FI91279B - Menetelmä reaktorissa olevan immobilisoidun entsyymin aktiivisuuden pitämiseksi vakiona - Google Patents

Description

91279

Menetelmä reaktorissa olevan immobilisoidun entsyymin aktiivisuuden pitämiseksi vakiona Tämä keksintö koskee immobilisoitujen entsyymien 5 teknologiaa. Tarkemmin sanoen tämän keksinnön kohteena on jatkuva menetelmä syöttövirran glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi glukoosi-isomeraasilla.

Vaikka proteiinin immobilisoinnista voidaan löytää esimerkkejä, jotka ovat peräisin 1920-luvun alusta (Nel-10 son, J.M. ja D.I. Hitchcocks, J. Amer. Chem. Soc. 46; 1956 (1921)), voimakas mielenkiinto tähän ilmiöön on ollut ilmeinen viimeiset 25 vuoden ajan. Immobilisointitavat voidaan jakaa neljään yleiseen luokkaan; (1) sulkeminen kantajaan, (2) ristiinsidonta, (3) kovalenttinen sidonta ja 15 (4) adsorptio.

Sulkeminen kantajaan perustuu yleensä sulkemiseen silloitettuihin geeleihin tai kapselointiin onttoihin kuituihin, liposomimikrokapseleihin yms. Ristiinsidonta käsittää entsyymin modifioinnin lisäämällä ns. bi- tai moni-20 funktionaalisia ristiinsidontareagensseja, mitä seuraa usein adsorptio tai kapselointi. Kovalenttiseen sidontaan, joka on laajimmin tutkittu immobilisointitapa, liittyy entsyymin kovalenttinen sidonta kantajaan funktionaalisten ryhmien avulla, jotka ovat epäoleellisia entsyymin biolo-25 gisen aktiivisuden kannalta. Adsorptio aikaansaadaan yk sinkertaisesti saattamalla entsyymi kosketukseen adsorp-tioaineen kanssa ja antamalla immonilisaation tapahtua entsyymin ja adsorptioaineen välisten suhteellisen heikkojen sidosvoimien vaikutuksesta.

30 Juuri tätä viimemainittua immobilisointitapaa tämä keksintö lähinnä koskee; tämän vuoksi tiettyjä adsorptio-periaatteita selvitetään täydellisemmin seuraavassa. On olemassa laajoja katsauksia sulkemisesta kantajaan, ris-tiinsidonnasta ja kovalenttisesta sidonnasta (kts. esim.

35 Weetal. H.H., ed "Immobilized Enzymes, Antigens, Anti- 2 bodies and Peptides", M. Dekker, New York, (1975) tai Za-borsky O.R. "Immobilized Enzymes" CRC Press. Cleveland, (1973)).

Ensimmäiset adsorptiota koskevat tutkimukset osoit-5 tivat, että tietyissä tapauksissa adsorptio saattoi johtaa entsyymin osittaiseen tai täydelliseen inaktivoitumiseen. Tämän vuoksi on ymmärrettävää, että sopiva adsorptioaine tämän keksinnön toteuttamiseen on sellainen, jolla on suhteellisen suuri affiniteetti entsyymin suhteen ja joka 10 kuitenkin aiheuttaa mahdollisimman vähän inaktivoitumista.

Immobilisointi adsorptiolla sellaisiin kantajiin kuin alumiinioksidiin, bentoniittiin, kalsiumkarbonaat-tiin, selluloosaan, kollageeniin, ioninvaihtohartseihin, kaliniittiin. Sephadex-hartsiin, piidioksidigeeliin ja 15 titaanilla päällystettyyn ruostumattomaan teräkseen on tunnettua.

Vaikka tämä keksintö on sovellettavissa laajaan joukkoon adsorboituja entsyymisysteemejä kuten jäljempänä selostetaan, se soveltuu erityisesti sellaisten prosessien 20 hyödyntämiseen, joissa käytetään immobilisoitua glukoosi-isomeraasia.

Suurin osa fruktoosista tuotetaan kaupallisesti isomeroimalla dekstroosia (tärkkelyksestä) fruktoosiksi reaktorissa, jolloin dekstroosiliuos johdetaan immobili-25 soitua glukoosi-isomeraasia sisältävän kerroksen läpi. Poistovirran fruktoosipitoisuus pidetään tyypillisesti vakiona esim. 40-44 %:na säätämällä virtausnopeutta reaktorin läpi. Koska immobilisoitu entsyymi tuhoutuu luonnostaan termisen ja kemiallisen inaktivoitumisen vuoksi, vir-30 tausnopeutta pienennetään jaksoittaisesti. Kun on saavutettu virtausnopeus, jota ei enää käytännössä kannata pienentää, immobilisoitu entsyymi korvataan uudella immobilisoitua entsyymiä sisältävällä kerroksella. Koska kolonnin virtausnopeus sen eliniän aikana voi vaihdella esim. 35 välillä n. 50-5 g/min, on käytettävä lukuisia kolonneja 3 91279 lähes muuttumattoman tuotantonopeuden aikaansaamiseksi.

