DE2705377C2

DE2705377C2 -

Info

Publication number: DE2705377C2
Application number: DE2705377A
Authority: DE
Inventors: Isao Kaetsu; Minoru Kumakura; Masaru Takasaki Gunma Jp Yoshida
Original assignee: Japan Atomic Energy Research Institute
Current assignee: Japan Atomic Energy Agency
Priority date: 1976-02-09
Filing date: 1977-02-09
Publication date: 1988-11-03
Also published as: JPS5718467B2; JPS5296791A; US4272617A; DE2705377A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung einer unlöslich gemachte Enzyme und/oder Bakterienzellen enthaltenden Zusammensetzung. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieser Erfindung.

Enzyme oder Bakterienzellen werden zur Durchführung vieler Reaktionen, z. B. bei der Herstellung von Arznei- und Lebensmitteln eingesetzt. Werden Enzyme in Form einer Lösung eingesetzt, dann ist nach Beendigung der Reaktion die Enzymlösung nicht wieder verwendbar, weil die gebrauchte Enzymlösung das Reaktionsprodukt enthält und zusammen mit diesem aus dem Reaktionssystem entfernt werden muß. Bei Verwendung von Enzymlösungen ist es somit erforderlich, diese schubweise oder chargenweise einzusetzen und wieder zu entfernen, so daß die maximale Wirkung des Enzyms nicht ausgenutzt wird.

Die US-PS 38 60 490 beschreibt den Einschluß von Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze, Hefe und Viren in einem hydrophilen Acrylat, damit die lebenden Mikroorganismen bis zu ihrer Verwendung trocken oder unter Ausschluß von Luft aufbewahrt und am entsprechenden Ort zur entsprechenden Zeit rasch oder gesteuert freigegeben werden oder wirken können.

Die US-PS 38 59 169 beschreibt die Aufnahme von Enzymen in Gelen und gemäß der US-PS 38 71 964 werden Polypeptide wie Enzyme durch Bindung an ein vernetztes Copolymerisat wasserlöslich gemacht.

Gemäß der US-PS 39 62 038 werden Enzyme in Polymerisaten festgehalten, die aus Acrylamid, Bisacrylamid, Acrylsäure, Natrium-, Kalium- oder Calciumacrylat entstehen. Die Monomere befinden sich im kristallinen Zustand bei Temperaturen unterhalb von 0°C, bei denen jedoch die Polymerisierbarkeit der kristallisierbaren Monomere verringert ist, weil die Molekularbewegungen der Monomere infolge der Bildung von Kristallgittern gehindert werden. Wird zur Polymerisation eine ionisierende Strahlung in hoher Gesamtdosis angewendet, besteht die Möglichkeit einer Entaktivierung der Enzyme oder Bakterienzellen. Werden die Monomere bei niedriger Temperatur kristallisiert, vermögen die Enzyme und Zellen kaum in die monomere Phase einzudringen und lassen sich somit nicht fest im Polymerisat einschließen.

Die bekannten Verfahren zum Einschließen von Enzymen oder Bakterienzellen in einem Polymerisat haben den Nachteil, daß die Enzyme oder Zellen aus dem Polymerisat frei werden oder entweichen können. Folglich lassen sich die bekannten Zusammensetzungen, die unlöslich gemachte Enzyme enthalten, nur während einer kurzen Zeitdauer bei kontinuierlichen Verfahren verwenden, und sie können nicht mehrmals wiederholt zur Anwendung kommen.

Die DE-OS 23 05 320 beschreibt Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen, bei denen die Enzyme in ein Polymerisatgitter eingeschlossen werden, das durch Polymerisation eines die Enzyme enthaltenden Monomergemisches oder durch Vernetzung von mit den Enzymen gemischten Polymerisaten erhalten wird. Die Polymerisation oder Vernetzung kann durch Bestrahlung ausgelöst werden. Zur Herstellung des die Enzyme einschließenden Gitters wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen unterhalb von +5°C, üblicherweise zwischen 0 und +2°C, gearbeitet, um eine Zersetzung der Enzyme zu vermeiden. Die Polymerisatgitter werden vorzugsweise hergestellt aus hydrophilen Monomeren, die entweder hydroxylgruppenhaltige niedere Alkylacrylate oder -methacrylate oder hydroxylgruppenhaltige niedere Alkylacrylate oder -methacrylate oder hydroxylgruppenhaltige niedere Alkoxy-nieder-alkylacrylate oder -methacrylate sind. Ein auf diese Weise hergestellter, ein unlösliches Hydrogelgitter enthaltender Körper kann abschließend zum Schutz gegen eine mögliche Auslaugung der proteinischen Substanz und zur Verbesserung der Lagerbeständigkeit mit einem Überzug aus hydrophilem Material versehen werden. In Verbindung mit den Monomeren oder Copolymerisaten lassen sich auch andere, ethylenisch ungesättigte Monomere wie Alkylcrylate und -methacrylate, Alkoxyalkylacrylate und -methacrylate verwenden. Werden diese in Mengen von vorzugsweise nicht über 50% und normalerweise zwischen 0,5 und 20%, bezogen auf das Monomerengemisch, eingesetzt, dann ergeben sie eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften des Polymerisatgelgitters. Sie sollten jedoch nicht in einer Menge zum Einsatz gelangen, bei der die hydrophile Natur des Polymerisats beeinträchtigt wird.

