DE2413694B2 - Wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterlal - Google Patents

Wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterlal

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Description

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterial, weiches eine biologisch aktive Enzymsubstanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger enthält, ein Verfahren zur Herstellung dieses unbeweglich gemachten Enzymmaterials sowie ein Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Umwandlung eines Substrats, bei dem dieses unbeweglich gemachte Enzymmaterial eingesetzt wird.
Bis heute sind zahlreiche verschiedene Aktivitäten unterschiedlicher Enzyme sowie daraus resultierende Verwendungszwecke in weitem Maß untersucht und erkannt worden. Diese Enzyme sind ihrer Natur nach Proteine und sind daher in Wasser löslich. Die Folge davon ist natürlich, daß die meisten dieser Enzyme während ihrer Anwendung gelöst werden und verlorengehen.
Es existieren zahlreiche Anwendungszwecke, bei denen Mikrobenzellen, denen die Wachstumsfunktion fehlt, die jedoch enzymatische Aktivität haben (sogenannte ruhende Mikroorganismenzellen), für verschiedene Enzymreaktionen verwendet werden. In diesem Fall sind zwar die Zellen selbst unlöslich, die in ihnen enthaltenen aktiven Enzyme werden jedoch im Laufe der Anwendung herausgelöst und gehen verloren. Damit solche Enzyme und Mikroorganismenzellen ihre biologische Aktivität während langer Dauer beibehalten können, wurden in den letzten Jahren zahlreiche Versuche unternommen, sie in unbewegliche, auf einem wasserunlöslichen Träger angeordnete Substanzen zu überführen, um ihre enzymatische Aktivität zu verlängern.
Die zu diesem Zweck bisher angewendeten Methoden sind jedoch im Hinblick auf die technische Anwendung mit folgenden verschiedenen Nachteilen behaftet:
I. Träger, deren Verwendung zusammen mit Enzymen zur Herstellung von unlöslich gemachten Enzymen unerläßlich ist, sind teuer.
2. Die zur Reaktion zwischen den Trägern und Enzymen zur Herstellung dieser Materialien verwendeten Verfahren sind kompliziert.
3. Die auf diese Weise unlöslich gemachten Enzyme zeigen ausgeprägt niedere enzymatische Aktivität im Vergleich mit der Aktivität der gleichen Enzyme in der ursprünglichen Form vor dem Unlöslichmachen.
4. Die Substratspezifität, welche die unlöslich gemachten Enzyme zeigen, weicht manchmal von der Substratspezifität ab, welche die gleichen Enzyme in ihrer ursprünglichen Form vor dem Unlöslichmachen zeigen. Die Verringerung einer solchen Spezifität ist im Hinblick auf hochmolekulare Substrate besonders deutlich.
5. Zum Unlöslichmachen einer großen Vielfalt von Enzvmen ist kein Träger universell anwendbar.
Ein Beispiel für diesen Stand der Technik ist das in der DE-OS 19 55 638 beschriebene Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzympräparaten. Bei diesem bekannten Verfahren werden zu einer wäßrigen Lösung eines Enzyms ein oder mehrere wasserlösliche Monomere gegeben, von denen mindestens eines im Laufe der Polymerisation zur Vernetzung befähigt ist, und das System wird danach bis zur Polymerisation von mindestens 80% der Monomeren mit Röntgenstrahlung oder Gamma-Strahlung hoher Dosis bestrahlt. Es ist ferner möglich, vor der Polymerisation des oder der Monomeren ein festes poröses Trägermaterial, z. B. einen porösen Kunststoff oder Baumwollwatte, zuzugeben. Das bekannte Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen ünzymen hat den Nachteil, daß, wahrscheinlich durch die Finwirkvng der energiereichen Strahlung, die Aktivität der verwendeten Enzyme stark vermindert wird. So beträgt -""ie Aktivität des erhaltenen unbeweglich gemachten Enzymmaterials meist weniger als 10% der ursprünglichen Aktivität.
Unter diesen Umständen bestand seit langem ein Bedürfnis nach einer universellen Methode zur Herstellung voti leicht zugänglichen und billigen hochaktiven unbeweglich gemachten Enzymmaterialien.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue unbeweglich gemachte Enzympräparate und ein technisch vorteilhaftes Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfugung zu stellen, bei dem die ursprüngliche enzymatische Aktivität in hohem Maß erhalten bleibt.
Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe gelöst werden kann, indem man die Enzyme an Anionenaustauscherharze mit spezifischen Gruppen bindet.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können Enzyme und Mikroorganismenzellen als Gastsubstanz auf den in den Ansprüchen genannten Trägern in die unbewegliche Form übergeführt werden, wobei ihre biologische Aktivität in hohem Maße beibehalten wird. Die Verwendung der so hergestellten Materialien ermöglicht es, daß verschiedene Enzym-Reaktionen in einem kontinuierlichen Reaktionssystem durchgeführt werden, was unter Verwendung von üblichen wasserlöslichen Enzymen nicht möglich war. Die Erfindung ist daher von großer industrieller Bedeutung.
Die erfindungsgemäß verwendeten Träger können insbesondere mit den gewünschten Eigenschaften und in gewünschter Form hergestellt werden, indem die Herstellungsbedingungen in geeigneter Weise eingestellt werden. Es ist daher für die Erfindung charakteristisch, daß die Träger in Übereinstimmung mit der Ausbildung der Gefäße für die enzymatische Reaktion hergestellt werden, die den Arten der Enzyme und Mikroorganismenzellen, die unlöslich gemacht werden sollen, und den entsprechenden charakteristischen
ι Enzym-Reaktionen angepaßt sind, und daß unter Verwendung dieser Träger die unlöslich gemachten Enzym-Materialien hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des unbeweglich gemachten Enzymmaterials umfaßt
in folgende drei Verfahrensstufen:
1. Herstellung der Copolymeren,
2. Herstellung von wasserunlöslichen, zum Anionenaustausch geeigneten Matrix-Substanzen durch
υ Quaternisieren der Pjridinringe dieser Copolymeren und
3. Herstellung von unbeweglich gemachten Enzym-Materialien durch Kombination dieser Matrizen mit Enzymen oder Mikroorganismenzellen.
Die einzelnen Stufen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden nachstehend ausführlicher erläutert.
1. Herstellung des Copolymeren
Erfindungsgemäß geeignete Monomere werden nachstehend erläutert.
Zu Vinylpyridin und dessen Derivaten gehören 2-Vinylpyridin, 4-Vinylpyridin, 2-Methyl-5-vinylpyridin, 5-Methyl-2-vinylpyridin, 3-Allylpyridin und verwandte Verbindungen, wie !-Vinylchinolin. Unter Berücksichtigung der Wirtschaftlichkeit und der Copolymerisierbarkeit mit anderen Monomeren ist es jedoch am wünschenswertesten, 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridin und 2-Methyl-5-vinylpyridin zu verwenden. Zu anderen mit Vinylpyridin und dessen Derivaten copolymerisierbaren Monomeren gehören aromatische Vinylverbindungen, wie Styrol, Λ-Methylstyrol und halogenierte Styrole, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, wie Äthylen, Propylen, Acrylsäure, Methacrylsäure, Methylmethacrylat, Acrolein, Vinylacetat, Acrylnitril, Vinylchlorid, Acrylamid und N-Methylolacrylamid, Diene, wie Butadien, Isopren und Chloropren, und Divinylverbindungen, wie Divinylbenzol, Äthylenglycoldimethacrylat, PoIyäthylenglycoldimethacrylat, Butandioldiacrylat, Diallylphthalat und Methylenbisacrylamid.
