DE3012693C2

DE3012693C2 -

Info

Publication number: DE3012693C2
Application number: DE3012693A
Authority: DE
Inventors: Kiyotaka Shin-Nanyo Yamaguchi Jp Oyama; Shigeaki Kudamatsu Yamaguchi Jp Nishimura; Yuji Shin-Nanyo Yamaguchi Jp Nonaka; Tsutomu Hashimoto; Keiichi Tokuyama Yamaguchi Jp Kihara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc; Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Current assignee: Sagami Chemical Research Center Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1979-04-03
Filing date: 1980-04-01
Publication date: 1990-04-26
Also published as: CH645341A5; BE882603A; DE3012693A1; GB2049703A; IT1147338B; JPS55135595A; FR2453137B1; FR2453137A1; CA1133841A; IT8021154A0; US4284721A; GB2049703B; NL8001902A; JPS615399B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden durch Um setzen einer N-substituierten Asparaginsäure mit einem Phenylalanin-C_1-4-al kylester in Gegenwart einer Metalloproteinase.

Enzyme sind proteinartige Verbindungen, die in extrem starkem Ausmaß Vital reaktionen katalysieren. Im allgemeinen sind die Enzyme jedoch nicht nur kost spielig, sondern auch instabil und haben daher im industriellen Bereich nur in sehr begrenztem Ausmaß Anwendung gefunden. Aufgrund der ausgezeichneten katalytischen Wirksamkeit der Enzyme wurden in jüngster Zeit erhebliche An strengungen im Hinblick auf ihre industrielle Anwendung unternommen. Als Er gebnis solcher Forschungen ist es möglich geworden, die Enzymstabilität durch Immobilisieren des Enzyms zu verbessern. Weiterhin werden hierdurch ihre wie derholte Verwendung und eine kontinuierliche Durchführung der Reaktion er möglicht, wodurch es gelingt, sie auch für industrielle Zwecke einzusetzen. Je doch ist die Aktivität der Enzyme in organischen Lösungsmitteln sehr gering. Weiterhin werden sie in dem organischen Lösungsmittel leicht denaturiert und desaktiviert. Demzufolge ist die Anwendung der Enzyme auf wäßrige Medien be schränkt, was einen erheblichen Nachteil darstellt.

Im Hinblick auf eine in einem organischen Lösungsmittel ablaufende enzymati sche Reaktion ist auf die Herstellung von Acetyl-L-tryptophanäthylester aus Ace tyl-L-tryptophan und Äthylalkohol hinzuweisen.

Es ist weiterhin seit langem bekannt, daß proteolytische Enzyme die Peptidbin dungen ergebende Reaktion in einem wäßrigen Medium katalysieren. Es findet sich jedoch kein Hinweis auf die Durchführung einer solchen Reaktion in einem organischen Lösungsmittel.

In Chemical Abstracts, Vol. 87 (1977), 129 560a wird eine präparative enzymati sche Synthese unter Anwendung eines Zweiphasensystems aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel beschrieben. In diesem Fall wird das Enzym in der wäßrigen Phase angeordnet, beispielsweise dadurch, daß man ein poröses Glas mit einer wäßrigen Pufferlösung des Enzyms impräg niert. Die Umsetzung erfolgt dann in der Weise, daß man das in dieser Weise im mobilisierte Enzym in Chloroform eintaucht, welches N-Acetyl-L-tryptophan und Äthanol enthält.

Von der Anmelderin wurde bereits ein Verfahren vorgeschlagen, gemäß dem eine N-substituierte Monoaminodicarbonsäure in einem wäßrigen Lösungsmittel und in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms mit einem Aminocarbonsäuree ster umgesetzt wird, worauf der in dieser Weise gebildete Dipeptidester mit dem Aminocarbonsäureester eine Additionsverbindung liefert, die dann abgetrennt wird. Diese Methode ist in der JP-OS 92729/1978 beschrieben.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, eine Peptidbindungen erzeugende Reaktion in wirksamer Wei se in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel durchzu führen, um in dieser Weise aus einer N-substituierten Asparaginsäure und einem Phenylalaninniedrigalkylester ein Dipeptid zu bilden.