In einem hydrophilen Polymerisatkörper sind die Enzyme zusammen mit Wasser innerhalb der Masse des Polymerisats eingeschlossen. Wird ein derartiger Polymerisatkörper zur Durchführung von Enzymreaktionen eingesetzt, dann verlaufen diese relativ langsam, weil die Reagenzien vor einer Umsetzung zuerst in das die Enzyme umschließende Polymerisat eindringen müssen. Die Geschwindigkeit der Enzymreaktion hängt somit von der Diffusion der Reagenzien in das Polymerisat ab.

Hydrophile Polymerisate neigen zum Aufquellen. Werden derartige, Enzyme einschließende Polymerisate oft oder im Verlauf einer längeren Zeitdauer bei Enzymreaktionen eingesetzt, dann werden die Enzyme aufgrund des Aufquellens des Polymerisats freigegeben. Die Aktivität des Polymerisatkörpers nimmt somit ab.

Bei der Herstellung der Polymerisate sind die Monomere gleichmäßig in flüssigem Wasser verteilt. Das durch Strahlungspolymerisation gebildete unlösliche Polymerisat wird aus dem Wasser ausgeschieden, wobei jedoch die wasserlöslichen Enzyme zum großen Teil im Wasser zurückbleiben, so daß nur geringe Enzymmengen in der Polymerisatphase aufgenommen werden. Außerdem weisen die kristallisierbaren Monomere im kristallinen Zustand eine nur geringe Polymerisierbarkeit auf.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer unlöslich gemachte Enzyme und/oder unlöslich gemachte Bakterienzellen enthaltenden Zusammensetzung vorzusehen, in die bei der Durchführung einer Enzymreaktion die Reaktionsmittel leicht eindringen können, in der jedoch die Enzyme oder Zellen so fest eingeschlossen sind, daß die Zusammensetzung im Verlauf einer größeren Zeitspanne kontinuierlich sowie auch wiederholt verwendbar ist.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ergibt sich bei dem eingangs genannten Verfahren aus dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.

Das im Anspruch 1 genannte deutsche Patent 26 33 259 betrifft ein Verfahren zum Unbeweglichmachen von Enzymen oder enzymhaltigen Zellen, bei dem das Enzym oder die Zellen zunächst an einem Adsorptionsmittel der Gruppe A in Pulverform, welches eine adsorptionsfähige anorganische natürliche Erde, ein synthetisches anorganisches Adsorptionsmittel, Aktivkohle, ein natürliches oder synthetisches amorphes adsorptionsfähiges Kohlenhydrat oder Polypeptid darstellt, in wäßrigem Medium adsorbiert und mit einem Monomer B der allgemeinen Formel

oder

worin R′ eine Gruppe -CH₂CH₂- oder -CH(CH₃)CH₂-, R² ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Gruppe der Formel

X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, n eine ganze Zahl von 2, 3 oder 4 und m eine ganze Zahl von 2 bis 20 bedeutet, allein oder zusammen mit einer kleineren Menge eines Monomers C als zweites Monomer, dessen Wassermischbarkeit von der des ersten Monomers B verschieden ist, mittels Bestrahlung polymerisiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Herstellung von porösen enzymhaltigen Körpern die aus A, an dem das Enzym oder die enzymhaltigen Zellen adsorbiert sind, und Wasser bestehende Dispersion mit dem Monomer B und gegebenenfalls dem Monomer C, vermischt, wobei der Anteil des zweiten Monomers bis zu 30 Gew.-% des Gesamtgewichts der Monomeren beträgt, und daß man dann die Polymerisation mit Hilfe von Lichtstrahlung oder ionisierender Strahlung bei einer Temperatur zwischen -20 und -80°C durchführt.

Das im Patentanspruch 1 genannte deutsche Patent 27 03 834 betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer unlöslich gemachte Enzyme und/oder unlöslich gemachte Bakterienzellen enthaltenden Zusammensetzung durch Bestrahlen eines aus einer wäßrigen Enzymlösung und/oder einer wäßrigen Dispersion von Bakterienzellen, mindestens einem porösen Adsorptionsmittel und mindestens einem Monomer hergestellten Gemisches mit ionisierenden Strahlen bei einer Temperatur unterhalb von -10°C, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Monomer oder Monomere mindestens eine vitrifizierbare Verbindung der Formel

worin X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R₁ die Gruppe

(-CH₂-)_n

in der n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist,

in der m eine ganze Zahl größer als 1, vorzugsweise 2 bis 6, ist, oder

in der l eine ganze Zahl größer als 1, vorzugsweise 2 bis 6 ist, darstellt, und worin wenn R₁ die Gruppe

darstellt, R₂ die Gruppe

-OH -OCH₃

oder

in der X wie obenstehend definiert ist, darstellt, und wenn R₁ die Gruppe

(-CH₂-CH₂-O-)_m

oder

darstellt, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder die Gruppe

in der X wie obenstehend definiert ist, darstellt, oder

in der X wie obenstehend definiert ist, oder

in der R eine Ethyl-, n-Propyl- oder Isopropylgruppe darstellt und X wie obenstehend definiert ist, einsetzt, ausgenommen das Verfahren zum Unbeweglichmachen von Enzymen oder enzymhaltigen Zellen, bei dem das Enzym oder die Zellen zunächst an einem Adsorptionsmittel der Gruppe A in Pulverform, welches eine adsorptionsfähige anorganische natürliche Erde, ein synthetisches anorganisches Adsorptionsmittel, Aktivkohle, ein natürliches oder synthetisches amorphes adsorptionsfähiges Kohlenhydrat oder Polypeptid darstellt, in wäßrigem Medium adsorbiert und mit einem Monomer B der allgemeinen Formel

