entsyymiå.

91279 15

Immobilisoinnissa kåvtettv kantaia GDC-kantajaa (7,75 g kuivaksi laskettuna) lisåttiin lasikolonniin esimerkisså I kuvatulla tavalla. Kantajaan adsorboitiin puhdistettua entsyymiå n. 25 %:iin sen kapa-5 siteetista pumppaamalla alaspåinvirtauksena 50%:ista ki-teisen dekstroosin liuosta (pH 7,8, 5 mM MgS04, 5 mM

NaHS03), joka sisalsi 136 ml puhdistettua entsyymiå, joka oli laimennettu suhteessa 1:40 (2720 IGIU), virtausno- peudella 0,4-0,7 ml/min. Poistovirrassa ei todettu liu-10 koista entsyymiå. Kiteisen dekstroosin liuoksen virtaus (pH 7,8, 5 mM MgS04, 5 mM HaHS03) jatkettiin mååritystå vårten ja kolonnin vaippa temperoituna vedellå siten, ettå kolonnikerroksen låmpotila oli 60 °C.

Immobilisoidun aktiivisuuden mååritvs 15 Immobilisoitu aktiivisuus mååritettynå esimerkin I

mååritysmenetelmållå oli 1686 IGIU aktiivisuuden ilmauk-sella, joka perustui 62 %:n adsorboituneeseen mååråån. Isomerointi ia aioittainen entswmin lisåvs Maissitårkkelyshydrolysaatin virtaus aloitettiin 20 immobilisoitua entsyymiå sisåltåvån kerroksen låpi ja virtaus såådettiin 40-44 %:n fruktoosikonversion aikaansaami-seksi. Virtausnopeus pidettiin vakiona, n. 0,35 ml/min:ssa kokeen kestoajan. Kun fruktoositaso laski ajan mukana joh-tuen entsyymin hajoamisesta, noin 20 ml:n erå laimennet-25 tua, puhdistettua liukoista isomeraasia, joka sisålsi 434 IGIU, lisåttiin kiteisen dekstroosin 50 %:iseen liuokseen (pH 7,8, 5 mM MgS04, 5 mM NaHS03) ja liuosta pumpattiin kerroksen låpi nopeudella n. 0,4 ml/min. Adsorption jål-keen syotto muutettiin takaisin maissitårkkelyshydrolysaa-30 tille. Taulukkoon II on koottu isomerointisuorituskyky ja entsyymilisåykset. Kuten esimerkisså I olennaisesti muut-tumatonta fruktoos ikonvers iota yllåpidettiin vakiovirtaus-nopeudella lisååmållå ajoittain liukoista isomeraasia.

16

Taulukko II

_Isomeroinnin ja entsyymin lisayksen yhteenveto_

Viikko Entsyymin Entsyymin Keskim. Kertynyt Entsyymin lisays kertymå fruk- fruktoosi g tehokkuus IGIU IGIU toosi-% 43 %sista IGIU/g

kuivaksi 43%:ista F

_____laskettuna 5 1 2720 2720 33,5 1608 1,69 2 434 3154 41,3 3149 1,00 3 434 3588 42,9 4756 0,75 4 3588 43,6 6117 0,59 5 434 4022 42,3 8236 0,49 10 6 4022 43,1 9664 0,42 7 434 4456 41,6 11240 0,40 8 434 4890 41,0 12924 0,38 9 4890 41,9 14585 0,34 10 434 5324 45,1 16366 0,33 15 11 5324 43,2 18152 0,29 12 434 5758 42.1 19535 0,29 13 5758 42,4 21108 0,28 14 ___5758 38,7__22624__0,25

Claims (13)

91279

1. Jatkuva menetelmå syottovirran glukoosin isome-roimiseksi fruktoosiksi glukoosi-isomeraasilla, t u n -5 n e t t u siitå, ettå (a) kiinteålle heikosti emåksiselle anioninvaihta-jahartsikantajalle, jonka maksimisitomiskyky glukoosi-iso-meraasille on våhintåån noin 684 IGIU/g, adsorboidaan glu-koosi-isomeraasia måårå, joka on noin 10 - 90 % hartsin 10 maksimikyvystå siten, ettå kun se altistetaan glukoosili-uoksen alkusyottovirralle, se tulee tuottamaan alkupois-tovirran, jossa on vahintaan 40 % fruktoosia eikå se sisållå glukoosi-isomeraasia; (b) adsorboitunut glukoosi-isomeraasi altistetaan 15 glukoosiliuoksen syottovirralle siten, ettå alkupoistovir- ta sisåltåå våhintåån 40 % fruktoosia; (c) glukoosi-isomeraasia lisåtåån syottovirtaan siten, ettå poistovirran fruktoosipitoisuus pidetåån ta-solla våhintåån 40 % eikå se sisållå glukoosi-isomeraasia; 20 ja (d) yllåpidetåån glukoosin ja glukoosi-isomeraasin syottovirta kunnes hartsikantajan poistovirta jo sisåltåå glukoosi-isomeraasia; ja mahdollisesti (e) altistetaan glukoosiliuoksen poistovirta, joka 25 jo sisåltåå glukoosi-isomeraasia toisille heikosti emåksi- sille anioninvaihtajahartsikantajille, joiden maksimisitomiskyky glukoosi-isomeraasille on våhintåån noin 684 IGIU/g (b)sn, (c):n ja (d):n olosuhteissa siten, ettå poistovirta edelleen ei sisållå glukoosi-isomeraasia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tun net t u siitå, ettå adsorboitu glukoosi-isomeraasimåårå on noin 25 % - noin 50 %.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnet t u siitå, ettå adsorboitu glukoosi-isomeraasimåårå 35 on noin 10 % - noin 50 %.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t unnet t u siitå, ettå poistovirran fruktoosipitoisuus pidetåån alueella noin 40 % - 44 %.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u n-5 n e t t u siitå, ettå syottovirta pidetåån noin 60 °C:ssa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t unnet t u siitå, ettå useampia hartsikantajia on liitetty sarjaan.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t un net t u siitå, ettå valittu hartsi on DEAE-Sephadex® tai DEAE-selluloosa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t unnet t u siitå, ettå entsyymiå lisåtåån jaksoittain.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tun net t u siitå, ettå entsyymiå lisåtåån jatkuvasti.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå poistovirta, joka jo sisåltåå glukoosi-isomeraasia altistetaan jatkokåsittelylle glukoo- 20 si-isomeraasin poistamiseksi.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå suoritetaan myos vaihe (e).

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå glukoosi-isomeraasin låhto- 25 måårå on noin 10 % - noin 50 % hartsin maksimikantokyvys-tå.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå glukoosi-isomeraasin låhto-måårå on noin 10 % - noin 25 % hartsin maksimikantokyvys- 30 tå. 91279