DE2439923B2 - Verfahren zum fixieren von enzymen auf einem traegermaterial - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Bekanntlich ist die technische Verwertbarkeit von Enzymen eingeschränkt durch die Unbeständigkeit der Enzyme, durch die häufig benötigten großen Mengen an Enzym und infolgedessen durch die hohen Gestehungskosten.

Um die Enzyme rationeller auswerten zu können, wurde bereits versucht, sie auf Trägermaterialien zu immobilisieren, und zwar durch Adsorption, Einschluß in unlösliche Gele, Vernetzung oder durch Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen Träger und Enzym. Diese letztere Arbeitsweise ist die häufigste, auf Grund der Eigenschaften der dabei erhaltenen Enzymderivate; allgemein wird hierzu ein in Wasser löslicher oder unlöslicher Träger und das Enzym in einem vollständig oder teilweise wäßrigen Medium bei einer Temperatur unterhalb 50⁰C und bei einem pH-Wert, bei welchem das Enzym beständig und aktiv ist, miteinander in Berührung gebracht.

Die Fixierungsreaktion verläuft jedoch langsam, es treten während dieser Reaktion Adsorptionserscheinungen auf, die erhaltenen Komplexe Träger-Enzym sind noch nicht ausreichend beständig und ihre Aktivität ist gering. Außerdem konkurrieren im Verlauf der Fixierungsreaktion häufig die Enzymmoleküle und die Wassermoleküle beim Besetzen der reaktionsfreudigen Stellen des Trägermaterials; hierdurch wird die Menge an fixiertem aktivem Enzym eingeschränkt.

Aufgabe der Erfindung ist es, diese Nachteile zu vermeiden und mit Hilfe einer raschen Fixierungsreaktion ohne besondere Bedingungen hinsichtlich des pH-Wertes Träger-Enzym Komplexe zu erhalten, auf denen eine größere Menge aktives Enzym fixiert ist und die den üblichen Denaturierungsfaktoren wie Aufbewahren, Temperatur und pH-Wert widerstehen und außerdem aktiver sind als die bekannten Komplexe,

Erfindungsgemäß werden Enzyme auf Trägermaterialien in wasserfreiem organischem Medium bei einer Temperatur von 30 bis 120⁰C fixiert. Für dieses Verfahren kommen folgende Enzyme in Frage:

a) Oxydoreduktasen wie Glukoseoxydase, Glutamin säuredehydrogenase, Äpfelsäuredehydrogenase. Milchsäuredehydrogenase, Peroxydase und Kataiase;

b) Transferasen wie Aspartat-aminotransferase, Hi staminmethvltransferase, Glvcin-arninotransferas« Aspartat-acetyltransferase, ε-Lysin-acetyltransferase, Hexokinase und Fructokina.se;

c) Hydrolasen wie Lipase, Phospholipase, Acetylcholinesterase, Pectinase, Phosphatase, α- und 0-Amyläse, Maltase, Cellulase, Invertase, Acylase, Pepsin, Papain, Rennin, Trypsin, Chymotrypsin, Asparaginase, Urease, Arginase und Ribonuclease;

d) Lyasen wie Aspartat-decarboxylase, Glutamat-decarboxylase, Malatsynthase, Citratlyase, Fumarat-

[o hydratase;

e) Isomerasen wie Alaninracemase, Methioninracemase, Glutamatracemase, Lactatracemase und Glukosephosphat-isomerase;

f) Ligasen wie Asparagin-synthetase, Glutamin-syns thetase, Glutathion-synthetase und Pyruvat-synthe-

tase.

Das eingesetzte Trägermaterial kann anorganisch, organisch oder gemischt anorganisch-organisch sein

und ist in organischem Medium unlöslich; es muß aktiv sein, das heißt eine oder mehrere funktionell Gruppen besitzen, die mit anderen Gruppen wie Amino-. Carboxyl-, Sufhydril- oder Hydroxylgruppen, über welche die Enzyme sich bekanntlich fixieren können.

2s reagieren. Besitzt das Trägermaterial selbst nicht diese funktioneilen Gruppen, so muß es in diesem Sinne aktiviert werden.