Diese Aufgabe wird nun gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausfüh rungsformen dieses Erfindungsgegenstandes.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden durch Umsetzen einer N-substituierten Asparaginsäure mit einem Phenylala nin-C_1-4-alkylester in Gegenwart einer Metalloproteinase, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß man die Umsetzung in einem mit Wasser gesättigten Carbonsäu reester in Gegenwart einer Wasser enthaltenden, immobilisierten Metalloprotei nase durchführt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden somit die N-substituierte Asparaginsäure und der Phenylalanin-C_1-4- alkylester in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel mit einer wasserhaltigen immo bilisierten Metalloproteinase in Kontakt gebracht und in dieser Weise unter Bildung des Dipeptids miteinander gekuppelt bzw. umgesetzt.

Der N-Substituent der bei dem erfindungsgemäßen Verfah ren eingesetzten N-substituierten Asparaginsäure ist eine in der Peptidsynthese üblicherweise verwendete Schutzgruppe für Aminogruppen. Beispiele für bevorzugte Schutzgruppen sind Schutzgruppen des Urethan-Typs, wie die Benzyloxycarbonylgruppe, die p-Methoxybenzyloxy carbonylgruppe, die tert.-Butoxycarbonylgruppe.

Die niedrigmolekulare Alkylgruppe des als zweites Aus gangsmaterial bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ver wendeten Phenylalaninalkylesters ist eine Alkyl gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und insbesondere eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können beide Mate rialien in der L- und/oder DL-Konfiguration vorliegen. Wenn man die DL-Isomeren verwendet, nimmt lediglich das L-Isomere an der Reaktion teil, während das D-Isomere nicht umgesetzt wird und in der Lösung verbleibt.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in immobilisier ter Form eingesetzte Enzym ist ein proteolytisches Enzym, das ein Metallion in seinem aktiven Zentrum aufweist, das heißt mit anderen Worten eine Metalloproteinase. Beispiele für solche Enzyme sind die aus Mikroorganismen gewonnenen, wie eine natürliche Protease, die aus Actino mycetes gewonnen worden ist, Prolysin, Thermolysin, Collagenase, Crotulus atrox-Protease. Man kann auch ein rohes Enzym, wie Thermoase, verwenden. Bei der An wendung eines solchen rohen Enzyms kann man einen Kar toffel-Inhibitor oder einen ähnlichen Inhibitor verwen den, um die Wirkung einer verunreinigenden Esterase oder dergleichen zu inhibieren. Erfindungsgemäß ist es jedoch am bevorzugtesten, Thermolysin oder Thermoase einzusetzen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese Enzyme in immobilisierter Form eingesetzt, in die man sie mit Hilfe herkömmlicher Immobilisierungsverfahren überführt. Diese Immobilisierungsverfahren schließen Methoden ein, die auf der physikalischen Adsorption, der Ausbildung von Ionenbindungen, der Ausbildung von kovalenten Bin dungen, einer Einschlußreaktion und/oder einer Vernetzungs reaktion beruhen. Die Methode der Immobilisierung ist jedoch nicht auf diese Verfahrensweisen beschränkt, so daß man auch Enzyme, die lediglich auf einem porösen Trägermaterial vorliegen, das eine sehr schwache Wechsel wirkung mit den Enzymen eingeht, verwenden kann.

Der hierin verwendete Ausdruck "immobilisiertes Enzym" steht für einen Komplex, der das Enzym und ein Träger material umfaßt.