oder

X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, n eine ganze Zahl von 2, 3 oder 4 und m eine ganze Zahl von 2 bis 20 bedeutet, allein oder zusammen mit einer kleineren Menge eines Monomers C als zweites Monomer, dessen Wassermischbarkeit von der des ersten Monomers B verschieden ist, mittels Bestrahlung polymerisiert, wobei man zur Herstellung von porösen enzymhaltigen Körpern die aus A, an dem das Enzym oder die enzymhaltigen Zellen adsorbiert sind, und Wasser bestehende Dispersion mit dem Monomer B und gegebenenfalls dem Monomer C, vermischt, wobei der Anteil des zweiten Monomers bis zu 30 Gew.-% des Gesamtgewichts der Monomeren beträgt, und daß man dann die Polymerisation mit Hilfe von ionisierender Strahlung bei einer Temperatur zwischen -20 und -80°C durchführt.

Unter Unlöslichmachen von Enzymen oder Bakterienzellen ist zu verstehen, daß die Enzyme oder Zellen von einem Substrat festgehalten werden, so daß die Enzyme oder Zellen in einer Enzymreaktion einsetzbar sind. Unter Enzymreaktion ist eine Reaktion zu verstehen, in der Enzyme oder Zellen als Katalysatoren; Initiatoren oder Reagenzien eingesetzt werden.

Bisher wurde angenommen, daß Enzyme nur in wäßriger Lösung stabil sind. Es wurde jedoch gefunden, daß Wasser auskristallisiert, wenn eine wäßrige Lösung eines Enzyms auf Temperaturen unterhalb von 0°C abgekühlt wird, wobei das Enzym aus dem kristallisierenden Wasser freigegeben wird. Ferner wurde festgestellt, daß Enzyme in Abwesenheit einer Pufferlösung stabil sind, wenn sie bei einer unterhalb von 0°C liegenden Temperatur gehalten werden. Somit ergab es sich, daß zum Unlöslichmachen eines Enzyms in einem Polymerisat die Verwendung von wasserlöslichen Monomeren nicht kritisch ist. Da die Anzahl wasserlöslicher Monomere gering ist, wären die technischen Möglichkeiten zum Unlöslichmachen von Enzymen oder Bakterienzellen eingeschränkt, wenn die Verwendung von wasserlöslichen Monomeren kritisch wäre.

Es wurde festgestellt, daß Enzyme und/oder Bakterienzellen durch Verwendung eines hydrophoben vitrifizierbaren Monomers in gleicher Weise unlöslich gemacht werden können, wie durch Verwendung eines wasserlöslichen Monomers.

Wird ein vitrifizierbares Monomer auf eine unterhalb seines Schmelzpunktes liegende Temperatur abgekühlt, kristallisiert es nicht, sondern geht in einen unterkühlten Zustand über. Je niedriger die Temperatur eines vitrifizierbaren Monomers ist, desto größer ist seine Viskosität. Die Polymerisationsgeschwindigkeit eines vitrifizierbaren Monomers ist auch bei einer sehr niedrigen Temperatur groß. Wird ein erfindungsgemäß eingesetztes hydrophobes vitrifizierbares Monomer mit einer wäßrigen Enzymlösung zusammengemischt, bildet sich eine homogene Dispersion. Beim Abkühlen dieser Dispersion auf eine unterhalb von -10°C liegenden Temperatur kristallisiert Wasser aus, das Monomer kristallisiert jedoch nicht. Folglich bleibt bei unterhalb von 0°C liegenden Temperaturen die Suspension des Enzyms im Monomer erhalten. Wird eine derartige Dispersion mit ionisierender Strahlung bestrahlt, bildet sich unter rasch erfolgender Polymerisation des Monomers eine Zusammensetzung, in der das Enzym fest eingeschlossen ist. Nach der Polymerisation des Monomers wird das Kristallwasser durch Schmelzen aus der Zusammensetzung frei, so daß sich eine poröse Zusammensetzung bildet. Da bei einer Enzymreaktion die Reaktionsmittel in die poröse Zusammensetzung eindringen können, läßt sich die Enzymreaktion wirksam durchführen. Ferner ist es für das in der Zusammensetzung enthaltene, unlöslich gemachte Enzym schwierig, aus der porösen Zusammensetzung zu entweichen.

Aus dem nachstehend erläuterten Grund wird die Polymerisation bei einer unterhalb von -10°C liegenden Temperatur durchgeführt. Enzyme und Bakterienzellen sind instabil und können entaktiviert werden, so daß es notwendig ist, die Polymerisation bei einer niederen Temperatur durchzuführen.

Damit die Polymerisation bei niedriger Temperatur stattfinden kann, ist es kritisch, eine ionisierende Strahlung zur Einwirkung zu bringen.