Erityisen hyödyllisiä systeemejä glukoosi-isomeraa-sin immobilisoimiseksi on esitetty US-patenteissa 3 788 945, 3 909 354, 3 110 164, 4 168 250 ja 4 355 117.

5 US-patentissa 3 960 663 kuvataan liukoisen glukoosi-isome-raasin jaksoittainen lisääminen dekstroosisyöttövirran kautta isomerointireaktoriin, joka sisältää immobilisoitua glukoosi-isomeraasia. Glukoosi-isomeraasi immobilisoidaan vahvasti emäksiseen anioninvaihtohartsiin, jonka koko ka-10 pasiteetti on täytetty liukoisella glukoosi-isomeraasilla.

Kun entsyymi hajoaa, sen adsorptio-ominaisuudet muuttuvat siten, että inaktiivinen entsyymi irtoaa kantajasta, ja sitä esiintyy eluentissa. Patentissa neuvotaan korvaamaan huuhtoutunut entsyymi saattamalla kantaja kosketukseen 15 tuoreen entsyymin kanssa, jonka määrä on riittävä panostamaan kantajan kokonaan uudelleen. Koska käytettyä entsyymiä huuhtoutuu jatkuvasti pois adsorptioaineesta, eluentti on saatettava lisäpuhdistusvaiheeseen siinä epäpuhtautena olevan entsyymin poistamiseksi.

20 Tämän keksinnön soveltaminen johtaa merkittäviin etuihin verrattuna tavanomaisiin reaktioihin seuraavissa suhteissa: (1) operaatioiden yksinkertaistaminen - tarve jaksoittaisesti säätää reaktorivirtauksia jäisi pois; (2) pienempi pääomainvestointi - tarvittaisiin pienempiä reak-25 toreita muutaman suuren reaktorin sijasta johtuen vaihte-levien virtausnopeuksien eliminoimisesta; (3) parantunut tuotannon valvonta - voitaisiin saavuttaa suuremmat fruk-toosipitoisuudet lisäämällä liukoisempaa entsyymiä reaktoriin tarvitsematta pienentää virtausnopeuksia; ja (4) pie-30 nentyneen tuotteen jalostuskustannukset - koska erittäin hitaat virtausnopeudet ja tästä johtuen pitkät viipymis-ajat eliminoitaisiin, värin ja sivumakujen muodostuminen vähenisi.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään immobilisoidun 35 entsyymin vakioaktiivisuuden ylläpitämiseksi reaktorissa 4 adsorboimalla kiinteään kantajaan adsorboivissa olosuhteissa sellainen määrä entsyymiä, joka edustaa ennalta määrättyä aktiivisuustasoa ja on vähemmän kuin tämän kantajan maksimikantokyky; ja adsorboimalla lisämääriä ent-5 syymiä sanottuun kantajaan ennalta määrätyn aktiivisuus-tason ylläpitämiseksi, kun aikaisemmin adsorboidun entsyymin aktiivisuus laskee sanotun ennalta määrätyn tason alapuolelle. Entsyymin jaksoittaista lisäämistä jatketaan, kunnes kantajan maksimikantokyky on saavutettu. Keksintö 10 on erityisen hyödyllinen immobilisoidun glukoosi-isomeraa-sin reaktion aktiivisuuden ylläpitämisessä, jota reaktiota voidaan käyttää esimerkiksi fruktoosin valmistuksessa glukoosista. Keksinnön mukaiselle menetelmälle glukoosin im-mobilisoimiseksi fruktoosiksi on tunnusomaista se, mitä 15 patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Päätekijä määritettäessä immobilisoidun entsyymin avulla suoritettavan prosessin tehokkuutta on sen ajan pituus, jonka entsyymipanos säilyy aktiivisena. Kuten yllä mainittiin entsyymi hajoaa luonnostaan, kun prosessi jat-20 kuu. Vaikka ei haluta sitoutua mihinkään määrättyyn teoriaan siitä, kuinka entsyymit hajoavat, arvellaan että sekä terminen että kemiallinen denaturoituminen ovat hajoamiseen vaikuttavia tekijöitä.

Eräs ratkaisu tähän ongelmaan on ollut yksinker-25 taisesti pienentää reagenssien virtausta immobilisoidun systeemin läpi, kun systeemien tehokkuus laskee. Mutta koska virtausnopeudet voivat vaihdella kertoimella 10 tai enemmänkin, on välttämätöntä käyttää kolonnisarjaa jatkuvan tuotannon aikaansaamiseksi. Muita ratkaisuja ovat ol-30 leet systeemin operaatioiden keskeyttäminen jaksoittaises- ti, käytetyn entsyymin poistaminen ja uudelleenpanostus tuoreella entsyymillä: tai kuten US-patentissa 3 960 663 on esitetty, tuoreen entsyymin lisääminen jaksoittaisesti, kun käytetty entsyymi huuhtoutuu eluenttiin.

