DE2821890A1

DE2821890A1 - Verfahren zur regenerierung von enzym-immobilisaten

Info

Publication number: DE2821890A1
Application number: DE19782821890
Authority: DE
Inventors: Gieselher Dipl Chem Franzmann; Hans-Leo Dipl Chem D Huelsmann
Original assignee: Dynamit Nobel AG
Current assignee: Dynamit Nobel AG
Priority date: 1978-05-19
Filing date: 1978-05-19
Publication date: 1979-11-22
Also published as: US4271269A; FR2426056A1; GB2022097B; DK205679A; NL7903946A; JPS54151189A; BE876354A; GB2022097A

Description

282189Q

DYNAMIT NOBEL AKTIENGESELLSCHAFT Troisdorf, Bes. Köln

Verfahren zur Regenerierung von Enzym-Immobilisaten

Die Regenerierung von Enzym-Immobilisaten ist entweder nicht möglieh oder hat nach dem Stand der Technik unter sehr drastischen Bedingungen zu erfolgen.
Nach der DT-AS 25 37 671 erfolgt eine Pyrolyse bei 500 - 900⁰C.

Nach der DT-OS 27 20 538 erfolgt eine Regenerierung für eine in organischem Ionenaustauscherharz immobilisierte Glukoseisomerase mit wässriger Mineralsäure und Alkalilauge. Diese Verfahren führen lediglich zu einer Wiedergewinnung des von Enzymen freien Trägers, schädigen jedoch vielfach noch gebundenes aktives Enzym und auch den Träger, insbesondere sowie auf diesen ein Modifizierungsmittel aufgebracht ist, dem im Immobilisat das Enzym räumlich zugeordnet ist.

j Es bestand die Aufgabe, ein einfaches und zumindest für den Träger einschließlich seiner für Enzyme bindefähigen Funktionen schonendes Verfahren zur Regenerierung von durch Enzym-Schädigung in ihrer Aktivität geminderten Enzym-Immobilisaten zu finden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Regenerierung von Enzym-Immobilisaten, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus einem Immobilisat das inaktivierte Enzym mittels Salzlösungen desorbiert und den Enzymträger mittels frischer Enzyailösung reaktiviert.

Die Salzlösungen sind insbesondere wässrige Salzlösungen. Jedoch sind auch Lösungen polarer organischer Lösung.^uiittel. z.B. alkoholische Salzlösungen möglich. Gegebenenfalls kann der Zusatz polarer Lösungsmittel zu wässrigen Salzlösungen erfolgen. Die Salzlösungen sollen bevorzugt einen neutralen oder schwach alkalischen pH-Wort im Bereich von etwa 7 biß 9 haben.

909847/0386

Sehr bevorzugt sind gepufferte Salzlösungen. Als besonders vorteilhaft haben sich Annnonsulfat-Lösungen erwiesen, jedoch können auch Lösungen von Natriumacetat sowie gegebenenfalls primäre, sekundäre, tertiäre, quarternary C. - C,--Alkylammoniumsulfat-Lösurigen Verwendung finden oder enthalten sein.

Die Konzentration der Salse in der Lösung liegt im allgemeinen zwischen 10 und 40, bevorzugt zwischen 20 und JO Gew.-%.

Die Temperatur der Regenerierung liegt in demselben Bereich, in dem auch die Aufbringung der Enzyme auf den Träger und die Verwendung der Enzym-Immobilisate erfolgt, d.h. im allgemeinen zwischen 0 und 60, bevorzugt zwischen 20 und 40⁰C. Die Dauer der Desorption und Reakuivierung erfordert im allgemeinen nicht mehr als 10 bis 24 Stunden. Die Desorption wie auch die Reaktivierung mit der Enzymlösung erfolgt im allgemeinen durch Stehenlassen oder unter Durchleitung der Lösungen, wobei das zu regenerierende Immobilisat ruht oder mäßig bewegt wird.

Es ist überraschend, daß bei der Regenerierung ein vollständiges Enzym-Immobilisafc gewonnen wird und daß das Verfahren unter milden Bedingungen möglich ist, die denen bei Herstellung und Gebrauch der Immobilisate gleichen.

Nach dem Vaschen mit diesen Desorptionslösungen wird der Träger mit üblichen verdünnten PufferlösungenCbeispielsweise mit Essigsäure/Acetatpuffer, Phosphatpuffer; pH ca. 7 bis 9. ) gewaschen und mit einer frischen Enzymlösung in Kontakt gebracht. Er wird dadurch wieder aktiviert.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für solche Enzym-Immobilisate, bei denen das Enzym nicht kovalent gebunden, sondern durch beispielsweise ionische Anziehung oder Adsorption auf dem Träger angeordnet ist.