Kristallisierbare Monomere befinden sich bei Temperaturen, die unterhalb von 0°C liegen, im kristallinen Zustand. Die Polymerisierbarkeit eines kristallisierbaren Monomers ist bei unterhalb von 0°C liegenden Temperaturen herabgesetzt, weil die molekularen Bewegungen im Monomer infolge der Bildung eines Kristallgitters behindert werden. Ferner stellt ein kristallisierbares Monomer kein homogenes Dispersionsmedium dar, d. h., daß die Mischung aus dem kristallisierbaren Monomer und dem Enzym keine homogene Dispersion bildet, in der das Enzym homogen dispergiert ist. Aus diesem Grund werden Enzyme usw. nicht im gebildeten Polymerisat fest eingeschlossen, wenn die Mischung des Monomers und des Enzyms usw. bei einer unterhalb von 0°C liegenden Temperatur polymerisiert wird.

Dagegen befindet sich das erfindungsgemäß eingesetzte hydrophobe vitrifizierbare Monomer bei Temperaturen unterhalb von -10°C nicht im kristallinen, sondern im unterkühlten Zustand. Bei Temperaturen unterhalb von -10°C ist die Polymerisierbarkeit des vitrifizierbaren Monomers sehr groß, weil die Molekularbewegungen im Monomer nicht behindert werden.

Im Gegensatz zum Verfahren nach der DE-OS 23 05 320 werden beim erfindungsgemäßen Verfahren keine hydrophilen, sondern hydrophobe Monomere eingesetzt, so daß auch die gebildeten Polymerisate hydrophob sind. Hierdurch ergeben sich die nachfolgend erläuterten Vorteile.

Werden hydrophile Polymerisate verwendet, müssen bei einer Enzymreaktion die Reagenzien zuerst in das Polymerisat eindringen, wie bereits erwähnt worden ist. Werden im Gegensatz hierzu hydrophobe Polymerisate eingesetzt, dann sind die Enzyme nicht im Inneren des Polymerisatkörpers eingeschlossen, sondern auf dessen Oberfläche unlöslich gemacht. Die Enzyme sind somit für die Reagenzien leicht zugänglich, so daß die Enzymreaktion rasch stattfindet.

Hydrophobe Polymerisate quellen in Wasser nicht auf, so daß bei wiederholter Verwendung der Zusammensetzung die Enzyme nicht freigegeben werden.

Enzymmoleküle weisen hydrophobe Bindungen auf, die den Enzymen Aktivität und Beständigkeit gegenüber Hitze und organischen Chemikalien geben und bestimmen die sterische Konfiguration der Enzymmoleküle. Die Enzyme verbinden sich mit den hydrophoben Gruppen des hydrophoben Polymerisats, so daß bevorzugte Konfigurationen der unlöslich gemachten Enzyme im Polymerisat entstehen. Die Beständigkeit der hydrophobe Polymerisate enthaltenden Zusammensetzung gegenüber Hitze und organischen Chemikalien ist größer als diejenige einer hydrophile Polymerisate enthaltenden Zusammensetzung.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das gebildete unlösliche Polymerisat nicht aus dem Wasser ausgeschieden, in dem die wasserlöslichen Enzyme größtenteils zurückbleiben, sondern es wird bei niedrigen Temperaturen gearbeitet, so daß das Wasser kristallisiert und die daraus ausgeschiedenen Enzyme an der Oberfläche der polymerisierenden Monomerphase erfaßt und dort festgehalten werden.

Die erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzung läßt sich im Verlauf einer längeren Zeitspanne kontinuierlich oder vielmals wiederholt verwenden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich verschiedenartige Enzyme und/oder Bakterienzellen unlöslich machen, ohne daß deren Aktivität verlorengeht. Es lassen sich zwei oder mehr Enzyme oder Bakterienzellen zweier oder mehr Arten oder Enzyme und Bakterienzellen in Mischung miteinander unlöslich machen.

Enzyme, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unlöslich gemacht werden können, sind z. B. Urease, Alkoholdehydrogenase, Milchsäure-Dehydrogenase, Maleinsäure-Dehydrogenase, Glucoseoxidase, Diaminoxidase, Glucoseoxidasecatalase, D-Aminosäure-Oxidase, Liposidase, Uricase, Ribonuclease, Hexokinase, Lipase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Deoxyribonuclease, α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase, Glucoseisomerase, Cellulase, Hemicellulase, b-Glucosidase, Invertase, Anthoxyanase, Narindinase, Hesperidinase, β-Glucoronidase, Hyaluronidase, alkalische Protease, halbalkalische Protease, saure Protease, Thermorairin, Collagenase, Pepsinpesinagen, Aminopeptidase, Rennin, Trypsin-Trypsinogen, Chymotrypsinogen, Elastase, Enterodinase, Acrylase, Arginase, L-Glutaminsäurecarboxylase, L-Lysindecarboxylase und Papain.

Beispiele der Bakterienzellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unlöslich gemacht werden können, sind Zellen, die die vorstehend erwähnten Enzyme enthalten, Aerobacter aerogenes, Azetobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Escherrichia coli und Micrococcus lysodeikticus.

Das Zusammenmischen der Enzyme und/oder Bakterienzellen mit dem vitrifizierbaren Monomer läßt sich nach jeder bekannten Verfahrensweise, z. B. mechanisch, durchführen.

Vor der Polymerisation kann der Mischung mindestens ein Adsorptionsmittel zugegeben werden. In diesem Fall werden die Enzyme und/oder Bakterienzellen mit dem Adsorptionsmittel zusammengegeben, ehe es zum Zusammenmischen mit dem Monomer kommt. Die Enzyme und/oder Bakterienzellen werden beim Zusammenmischen mit dem Adsorptionsmittel an der Oberfläche des Adsortionsmittels adsorbiert. Das die Enzyme und/oder Zellen adsorbierende Material wird dann innerhalb des Polymerisats eingeschlossen.