35 Tämän keksinnön mukaisesti ongelma ratkaistaan ta- 5 91279 valla, joka on parempi kuin yllä selostetut sikäli, että tuoretta entsyymiä voidaan lisätä systeemiin keskeyttämättä operaatiota, tuotantoa voidaan pitää muuttumattomalla tasolla tai haluttaessa sitä voidaan lisätä ja eluentti on 5 oleellisesti vapaa käytetystä entsyymistä.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään, jossa immobi-lisoidun systeemin alkuperäisen valmistuksen aikana entsyymiä lisätään kantajaan määrä, joka on pienempi kuin ad-sorptioaineen maksimikantokyky, ts. kantaja alikuormitelo taan; muuttumaton tuotanto ylläpidetään siten syöttämällä tuoretta entsyymiä tarpeen mukaan siihen saakka, kunnes saavutetaan kantajan maksimikantokyky.

Koska adsorptioon perustuvaan immobilisointitek-niikkaan vaikuttavat entsyymin ja kantajan väliset varaus-15 vuorovaikutukset, entsyymin ja kantajan väliset hydrofobiset vuorovaikutukset jne. kulloisenkin entsyymikantaja-yhdistetään valinta on määritettävä kokeellisesti. Käyttökelpoisia kantajia ovat: 1. Heikosti emäksiset polystyreenihartsit, kuten: 20 Amberlite IRA-93 (Rohm & Haas), Diaion WA-30 (Mitsubishi),

Diaion WA-11 (Mitsubishi), Amberlite IR-45 (Rohm & Haas); 2. Heikosti emäksiset (-N (R) 2)fenoli-formaldehydi-hartsit, kuten: Duolite EA-561 (Diamond Shamrock), Duolite ES-562 (Diamond Shamrock), Duolite ES-568 (Diamond Sham- 25 rock); 3. Sekalaiset entsyymiadsorbentit, kuten: DEAE-

Sephadex (derivoitu silloitettu dekstraani - Pharmacia), DEAE-Glycophase (huokoisuudeltaanvalvottu lasi, joka on päällystetty hiilihydraatilla ja derivoitu - Pierce Chemi- 30 cal Co), QAE-Glycophase (yllä mainitun vahvasti emäksinen vastine), DEAE-Biogel A (derivoituja, silloitettuja aga-roosigeelihelmiä - Bio Rad), Selectacel DEAE-selluloosa Grannular. Brow Co., Vistec D 2 ja D 3 (Grannular DEAE-selluloosa viskoosista - Viscose Group Lts.), DEAE-Sepha-35 cel (helmimäinen DEAE-selluloosa - Pharmacia), DEAE-sellu- 6 loosahelmet (US-patentti 4 090 022), DEAE-selluloosahelmet (Polytecha, Tsekkoslovakia), valvotusti huokoinen lasi (Corning Glass) ja valvotusti huokoinen alumiinioksidi, titaanioksidi, sirkoniumoksidi (Corning Glass).

5 On edullista käyttää DEAE Sephadex tai DEAE-sellu- loosatyyppisiä kantajia.

Suuri joukko entsyymejä voidaan adsorboida yllä mainituille kantajille; alaan perehtynyt voi helposti valita kulloisenkin kantajan ilman kohtuutonta kokeilua. On 10 edullista käyttää sellaisia entsyymejä kuin glukoosi-iso-meraasia, glukoamylaasia, aminoasylaasia, invertaasia, β-glukanaasia, glukoosi-l-oksidaasia ja glukoosi-2-oksidaa-sia.

Jos immobilisaatio perustuu pelkästään sähköstaat-15 tiseen vetovoimaan, konjugaateilla on mahdollisuus disso-sioitua, kun reaktion ionivahvuus, pH-arvo tai lämpötila vaihtelee. Näiden vaikutusten minimoimiseksi on edullista valita entsyymi, joka sitoutuu halukkaasti kantajaan. Vaihtoehtoisesti on mahdollista lisätä proteiinin varausta 20 kemiallisella modifioinnilla, kuten Solomon ja Levine tekivät amyloglukosidaasilla (Biotech, Bioeng. 16:1161 (1974)).

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa osittain puhdistetun, liukoi-25 sen glukoosi-isomeraasin ajoittaista lisäämistä isomeroin-tireaktoriin, joka sisälsi osakapasiteetiltaan entsyymillä täytettyä kantajaa, sillä tavoin, että olennaisesti muuttumaton isomerointinopeus säilyi kohotetulla tasolla 19 lisäviikkoa.

30 Liukoisen entsyymin puhdistus 1460 ml:n Streptomyces rubiginosus-käymislientä suodatettiin ja solut suspendoitiin uudelleen 730 ml:aan ionivaihdettua vettä ja suodatettiin kahdesti uudelleen. Solut lietettiin uudelleen 1460 ml:aan ionivaihdettua vet-35 tä. Lietteen pH säädettiin arvoon 6,5 laimealla HCl:lla ja 91279 7 10 mg lysotsyymiä ja 1700 ppm Variquat-valmistetta (dime-tyylialkyylibentsyyliammoniumkloridi) lisättiin. Seosta inkuboitiin 40 °C:ssa 3,6 tuntia varovasti ylhäältäpäin sekoittaen liukoisen isomeraasin uuttamiseksi soluista.