Solche Enzym-Immobilisate können vielfältiger Art sein, insbesondere handelt es sich bei solchen Ensym-Imjiiobilisaten jedoch usi die

909847/0386

nach unserer deutschen Patentanmeldung P 27 4Q 317.O und deren : Zusatz-Anmeldung OZ: 78 037 (-28"1J) hergestellten Enzym-Immobilisate, in denen auf anorganischen, besonders SiOp enthaltenden Trägern Aminoalkyl- oder Aminoarylgruppen enthaltende Alkoxisilane aufgebracht und das Enzym diesen Silanen zugeordnet, aber nicht an diese !covalent gebunden ist. \

Die Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Regenerierung von Enzym-Immobilisaten mit einem der Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf einen anorganisciien Trägermaterial nach der deutschen Patentanmeldung P 27 4-9 371 ·0 und der genannten Zusatz-Anmeldung zeigt einen besonderen Vorteil der Immobilisierung von Enzymen auf Trägern, bei der durch besondere Maßnahmen die Enzyme nicht !covalent gebunden, sondern in offenbar räumlicher Anordnung dem mit Silanen behandelten Träger dauerhaft zugeordnet sind.

Beruht der Aktivitätsabfall eines Enzym-Immobilisats nicht auf einer Schädigung von immobilisertem Enzym, sondern lediglich auf einem Enzymverlust durch langsame Desorption nach langer Einsatzzeit, so genügt eine Reaktivierung mit frischer Enzymlösung, der eine kurzzeitige Waschung mit verdünnter Pufferlösung anstelle der Waschung mit Desorptionslösung vorausgehen kann. Solche verdünnte Pufferlösungen haben im allgemeinen einen Gehalt von 1 bis 10 Gew.-% der Puffersubstanzen und einen pH-Wert im genannten Bereich.

909847/0386

- 6 Beispiel 1

8 g (Feuchtgewjcht) einec Enzym-Immobilisats, hergestellt durch Inkubation von S S eines porösen Si O₉-Trägers rnt Ϋ' -Arλ noprop"I triäthoxisilan und anschließender Aufbringung einer AfIATTO-ACyIaF-C-lösung ( nach Patentanmeldung P 27 4Q 317) werden bei 37⁰O dreir.al je 8 Stunden mit je 30 ml einer 20 Gew.-%igen wässrigen Ammoniumsulfatlösung von pH 7 behasdelt. Das Immobili r.at wird 20 min. nit 30 ml 2 Gew.-%igern Acetatpuff er von pH 7, gewaschen. Die Aktivität, gemessen an der enzynatischen Hydrolyse von Ka-IT-Acetyl-DL-phenylalanin beträgt nach der Desorption 1/3 ~ 1/4 der Ausgangs™ aktivität. Das Immobil i s at -wird durch 24stündi.ge Inkubation mit 8 ml einer 10 Gew.~%igen AIIANO-Acylaselösuag in Acetat puff er bei 22⁰C reaktiviert.

Nach Waschen mit Acetatpuffer zum Entfernen nicht gebundenen Enzyms zeigt das Imraobilisat, auch in Langzeitversuchen, die gleiche Aktivität wie das Original-Immobilisat. Die Versuche wurden mit dem gleichen Ergebnis box 20⁰C und 45 w ^: durchgeführt. I

Statt 20 Gew.-%iger Ammonsulfatlösung wurden mit gleichem Ergebnis 30 oder 40 Gew.-%ige Ammonsulfatlösungen verwendet.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde mit entsprechenden Iiamobilisaten wiederholt, bei denen a) durch zu hohe Arbeitstemperatur (über 50⁰C), b) durch verunreinigte Substrat}ögunpen (enthaltend Z-.B. Konjplejcbi7φιττ, Thiole oder Cadmium) und c) durch zu hohe Substratkonzenfcration von über 25 Gew.-% Na-N-Acetyl-phenylalanin das immobilisierte Enzym geschädigt war. Nach Durchführung der Regenerierungsoperationen erhält man Immobilisate mit einer Aktivität, die «Jen nach Patentanmeldung P 27 49 3^7 frisch hergestellten Präparaton gleicht.

Beispiel 3

Beispiel Λ wurde mit entsprechenden Lösungsciengen auf das Enzym-Imraobilisat einer Säulenfüllung angewendet, da& ursprünglich

909847/0386

BAD ORfGINAL

28218SQ

nach P 27 4-9 317 aus 250 g eines poi'ösen SiO₂-Trägers mit

P^-Aminopropyltrialkoxisilan und einer Acylase hergestellt worden war und das nach 60 Tagen Einsatz zur Herstellung von L-Phenylalanin aus Na-N-Acetyl-DL-phenylalanin noch etwa 55 % der Anfangsaktivität zeigte. Nach Durchführung der Regenerierungsmaßnahmen nach Beispiel 1 zeigte die SauIoηfüllung eine um ca. 10 % höhere Aktivität als die ursprüngliche.