Beispiele verwendbarer poröser Adsorptionsmittel sind Molekularsiebe, Kaolin, Aluminiumoxid, Silicagel, Aktivkohle, Kanumaerde (eine in der Kanumagegend von Japan vorkommende Erde), poröser Ton, Bentonit, saurer Ton, Ionenaustauscherharze, Zinkhydroxid, Kunststoffteilchen wie Phenolharz- und Polyethylenteilchen, Gelatineteilchen, Amylose, Amylopectin, Cellulose und ihre Derivate, Agar, Kollagen, Stärke und ihre Derivate, Sägemehl, Baumwolle, Talk, Glasperlen, Silikat, Teilchen aus geschäumtem Kunststoff, Flocke, z. B. aus Wolle, Ton, Diatomeenerde und Mischungen daraus.

Die Anteile der einzelnen Komponenten in der zu bestrahlenden Mischung sind nicht kritisch. In zweckmäßiger Weise werden jedoch weniger als 50 Gewichtsteile des Enzyms und/oder der Bakterienzellen pro 100 Gewichtsteile des Monomers eingesetzt. Vorzugsweise liegt der Anteil an Enzymen und/oder Bakterienzellen im Bereich von 5 bis 30 Gewichtsteilen. Das Verhältnis von Wasser zu Monomer kann im Bereich von 99 : 1 bis 20 : 80 liegen. Wird ein Adsorptionsmittel verwendet, kann das Gewichtsverhältnis von Adsorptionsmittel zu Monomer im Bereich von 8 : 2 bis 2 : 8, vorzugsweise 6 : 4 bis 4 : 6 liegen.

Als ionisierende Strahlen werden z. B. Alpha-, Beta-, Elektronen-, Gamma- oder Röntgenstrahlen, sowie auch Strahlengemische aus einem Kernreaktor eingesetzt. Die Dosis der Bestrahlung kann im Bereich von 10² bis 10⁷ R, vorzugsweise 10³ bis 10⁶ R, und die Dosisrate im Bereich von 10² bis 10⁹ R/h, vorzugsweise 10³ bis 10⁸ R/h, liegen. Die Bestrahlung oder Polymerisation wird bei einer Temperatur unterhalb von -10°C, vorzugsweise im Bereich von -100°C bis -25°C durchgeführt. Die Bestrahlung kann sogar bei einer unterhalb von -200°C liegenden Temperatur durchgeführt werden.

Beispiele der beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren hydrophoben vitrifizierbaren Monomere sind Pentandiolmono- oder -dimethacrylat, Pentandiolmono- oder -diacrylat, Hexandiolmono- oder -dimethacrylat, Hexandiolmono- oder -diacrylat, Heptandiolmono- oder -dimethacrylat, Heptandiolmono- oder -diacrylat, Octandiolmono- oder -dimethacrylat, Octandiolmono- oder -diacrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Diethylenglykoldiacrylat, Triethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldiacrylat, Tetraethylenglykoldimethacrylat, Tetraethylenglykoldiacrylat, Methoxydiethylenglykolmethacrylat, Methoxydiethylenglykolacrylat, Methoxytriethylenglykolmethacrylat, Methoxytriethylenglykolacrylat, Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Methoxytetraethylenglykolacrylat, Ethoxydiethylenglykolmethacrylat, Ethoxydiethylenglykolacrylat, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Ethoxytriethylenglykolmethacrylat, Ethoxytriethylenglykolacrylat, Ethoxytetraethylenglykolmethacrylat, Ethoxytetraethylenglykolacrylat, Diethylenglykolmonomethacrylat, Diethylenglykolmonoacrylat, Triethylenglykolmonomethacrylat, Triethylenglykolmonoacrylat, Tetraethylenglykolmonomethacrylat, Tetraethylenglykolmonoacrylat, Dipropylenglykoldimethacrylat, Dipropylenglykoldiacrylat, Tripropylenglykoldimethacrylat, Tripropylenglykoldiacrylat, Dipropylenglykolmonomethacrylat, Dipropylenglykolmonoacrylat, Tripropylenglykolmonomethacrylat, Tripropylenglykolmonoacrylat, Methoxypropylenglykoldimethacrylat, Methoxypropylenglykoldiacrylat, Methoxydipropylenglykoldiacrylat, Methoxytripropylenglykoldimethacrylat, Methoxytripropylenglykoldiacrylat, Ethoxydipropylenglykoldimethacrylat, Ethoxydipropylenglykoldiacrylat, Ethoxytripropylenglykoldimethacrylat, Ethoxytripropylenglykoldiacrylat, Ethoxyethylmethacrylat, Ethoxyethylacrylat, Butoxyethylmethacrylat, Butoxyethylacrylat, Isopropoxyethylmethacrylat, Isopropoxyethylacrylat, 2-(2-Butoxyethoxy)ethylmethacrylat, 2-(2-Butoxyethoxy)ethylacrylat, Allyloxymethylmethacrylat, Methoxyethylmethacrylat, Methoxyethylacrylat, Ethoxypropylmethacrylat, Ethoxypropylacrylat, 2-(2-Vinyloxyethoxy)ethylmethacrylat, 2-(2-Vinyloxyethoxy)propylmethacrylat, 2-(2-Ethoxyethoxy)ethylmethacrylat, Acetoxyethylacrylat, Acetoxyethylmethacrylat, Acetoxyisobutylacrylat, Acetoxyisopropylmethacrylat, Acetylmethylmethacrylat, Propionylmethylmethacrylat, Acetylmethylacrylat, Propionylmethylacrylat, Butylylmethylacrylat, Butylylmethylmethacrylat, Butylacetatacrylat, Isobutylacetatacrylat, Isopropylacetatacrylat, Isopropylacetatmethacrylat, Butylacetatmethacrylat, Isobutylacetatbenzylmethacrylat, Benzylacrylat, Phenylacrylat, Phenylmethacrylat, Furfurylacrylat, Furfurylmethacrylat, Cyclohexylacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Cyclopentylacrylat, Cyclopentylmethacrylat, Trimethylolpropanacrylat, Trimethylolpropanmethacrylat, Trimethylolbutanacrylat, Trimethylolbutanmethacrylat, 2-Ethyl-hexylacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Neopentylglykoldiacrylat und Neopentylglykoldimethacrylat. Mischungen dieser Verbindungen sind auch verwendbar.