5 Liukoinen entsyymi poistettiin solujätteistä suodattamalla ja sen määritettiin sisältävän 18 IGIU/ml. Määritysmenetelmän kuvauksen suhteen ks. Lloyd, N.E., Khaleeluddin, K. ja Lamm, W.R. (1972), Cereal Chem. 49, 544. Kansainvälinen glukoosi-isomeraasiyksikkö määritellään siksi entsyymimää-10 räksi, joka katalysoi D-glukoosin muuttumisen D-fruktoo-siksi nopeudella 1 pmol/min määritellyissä olosuhteissa (pH 7,0, 60 °C, 2,0-M glukoosi, 0,2-M Mg**, 0,001-M Co** ja 0,2-M natriummaleaattipuskuri).

Immobilisoinnissa käytetty kantaja 15 Heikosti emäksinen kantaja, jota käytettiin liukoi sen glukoosi-isomeraasin immobilisointiin, oli raemainen DEAE-selluloosa (GDC). Yleinen valmistusmenetelmä, jolla jauhettu selluloosa ja painonlisäysaine agglomeroidaan muovin kanssa ja sen jälkeen selluloosa muutetaan dietyy-20 liaminoetyylikloridilla ominaisuuksiltaan heikosti emäksi seksi on kuvattu US-patentissa 4 355 117, jonka haltija on Nabisco Brands, Ins.

Tarkemmin sanoen seos, jossa oli 16,3 kg C-100-jauhettua selluloosaa (International Filler Corp.) ja 10,9 kg 25 kalsinoitua alumiinioksidia (Reynolds RC-20), seostettiin 27,2 kg: n kanssa iskunkestoista polystyreeniä (Hammond Plastics) 200 °C:n telamyllyllä, kunnes muovi oli sulaa ja seos homogeeninen. Raemainen selluloosayhdistelmä jäähdytettiin, jauhettiin johtamalla useita kertoja vasaramyllyn 30 läpi ja seulottiin niin että saatiin 40-80 U.S. Standard-meshin jae (halkaisija 0,18 - 0,42 mm). Seulottu materiaali (16,3 kg) lietettiin alkaliseen sulfaattiliuokseen, . joka sisälsi 16,8 kg natriumsulfaattia, 2,2 kg natriumhyd- roksidia ja 53,4 1 vettä. Liete kuumennettiin 40 °C:seen 35 ja 6,42 kg dietyyliaminoetyylikloridin hydrokloridin 50- 8 %:ista vesiliuosta annosteltiin lietteeseen sekoittaen ja nopeudella 115 ml/min (lisäysaika n. 1 h). Lietettä sekoitettiin vielä 30 minuuttia/ 3,3 kg 50-%:ista NaOH:a lisättiin ja toiset 6,42 kg dietyyliaminoetyylikloridin hydro-5 kloridin 50-%:ista vesiliuosta annosteltiin kuten yllä. Liete kuumennettiin 60 °C:een, laimennettiin 56,8 1:11a vettä, pH säädettiin arvoon 4,5 HCl:lla ja se pestin 60 meshin (0,25 mm) ravistusseulalla. GDC lietettiin uudelleen, pH säädettiin arvoon 7,0 - 7,5 ja vesi poistettiin 10 60 meshin (0,25 mm) seulalla.

Sarjan adsorptiokyky mitattiin seuraavasti: 100 ml:aan liukoista entsyymiä lisättiin 2,63 g kuivaksi laskettua kantajaa. pH säädettiin arvoon 7,0 ja lietettä sekoitettiin varovasti 5 tuntia. Adsorptiota seurattiin 15 suodattamalla näytteet määrätyin aikavälein ja mittaamalla liukoisen isomeraasin aktiivisuus.

Aika, h Liukoinen aktiivisuus IGIU/ml % adsorboitunut 0 18,0 0 20 0,25 12,7 29,4 1 5,8 67,8 2 2,5 86,1 3 1,2 93,3 4 0,4 97,8 25 5 0 100

Kantajan mitattu kapasiteetti liukoisen isomeraasin suhteen oli siten n. 584 IGIU/g kuivaksi laskettuna. Entsyymin alkuimmobilisointi GDC-kantaiaan 30 GDC-kantaja täytettiin osakapasiteetiltaan n.