Zu Polymeren, die bei der Pfropfcopolymerisation mit Vinylpyridin copolymerisierbar sind und die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, gehören Polybutadien, Polyisopren, Polychloropren, Styrol-Butadien-Copolymere, chloriertes Polyäthylen, Polypropylen, Polyvinylalkohol.
DIs Herstellung von erfindungsgemäß verwendeten Copolymeren kann unter Verwendung irgendeiner der bekannten Copolymerisationsmethoden vorgenommen werden. Zur Herstellung von erfindungsgemäß verwendbaren Copolymeren ist es am wichtigsten, daß die anzuwendende Copolymerisationsmethode und die Art des zu verwendenden Monomeren in dieser Stufe so gewählt werden, daß die in der anschließenden Stufe durch Quaternisierung dieser Copolymeren gebildeten Matrizen hydrophil sind und gleichzeitig in allen Lösungsmitteln, speziell in Wasser, unlöslich sind.
Im Hinblick auf diese Tatsache können die zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren Copolymeren angewendeten Verfahren grob in folgende beide Klassen unterteilt werden:
1. Statistische Copolymerisation
Wenn die Methode der radikalischen Copolymerisation, wie beispielsweise als Suspensionspolymerisation und Emulsionspolymerisation, für die Copolymerisation angewendet wird, werden Copolymere erhalten, in denen Vinylpyridin und andere Monomere statistisch angeordnet sind. Obwohl diese Copolymereri in Wasser unlöslich sind, werden sie wasserlöslich, wenn sie in der anschliefenden Stufe zur Modifizierung des Polymeren der Quaternisierung unterworfen werden. Aus diesem Grund sollten Vinylpyridin und Divinylverbindungen als wesentliche Komponenten verwendet werden, wenn die Copolymerisation mit Hilfe dieser Methoden durchgeführt wird. In diesem Fall sind wünschenswerte Divinylverbindungen Divinylbenzol und (Poly)äthylenglycoldimethacrylat.
Die Zusammensetzung und das Molekulargewicht von Monomeren, weiche diese Copolymeren bilden, sind nicht kritisch, sondern können frei in der Weise gewählt werden, daß der vorgesehene Zweck der schließlich gebildeten Matrizen erfüllt wird. Aus praktischen Gründen liegt die Menge :on Vinylpyridin oder dessen Derivaten, die in den statistischen Copolymeren vorliegen, im Bereich von 20 bis 99 Mol-%, vorzugsweise 50 bis 95 Mol-%, und die der Divinylverbindungen im Bereich von 0,5 bis 30 Mol-%. vorzugsweise 1 bis 20 Mol-%.
Zu bevorzugten Beispielen von Copolymeren, die mit Hilfe der statistischen Copolymerisationsmethode hergestellt werden können, gehören Vinylpyridin-Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, Vinylpyridin-Methylmethacrylat-Divinylbenzol-Copolymere und Vinylpyndin-Äthylenglycoldimethacrylat-Copolymere.
2. Block- und Pfropf-Copolymerisation
Wenn zur Copolymerisation die Methoden der ßlock-Copolymerisation und Pfropf-Copolymerisation angewendet werden, werden Copolymere erhalten, in denen Vinylpyridin und andere Monomere oder Polymere in Form von Blöcken angeordnet sind. Wenn diese anderen Monomeren oder Polymeren hydrophob sind, werden in der nachfolgenden Stufe der Polymermodifikation, in der die Copolymeren quaternisiert werden, um die Hydrophilie ver Vinylpyridineinheiten zu erhöhen, die Copolymerisate als ganzes hydrophil, bleiben jedoch im wesentlichen unlöslich in Wasser, weil die aus den anderen Monomeren gebildeten Bereiche des Polymeren iniTier noch ihre hydrophoben Eigenschaften beibehalten. In diesem Fall ist es daher nicht speziell notwendig, Vernetzungsmittel zu verwenden, wie Divinylverbindungen. Im Fall der Block-Copolymerisation sind die wünschenswertesten Monomeren zur Copolymerisation mit Vinylpyridin Styrol und Methylmethacrylat. Im Fall der Pfropf-Copolymerisation gehören zu wünschenswerten Grundpolymeren Styrol-Butadien-Copolymere und chloriertes Polyäthylen. Die Art (Zusammensetzung) und das Molekulargewicht von Monomeren, die zur Herstellung der Copolymeren verwendet werden, können frei in der Weise gewählt werden, daß sie dem Endverwendungszweck der gebildeten Endprodukte (Matrizen) genügen. Für praktische Zwecke liegt die Menge an Vinylpyridin oder dessen Derivaten, die in die Pfropf- und Blockcopolymeren einpolyme; isiert werden soll, im Bereich von 25 bis 75 Mol-%, vorzugsweise 40 bis 60 Mol-%.
Konkrete Beispiele für bevorzugte Copolymere, die durch Block- und Pfropf-Copolyinerisation gebildet werden, sind Vinylpyridin-Styrol-Blockcopolymrre, Vinylpyridin-Methylmethacrylat-Block-Copolymere und Pfropf-Copolymere aus Vinylpyridin und chloriertem Polyäthylen.
Welche Methode unter den vorstehend erläuterten gewählt wird, hängt von der Art der Matrizen ab, die hergestellt werden sollen.
Wenn eine Matrize in amorpher Pulverform gewünscht wird, eignet sich für diesen Zweck ein Copolymeres, das durch radikalische Emulsions-Copolymerisation oder ionische Block-Copolymerisation gebildet wird. Wenn eine Matrize in Form von porösen Perlen erforderlich ist, eignet sich für diesen Zweck ein Copolymeres, das durch radikalische Suspensions-Copolymerisation gebildet wurde. Wird eine Matrij'.e in Form eines Films gewünscht, so kann sie hergestellt werden, indem zuerst ein Copolymeres durch ionische Block-Copolymerisation oder Pfropf-Copolymerisation hergestellt wird und anschli· iiend das resultierende Copolymerisat mit Hufe der GirSmethode zu einem Film verarbeitet wird.
Die Verfahren zur Herstellung der Copolymeren können daher so gewählt werden, dali sie der endgültigen Form Rechnung tragen, in der die unbeweglich gemachten Enzym-Präparate vorliegen sollen.
2. Herstellung des Trägers
Die Quaternisierung des Stickstoffatoms des Pyridinrings erfolgt am vorteilhaftesten durch Anwendung der Quaternisierungsreaktion eines Amins mit Hilfe eines HalogenierungsmiUels, speziell eines Halogenalkyl-Reagens. Zu wünschenswerten Alkylhalogeniden gehören Methylchlorid, Methylbromid, Propylbromid. Methyljodid und ähnliche Verbindungen.
Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist die Verwendung von Alkylhalogeniden und Alkylsulfaten besonders wünschenswert im Hinblick auf die Wirksamkeit des Quaternisierungsvorgangs. Die Bedingungen der Quaternisierung lassen sich unverändert sehr leicht einstellen, wenn sie auch in Abhängigkeit von der speziellen Art der zu verwendenden Qiiaternisierungsmittel variabel sind. Wenn beispielsweise ein Alkylhalogenid verwendet wird, kann der Pyridinring praktisch quantitativ quaternisiert werden, indem ein trockenes Polymeres und das Alkylhalogenid in ein druckempfindliches Gefäß gegeben werden und die Reaktanten vier bis fünf Stunden auf eine Temperatur von 70 bis 1300C erhitzt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten und verwendeten Träger, die Anionenaustauscherharze darstellen, können eine Gesamt-Anionenaustausch'tapazitat in der Größenordnung von 1,5 bis 5,0 mÄq/g haben. Insbesondere solche mit einer Kapazität in der Größenordnung von 2,5 bis 4,5 mÄq/g sind wünschenswert.