Bevorzugte monomere Verbindungen sind Butandiolmethacrylat, Butandiolacrylat, Pentandiolmethacrylat, Pentandiolacrylat, Hexandiolmethacrylat, Hexandiolacrylat, Heptandiolmethacrylat, Heptandiolacrylat, Butandioldimethacrylat, Butandioldiacrylat, Pentaldioldimethacrylat, Pentaldioldiacrylat, Hexandioldimethacrylat, Hexandioldiacrylat, Heptandioldiacrylat, Heptandioldimethacrylat, Ethoxyethylmethacrylat, Ethoxyethylacrylat, Methoxyethylmethacrylat, Methoxyethylacrylat, Acetoxyethylacrylat, Acetoxyethylmethacrylat, Benzylmethacrylat, Benzylacrylat, Phenylacrylat, Phenylmethacrylat, Cyclohexylacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Trimethylolpropanacrylat, Trimethylolpropanmethacrylat, Trimethylolbutanacrylat, Trimethylolbutanmethacrylat, 2-Ethyl-hexylacrylat, 2-Ethyl-hexylmethacrylat, Neopentylglykoldiacrylat, Neopentylglykoldimethacrylat. Es können zwei oder mehr Monomere in Form einer Mischung eingesetzt werden.

Wenn die Gruppe R₅ in der im Anspruch 1 mit (e) bezeichneten Formel eine Alkan-yl-ylidgruppierung ist, stellt die Formel (e) die Struktur

(Meth)Acrylatgruppe-N(Alkylgruppe) (OR₆) (OR₇)

dar, in der das Stickstoffatom mit der Alkyl-, OR₆- und OR₇-Gruppe jeweils kovalent und mit dem anderen Sauerstoffatom ionisch verbunden ist.

Der Mischung aus einem hydrophoben vitrifizierbaren Monomer, Enzymen und/oder Bakterienzellen und Wasser können zusätzlich andere Monomere, die als zweite Monomere bezeichnet werden und nicht vitrifizierbar sind, zugesetzt werden. Die Menge der zweiten Monomere kann innerhalb des Bereiches von 10 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des vitrifizierbaren Monomers, liegen.

Beispiele der als zweite Monomere verwendbaren Monomere sind Styrol, Methylmethacrylat, Methylacrylat, Ethylmethacrylat, Ethylacrylat, Butylmethacrylat, Butylacrylat, Isobutylmethacrylat, Isobutylacrylat, Propylmethacrylat, Propylacrylat, Isopropylmethacrylat, Isopropylacrylat, Vinyltoluol, Alphamethylstyrol, Vinylpyrrolidon, Vinylpyridin, Acrylsäure, Acrylamid, Methacrylsäure, Methacrylamid, Methylolacrylamid, Methylenbisacrylamid, Vinylacetat, Vinylbutyrat, Vinylpropionat, Divinylbenzol, Dipropargylmaleat, Triacrylformal, Triallylcyanurat, Isobutylvinylether, Diallylsuccinat, Diallylphthalat, Diallylmaleat, Diallylitaconat, Ethylendimethacrylat, Ethylendiacrylat, Dipropargylitaconat, Triallylisocyanurat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Hydroxypropylacrylat, Itaconsäure, wasserfreies Maleat. Mischungen dieser Verbindungen sind auch einsetzbar.

Der Zweck der Zugabe des zweiten Monomers ist es, die Festigkeit der erhaltenen Enzyme und/oder Bakterienzellen enthaltenden Zusammensetzung zu erhöhen, der Zusammensetzung ein gewisses Maß an hydrophilen Eigenschaften zu verleihen, die Materialkosten der Zusammensetzung zu verringern, die Porosität der Zusammensetzung zu vergrößern, die Aktivität der Zusammensetzung zu steigern und die Bindung der Enzyme und/oder der Bakterienzellen an das Substrat zu verbessern.