25-%risesti, liukoisella isomeraasilla seuraavasti. GDC (14,8 g kuivaksi laskettuna) lietettiin ionivaihdettuun veteen ja pH säädettiin arvoon 7,0-7,1. Lietteestä poistettiin ilmaa vesisuihkupumpun alipaineella huoneenlämpö-35 tilassa 60 minuutin ajan ja se kaadettiin halkaisijaltaan 9 91279 2,5 cm:n ja 305 cm pitkään vaipalla varustettuun Ace Glass Adjustachrom<S>-lasikolonniin, jossa oli sintrattu lasipohja. Kerros pakattiin 90,0 mm paksuksi. Lasihelmiä asetettiin kerroksen päälle (10 cm) virtauksen jakamiseksi ta-5 saisesti. Entsyymi adsorboitiin GDC:lle pumppaamalla 145 ml (2600 IGIU liukoista isomeraasia virtauksena alaspäin kerroksen läpi nopeudella 1 ml/min ja huoneen lämpötilassa. Mitattavaa liukoista aktiivisuutta ei kulkenut kerroksen läpi.

10 Immobilisoidun isomeraasiaktiivisuuden määrittämi nen

Kolonnia ympäröivä vesivaippa temperoitiin 61 °C:een. Kiteisen dekstroosin 50-%:ista liuosta, jonka pH-arvo oli 7,8 ja joka sisälsi 5 mM MgS04:a ja 5 mM 15 NaHS03:a alettiin ajaa immobilisoitua isomeraasia sisältävän kerroksen läpi ylhäältä alasvirtausnopeudella 0,4 ml/min. Ajoa jatkettiin kolonnissa 16 tuntia.

E' = ψ in J‘ ~ J° 20 jossa Et = immobilisoitu kokonaisaktiivisuus IGIU-yksi- köissä R = virtausnopeus, ml/h C = monosakkaridiväkevyys, g/ml kf = reaktion nopeusvakio 61 °C:ssa (0,019 g/IGIU/h) 25 I = poistovirran isomeroitumisaste = f ruktoosiväkevvvs monosakkaridiväkevyys I0 = syöttövirran 1=0 kiteiselle dekstroosille Ιβ = I tasapainossa 0,510 61 °C:ssa 30

Isomeroitumisaste I mitattiin polarimetrisesti seuraavasti: Kolonnin syöttövirtaus ja poistovirtausnäytteet 10 laimennettiin 20-kertaisesti ioninvaihdetulla vedellä ja pidettiin paikallaan 1 tunti kiertokulman tasapainon saavuttamiseksi. Kiertokulmamittaukset tehtiin Perkin Elmer Model 241-polarimetrillä 25 °C:ssa elohopealähteen aallon-5 pituudella 576 nm. Instrumentti nollattiin käyttäen kennossa vettä ja kiertokulmalukemat asteina otettiin laimennetusta syöttövirrasta ja poistovirrasta.

syöttövirran poistovirran 10 kiertokulma “ kiertokulma ΔΙ = ( - ) x kerroin (2) g monosakkaridia/ml laimennettua syöttövirtaa tai poistovirtaa 15 jossa Δΐ = I - I0

D

kerroin = - L( [“„] - [«f] ) D = laimennuskerroin (5 ml ---> 100 ml) = 20 20 L = polarimetrin kennon pituus = 10 cm [«d] - [“f] ominaiskiertokulman muutos, puhtaan-dekstroosin konversiolle puhtaaksi fruktoosiksi: mitattuna elohopealampulla = 167,33 kerroin = 0,1195 25 Tällä menetelmällä määritetty immobilisoitu aktiivisuus oli 1548 IGIU osoittaen, että kantajaan panostetusta 2600 IGIUrsta liukoista aktiivisuutta 60 % oli muuttunut immobilisoiduksi aktiivisuudeksi.

30 Isomerointi ia ajoittainen entsyymin lisäys 50-%:nen maissitärkkelyshydrolysaatin liuos, joka sisälsi dekstroosia 95 % kuiva-aineista 5 mM MgS04:a ja 5 mM NaHS03:a, säädettiin pH-arvoon 7,8 ja sitä alettiin ajaa immobilisoidun isomeraasikerroksen läpi ylhäältä alas 35 61 °C:ssa. Alkuvirtaus kolonnin läpi laskettiin yhtälöstä 1 ja se säädettiin aikaansaamaan n. 44 %:n fruktoosikon-versio. Tätä n. 17 ml/h:n virtausta pidettiin muuttumatto- 91279 11 mana paitsi immobilisoidun aktiivisuuden tutkimisen aikana. Poistovirran fruktoosipitoisuus mitattiin olennaisesti samalla menetelmällä, jolla isomeroitumisaste määritettiin.

5 fruktoosi-% = 100 Id jossa d = poistovirran monosakkaridipitoisuus ilmoitettuna murto-osana kaikista kuiva-aineista.