3. Herstellung des unbeweglich
gemachten Enzym-Matsriais
Zu typischen Enzymen und Mikroorganismenzellen, die zur Herste'lung der erfindungsgemäßen unbeweglich gemachten Enzym-Materialien verwendet werden können, gehören bakterielle Protease. Aminoacvlase
Adenosindesaminase, AMP-Desaminase, Amidase, Λ-Amylase, /J-Amylase, Glucoamylase, Succinylglucoamylase, Lactatdehydrogenase, Trypsin, Papain, Ribonuclease, Dextranase, Glucoseoxidase, Penicillinacylase, Chymotrypsin, Ficin, Pepsin, Carboxypectidase, Strep- ■-> tokinase, Urease, Invertase, Maltese, Lactasc, Lipase, Cellulase, Catalase, Melibiase, Tyrosinase, Aspartase, Glucoseisomerase, Phenoloxidase und Racemase sowie Mikroorganismenzellen, welche die Aktivität dieser Enzyme beibehalten haben. Die Bindung der vorstehend in beschriebenen verschiedenen Enzyme und der entsprechenden Mikroorganismenzellen an die vorstehend angegebenen Träger kann sehr leicht erfolgen, indem die Träger in wäßrige Lösungen der Enzyme oder wäßrige Suspensionen der Mikroorganismen/ellcn ι ~. jeder gewünschten Konzentralion in einem pH-Bereich eingebracht werden, in welchem die gewählten F.nzyme und Mikroorganismen/ellcn stabil sind. Durch die Berührung der beiden Materialien werden die erfindungsgemäß angestrebten unbeweglich gemachten > Enzym-Materialien gebildet. Die Reaktion der Bindung ist innerhalb kurzer Zeil vervollständigt.
Die Temperatur der ßindiingsrcaktion kann innerhalb eines weiten Bereiches gewählt werden, sofern sie unterhalb des Werts liegt, von dem an die Aktivität der :"> Enzyme beeinträchtigt wird. Es ist wünschenswert, die Temperatur im Bereich von 5 bis 20"C zu wählen.
Wie vorstehend erläutert wurde, erfolgt die Bindung /wischen den Trägern und Enzymen oder Mikroorganismenzellen zur Herstellung der unbeweglich gemach- im ten Enzym-Materialien mit Hilfe eines sehr einfachen Verfahrens unter milden Bedingungen, verglichen mit denen der üblichen Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet daher große technische Vorteile.
Bei der Reaktion der Bindung zwischen dem Träger π und dem Enzym führt die Zugabe einer Substanz, die anschließend als Substrat für die enzymatische Reaktion dient, und eines Metallions, das dazu dient, diese enzymatische Reaktion zu beschleunigen, zu dem Reaktionssystem, dazu, daß in wirksamer Weise 4<> verhindert wird, daß die resultierenden unbeweglich gemachten enzymatisch aktiven Substanzen in ihrer enzymatischen Aktivität verschlechtert werden.
Falls erforderlich, können die in vorstehender Weise hergestellten unbeweglich gemachten Enzym-Materia- >> lien mit Pufferlösungen gewaschen werden, die für die darin enthaltenen Enzyme geeignet sind, oder können mit gereinigtem Wasser gewaschen werden, um sie von nicht gebundenem Enzym zu befreien, und können danach durch Gefriertrocknung lyophilisiert werden, in um sie in vollständig trockener Form während langer Dauer aufzubewahren.
Die biologische Aktivität dieser unbeweglich gemachten Enzym-Materialien wurde — mit den notwendigen Abwandlungen — mit Hilfe eines Verfahrens untersucht, das zur Bestimmung der Aktivität der ursprünglichen Enzyme vor dem Einbau in diese Materialien verwendet wurde, und die Lebensdauer dieser Aktivität wurde durch Analyse der kontinuierlichen Enzym-Reaktion unter Verwendung einer Füllkör- ω perkolonne bestimmt. Dabei wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Enzym-Materialien ihre biologische Aktivität während langer Dauer beibehalten. Die erfindungsgemäßen unbeweglich gemachten Enzym-Materialien haben sich daher als ausgezeichnet b5 erwiesen.
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Träger zeigen zahlreiche Vorteile. So haben sie beispielsweise hohe lonenaustauschkapazität, zeigen hohe Hydrophilie trotz ihrer Unlöslichkeit in Wasser und anderen Lösungsmitteln; sie ermöglichen die Bindung einer großen Menge von Enzym und Mikroorganismenzellen; sie haben keine störende Wirkung auf die an sie gebundenen Enzyme (aufgrund der Neutralität des Grundpolymeren des Trägers), und die in den Materialien vorliegenden Enzyme behalten die gleiche enzymatische Aktivität bei, welche die entsprechenden ursprünglichen Enzyme vor der Bindung an die Träger aufweisen.
Ein weiteres wesentliches Merkmal isl die Tatsache, daß das Enzym und der Träger nicht mit der Festigkeil einer bloßen ionischen Adsorption, sondern mit der Festigkeit einer covalenten Bindung aneinander gebunden sind, so daß das Enzym nicht leicht von dem Träger freigesetzt werden kann. Es wurde bestätigt, daß all diese Vorteile aus der speziellen Tatsache resultieren, daß Copolymere verwendet werden, die unter Verwendung von Vinylpyridin oder dessen Derivaten als Hauptkomponenten hergestellt wurden.
Enzyme und enzymatisch aktive Mikroorganismenzellen sind sehr wertvoll und haben daher ausgedehnte Verwendung für industrielle Anwendungszwecke gefunden. Da jedoch die Enzyme leicht in Wasser löslich sind, ist es unvermeidbar erforderlich, daß die enzymatischen Reaktionen anteiiweise durchgeführt werden. Die einmal für Reaktionen eingesetzten Enzyme bleiben in den Reaktionsgemischen gelöst und können daher nicht zur wiederholten Verwendung zurückgewonnen werden. Im Fall eines Enzym-Reaktionssystems, in welchem das Reaktionsprodukt die Reaktion stört, wird verhindert, daß die Reaktion über eine gewisse Grenze hinaus abläuft.
Wie vorstehend erläutert wurde, sind die üblichen Methoden der Enzymanwendung von zahlreichen Schwierigkeiten begleitet. Unter diesen Umständen hat man Methoden zum Unlöslichmachen von Enzymen und zum Unbeweglichmachen von Mikroorganismenzellen als wirksame Maßnahmen zur Lösung dieser Probleme erwartet.
So erlaubt speziell das Unlöslichmachen von Enzymen und das Unbeweglichmachen von Mikroorganismenzellen, daß die resultierenden Präparate in einem zyklischen Verfahren während langer Dauer angewendet werden und daß die Enzym-Reaktionen in einem kontinuierlichen Vorgang durchgeführt werden. Die technischen Gebiete, auf denen Enzyme verwendet werden, können daher im Hinblick auf die Verfahrensweise rationalisiert werden und im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit stark verbessert werden.