Anhand der folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert. Prozent- und Mengenangaben sind gewichtsbezogen, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Es wurden 10 Teile einer 1%igen wäßrigen Lösung von Alpha-Amylase mit 40 Teilen Aktivkohle zusammengemischt, so daß die Amylase an der Kohle adsorbiert wurde. Die Aktivkohle mit der adsorbierten Amylase wurde in Wasser dispergiert. Der Dispersion wurden 50 Teile Hexandiolmethacrylat zugegeben. Die erhaltene Dispersion wurde mit Gammastrahlen aus Kobalt 60, deren Dosis 1 × 10⁶ R betrug, bei einer Temperatur von -24°C bestrahlt, um das Monomer zu polymerisieren. Die erhaltene, das Enzym enthaltende Zusammensetzung wurde zu flockenartigen Teilchen zerkleinert, denen 5 ml einer 1%igen Lösung von Kartoffelstärkepaste zugegeben wurden.

Nach einstündiger Umsetzung der Stärke zu Maltose bei einer Temperatur von 40°C wurde dem Gemisch 0,1 N HCl zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Einer aus dem Gemisch abgezogenen 5 ml Probe wurden 100 ml einer Lösung, die 0,005% J₂ und 0,05% KJ enthielt, hinzugegeben, die dann geschüttelt wurde. Eine kolorimetrische Analyse wurde mit einer 10 mm Cuvette bei einer Wellenlänge von 660 nm durchgeführt, um die Aktivität der enzymhaltigen Polymerisatzusammensetzung zu bestimmen.

Ein Vergleichsversuch wurde in gleicher Weise durchgeführt mit der Ausnahme, daß sich das Enzym im gelösten Zustand befand. Das Verhältnis von Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzung zu Aktivität der Enzymlösung betrug 75%. Nach vielen Wiederholungen der Enzymreaktion unter Verwendung derselben Zusammensetzung wurde keine Abnahme der Enzymaktivität festgestellt.

Beispiel 2

Es wurden 600 µg Glucosamylase in 0,9 ml Essigsäure-Pufferlösung gelöst. Die Lösung wurde mit einem aus Molekularsieb bestehenden Adsorptionsmittel vermischt. Der Mischung wurde 0,1 ml Pentandiolmethacrylat hinzugegeben. Danach wurde die Mischung mit Gammastrahlen aus Kobalt 60, deren Dosis 1 × 10⁶ R betrug, bei einer Temperatur von -78° bestrahlt, um das Monomer zu polymerisieren. Die erhaltene, das Enzym enthaltende Zusammensetzung wurde zu flockenartigen Teilchen zerkleinert. Die flockenartige Zusammensetzung wurde 5 ml einer 1%igen Maltoselösung zugegeben. Die Maltose wurde 30 Minuten bei einer Temperatur von 40°C in Glucose umgewandelt, aus deren durch quantitative Analyse bestimmter Menge sich die Aktivität der enzymhaltigen Zusammensetzung ergab.