Die Menge, in der das Enzym auf dem Trägermaterial vor liegt, kann nicht ohne weiteres vorausgesagt werden, da die Fähigkeit des Trägermaterials zur Aufnahme des Enzyms von der Intensität der Wechselwirkung zwischen dem Träger material und dem Enzym abhängt. Jedoch kann die Menge etwa 1 bis etwa 2000 mg und normalerweise etwa 50 bis etwa 1000 mg pro Gramm des Trägermaterials, auf das Trockengewicht bezogen, betragen. Die oben angegebenen Mengen sollen jedoch die Erfindung nicht einschränken, insbesondere im Hinblick auf die Obergrenzen, wobei ein Trägermaterial, das dazu geeignet ist, das Enzym in einer Menge zu immobilisieren, die oberhalb der oben angegebenen Werte liegt, bevorzugt ist, da es hierdurch möglich wird, den Trägermaterialverbrauch zu vermindern. Da das erfindungsgemäß in immobilisierter Form verwen dete Enzym eine sehr geringe Aktivität in einem trocke nen organischen Lösungsmittel aufweist und instabil ist, ist es erforderlich, die Poren des immobilisierten Enzyms mit Wasser zu füllen, wenn dieses in dem organi schen Lösungsmittel verwendet wird. Das in den Poren enthaltene Wasser sollte einen pH-Wert besitzen, der für die Aktivität der Metalloproteinase geeignet ist. Da der optimale pH-Wert der Metalloproteinase im neutra len Bereich liegt, kann das Wasser einen Puffer enthal ten, der dazu geeignet ist, den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten (ein pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9).

Wenngleich im Hinblick auf den Wassergehalt des immobi lisierten Enzyms keine besonderen Beschränkungen beste hen, liegt der Wassergehalt üblicherweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 500 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 200 Gew.-%, bezogen auf das Träger material auf Trockenbasis. Weiterhin ist es für diesen Zweck möglich, Wasser zu verwenden, das in natürlicher Weise von dem Trägermaterial zurückgehalten wird, wenn man das Enzym bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms aus einer wäßrigen Lösung auf das Trägermaterial aufbringt.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Lösungs mittel ist ein mit Wasser nicht mischbarer Carbonsäureester. Die Anwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels ist nicht erwünscht, es sei denn, daß man es als Zusatz zu dem mit Wasser nicht misch baren Carbonsäureester verwendet, wie es nach stehend erläutert wird, da bei Anwendung eines solchen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels das in den Poren des immobilisierten Enzyms zurückgehaltene Wasser sich in dem organischen Lösungsmittel lösen und durch dieses ersetzt werden würde, wodurch die Reaktion gehindert würde. Bei der Verwendung des mit Wasser nicht mischbaren Carbonsäureesters ist diesen in mit Wasser gesättigter Form einzusetzen, um sicherzustellen, daß es das in den Poren des Trägerma terials enthaltene Wasser nicht löst und in seiner Menge verringert. In diesem Sinne steht der Ausdruck "mit Wasser nicht mischbarer Carbonsäureester", wie er hierin verwendet wird, mit anderen Worten für einen Carbonsäureester oder eine homogene Mischung aus dem Carbonsäureester und Wasser, das bzw. die sehr wenig Wasser löst, wenn es bzw. sie mit einer geringen Menge Wasser in Kontakt kommt. Demzufolge ist es, solange die Reaktionsbedingungen nicht gestört werden, möglich, den mit Wasser nicht mischbare Carbonsäureester mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu versetzen. Weiterhin ist es erfin dungsgemäß erforderlich, daß der mit Wasser nicht mischbare Carbonsäureester sowohl die Ausgangs materialien als auch das Reaktionsprodukt löst. Bei spiele für bevorzugte Carbonsäureester, sind Äthylacetat und Isopropylacetat; und Mischungen aus solchen Carbonsäureestern. Wie oben angegeben kann man diese Carbonsäureester mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Äthanol, ver setzen, vorausgesetzt, daß der Zustand der Unmischbar keit des organischen Lösungsmittels mit Wasser aufrecht erhalten wird.

Vorzugsweise verwendet man beide Ausgangsmaterialien bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in hohen Konzentra tionen, da die Reaktionsgeschwindigkeit um so größer ist, je höher die Konzentrationen sind. Man verwendet die Ausgangsmaterialien normalerweise in einer Konzen tration, in der sie sich in dem Lösungsmittel lösen. Da die Materialien jedoch mit fortschreitender Reaktion verbraucht werden, ist es möglich, einen Teil der Ausgangsmateria lien in suspendierter Form in dem Lösungsmittel vorliegen zu haben. Vorzugsweise verwendet man die beiden Ausgangs materialien in Konzentrationen von etwa 0,001 m bis etwa 2 m und noch bevorzugter in Konzentrationen von etwa 0,01 m bis etwa 0,5 m.