Da die Träger mit Hilfe eines rein chemischen Syntheseverfahrens hergestellt werden, können sie in einer reichen Vielfalt der Arten erhalten werden, indem die Polymerisationsmethode, die Bedingungen der Polymerisation und die Zusammensetzung des Monomergemisches in geeigneter Weise gewählt werden. Demnach können unbeweglich gemachte Enzym-Materialien in jeder beliebigen Form erhalten werden, welche den speziell verwendeten verschiedenen Reaktionsgefäßen angepaßt ist
Unter den verschieden möglichen Reaktionsgefäßen ist eine Füllkörperkolonne (Kolonne mit Füllkörperschicht) besonders wirksam. Bei Verwendung dieses speziellen Reaktionsgefäßes kann die gewünschte Enzym-Reaktion in einfacher Weise kontinuierlich und im wesentlichen automatisch während langer Dauer durchgeführt werden, indem lediglich die Kolonne mit
dem unbeweglich gemachten Enzym-Material, das in Form von Perlen oder Pulver hergestellt wurde, bis zu einer festgelegten Kapazität gefüllt wird und mit einem gegebenen Substrat in festgelegter Beschickungsrate beschicht wird.
Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kolonne mit dem unbeweglich gemachten Enzym-Material in Verbindung j't einem inaktiven Verdünnungsmittel gefüllt.
Dieser Zusatz des Verdünnungsmittels dient dazu, mögliches Verstopfen oder Kanalbildung in der Kolonne zu verhindern und infolgedessen das Reaktionssystem in stabilem Zustand zu halten.
Zu Beispielen für zu diesem Zweck geeigneten Verdünnungsmitteln gehören Holzpulver, Glasperlen, Cellulosepulver, Kunststoffperlen, Diatomeenerde, Gelite und andere anorganische Substanzen. Es kann auch jede ähnliche Substanz verwendet werden, soweit sie inaktiv ist.
L/tt3 v_i ι ti lOÜMgSgt-iitii UL τ ^i [attii.ii /up KGPninUi ν Tu
chen Umwandlung eines Substrats eignet sich besonders gut ?.ur Überführung von N-Acetyl-D-L-aminosäure in eine L-Aminosäure mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Aminoacylase, zur Umwandlung von Stärke in Glucose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoamylase, z.ur Überführung von Glucose in Fructose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoseisomerase, zur Überführung von Glucose in Gluconsäure mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Glucoseoxydase, zur Umwandlung von Stärke in Glucose mit Hilfe unbeweglich gemachter Succinylglur jamylase oder zur Überführung von Saccharose in Glucose und Fructose mit Hilfe einer unbeweglich gemachten Invertase.
Beispiel I
Herstellung von quaternisiertem
(2-Vinylpyridin-Styrol)-Blockcopolymerem κι
Ein Reaktor mit einem Fassungsvermögen von 1,5 Liter, aus welchem die Luft vollständig mit trockenem N2 verdrängt war, wurde mit 830 cm1 gereinigtem Tetrahydrofuran und 55,2 cm3 (0,43 Mol) gereinigtem -r, Styrol (nachstehend als »St« bezeichnet) beschickt und von außen gekühlt, bis die Temperatur des Inhalts auf -200C gefallen war. Danach wurden 2,0 Milümol n-Butyllithium dem Reaktorinhalt zugesetzt, um die Polymerisation einzuleiten. Etwa 30 Minuten danach -,0 wurden 50,4 cm3 (0,48 Mol) gereinigtes 2-Vinylpyridin (nachstehend als »2-VP« bezeichne:) zugesetzt, und die Reaktion wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt. Dann wurde eine geringe Menge n-Propanol zugesetzt, um die Polymerisation zu unterbrechen, und das Reaktionsgemisch wurde in eine große Volumenmenge Wasser eingeführt, um das gebildete Polymere abzutrennen. Das erhaltene Polymere wurde dann getrocknet Die Umwandlung betrug 100%. Die Analyse des Copolymerisats durch IR- und NMR-Spektroskopie zeigte, daß ω 2-VP und St im wesentlichen äquimolar in einem der Block-Copolymerisation entsprechenden Muster gebunden waren. Eine Glaskolonne mit einem Innendurchmesser von 3 cm wurde schichtweise mit 20 g des pulverförmigen 2-VP-St-Block-Copolymeren (Korngröße gemäß ASTM-Sieb mit 60 bis 100 Maschen) und dampfförmiges Methylbromid wurde während etwa 2 Stunden in einer Beschickungsraie von 100cm3/Min.
durchgelcitet. Das so erhaltene quaternisierte Block-Copolymere zeigte eine Gewichtserhöhung von 7 g, die anzeigte, daß die entsprechende Menge Methylbromid gebunden worden war. Dieses Copolymere blieb ungelöst in Tetrahydrofuran, Methanol und Wasser. Es zeigte sich, daß es eine Anionenaustauschkapazität von etwa 3,5 mÄq/g hatte. Diese Anionenaustauschkapazität wurde mit Hilfe der Silbernitrat-Titrationsmethode bestimmt.
Beispiel 2
Durch Wiederholung der Verfahrensweise des Beispiels I, mit der Abänderung, daß 0,72 Mol 2-VP und 0.24 Mol St verwendet wurden, wurde ein quatcrnisicrics Block-Polymcres hergestellt. Es wurde gefunden, daß das resultierende ( (»polymere eine Anionenaiistauschkapii/.ität von 4,6 mÄq/g hatte.
Beispiel i
Durch Wiederholung der Verfahrensweise gemäß Beispiel 1, mit der Abänderung, daß 0,24 Mol 2-VP und 0.72 Mol St verwendet wurden, wurde ein quaternisiertes Block-Copolymcrcs hergestellt. Das resultierende C'opolymerisat zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 2.5 mÄq/g.
Beispiel 4
Herstellung eines quaternisierten statistischen
(2-Vinylpyridin-Styrol-Divinylbenzol)-Copolymcren
Ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 2 Liter, in welchem die Luft mit trockenem N2 verdrängt war. wurde zuerst mit 1000 g Wasser und 10 g Polyvinylalkohol als .Suspensionsstabilisator und danach mit 250 g 2-VP und 250 g Styrol und 10 g Divinylbenzol (nachstehend als »DVBz« bezeichnet) beschickt. Der Reaktorinhalt wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 70°C gehalten. Dann wurden 2 g Benzolperoxid zugesetzt, um die Polymerisation zu initiieren. In etwa 20stündiger Reaktion wurde ein Copolymeres erhalten, welches in Form von Perlen auskristallisierte. Das Copolymere wurde durch Filtration abgetrennt, gründlich mit Methanol und Wasser gewaschen und getrocknet. Der Umsatz betrug 95%. Die Elementaranalyse zeigte, daß dieses Copolymere Styrol und 2-Vinylpyridin in äquimolaren Mengen enthielt und eine vernetzte Struktur hatte. In einen Autoklav aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 500 cm3 wurden 100 g des statistischen (2-VP-St-DVBz)-Copolymeren in Form von Perlen (Siebgröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit 10 bis 100 Maschen) und 100 g Methylbromid gegeben und 5 Stunden bei 8O0C umgesetzt Am Ende der Reaktion wurde der Autoklavinhalt von nicht umgesetztem Methylbromid befreit, und das Reaktionsprodukt wurde getrocknet Das so erhaltene quaternisierte Polymere zeigte einen Gewichtsanstieg von 40 g, wodurch angezeigt wurde, daß die entsprechende Menge an Methylbromid gebunden worden war. Dieses Polymere erwies sich als unlöslich in allen Lösungsmitteln und zeigte eine Anionenaustauschkapazität von 3,6 mÄq/g.
Beispiel 5
Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholen der Verfahrensweise des Beispiels 4 erzielt, iedoch mit der Abänderung, daß 375 g 2-VP und 125 g St verwendet wurden. Das resultierende Copolymere zeigte eine Anionenaustausd'.kapazität von 4,5 mÄq/g.