Fruktoosipitoisuus putosi vähitellen 16 päivän aikana n. 40 %:iin, jolloin tehtiin ensimmäinen liukoisen 10 entsyymin lisäys. Immobilisoidun aktiivisuuden määritys osoitti, että tarvittiin n. 800 IGIU-yksikköä menetetyn aktiivisuuden täydentämiseen ja fruktoosikonversion nostamiseen 44 %:iin. Näin ollen 40 ml entsyymiä (720 IGIU) lisättiin 126 ml:aan 50-%:ista kiteisen dekstroosin liuos-15 ta, joka sisälsi suoloja kuten yllä. Kolonnin syöttö muutettiin entsyymiä sisältäväksi dekstoosiliuokseksi ja sen annettiin virrata nopeudella 0,3 ml/min, kunnes se oli kulunut loppuun. Poistovirran, joka otettiin kolonnista entsyymin adsorptioprosessin aikana, ei havaittu sisältä-20 vän lainkaan liukoista isomeraasia (määritettiin inkuboi-malla poistovirtaa 16 tuntia 61 °C:ssa ja mittaamalla kasvanut fruktoosipitoisuus). Kiteisen dekstroosin liuosta jatkettiin sitten syöttönä immobilisoidun lisäaktiivisuu-den määrittämiseksi. Syöttö muutettiin takaisin maissi-25 tärkkelyshydrolysaatiksi ja poistovirran fruktoositaso palautui 44 %:iin.

Tätä järjestystä, jossa annettiin poistovirran fruktoositason vähitellen laskea n. 40 %:iin, muutettiin kiteisen dekstroosin syöttöliuokselle immobilisoidun ak-30 tiivisuuden määrittämiseksi, lisättiin liukoista entsyymiä dekstroosisyöttövirran mukana, määritettiin lisääntynyt immobilisoitu aktiivisuus ja muutettiin takaisin maissi-tärkkelyshydrolysaatin syötölle, jatkettiin 17 viikon ajan. Kokeen jäljellä olevien 10 viikon ajaksi järjestystä 35 muutettiin jättäen pois immobilisoidun aktiivisuuden mää- 12 ritys ennen entsyymin lisäystä ja sen jälkeen. Tämän jälkeen lisättiin ajoittain vakiomäärä liukoista entsyymiä. Tänä aikana fruktoosin annettiin vaihdella vain mielivaltaisesti asetettujen rajojen 40-44 % välillä pitäen vir-5 tausnopeus vakiona. Tietenkin voitaisiin asettaa tiukemmat rajat, mikä tekisi välttämättömäksi liukoisen entsyymin useammin tapahtuvat lisäykset.

7,5 viikon käytön jälkeen entsyymiaktiivisuus kolonnissa kaksinkertaistettiin ilman merkittävää vaikutusta 10 muihin toimintoihin kuin että se salli suuremman virtausnopeuden 40-44 %:sen fruktoosin saavuttamiseksi. 13 viikon käytön jälkeen suolojen taso maissitärkkelyshydrolysaatti-syötössä pudotettiin 1 mM:in MgS04 (5 mMzsta) ja 2 mM:in NaHS03 (5 mMzsta).

15 Viikon 20 kohdalla poistovirran tutkiminen, joka tehtiin entsyymisyötön aikana, osoitti jonkin verran liukoisen aktiivisuuden vuotamista. Viimeinen entsyymi lisäys, joka tehtiin ennen vuodon tapahtumista, saattoi adsorboituneen kokonaisentsyymin arvoon 649 IGIU/g eli lähelle 20 alunperin mitattua 684 IGIU/g:n kapasiteettia. Vuoto kas-voi seuraavien syöttöoperaatioiden aikana, vaikka riittävästi tuoretta entsyymiä adsorboitui fruktoosikonversion pitämiseksi yli 40 %:n. Se seikka, että entsyymiä oli yhä adsorboitunut sen jälkeen, kun alunperin mitattu kapasi-25 teetti oli ylitetty, osoitti, että jonkin verran inaktiivista entsyymiä saattaa desorboitua.

Taulukkoon I on koottu fruktoosituotanto ja entsyy-milisäykset 27 viikon kokeen ajalta. Tuotettu fruktoosi-määrä on ilmaistu grammoina 43 %:ista fruktoosisiirappia 30 kuivaksi laskettuna. Viikottaiset todelliset fruktoosin tuotantotulokset normalisoitiin 43-%:isen fruktoosin tuotannoksi.

91279 13

Taulukko I

_Isomeroinnin ja entsyymin lisäyksen yhteenveto_

Viikko Entsyymin Entsyymin Keskim. Kertynyt Entsyymin lisäys kertymä fruk- fruktoosi g tehokkuus IGIU IGIU toosi-% 43 %:ista IGIU/g

kuivaksi 43%:ista F

_____laskettuna__ 5 1 2600 2600 43,7 2059 1,26 2 42,5 3606 0,72 3 720 3320 39,1 4851 0,68 4 42,3 6533 0,51 5 43,1 8292 0,40 10 6 41,6 9891 0,34 7 39,8 11298 0,29 8 3200 6520 39,5 12379 0,53 9 44,7 15293 0,43 10 44,6 18302 0,36 15 11 43,5 20476 0,32 12 43,6 22789 0,29 13 470 6990 41,1 24856 0,28 14 940 7930 41,4 26764 0,30 15 44,3 29322 0,27 20 16 40,4 31298 0,25 17 940 8670 43,4 33733 0,26 18 40,7 35433 0,24 19 940 9610 43,2 37949 0,25 20 940 10550 42,7 40162 0,26 25 21 42,0 42264 0,25 22 940 11490 43,3 44497 0,26 23 41,9 46730 0,25 24 940 12430 41,9 48811 0,25 25 44,5 51011 0,24 30 26 43,0 52737 0,24 27 770 13200 41,1 54528 0,24