Ein Vergleichsversuch wurde in gleicher Weise durchgeführt mit der Ausnahme, daß sich das Enzym im gelösten Zustand befand. Das Verhältnis von Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzung zu Aktivität der Enzymlösung betrug 70%. Nach vielen Wiederholungen der Enzymreaktion unter Verwendung derselben Zusammensetzung wurde keine Abnahme der Enzymaktivität festgestellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer unlöslich gemachte Enzyme und/oder Bakterienzellen enthaltenden Zusammensetzung, in dem eine wäßrige Enzymlösung und/oder eine wäßrige Dispersion von Bakterienzellen mit mindestens einem hydrophoben, vitrifizierbaren Monomer zusammengemischt und durch Bestrahlen der entstehenden Mischung mit ionisierender Strahlung das Monomer polymerisiert und dadurch das Enzyme und/oder Bakterienzellen enthaltende Polymerisat aus dem Wasser ausgeschieden wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestrahlung bei einer unterhalb von -10°C liegenden Temperatur durchführt und als Monomer eine Verbindung der folgenden Formeln einsetzt: in der X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, R₀ ein Wasserstoffatom oder die Gruppe in der X wie vorstehend definiert ist, darstellt und n 4 oder eine größere ganze Zahl ist, in der X wie vorstehend definiert ist, R₁ die Gruppe -CH₂CH₂O-, in der X wie vorstehend definiert ist, CH₃O-, CH₃CH₂O- oder ein Wasserstoffatom darstellt, und m eine der ganzen Zahlen von 1 bis 3 ist, in der X wie vorstehend definiert ist, in der X wie vorstehend definiert ist, R₃ eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und R₄ eine Vinyl- oder Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt, in der R₅ eine Alkan(C₁ bis C₅)-yl-ylidgruppierung ist, R₆ und R₇ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Alkylaminogruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Alkyl- oder eine Vinylgruppe darstellen, in der X, R₃ und R₄ wie vorstehend definiert sind, R₈ wie R₃ definiert ist, und R₃ und R₈ gleich oder verschieden sind, in der X, R₃ und R₄ wie vorstehend definiert sind, in der X, R₃ und R₄ wie vorstehend definiert sind, in der X wie vorstehend definiert ist und R₁₁ eine Benzyl-, Toluyl-, Xylyl-, Phenyl-, Furfuryl-, Naphthyl-, Phthalyl-, Cyclohexyl-, Cyclopentyl-, Cycloheptyl-, Cyclobutyl-, Pyridyl- oder 3-Oxopyrrolidinylgruppe darstellt, in der X wie vorstehend definiert ist und R₉ eine Ethyl- oder Propylgruppe darstellt, oder in der X wie vorstehend definiert ist und R₁₀ eine Isopropylen- oder Isobutylengruppe, eine verzweigtkettige Alkylengruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, die Gruppe oder die Gruppe in der R₁₁ wie vorstehend definiert ist, darstellt, wobei ggf. mindestens ein Adsorptionsmittel mit den Enzymen und/oder Zellen zusammengegeben wird, ehe es zum Zusammenmischen mit dem Monomer kommt, mit Ausnahme des Gegenstands des deutschen Patents 26 33 259 betreffend ein Verfahren zum Unbeweglichmachen von Enzymen oder enzymhaltigen Zellen, bei dem das Enzym oder die Zellen zunächst an einem Adsorptionsmittel der Gruppe A in Pulverform, welches eine adsorptionsfähige anorganische natürliche Erde, ein synthetisches anorganisches Adsorptionsmittel, Aktivkohle, ein natürliches oder synthetisches amorphes adsorptionsfähiges Kohlenhydrat oder Polypeptid darstellt, in wäßrigem Medium adsorbiert und mit einem Monomer B der allgemeinen Formel oder worin R′ eine Gruppe -CH₂CH₂- oder -CH(CH₃)CH₂-, R² ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Gruppe der Formel X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, n eine ganze Zahl von 2, 3 oder 4 und m eine ganze Zahl von 2 bis 20 bedeutet, allein oder zusammen mit einer kleineren Menge eines Monomers C als zweites Monomer, dessen Wassermischbarkeit von der des ersten Monomers B verschieden ist, mittels Bestrahlung polymerisiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Herstellung von porösen enzymhaltigen Körpern die aus A, an dem das Enzym oder die enzymhaltigen Zellen adsorbiert sind, und Wasser bestehende Dispersion mit dem Monomer B und gegebenenfalls dem Monomer C, vermischt, wobei der Anteil des zweiten Monomers bis zu 30 Gew.-% des Gesamtgewichts der Monomeren beträgt, und daß man dann die Polymerisation mit Hilfe von Lichtstrahlung oder ionisierender Strahlung bei einer Temperatur zwischen -20 und -80°C durchführt; und mit Ausnahme des Gegenstands des deutschen Patents 27 03 834 betreffend ein Verfahren zur Herstellung einer unlöslich gemachte Enzyme und/oder unlöslich gemachte Bakterienzellen enthaltenden Zusammensetzung durch Bestrahlen eines aus einer wäßrigen Enzymlösung und/oder einer wäßrigen Dispersion von Bakterienzellen, mindestens einem porösen Adsorptionsmittel und mindestens einem Monomer hergestellten Gemisches mit ionisierenden Strahlen bei einer Temperatur unterhalb von -10°C, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Monomer oder Monomere mindestens eine vitrifizierbare Verbindung der Formel worin X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R₁ die Gruppe(-CH₂-)_nin der n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, in der m eine ganze Zahl größer als 1, vorzugsweise 2 bis 6, ist, oder in der l eine ganze Zahl größer als 1, vorzugsweise 2 bis 6 ist, darstellt, und worin wenn R₁ die Gruppe darstellt, R₂ die Gruppe-OH -OCH₃oder in der X wie obenstehend definiert ist, darstellt, und wenn R₁ die Gruppe(-CH₂-CH₂-O-)_moder darstellt, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder die Gruppe in der X wie obenstehend definiert ist, darstellt, oder in der X wie obenstehend definiert ist, oder in der R eine Ethyl-, n-Propyl- oder Isopropylgruppe darstellt und X wie obenstehend definiert ist, einsetzt, ausgenommen das Verfahren zum Unbeweglichmachen von Enzymen oder enzymhaltigen Zellen, bei dem das Enzym oder die Zellen zunächst an einem Adsorptionsmittel der Gruppe A in Pulverform, welches eine adsorptionsfähige anorganische natürliche Erde, ein synthetisches anorganisches Adsorptionsmittel, Aktivkohle, ein natürliches oder synthetisches amorphes adsorptionsfähiges Kohlenhydrat oder Polypeptid darstellt, in wäßrigem Medium adsorbiert und mit einem Monomer B der allgemeinen Formel oder worin R′ eine Gruppe -CH₂CH₂- oder -CH(CH₃)CH₂-, R² ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Gruppe der Formel X ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, n eine ganze Zahl von 2, 3 oder 4 und m eine ganze Zahl von 2 bis 20 bedeutet, allein oder zusammen mit einer kleineren Menge eines Monomers C als zweites Monomer, dessen Wassermischbarkeit von der des ersten Monomers B verschieden ist, mittels Bestrahlung polymerisiert, wobei man zur Herstellung von porösen enzymhaltigen Körpern die aus A, an dem das Enzym oder die enzymhaltigen Zellen adsorbiert sind, und Wasser bestehende Dispersion mit dem Monomer B und gegebenenfalls dem Monomer C, vermischt, wobei der Anteil des zweiten Monomers bis zu 30 Gew.-% des Gesamtgewichts oder Monomeren beträgt, und man dann die Polymerisation mit Hilfe von ionisierender Strahlung bei einer Temperatur zwischen -20 und -80°C durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zum vitrifizierbaren Monomer mindestens ein zweites Monomer in einer von 10 bis 30 Gew.-% betragenden Menge, bezogen auf das Gewicht des vitrifizierbaren Monomers, dem Polymerisationssystem zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestrahlung bei einer im Bereich von -100°C bis -25°C liegenden Temperatur durchführt.