Beispiel 6
Ähnliche F.rgcbnisse wurden cr/ielt, indem die Verfahrensweise des llerstellungsbeispiels 4 wiederholt wurde, mit der Abänderung, daß 375 g 4-Vinylpyridin (als »4-VP« bezeichnet) anstelle von 2-VP und 125 g Methylmethacrylat (nachstehend als »MMA« bezeichnet) anstelle von Styrol verwendet wurden. Das resultierende Copolymere zeigte eine Anioncnauslauschkapaziiät von 4,3 mÄq/g.
resultierende Polymere zeigte eine Anionenauslauschkapazität von 4,5 mÄq/g.
Die Herstellung von unbeweglich gemachten Enzym-Präparaten gemäß der Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben.
Beispiel IO
in Herstellung eines unbeweglich gemachten
Aminoacylase- Präparats
2 g des in dem Hersielliingsbeispiel I erhaltenen qiuitcrnisierten Block-Copolymeren (Teilchengröße entsprechend einem ASTM-Sieb mil 60 bis 100 Maschen) wurden über Nacht in 100 cm' einer 0,1 η Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gelegt, und das resultierende gepufferte Polymere wurde abfiltriert, um als feuchtes Trägermaterial
Beispiel 7
Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholung der Verfahrensweise des Herstellungsbeispiels 4 erzielt, mit der Abänderung, daß 20 g Äthylenglycoldimethacrylat (nachstehend als »EDMA« bezeichnet) anstelle von Divinylbcnzol verwendet wurden. Es zeigte sich, daß das resultierende Copolymere eine Anionenaustauschkapazität von 3,5 niAq/g hatte.
B c i s ρ i c I 8
Ein Reaktionsgefäß mit einem fassungsvermögen von 2 Liter, in welchem die Luft mit trockenem Stickstoff verdrängt war, wurde zuerst mit 1000 g reinem Wasser und 30 g Natrium-Fettsäureseife als Emulgator und danach mit 250 g 4-VP, 250 g St und 10 g DVBz beschickt. Ferner wurden 1,5 g t-Dodecylmercaptan als Molekulargewichts-Modifizicrmittel zugegeben. Der Reaktorinhalt wurde unter Rühren bei einer Temperatur von 50nC gehalten. Dann wurden 1,5 g Kaliumpersulfat als Katalysator zugegeben, um die Polymerisation einzuleiten. Nach etwa 20stündiger Polymerisation wurde das gebildete Polymere durch Zugabe von 2 Liter Aceton aus dem Reaktionsgemisch ausgefällt. Das ausgefällte Polymere wurde durch Filtration abgetrennt, gründlich mit reinem Wasser gewaschen und getrocknet. Der Umsatz wurde zu 90% festgestellt. Die Elementaranalyse zeigte, daß dieses Copolymere St und 4-VP in äquimolaren Mengen enthielt und eine vernetzte Struktur hatte. Dann wurden 100 g des in vorstehender Weise hergestellten pulverförmigen Polymeren (Korngröße entsprechend einem ASTM-Sieb mit 100 bis 200 Maschen) mit Methylbromid quaternisiert, wobei die Verfahrensweise des Beispiels 4 wiederholt wurde. Das resultierende Polymere erwies sich als unlöslich in allen Lösungsmitteln und hatte eine Anionenaustauschkapazität von 3,4 mÄq/g.
Beispiel 9
Ähnliche Ergebnisse wurden durch Wiederholung der Verfahrensweise des Herstellungsbeispiels 8 erzielt, mit der Ausnahme, daß 375 g 2-VP ansteile von 4-VP und 125 g MMA anstelle von St verwendet wuraen. Das
/.U tTLIULI
WUIUC UICSCI IClIWIlC
Träger einer Lösung zugesetzt, die durch Auflösen von I g einer handelsüblichen Aminoacylase (Aktivität K)OOO E/g) aus einer Spezies des Genus Aspergillus in 100 ml einer 0,1m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 gebildet war und in dieser Lösung suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden bei 4'C gerührt. Danach wurde die Suspension zentrifugiert, und der resultierende Niederschlag wurde mehrere Male mit 0,1 in Phosphatpufferlösung vom pH 8.0 gewaschen. Der so erhaltene Niederschlag wurde schließlich lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 2,3 g. Die Proteinkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit, die bei der vorstehend beschriebenen Reaktion erhalten wurde, wurde mit Hilfe des Lowry-Verfahrens (). Biol. Chem., 193, 26 [1951]) analysiert, wobei gezeigt werden konnte, daß sie völlig frei von Protein war. Dies zeigt klar die Tatsache an, daß die gesamte Menge der verwendeten Aminoacylase an den Träger gebunden wurde. Dann wurde die enzymatische Aktivität des so erhaltenen unbeweglich gemachten Aminoacylase-Präparats nach folgender Methode geprüft: ein Gemisch aus 10 mg der Testprobe, 1 cm3 reinem Wa.-"-er, 2 cm' einer 0,1 m Phosphatpufferlösung von pH 8,0 und 1 cm1 0,1 m N-Acetyl-DL-methionin (pH 8,0, enthaltend 5,0x10-1In Co++) wurde 30 Minuten be, 370C gebrütet. Das freigesetzte Methionin wurde durch Colorimetric mit Hilfe von Ninhydrin bestimmt. Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Annahme angegeben, daß die Einheit, 1 Einheit/g, der Menge entspricht, die zur Bildung von 1 μ Mol Methionin aus 1 g einer gegebenen Probe unter festgelegten Bedingungen entspricht. Es wurde gefunden, daß das in diesem Beispiel erhaltene unbeweglich gemachte Aminoacylase-Präparat eine Aktivität von etwa 1500 Einheiten/g hatte.
Beispiele 11 bis 14
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt verschiedene unbeweglich gemachte Aminoacylase-Materialien, die unter Verwendung verschiedener Träger erhalten wurden, die in den vorstehend angegebenen Beispielen zur Herstellung der Träger erhalten wurden. Die Bedingungen des Unlöslichmachens und die Methode 7-ir Bestimmung der enzymatischen Aktivität, die in Beispiel 10 beschrieben sind, wurden auch in diesem Fall mit erforderlichen Modifizierungen angewendet.
13
14
Tabelle '. Beispiel Beispiel der
Triigerherstellung
Zusammensetzung des Ausgangspolymeren
Ausbeute des
unbeweglich
gemachten
Produkts		 Anieil der
gebundenen
Aminoacylase		 Aktivitäts
einheilen
des
Enzyms
(g) (%)·) (E/g)**)
3,0 IW) 2500
2.0 100 800
2.5 95 1700
2.7 100 2100
11 2 2-VP-St-Block-Copolymeres
12 4 2-VP-St-DVBz-CopoIymeres
13 5 2-VP-St-DVBz-Copolymeres
14 6 4-VP-MMA-DVBz-
Copolymeres
*) Die Werte in dieser Spalte wurden erhalten, indem die f'rnlcinkon/cntration tier obenstehenden l-'lüssigk;it der jeweiligen
Reaktionsgemische mit Hilfe des Lowry-Verfahrcns geprüft wurde.
**) Die Werte in dieser Spalte wurden erhalten, indem die Bestimmung unter Verwendung von N-Acctyl-DL-melhionin als Substrat durchgeführt wurde.
Beispiele 15 bis
Herstellung von unbeweglich gemachten Glucoamylase-Präparaten
In Tabelle 2 sind bevorzugte Alisführungsformen des Rhizopus auf verschiedenen Trägern gezeigt, die in der Unbeweglichmachens einer handelsüblichen Gliicoamy- angegebenen Beispielen zur Trägerherstellung erhalten läse (Aktivität 5000 E/g) aus einer Spezies des Genus wurden.