Esimerkki II

35 Tämä esimerkki kuvaa kolonniin tapahtuvaa täyttöä, jossa liukoinen glukoosi-isomeraasi, jota käytetään aluksi kantoaineen osittaiseen täyttämiseen ja myöhempiin lisäyksiin, on erittäin puhdasta. Kolonnitoiminnat olivat samoja kuin esimerkissä I siinä mielessä, että maissitärkkelys-40 hydrolysaattisyötön virtausnopeus pidettiin muuttumattomana ja liukoisen entsyymin ajoittaiset lisäykset kiteisen 14 dekstroosin liuoksessa tehtiin syöttölinjaa pitkin.

Fruktoosikonversiota pidettiin täten välillä 40-44 % 14 viikon ajan. 45 % kiintoaineita sisältävä puhdistettu maissitärkkelyshydrolysaattisyöttö sisälsi n. 95 % deks-5 troosia, 1,5 mM MgS04:a ja 2,0 mM NaHS03:a. Tulovirran pH säädettiin arvoon n. 7,8 poistovirran pH-arvon 7,5 aikaansaamiseksi; immobilisoitua entsyymiä sisältävän kerroksen lämpötila säädettiin 60 °C:seen.

Liukoisen qlukoosi-isomeraasin puhdistus 10 Streptomyces rubiginosus-käymisliemi uutettiin liukoisen glukoosi-isomeraasin vapauttamiseksi soluista kuten esimerkissä I paitsi, että soluja ei erotettu liemestä ja pesty ennen uuttoa. 2350 ml:n osa suodatetusta uutteesta puhdistettiin fraktioimalla raemaista DEAE-sel-15 luloosaa sisältävässä kolonnissa. Raemainen DEAE-selluloo-sa kolonnisssa oli samaa materiaalia kuin immobilisoidun entsyymin kantaja esimerkissä I. Kolonnin preparoimiseksi 300 g kuivaksi laskettua GDC:tä tasapainotettiin 10 mM Tris-puskurissa ja suspensio kaadettiin 5 cm:n kromatogra-20 fiakolonniin tasaisen kerroksen muodostamiseksi. Kolonni pestiin 2 litralla 10 mM Tris-puskuria 10 ml/min virtauksella tai kunnes poistovirran pH oli n. 7.

Entsyymi1iuos, joka sisälsi 29,3 IGlu/ml levitettiin kolonniin virtauksena ylhäältä alas virtausnopeudella 25 5 ml/min. Kun entsyymi oli levitetty, kolonni pestiin 3,5 litralla 0,1-M NaCl 10 mM Tris-puskurissa, jonka pH oli 7,0 virtausnopeudella 10 ml/min. Poistovirtajakeiden entsyymipitoisuutta seurattiin ultraviolettiabsorbanssilla ja entsyymimäärityksellä. Jakeet, jotka sisälsivät enemmän 30 kuin 20 IGIU/ml, kerättiin yhteen (900 ml) lisäpuhdistusta varten ultrasuodatuksella. Yhteenkerätyt jakeet ultrasuo-datettiin Amicon XM-100-membraanilla sekoitetussa Amicon 407-kennossa 6,9 N/cm2:n N2-paineessa. Ultrasuodattimelle jäänyt osuus sisälsi 800 IGIU/ml n. 50 %:isesti puhdasta 35 entsyymiä.

15 91279

Immobilisoinnissa käytetty kantaja GDC-kantajaa (7,75 g kuivaksi laskettuna) lisättiin lasikolonniin esimerkissä I kuvatulla tavalla. Kantajaan adsorboitiin puhdistettua entsyymiä n. 25 %:iin sen kapa-5 siteetista pumppaamalla alaspäinvirtauksena 50%:ista kiteisen dekstroosin liuosta (pH 7,8, 5 mM MgS04, 5 mM

NaHS03), joka sisälsi 136 ml puhdistettua entsyymiä, joka oli laimennettu suhteessa 1:40 (2720 IGIU), virtausno peudella 0,4-0,7 ml/min. Poistovirrassa ei todettu liu-10 koista entsyymiä. Kiteisen dekstroosin liuoksen virtaus (pH 7,8, 5 mM MgS04, 5 mM HaHS03) jatkettiin määritystä varten ja kolonnin vaippa temperoituna vedellä siten, että kolonnikerroksen lämpötila oli 60 °C.