Beispiel 4-

Beispiel 3 wurde an einer Säulenfüllung durchgeführt, die nach 90 Tagen Einsatz zur Herstellung von L-Tryptophan aus Na-N-Ace·- tyl-DL-tryptophan noch ca. 35 % der Anfangsaktivität zeigte. Nach Durchführung der Regenerierungsoperationen zeigte die Säulenfüllung ca. 90 % der Ausgangsaktivität.

Beispiel 5

Beispiel 3 wurde mit der Hälfte einer Säulenfüllung durchgeführt, die nach 100 Tagen Einsatz zur Herstellung von L-Phenylalanin aus Na-N-Acetyl-DL~phenylalanin ca. 25 % der Anfangsaktivität zeigte. Nach Durchführung der Regenerierungsoperationen zeigte j die Säulenfüllung wieder die Ausgangeaktivität.

Beispiel 6

Die zweite Hälfte der in Beispiel 5 genannten Säulenfüllung wurde ohne Anwendung einer Salzlösung durch Waschen mit einer 2 Gew.~%igen Essigsäure/Na-Acetat-Pufforlösung und Behandlung mit Acylase-Lösung regeneriert. Anschließend zeigte f'er Katalysator ca. 80 % der AusgangsaktivLtäi;.

Beispiel 7

Beispiel 1 wurde mit Enzyro-Iromo'bilisatim, welche *uö '"-■ ·--'- --^V-Träger und p-Ar;ii.r_JDi'hfⁱ.ri«l{.r"tnrifchoxir-·.üan p-ovie -Acyla^e ];.>.■ _cy.i -.-~-.'.'['.. worden, v'aron, -πόΛ durch G<VbrMnch suf t<t\-iz -'4-0 oio 60 % -¹^'" "··'·-·

9Q9847/0386

BAD ORIGINAL

282189Q

liehe Aktivität wurde zn 95 - ^CO % vii^derhergPRtellt und bleib "bei weiterem gleichartigem Gebrauch ebensolange erhalten, v/i*» die Aktivität frisch hergestellter Enzym-Imraobilicate.

909847/0386

Claims

282189Q

Troiedorf, den 27. Am-Π 1^r>?-: OZ: 7^ ^?β ( 28V+ )

Pat ent anspräche

1. Verfahren zur Regenerierung von Enzym-ImmobiTisaten, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem Immobilität das inaktivierce Enzym mittels Salzlösungen desorbiert und der· Enzym träger mittels frischer Enzymlösung reaktiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Desorption und Reaktivierung eine Waschung pit Bafferlösung erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, d&'l die Waschung mit Pufferlösung anstelle der Desorption in.it OaIzlösungen erfolgt.

4. Verfahren nach einem de:.:* Anspräche 1 bis 3-, dadurch gekennzeichnet, daß die riaßnahncn.der Regenerierung im pU-I^i-eich 'von I 5 bis 11, vorzugsweise von 7 bis 9» ausgeführt werden.

■ 5- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch [rtkonn-I zeichnet, daß die Salzlösungen der Desorption. ^ep'Uicrt; sir-d.

^: 6. Verrahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 5, dacurch ftokenn- \ zeichnet, daß die Desorptionslößimgen wässrige Ar^:ox-r;t.a.fat- ! lösungen im Eonzentrationsbereich 10 bis 40, vorziircii^-tii-se PO j bis 30 Gew.~?^, sind.

j 7· Verfahr-η nach einem der Ansprüche 1 bis 6, cU-.dtirch f^ih.enu-

; zeichnet, daß das Enzym nicht kovalemt εη den Träger f';/bu:vJ.o>..

: ist.

^; 8. Verfahren nach An^pj-ucli 7, dadurch g«ke3n;:c-:Lc:hr,.tii7, '3λΒ dar

; Enzyrc auf dei-i Trägor aiifgebrachtoa A-^:i.^od1 "■ -j"\ ~ 'isi·:-·* '·;:ο rioo -·., 1 ■■-

Gruppen erxthiü bonden A]>.OÄ-isi.la:r^:r· ni.cat kovalanl^ sa^oordre^. ¹ ist. ' -

9 098 47/0386

BAD ORIQfNAL

282189Q

9. "Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet;, daß als Enzym des Inuaobilisats eine Acyiaae verwendet ist.

Dr.La/Be

909847/0386