Tabelle
Beispiel
Beispiel der Tragerher stellung
Träger
Zusammensetzung des Ausgangspolymeren
(ilucoamyhise
verwendete Menee
15 1 2-VP-St-Blrck-
Copolymeres
16 2 2-VP-St-Block-
Copolymeres
17 5 2-VF-St-DVBz-
Copolymeres
18 6 4-VP-MMA-DVBz-
Copolymeres
19 7 2-VP-St-EDMA-
Copolymeres
20 8 4-VP-St-DVBz-
Copolymeres
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Jeder Träger. 2 g. wurde niil().l-ni AcetatpulTerlösung (pH 4.5) gepuffert und in einen feuchten Träger übergeführt.
g Glucoamylasc wurden in 100 ml 0.1-πι Acctatpufferlösung (pH -4.5) gelöst.
Beispiel
Bedingungen des Unbeweglichmachens
Ausbeute an Anieil der Einheiten
unbeweglich gebundenen der
gemachtem Ciluco- En.tym-
Produkt amvlase aktivität
(g)
Jeder feuchte Träger wurde zu der Glucoamylaselösung gegeben und 2 -Std. bei 4C gerührt, um die Umsetzung zu gewährleisten. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, der Niederschlag mehrere Male mit 0,1-m Acetatpufferlösung (pH 4,5) gewaschen und dann lyophilisiert.
2,3 50 400
2.6 70 500
2,5 65 430
2.5 68 450
2,4 65 400
2,0 53 280
*) Der Anteil der gebundenen Glucoamylase wurde bestimmt, indem die Proteinkonzentration in der überstehenden Flüssigkeit des jeweiligen Reaktionsgemisches mit Hilfe des Lowry-Verfahrens geprüft wurde.
**) Die enzymatische Aktivität wurde nach folgender Methode bestimmt: Ein Gemisch aus 10 mg einer gegebenen Probe, 1 cnr reinem Wasser und 9 m3 einer 0,56%igen Lösung von löslicher Stärke (in 0.1-m AceiatpufFer von pH 4.5) wurde 30 Minuten bei 40 C bebrüte:. Das resultierende Gemisch wurde mit Hilfe der DNS-Methode auf reduzierenden Zucker geprüft. Die Aktivitätseinheiten wurden angegeben, indem als Einheit, 1 E/g. die Menge angenommen wurde, die 10 mg reduzierenden Zucker au« 1 g einer gegebenen Probe unter festgesetzten Bedingungen erzeugt.
15
Beispiele 21 bis
Herstellung von unbeweglich gemachten Glucoseisomerase-Präparaten
In Tabelle 3 sind bevorzugte Ausführungsformen für das Unlöslichmachen handelsüblicher Mikroorganismenzellen gezeigt, die Glucoseisomeraseaktivität zeigen (Aktivität 1000 GIE) und einer Spezies des Genus
Streptomyces angehören. Dabei wurden verschiedene Träger verwendet, die in den vorstehend angegebener Beispielen zur Trägerherstellung erhalten wurden.
Tabelle 3
Beispiel
Beispiel der Trägerher- stellung
Träger
Zusammensetzung des Ausgangspolymeren
verwendete Menge
Glucoamylase
22 6
23 8
24 9
ι \/TJ ei r»\/o-
Copolymeres (60 bis 100 Mascherl) 4-VP-MMA-DVBz-Copolymeres (100 bis 200 Mascherl)
4-VP-St-DVBz-Copolymeres (100 bis 200 Mascherl) 2-VP-MMA-DVBz-Copolymeres (200 bis 400 Maschen)
Phosphatpuflerlösung von pH 8,0 gepufTert uno in einen feuchten Täger übergeführt.
2,0g Zellen (0,8g Feststoffe) wurden in 100 cm3 Wasser suspendiert.
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Beispiel
Bedingungen des Unbeweglichmachens
Ausbeute an
unbeweglich
gemachtem
Produkt 		Anteil an
gebundenem
Enzym und
Zellen 		Einheiten
der
Enzym
aktivität
(%)*) (GIU)**)
1,1 100 700
1,2 100 800
1,1 100 700
1,2 100 850
Jeder feuchte Träger wurde zu der Zellsuspension gegeben, und es wurde 2 Stunden bei 4 C gerührt, um die Reaktion zu gewährleisten. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, und der Niederschlag wurde mehrere Male mit Wasser gewaschen und dann lyophilisiert.
Die Werte des Anteils an gebundenem Enzym und gebundenen Zellen wurde festgestellt, indem die Proteinkonzentration der überstehenden Flüssigkeit der Reaktionsgemische nach dem Lowry-Verfahren geprüft wurde.
Die Enzymaklivität wurde mit Hilfe eines modinzierten Takasaki-Verfahrens bestimmt (Agricultural Biological Chemistry, Vol.30, 1248 [196O)). Die Aklivitätseinheiten wurden angegeben, indem als Einheit, I GlE, die Menge angenommen wurde, die zur Bildung von I mg Fructose aus I g einer gegebenen Probe während 60 Minuten bei 70 C führt.
Beispiele 25 bis 28
Herstellung von verschiedenen unbeweglich gemachten Enzym-Präparaten
Tabelle 4 zeigt bevorzugte Ausführungsformen für das Unbeweglichmachen von Glucoseoxidase, alkalischer Protease und Invertase auf verschiedenen
Trägern, die in den angegebenen Beispielen der Trägerherstellung erhalten worden waren.
909 512/221
17
Tabelle 4 Beispi.'l
der Tniger-
herstellun.ä 		Träger
Zusammensetzung des Ausgangspolymeren 		verwendete
Menge		 Enzym
Art 		und Zellen
Art der Ver
wendung
Beispiel 5
4
6
5		 2-VP-St-DVBz-Copolymeres
(60-100 Maschen)
2-VP-St-DVBz-Copolymeres
(60-100 Maschen)
4- VP-MMA-D VBz-Copülymeres
(100-200 Maschen)
2-VP-St-DVBz-Copolymeres		 (D
(4)
(4)
(7)		 (2)
(5)
(5)
(8)		 (3)
(6)
(6)
(9)
25
26
27
28
(60-100 Maschen)
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Bei- Bedingungen des Unbeweglichmachens spiel
Ausbeute an Anteil an Einheiten unbeweglich gebundenem der Enzymgemachtem Enzym und aktivität Produkt Zellen
(GIE)
Jeder Enzymlösung wurde der gepufTerte feuchte Träger zugesetzt, dann wurde 2 Stunden bei 4 C gerührt, um die Reaktion zu gewährleisten. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, und der erhaltene Niederschlag wurde mehrfach mit Wasser gewaschen lyophilisiert.
2,1 60 lOOO2)
2,2 75 160O1)
2,5 100 3OOO3)
2,4 85 5000")
(1) 2g Träger wuide mit 0,1-m AcetatpufTer (pH 5,5) gepuffert.
(2) Glucoseoxidase (der Sigma Chemical Company, Type II, Aktivität: 18900 E/g).
(3) 1 g Enzym wurde in 100ml 0,1-m Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst.
(4) 2 g Träger wurden mit 0,1-m Phosphatpuffer (pH 8,0) gepuffert.
(5) Alkalische Protease (Handelsprodukt, Aktivität: 30000 E/g).
(6) Ig Enzym wurde η lOOml 0,1-m Phosphatpuffer (pH 8,0) gelöst.
(7) 2g Träger wurden mit 0,1-m Acetatpuffer (pH 5,0) gepuffert.
(8) Invertase (Sigma Chemical Company, Aktivität: 100000 E/g).
(9) 1 g Enzym wurde in 100ml 0,1-m AcetatpufTer (pH 5,0) gelöst.