Als Trägermaterial kommen in Frage: Backstein, Kieselsäure bzw. Kieselerde, Tonerde bzw. Aluminium-

ίο oxid, Tone, Sand, Agarose, Stärke, Polydextran, Cellulose, polymere Stoffe wie Polybutadien, Polystyrol, gegebenenfalls vernetzt und Copolymere der Methacrylsäure sowie Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Äthylen.

Die Aktivierung des Trägermaterials besteht dann, daß man es derart behandelt, daß es die funktionellen Gruppen erhält, welche mit dem Enzym reagieren. Diese Modifizierung erfolgt nach beliebig bekannten Arbeitsweisen und hängt ab von der Beschaffenheit des eingesetzten Trägermaterials sowie von der Beschaffenheit des Enzyms, das fixiert werden soll. Zu diesen Aktivierungsreaktionen, die von klassischen chemischen Reaktionen wie Diazotieren, Halogenieren und Sulfonieren Gebrauch machen, gehören die Reaktionen zwischen Trägermaterial und beispielsweise einem Sulfurylhalogenid, Cyanurylhalogenid, Halogencyan oder Thionylhalogenid; das Aufpfropfen auf das Trägermaterial, vor allem auf Polymere von hydrolisierbaren Silanen mit mehreren funktionellen Gruppen

so oder von Carbonylgruppen.

Diese Träger liegen allgemein als granulierte Stoffe vor, deren Korngrößenverteilung meistens oberhalb 100 μΐη liegt und sehr unterschiedlich sein kann. Sie müssen selbstverständlich vollständig frei sein von allen Stoffen, die das Enzym hemmen oder denaturieren und dürfen keinerlei Wasserspuren enthalten.

Als organisches Medium, welches das Enzym nicht löst, werden aliphatische, cycloaliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe gewählt, die gegebenenfalls noch Chloratome enthalten, oder Verbindungen, die Heteroatome wie Sauerstoff und/oder Schwefel enthalten. Hierzu gehören: Hexan, Benzol, Toluol, Xylol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff. Dichloräthan. Trichloräthan, Trichloräthylen. Perchloräthylen, Di-

f>« oxan, Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid. Diesp Nicht-Lösungsmittel für das Enzym werden einzeln oder im Gemisch miteinander eingesetzt.

Erfindungsgemäß werden das aktive Träserma*?ri;v

und ein oder mehrere Enzyme gleichzeitig oder nacheinander in dem organischen Medium dispergiert und dann auf die Reaktionstemperatur erwärmt, vorzugsweise auf die Siedetemperatur des Mediums, während der zum Fixieren des Enzyms erforderlichen Zeitspanne.

Das Enzym soll stets im Überschuß vorliegen, bezogen auf die funktionellen Gruppen des Trägermaterials. Die Menge des organischen Mediums hängt ab von der Beschaffenheit des Trägermaterials und der Beschaffenheit des Enzyms; sie soll ausreichen, um eine gute Dispersion zu erhalten, die eine innige Berührung zwischen aktivem Trägermaterial und Enzym ermöglicht

Die Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 30 bis 120⁰C uno wird je nach Beschaffenheit von organischem Medium und Beschaffenheit des Enzyms im speziellen Fall eingestellt.

Es war außerordentlich überraschend, daß bei derart iiohen Temperaturen die Fixierung von Enzymen möglich ist, ohne daß die Enzymaktivität wesentlich verringert wird; es wurde vielmehr bisher angenommen, daß bei Temperaturen oberhalb 40 bis 50⁰C die Enzyme denaturieren würden.

Um die Reaktion zu beschleunigen, kann unter leichtem Druck gearbeitet werden.

Anders als bei den bekannten Verfahren bleibt der pH-Wert des Fixierungsmediums ohne Einfluß auf die Eigenschaften des fixierten Enzyms.

Die Reaktionszeit beträgt allgemein wenige Minuten bis zu 2 Stunden; dies stellt eine beträchtliche Zeitersparnis gegenüber den bekannten Verfahren dar.

Nach dem Fixieren läßt sich das organische Medium leicht abtrennen und der erhaltene Träger-Enzym Komplex wird mit einer Pufferlösung gewaschen, die sich nach dem Enzym richtet und deren pH-Wert und Zusammensetzung keinen nachteiligen denaturierenden Einfluß auf den Komplex ausüben. Hierdurch wird das nicht umgesetzte Enzym und das auf dem Trägermaterial einfach adsorbierte Enzym abgetrennt und zurückgewonnen und kann in einer weiteren Fixierungsreaktion eingesetzt werden.