Immobilisoidun aktiivisuuden määritys 15 Immobilisoitu aktiivisuus määritettynä esimerkin I

määritysmenetelmällä oli 1686 IGIU aktiivisuuden ilmauksella, joka perustui 62 %:n adsorboituneeseen määrään. Isomerointi ia ajoittainen entsyymin lisäys Maissitärkkelyshydrolysaatin virtaus aloitettiin 20 immobilisoitua entsyymiä sisältävän kerroksen läpi ja virtaus säädettiin 40-44 %:n fruktoosikonversion aikaansaamiseksi. Virtausnopeus pidettiin vakiona, n. 0,35 ml/min:ssa kokeen kestoajan. Kun fruktoositaso laski ajan mukana johtuen entsyymin hajoamisesta, noin 20 ml:n erä laimennet-25 tua, puhdistettua liukoista isomeraasia, joka sisälsi 434 IGIU, lisättiin kiteisen dekstroosin 50 %:iseen liuokseen (pH 7,8, 5 mM MgS04, 5 mM NaHS03) ja liuosta pumpattiin kerroksen läpi nopeudella n. 0,4 ml/min. Adsorption jälkeen syöttö muutettiin takaisin maissitärkkelyshydrolysaa-30 tille. Taulukkoon II on koottu isomerointisuorituskyky ja entsyymilisäykset. Kuten esimerkissä I olennaisesti muuttumatonta fruktoosikonversiota ylläpidettiin vakiovirtaus-nopeudella lisäämällä ajoittain liukoista isomeraasia.

16

Taulukko II

_Isomeroinnin ja entsyymin lisäyksen yhteenveto_

Viikko Entsyymin Entsyymin Keskim. Kertynyt Entsyymin lisäys kertymä fruk- fruktoosi g tehokkuus IGIU IGIU toosi-% 43 %:ista IGIU/g

kuivaksi 43%:ista F

_____laskettuna 5 1 2720 2720 33,5 1608 1,69 2 434 3154 41,3 3149 1,00 3 434 3588 42,9 4756 0,75 4 3588 43,6 6117 0,59 5 434 4022 42,3 8236 0,49 10 6 4022 43,1 9664 0,42 7 434 4456 41,6 11240 0,40 8 434 4890 41,0 12924 0,38 9 4890 41,9 14585 0,34 10 434 5324 45,1 16366 0,33 15 11 5324 43,2 18152 0,29 12 434 5758 42.1 19535 0,29 13 5758 42,4 21108 0,28 14 ___5758 38,7__22624__0,25

Claims (13)

91279

1. Jatkuva menetelmä syöttövirran glukoosin isome-roimiseksi fruktoosiksi glukoosi-isomeraasilla, t u n -5 n e t t u siitä, että (a) kiinteälle heikosti emäksiselle anioninvaihta-jahartsikantajalle, jonka maksimisitomiskyky glukoosi-iso-meraasille on vähintään noin 684 IGIU/g, adsorboidaan glu-koosi-isomeraasia määrä, joka on noin 10 - 90 % hartsin 10 maksimikyvystä siten, että kun se altistetaan glukoosili-uoksen alkusyöttövirralle, se tulee tuottamaan alkupois-tovirran, jossa on vähintään 40 % fruktoosia eikä se sisällä glukoosi-isomeraasia; (b) adsorboitunut glukoosi-isomeraasi altistetaan 15 glukoosiliuoksen syöttövirralle siten, että alkupoistovir- ta sisältää vähintään 40 % fruktoosia; (c) glukoosi-isomeraasia lisätään syöttövirtaan siten, että poistovirran fruktoosipitoisuus pidetään tasolla vähintään 40 % eikä se sisällä glukoosi-isomeraasia; 20 ja (d) ylläpidetään glukoosin ja glukoosi-isomeraasin syöttövirta kunnes hartsikantajän poistovirta jo sisältää glukoosi-isomeraasia; ja mahdollisesti (e) altistetaan glukoosiliuoksen poistovirta, joka 25 jo sisältää glukoosi-isomeraasia toisille heikosti emäksi sille anioninvaihtajahartsikantajille, joiden maksimisitomiskyky glukoosi-isomeraasille on vähintään noin 684 IGIU/g (b):n, (c):n ja (d):n olosuhteissa siten, että poistovirta edelleen ei sisällä glukoosi-isomeraasia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että adsorboitu glukoosi-isomeraasimäärä on noin 25 % - noin 50 %.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorboitu glukoosi-isomeraasimäärä 35 on noin 10 % - noin 50 %.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poistovirran fruktoosipitoisuus pidetään alueella noin 40 % - 44 %.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että syöttövirta pidetään noin 60 °C:ssa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että useampia hartsikantajia on liitetty sarjaan.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valittu hartsi on DEAE-Sephadex® tai DEAE-selluloosa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymiä lisätään jaksoittain.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että entsyymiä lisätään jatkuvasti.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poistovirta, joka jo sisältää glukoosi-isomeraasia altistetaan jatkokäsittelylle glukoo- 20 si-isomeraasin poistamiseksi.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan myös vaihe (e).

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasin lähtö- 25 määrä on noin 10 % - noin 50 % hartsin maksimikantokyvys-tä.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasin lähtö-määrä on noin 10 % - noin 25 % hartsin maksimikantokyvys- 30 tä. 91279