') Die Werte für den Anteil an gebundenen Enzymen und Zellen wurden in gleicher Weise wie in den vorhergehenden Beispielen mit Hilfe des Lowry-Verfahrens bestimmt.
2) Bestimmt durch die Titrationsmethode (Soc. Chem. Ind. [Londonl, Monograph II, 72 [196I)). Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Voraussetzung angegeben, daß einer Einheit/g die Menge entspricht, die zur Ox;· «üion von 1,OuMoI Glucose zu Gluconsäure durch 1 geinergegebenen Probe bei pH 5,1 bei 35 C während einer Minute befähigt ist.
1J Bestimmt mit Hilfe der Casein-Methode nach FoI in (Standard Riochemical Experiment, Kobundo, 207 [1953)). Die Aktivitätseinheiten wurden unter der Annahme angegeben, daß eine Einheit/g der Bildung einer solchen Menge nicht proteinartiger Substanz pro 1 g einer gegebenen Probe entspricht, daß eine Absorption bei 660 mu erzielt wird, die I γ Tyrosin entspricht, nachdem I Minute bei pH 8,0 bei 3 C stehengelassen wurde.
4) Bestimmt durch die Methode nach E. Fischer und L. Kohles (HeIv. Chem. Acta., 34, 1123 (19511). Die Einheitender Enzymaktivität wurden unter der Annahme angegeben, daß die Einheit, I Einheit/g, der Menge entspricht, die I mg Hexose aus Saccharose als Substrat nach 3 Minuten dauerndem Stehenlassen bei 20 C freisetzt.
B eispielc 29 bis 32
Herstellung von unbeweglich gemachten Succinylglucoamylase-I'räparaten
In Tabelle 5 sind bevorzugte Ausführungsformen für das Unlöslichmachen von Succinyl-Derivaten von handelsüblicher Glucoamylase (Aktivität: 5000 E/g) aus Spezies des Genus Rhizopus auf verschiedenen Trägern gezeigt, die in den angegebenen Beispielen zur Trägerherstelking erhalten wurden.
Tabelle 5
Bei Beispiel der Träger 5 (Fortsetzung) des Unbeweglichmachens verwendete Gluco Bedingungen der (E/g)3)
spiel Träger- Bedingungen Menge amylase Succinylierung;
herstellung Zusammensetzung des Ausgangs Gewichtsverhältnis
polymeren 2,0 g Glucoamylase/Bern-
2,0 g steinsäureanhydrid
29 5 2-VP-St-DVBz-CopoIymeres 1,CIg 1/0,6
30 6 4-VP-MMA-DVBz- 2,0 g 1,0g 1/0,3
Copolymeres
31 7 2-VP-St-EDMA- i,0g 1,0g 1/0,3
Copolymeres
32 8 4-VP-St-DVBz-Copolymeres 1,0 g 1/0,2
Tabelle
Bei Ausbeute an Prozent Einheiten der
spiel unbeweg gebundene Enzymaktivität
lichem Giuco-
Produkt amylase2)
(g)
29
30
31
32
Das Unbeweglichmachen wurde durchgeführt, indem Succinylglucoamylaselösung unter den
gleichen Bedingungen des IJnlöslichmachens wie in Beispielen 15 bis 20 eingesetzt wurde.
2,5 2,3 2,3 2,0
100
97
95
80
650
700
630
580
') Succinylierung de· Glucoamylase: 1,0g handelsüblicher Glucoamylase wurde in50cm'0,I-m PhosphatpufTer (pH 7,0) gelöst. Unter Rühren des Gemisches bei Raumtemperatur wurde Bernsteinsäureanhydrid ainleilweise zugesetzt. Wenn der pH-Wert des Gemisches nach der Reaktion unter 7,0 lag, wurde eine 0,1-m Natriumcarbonatlömng zugegeben, um den pH-Wert über 7,5 zu erhöhen, und dann wurde erneut Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Unter Wiederholung dieses Vorgangs wurde die Gesamimenge an Bernsteinsäure, .ihydrid zugesetzt. Der End-pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.
') Bestimmt nach der gleichen Methode wie der gebundene Anteil an Glucoamylase in Beispielen 15 bis 20.
3) Bestimmt in gleicher Weise wie die Einheiten der Enzym-Aktivität in Beispielen 15 his 20.
Beispiel 33
Kontinuierliche Bildung von L-Methionin aus
N-Acetyl-DL-methionin mit Hilfe eines
unbeweglich gemachten Aminoacylase-Präparats
Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Höhe von 300 mm, die bei 500C gehalten wurde, wurde mit 1 g des in Beispiel 10 hergestellten unbeweglich gemachten Aminoacylasematerials gefüllt. Eine O,2m-Lösung von N-Acetyl-DL-methionin (pH 7,0;5χ \0~* m Co++) wurde kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5 cnWh von oben nach unten durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Kolonnenboden abfließende Abstrom wurde colorimetrisch mit Hilfe der Ninhydrinmethode analysiert, um die Ausbeute an L-Methionin zu bestimmen. Nach 30 Tagen einer kontinuierlichen Reaktion wurde die Umwandlung von N-Acetyi-L-methionin in dem Ausgangsmaterial, N-Acetyl-DL-methionin, zu L-Methionin, zu 100% festgestellt.
Beispiel 34
Kontinuierliche Herstellung von
L-2-Aminobuttersäure aus N-Acetyl-DL-2-
aminobuttersäure mit Hilfe eines unbeweglich
gemachten Aminoacylase-Präparats
Die gleiche Kolonne wie in Beispiel 33 wurde mit 1 g der unbeweglich gemachten Aminoacylase, die in Beispiel 14 hergestellt worden war, gefüllt. N-Acetyl-DL-2-aminobuttersäure (0,2 m. pH 7.0, 5xlO"4m Co++) wurde von oben nach unten kontinuierlich in einer Strömungsrati; von 5cmVh durch die Kolonne geleitet. Die Reaktionstemperatur betrug 50°C. Nach 30tägiger kontinuierlicher Reaktion wurde gefunden, daB die Umwandlung von N-Acetyl-L-2-aminobuttersäure zu L-2-Aminobuttersäure 100% betrug.
Beispiel 35
Kontinuierliche Herstellung von Glucose aus
Stärke mit Hilfe eines unbeweglich
gemachten Glucoamylase-Materials
Eine Mantelkolonne mit einem Innendurchmesser von 15 mm und einer Höhe von 300 mm, die bei 400C
rii gehalten wurde, wurde mit 2,0 g des unbeweglich gemachten Giucoamylase-Materials gefüllt, das in Beispiel 17 hergestellt worden war. Eine Stärkelösung (30% Gewicht/Gewicht) (pH 4,5, Dextroseäquivalent =20) wurde von oben nach unten kontinuierlich in
ho einer Fließrate von 5 cm3/h durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Boden der Kolonne abfließende Abstrom wurde mit Hilfe der DNS-Methode analysiert, um die Ausbeute an Glucose zu bestimmen. Nach 30tägiger kontinuierlicher Reaktion wurde gefunden, daß die
b5 Umwandlung von Stärke in Glucose mehr als 95% betrug. Die mit dem Produkt durchgeführte Papierchromatographie zeigte, daß kein Anzeichen der Bildung von Oligodextrose in dem Produkt vorhanden war.