Die erhaltenen Komplexe aus Trägermaterial und Enzym bestehen somit aus einem oder mehreren Enzymen, fixiert auf dem Trägermaterial. Enthält der Komplex mehrere Enzyme, so werden diese entweder gleichzeitig oder nacheinander fixiert oder es werden zwei getrennt voneinander hergestellte Komplexe mit jeweils einem Enzym miteinander vermischt

Wieviel Enzym mittels kovalenter Bindung fixiert wird, hängt ab von der Beschaffenheit des Enzyms sowie von der Beschaffenheit und der Struktur des Trägermaterials. Es wird deutlich mehr Enzym fixiert, als bei den bekannten Verfahren in wäßrigem Medium.

Die erfindungsgemäß hergestellten Komplexe aus Trägermaterial können bei höheren Temperaturen eingesetzt werden als die in wäßrigem Medium hergestellten Komplexe sowie kontinuierlich während ziemlich langer Zeitspannen ohne ihre Aktivität zu verlieren oder bei nur sehr geringem Aktivitätsverlust.

Tabelle 1

Sie werden als Katalysatoren mit hoher spezifischer oder gesteuerter Aktivität eingesetzt, und zwar auf dem Gebiet der Medizin, der Pharmazie, in der chemischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und in der Gerberei.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1
Fixierung von Pectinase auf Backstein

Der Backstein wurde zerkleinert und gesiebt, um eine homogene Korngrößenverteilung, das heißt ein Korn mit Durchmesser 0,5 bis 0,8 mm zu erhalten; dieses Pulver wurde mit destilliertem Wasser, darauf mit einer 1 η-Salzsäure und schließlich nochmals nut destilliertem Wasser gewaschen und 15 h bei 700⁰C unter Sauerstoffatmosphäre gehalten. Darauf wurde der Backstein ohne Begleitstoffe aktiviert: 2 g Backstein wurden in 40 ml einer 10%igen Lösung aus Sulfurylchlorid in wasserfreiem Benzol gegeben. Die erhaltene Suspension wurde unter Rühren auf die Siedetemperatur des Gemisches erhitzt und diese Temperatur 20 h beibehalten. Danach wurde der gebildete aktivierte Backstein abgetrennt.

0,5 g handelsübliche Pectinase und darauf 2 g aktivierter Backstein wurden mittels Schallbehandlung in 50 ml wasserfreiem Benzol dispergiert. Die erhaltene Dispersion wurde auf Siedetemperatur erwärmt und diese Temperatur 1 h lang beibehalten.

Nach dem Abkühlenlassen wurde die feste Substanz abgeschleudert, zum Waschen 15 h lang bei 4° C mit 20 ml einer 1 η-Kochsalzlösung in Berührung gehalten, zentrifugiert und getrocknet; der Waschvorgang wurde 7 χ wiederholt Mit seiner Hilfe wurde das auf dem Trägermaterial adsorbierte restliche Enzym desorbiert und konnte dann einer erneuten Verwendung zugeführt werden.

Nach jedem Waschgang des Komplexes aus Träger und Enzy:n, bei welchem das Enzym durch kovalente Bindung an das Trägermaterial gebunden ist, wurde die enzymatische Aktivität wie folgt bestimmt:

Ig Komplex, wurde in 10 ml einer 0,4gew.-%igen Lösung aus Polygalacturonsäure in 0,01m Acetatpuffer vom pH-Wert 4 gelöst Die Dispersion wurde 30 min lang auf 35° C erwärmt Nach dem Abkühlen und Absitzenlassen wurden 5 ml Lösung entnommen und durch Zugabe von 0,3 ml wäßriger 0,9%iger Zinksulfatlösung und 0,3 ml wäßriger 1 n-Sodalösung geklärt. Nach dem Zentrifugieren wurden die in der überstehenden Flüssigkeit vorhandenen reduzierenden Verbindungen mit Dinitrosalicylat titriert.