Beispiel 36
Kontinuierliche Bildung von Fructose aus
Glucose mit Hilfe eines unbeweglich
gemachten Glucoseisomerase-Materials
Eine Mantelkolonne mit 26 mm Innendurchmesser und 30Ci mm Höhe, die bei 60° C gehalten wurde, wurde mit einem homogenen Gemisch aus 1,0 g des unbeweglich gernprhten Glucoseisomerase-Materials, das gemäß Beispiel 24 hergestellt worden war, und 3,0 g Cellulose- in pulver als Verdünnungsmittel (200—400 Maschen ASTM-Sieb) gefüllt. Eine 30%ige (Gewicht/Gewicht) Glucosdösung (pH 8,0, 5xlO-3m MgSO4 · 7 H2O) wurde kontinuierlich in einer Strömungsrate von 5 cm3/h von oben nach unten durch die Kolonne geleitet. Der aus dem Kolonnenboden abfließende Abstrom wurde mit Hilfe der Cystein-Carbazol-Methode analysiert, um die Ausbeute an Fructose zu bestimmen. In den frühen Stadien der Reaktion wurde die Bildung von Fructose in einer Menge entsprechend etwa 50% der Glucose beobachtet (Isomerisierungsrate 50%). Auch nach 30tägiger kontinuierlicher Reaktion war die Isomerisierungsrate immer noch höher als 47%.
Beispiel 37
Kontinuierliche Herstellung von Gluconsäure aus
Glucose unter Verwendung eines unbeweglich
gemachten Glucoseoxidase- Präparats
In ein Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 1 Liter wurden 2 g der in Beispiel 25 hergestellten unbeweglich gemachten Glucoseoxidase und 500 cmJ einer 15gewichtsprozentigen Glucoselösung (pH 5,2) gegeben, und das Gemisch wurde bei 350C gerührt, indem saubere Luft eingepreßt wurde, um die Reaktion durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde durch geeignete Zugabe von NaOH konstant auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt. Nach 48stündiger Reaktion wurde der Gehali des Reaktionsgemisches an nicht umgesetzter Glucose geprüft. Die Analyse zeigte, daß 100% Glucose umgesetzt war. Durch Papierchromatographie des erhaltenen Produkts wurde festgestellt, daß es vollständig aus Gluconsäure bestand.
Beispiel 38
Kontinuierliche Herstellung von Glucose und
Fructose aus Saccharose mit Hilfe eines
unbeweglich gemachten Invertase-Präparats
Eine Kolonne mit 10 mm Innendurchmesser und 300 mm Höhe wurde mit 1 g des in Beispiel 28 hergestellten unbeweglich gemachten Invertase-Materials gefüllt. Bei Raumtemperatur wurde eine 10%ige (Gewicht/Gewicht) Saccharoselösung vom pH-Wert 4,5 von oben nach unten kontinuierlich in einer Fließrate von 5 cm-Vh durch die Kolonne geleitet. Der aus dsm unteren Ende der Kolonne abfV rßende Abstrom wurde mit Hilfe der DNS-Methode isr.a der Cystein-Carbazol-Methode analysiert, um die Umwandlung zu Glucose zu bestimmein. Selbst nach einem Monat einer kontinuierlichen Reaktion wurde die Umwandlung von i00% noch aufrechterhalten.
Beispiel 39
Kontinuierliche Herstellung von Glucose aus
Stärke mit Hilfe eines unbeweglich
gemachten Succinylglucoamylase-Präparats
Die kontinuierliche Herstellung von Glucose aus Stärke wurde mit Hilfe von 2,0 g Succinylglucoarnylase, die in Beispiel 30 erhalten wurde, in gleicher Weise wie in Beispiel 35 durchgeführt
Nach kontinuierlich durchgeführter Reaktion während 45 Tagen wurde gefunden, daß der Umwandlungsgrad von Stärke zu Glucose mehr als 97% betrug.

Claims (10)

Patentansprüche:
1. Wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterial, enthaltend eine biologisch aktive Enzymsubstanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es ein biologisch aktives Enzym oder Mikroorganismenzellen mit Enzymaktivität, gebunden an ein wasserunlcsliches Anionenaustauscherharz, in dessen Moleküleinheiten quaternisierte Pyridinringe vorliegen, auf Basis eines Copolymeren von Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats mit einem oder mehreren copolymerisierbaren Monomeren, die aromatische Vinylverbindüngen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, dienisch ungesättigte Verbindungen oder ungesättigte Divinylverbindungen sein können, enthält, welches ein durch Radikalpolymerisation gebildetes Copolymeres aus 20 bis 99 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats, 0,5 bis 30 Mol-% der ungesättigten Divinylverbindungen und 0 bis 70 Mo!-% eines der anderen copolyrncrisicrbaren Monomeren oder ein Block- oder Pfropfcopolymerisat, welches 25 bis 75 Mol-% Vinylpyridin- oder Vinylpyridinderivateinheiten enthält, darstellt.
2. Enzymmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Anionenaustauscherharz mit einer Gesamt-Anionenaustauschkapazität von 2,0 bis 5,0 mÄq/g aufweist.
3. Enzymmaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Vinylpyridin bzw. Vinylpyridinderivat 4-Vinylpyridin, 2-Vinylpyridin oder 2-Methyl-5-vinylpyridin eingesetzt wurde.
4. Enzymmaterial nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als ungesättigte Divinylverbindungen Divinylbenzol oder (PoIy)-äthylenglycoldimethacrylat eingesetzt wurden.
5. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Radikalpolymerisation 50 bis 55 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats, 1 bis 20 Mol-% ungesättigte Divinylverbindungen und 0 bis 70 Mol-% eines der anderen copolymerisierbaren Monomeren copolymerisiert wurden.
6. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Block- oder Pfropfcopolymerisation 40 bis 60 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats «!polymerisiert wurden.
7. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis
6, dadurch gekennzeichnet, daß Pyridinringe des Anionenaustauscherharzes mit Hilfe von Methylchlorid, Methylbromid, Methyljodid oder Dimethylsulfat quaternisiert worden sind.
8. Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis
7, dadurch gekennzeichnet, daß es als biologisch aktive Enzym-Substanz Aminoacylase, Glucoamylase, Succinylglucoamylase, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, alkalische Protease, Invertase oder Mikroorganismenzellen aufweist, die diese Enzyme enthalten.
9. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen, enzymatisch aktiven, unbeweglich gemachten Enzymmaterials, enthaltend eine biologisch aktive Enzym-Substanz auf einem praktisch wasserunlöslichen Träger nach Ansprüchen 1 —8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein biologisch aktives
Enzym oder Mikroorganismerizellen, die ein solches Enzym enthalten, mit einem wasserunlöslichen Anionenaustauscherharz, in dessen Moleküleinheiten quaternisierte Pyridinringe vorliegen, auf Basis eines Copolymeren von Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats mit einem oder mehreren copolymerisierbaren Monomeren, die aromatische Vinylverbindungen, äthylenisch ungesättigte Verbindungen, dienisch ungesättigte Verbindungen oder ungesättigte Divinylverbindungen sein können, umsetzt, welches ein durch Radikalpolymerisation gebildetes Copolymeres aus 20 bis 99 Mol-% Vinylpyridin oder eines Vinylpyridinderivats, 0,5 bis 30 Mol-% der ungesättigten Divinylverbindungen und 0 bis 70 Mol-% eines der anderen copolymerisierbaren Monomeren oder ein Block- oder Pfropfcopolymerisat, welches 25 bis 75 Mol-% Vinylpyridin- oder Vinylpyridinderivateinheiten enthält, darstellt
10. Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Umwandlung eines Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym ein wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8 verwendet wird.
DE2413694A 1973-05-30 1974-03-21 Wasserunlösliches, enzymatisch aktives, unbeweglich gemachtes Enzymmaterlal Granted DE2413694B2 (de)

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