Zum Vergleich wurde der Versuch wiederholt, die Fixierung jedoch in wäßrigem Medium mit einer Lösung aus 0,5 mg Pectinase in 50 ml Wasser, mit 2 g aktiviertem Backstein, bei 4° C während 7 h durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt; angegeben wird die prozentuale Aktivität des Komplexes, bezogen auf die Enzymaktivität vor der Fixierung.

Gewaschen mit Im NaCI 1 2

Aktivität (%)

Fixierung in Benzol 69 50

Fixienine in H2O 44 5 30

47

47
?8

47
27,5

47
24

Tabelle 2	in in	Hexan HjO	Anzahl 5	der Waschgänge 10 15
			3,2 0,3	1,6 1 0.2 0.1
Aktivität 1 ixierung I ixicrung

15

Der Vergleich zeigt, daß die Fixierung des Enzyms in benzolischem Medium wesentlich schneller erfolgt als in wäßrigem Medium und daß die in organischem (Benzol) Medium fixierte Pectinase sehr viel beständiger ist als die in wäßrigem Medium fixierte Pectinase. Im Falle der Fixierung in organischem Medium tritt zwar zunächst eine leichte Verringerung der Aktivkät ein, die aber nach dem dritten Waschgang konstant bleibt; die Aktivität der in wäßrigem Medium fixierten Pectinase nimmt hingegen ständig ab. Hieraus schließt man, daß in organischem Medium erheblich mehr Enzym kovalent gebunden wird als in wäßrigem Medium.

Beispiel 2
Fixierung von Papain auf Backstein

2 mg Papain und 2 g aktiver Backstein gemäß Beispiel I wurden in 20 m) Hexan suspendiert,- die erhaltene Suspension wurde unter Rückfluß 1 h lang erhitzt Nach dem Abkühlenlassen wurde der Feststoff abgetrennt, mit Wasser, 20 ml ! m Kochsalzlösung und erneut mit Wasser gewaschen.

Die Enzymaktivität des Komplexes aus Trägermaterial und Enzym wurde wie folgt gemessen: Der Komplex wurde in 1 ml Wasser suspendiert; darauf wurden 9 ml einer Caseinlösung — 0,3 Gew.-% in 0,025 m Phosphat-Citratpuffer — vom pH-Wert 7 zugegeben; die Suspension 10 min auf 37°C ;;rwärmt. Nach dem Abkühlen und Absitzenlassen wurde 4 ml Lösung entnommen und mit 4 ml einer wäßrigen, 10gew.-%igen Lösung aus Trichloressigsäure versetzt; das überschüssige Casein -.-. urde ausgefüllt, abfiltriert und darauf im Filtrat der Peptidgehalt nach der Methode Lowry bestimmt.

Der Komplex aus Trägermaterial und Enzym wurde erneut mit Wasser, mit Im NaCl und mit Wasser gewaschen und erneut seine enzymatische Aktivität gemessen. Diese Maßnahmen wurden mehrere Male wiederholt.

Zum Vergleich wurde die Fixierung von Papain auf dem gleichen Trägermaterial in wäßrigem Medium bei 4°C während 7 h vorgenommen. Nach dem Waschen wurde die Enzymaktivität wie oben beschrieben bestimmt.

Die Ergebnisse, ausgedrückt in μ§ freigesetzte Peptide je ml und je min sind m der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt:

Tabelle 3

Anzahl der Waschgänge
5 10 !5

55

Der Vergleich zeigt, daß die Fixierungszeit für Papain in Hexan sehr viel kürzer ist und daß weiterhin 1Ox mehr Enzym fixiert werden als beim Arbeiilen in Wasser.

Beispiel 3
Fixierung von Trypsin auf Backstein

Es wurde wie in Beispiel 2 gearbeitet mit Trypsin anstelle von Papain. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Aktivität	Hexan	4.8	2,6	! 4
Fixierung in	H2O	0.6	0.3	0.1
Fixierung in

Dieses Beispiel zeigt, daß die Fixierungszeit iür Trypsin in Hexan sehr viel kurzer ist als in Wasser, üuü weiterhin sehr viel mehr Enzym in organischem Medium fixiert wird und daß dieses sehr viel beständiger ist als beim Arbeiten in Wasser.

Der in Hexan hergestellte Komplex aus Trägermaterial und Enzym ist verhältnismäßig beständig, trotz der aufeinanderfolgenden Waschgänge, die den Komplex nachteilig beeinflussen. Diese Beständigkeit ist gröü-r. wenn der Komplex kontinuierlich benutzt wird: au g Komplex aus aktivem Backstein und Trypsin, hergestem wie oben, wurden in eine Säule gegeben und dort bei 37°C gehalten. Eine 03%ige Caseinlösung in einem 0,025 m Phosphat-Citratpuffer, pH-Wert 7, wurde kontinuierlich während 15 Tagen durch die Säule geschickt, mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h.

Alle 24 h wurden wie oben beschrieben Aktivitätsmessungen durchgeführt. Nach 15 Tagen hatte die Aktivität nur um 5% abgenommen.

Dies zeigt sehr gut die Beständigkeit der erfindungsgemäß hergestellten Komplexe.

Beispiel 4
Fixierung von Ribonuclease auf Polybutadien

Polybutadien wurde durch Reaktion mit Acetylchlorid aktiviert

20 mg Enzym wurden in 50 ml Benzol suspendiert und mit 2 g aktiviertem Polybutadien versetzt; die erhaltene Suspension wurde zum Sieden erhitzt und 1 h bei dieser Temperatur gehalten.

Die Fixierung des Enzyms ließ sich IR-spektroskopisch verfolgen. Die Absorptionsbande bei 1720 cm-' der Carbonylgruppe, die das aktivierte Polybutadien enthielt, verschwand im Verlauf der Fixierungsreaktion; statt dessen trat eine andere Absorptionsbande bei 1640 cm-' auf, die der Iminogruppe zugeschrieben wurde.

Der abgetrennte Komplex wurde mit 20 ml Carbonatpuffer vom pH-Wert 10,5 gewaschen, um das lediglich adsorbierte Enzym zu entfernen. Anschließend wurde die Aktivität des fixierten Enzyms gegenüber einem gereinigten Präparat aus Ribonucleinsäure (= RNS) gemessen.

Hierzu wurden 20 mg Komplex aus Trägermaterial und Enzym in einem Gemisch aus 1 ml Tris- Puffer (tris(Hydroxymethyl)aminomethan bzw. 2-Amino-2-Hydroxymethyl-propandiol-13) 0,2 m, mit pH-Wert 7,8, enthaltend 0,02 m Äthylendiaminotetraessigsäure, 1 ml Wasser und 1 ml RNS gelöst in Wasser entsprechend einer Konzentration von 33 mg RNS je ml Gemisch, dispergiert.

Die Suspension wurde 2 min bei 37°C gehalten; darauf wurde 1 ml Fayden-Reagens zugegeben, das Ganze 15 min bei 0⁰C ruhen gelassen und dann 5 min mit 6000 UpM bei 3°C zentrifugiert, um die überschüssige RNS abzutrennen. Die überstehende Lösung wurue abgetrennt und 1:30 verdünnt; darai'i w-^d·.· \w.-<z

Absorption bei 260 nm gemessen und mit einem Trägermaterial ohne Enzym verglichen.

Die enzymatische Aktivität entsprach 1,2 mg aktivem Enzym je g Trägermaterial.

Beispiel 5
Fixierung von Glucoamylase auf Kieselsäure

Eine Kieselsäure mit spezifischer Oberfläche 15 m²/g _[0 wurde durch Aufpfropfen eines Silans mit Epoxygruppen aktiviert.

1 g aktivierter Träger wurde zu 50 ml einer Dispersion von 20 mg Glucoamylase in Chloroform gegeben. Die erhaltene Suspension wurde 2 h unter Rückfluß erhitzt.

Nach dem Abkühlen wurde der gebildete Komplex durch Absitzenlassen abgetrennt, getrocknet und 3 χ mit 20 ml destilliertem Wasser und anschließend 24 h bei 4°C mit 20 ml 2 m Kochsalzlösung gewaschen.

Zum Vergleich wurde der gleiche Versuch in wäßrigem Medium durchgeführt mit 50 ml einer Acetatpufferlösung 0,1m, pH-Wert 4,5, enthaltend 20 mg Glucoamylase und 1 g des gleichen aktivierten Trägermaterials·, die Berührungszeit betrug 66 h bei 4° C unter Rühren. Nach dem Absitzenlassen, Spülen und Waschen wie oben, wurde die Aktivität bestimmt.

Die erhaltenen Komplexe aus Träger und Enzym wurden in 10 ml einer 3gew.-%igen Stärkelösung in einem 0,1 m Acetatpuffer von pH-Wert 4,5 gegeben und 10 min lang bei 40°C gerührt. Nach dem Abtrennen wurde die Menge der reduzierenden Zucker in der flüssigen Phase colorimetrisch mit 3,5-Dinitrosalicylsäure bestimmt. Es wurde mehrere Male gewaschen und die Aktivität auf diese Weise bestimmt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als optische Dichte, sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

die dabei erhaltenen Komplexe aktiver und beständiger sind als die in Wasser erhaltenen.

Beispiel 6
Fixierung von Invertase auf Backstein

0,2 g Invertase und 2 g aktiviertes Backsteinpulver gemäß Beispiel 1 wurden in 20 ml Toluol suspendiert; die Suspension wurde dann etwa 1 Stunde auf Rückflußtemperatur (etwa IH⁰C) erhitzt. Nach dem Abkühlenlassen wurde der Feststoff abgetrennt (filtriert), mit Wasser, darauf mit 20 ml einer 1 m-Kochsalzlösung und erneut mit Wasser gewaschen; anschließend wurde die enzymatische Aktivität wie folgt bestimmt:

500 mg Komplex aus Trägermaterial und Invertase in 5 ml destilliertem Wasser wurden mit 10 ml einer 0,0585m Rohrzuckerlösung in destilliertem Wasser und mit 5 ml 0,2m Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,2 in Berührung gebracht, Dauer der Behandlung 30 Minuten bei 40⁰C. Die Reaktion wurde abgebrochen und das ganze filtriert; das Filtrat wurde 5 Minuten zum Sieden erhitzt.

Die freigesetzten reduzierenden Zucker wurden mit Hilfe der Dinitrosalicylat-Methode bestimmt.

Darauf wurde der Komplex aus Trägermaterial und Enzym erneut mit Wasser, mit Im Kochsalzlösung und wiederum mit Wasser gewaschen und eine zweite Bestimmung der enzymatischen Aktivität durchgeführt. Diese Maßnahmen wurden mehrere Male wiederholt.

Zum Vergleich wurde die Fixierung der Invertase auf dem gleichen Trägermaterial in wäßrigem Medium bei 4°C während 7 Stunden vorgenommen. Nach dem Waschen wurde die enzymatische Aktivität, wie oben beschrieben, bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, angegeben in g/l freigesetzte reduzierende Zucker.

Tabelle 4	Aktivität nach !mal Waschen mit 2m NaCl	7 Tagen und Waschen mit	3mal 2m NaCI	45	Tabelle 5	Toluol Wasser	Anzahl 1	der Waschgänge 2 3	0.078 0.009
Fixierungs medium	0,800 0,180	0,564 0.120				0,085 0,022	0,080 0,015
				Aktivität (g/l) Fixierung in Fixierung in
Chloroform H2O

Der Vergleich zeigt wie in den vorangegangenen Beispielen, daß die Fixierungszeit für Glucoamylase in Chloroform wesentlich kürzer ist als in Wasser und daß Der Vergleich zeigt, daß die Fixierungszeit für Invertase in Toluol erheblich kürzer ist, daß dabei mehr Enzym fixiert wird und daß der erhaltene Enzym-Komplex beständiger ist als beim Arbeiten in Wasser.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Fixieren von Enzymen auf einem Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fixierungsreaktion in wasserfreiem organischem Medium bei einer Temperatur von 30 bis 120⁰C durchführt und hierzu als Trägermaterial ein in dem organischen Medium unlösliches anorganisches, organisches oder anorganisch-organisches Trägermaterial einsetzt, das funktioneile Gruppen besitzt, welche mit den Gruppen reagieren, über die sich die Enzyme fixieren können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man unter leichtem Druck arbeitet

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2. dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fixierungszeit von einigen Minuten bis zu 2 Stunden einhält.