Die Menge, in der die N-substituierte Asparaginsäure und der Phenylalanin-C_1-4-alkylester bei dem erfin dungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, entsprechen im allgemeinen einem stöchiometrischen Molverhältnis von 1 : 1, wenn beide Verbindungen in der L-Konfigura tion verwendet werden. In der Praxis kann man sie in einem Verhältnis von 10 : 1 bis 1 : 10 und vorzugsweise von 3 : 1 bis 1 : 5 einsetzen. Wenn man die Materialien in der DL-Konfiguration verwendet, kann man sie in Mengen einsetzen, die so gehalten sind, daß die Verhält nisse der L-Isomeren innerhalb der oben angegebenen Be reiche liegen.

Bezüglich der Menge, in der das wasserhaltige immobi lisierte Enzym bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ver wendet wird, bestehen keine besonderen Beschränkungen. Bei Anwendung einer höheren Konzentration dieses immo bilisierten Enzyms läßt sich die Reaktion in kürzerer Zeit vollständig durchführen, während bei niedriger Konzentration längere Reaktionszeiten erforderlich sind. Die verwendete Menge hängt auch von der Menge des auf dem Trägermaterial vorliegenden Enzyms und seiner Akti vität ab. Wenn man zum Beispiel das immobilisierte Enzym aus dem Enzym und dem Trägermaterial bildet, das keine besonders starke Wechselwirkung gegenüber dem En zym aufweist und diesen Fall mit dem vergleicht, bei dem das immobilisierte Enzym aus dem Enzym und einem Trägermaterial gebildet worden ist, das das Enzym stark adsorbiert, indem man beispielsweise eine Matrix aus einem Acrylsäureester verwendet, so enthält das zuletzt genannte Material eine größere Menge des Enzyms als das erstgenannte. Demzufolge kann man im Vergleich zu dem ersteren Material mit dem letzteren Material bei Anwendung einer geringeren Menge einen vergleichbaren Effekt erzielen. Im allgemeinen genügt jedoch pro je weils 1 Millimol der Ausgangsmaterialien die Anwendung von etwa 0,01 bis etwa 20 g und vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 5 g des wasserhaltigen immobilisierten Enzyms.

Zum Beispiel kann man das erfindungsgemäße Verfahren in der Weise durchführen, daß man das wasserhaltige, immobilisierte Enzym in dem mit Wasser nicht mischbaren Carbonsäureester suspendiert, das beide Aus gangsmaterialien enthält, und die Reaktion unter Rühren ablaufen läßt. Nach Beendigung der Reaktion kann man das immobilisierte Enzym und die das Reaktionsprodukt enthaltende Reaktionsmischung voneinander trennen, indem man die in Form einer Suspension vorliegende Reaktionsmischung filtriert.

Man kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in einer mit dem wasserhaltigen, immobilisierten Enzym gefüllten Säule durchführen, indem man den mit Wasser nicht mischbaren Carbonsäureester, das die beiden Aus gangsmaterialien enthält, durch die Füllschicht der Säule fließen läßt. Diese Methode ermöglicht die kon tinuierliche Durchführung der Reaktion und ist für die industrielle Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens von Vorteil.

Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis etwa 80°C und vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 50°C.

Die Reaktionszeit hängt von den Konzentrationen der beiden Substrate, der Menge des immobilisierten Enzyms, der Menge, in der das Enzym auf dem Trägermaterial vor liegt, einer vorbestimmten Umwandlungsgeschwindigkeit etc. ab. Im allgemeinen genügt eine Reaktionszeit von etwa 0,5 bis etwa 200 Stunden und vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 100 Stunden.

Man kann das Reaktionsprodukt, den N-substituierten L-Aspartyl-L-phenylalanin-C_1-4-alkylester, nach der Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktion aus der von dem immobilisierten Enzym abgetrennten Reaktions mischung in üblicher Weise isolieren, beispielsweise durch Aufkonzentrieren bis zur Kristallisation oder durch Extraktion. Da das immobilisierte Enzym, das von der in Form einer Suspension vorliegenden Reak tionsmischung abgetrennt worden ist, eine ausreichend hohe Aktivität aufweist, kann es erneut verwendet wer den.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Dipeptide sind nützliche Produkte. Beispielsweise kann man durch Abspalten des N-Substituenten mit Hilfe einer geeigneten Verfahrensweise von dem Dipeptid, das als niedrigmolekulare Alkylgruppe eine Methylgruppe auf weist, den L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester bilden, ein Süßungsmittel, das im Vergleich zu Saccharose die zweihundertfache Süßkraft besitzt.

Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, kann man mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Peptid bindungen bei einer in einem organischen Lösungsmittel durchgeführten Reaktion bilden, so daß es möglich wird, das Enzym ohne Schwierigkeit zurückzugewinnen und wieder zuverwenden. Da die Hydrolyse des Phenylalanin-C_1-4- alkylesters unterdrückt wird aufgrund der Durchführung der Reaktion in dem Carbonsäureester, ergeben sich geringere Verluste der Ausgangsmaterialien im Ver gleich zu den herkömmlichen Methoden, bei denen die Reak tion in einem wäßrigen Medium durchgeführt wird. Wenn beide Ausgangsmaterialien in der L-Konfiguration einge setzt werden, beträgt im Fall der Reaktion in einem wäßrigen Medium, die in der JP-OS 92729/1978 beschrieben ist, das stöchiometrische Molverhältnis von N-substituier ter Asparaginsäure zu dem Phenylalanin-C_1-4-alkylester 1 : 2, während dieses Molverhältnis bei dem erfindungsgemä ßen Verfahren 1 : 1 beträgt. Demzufolge kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren den Phenylalanin-C_1-4-al kylester in geringerer Menge einsetzen, was einen erheb lichen Vorteil für die industrielle Durchführung des Verfahrens darstellt.

Weiterhin kann man dann, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Ausgangsmaterialien in der DL-Konfigura tion verwendet werden, eine Anreicherung des oder der D-Isomeren eines oder beider Ausgangsmaterialien bei gleichzeitiger Bildung des Peptids erreichen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Man versetzt zunächst 25 ml einer 0,05 m Natriumacetat pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 mit 3,0 g Thermoase (Titer: 1,6 Millionen PU/g) und 0,15 g Calcium acetat-monohydrat und vermischt die Bestandteile. Dann zentrifugiert man, um die überstehende Flüssigkeit von dem unlöslichen Material zu trennen. Die in dieser Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit versetzt man mit 30 ml (20 g) eines feuchten Acrylsäureester-Matrix-Träger materials (Amberlite XAD-7, das einen Wassergehalt von etwa 230 Gew.-% auf Trockenbasis aufweist) und rührt die erhaltene Mischung über Nacht unter Bildung einer wäßrigen Suspension des immobilisierten Enzyms. Man trennt das Wasser enthaltende immobilisierte Enzym durch Filtration ab, indem man das Material über ein Glasfilter absaugt. Ausgehend von der anfänglich eingesetzten Enzymmenge und der enzymatischen Aktivität des Filtrats, die man mit Hilfe eines Digestionsverfahrens ermittelt, be trägt die auf dem Trägermaterial vorliegende Enzymmenge des immobilisierten Enzyms etwa 3 g. Der Wassergehalt des in dieser Weise gebildeten immobilisierten Enzyms entspricht im wesentlichen dem anfänglichen Wasserge halt des Trägermaterials. Auch in den nachstehenden anderen Beispielen verwendet man die gleiche Methode zur Bestimmung der Menge des auf dem Trägermaterial vor liegenden Enzyms.

Man gibt das in dieser Weise gebildete immobilisierte Enzym zu 37 ml einer Äthylacetatlösung, die zuvor mit Wasser gesättigt worden ist und die 3,21 g (12 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 4,14 g (23 mMol) L-Phenylalaninmethylester enthält. Dann führt man die Reaktion unter mäßigem Rühren während 23 Stunden bei 40°C durch. Nach Beendigung der Reaktion trennt man das immobilisierte Enzym durch Absaugen unter Verwen dung eines Glasfilters ab und wäscht mit 50 ml Äthyl acetat.

Man vermischt das Filtrat und die Waschflüssigkeit, wäscht zweimal mit 20 ml 1n Chlorwasserstoffsäure und einmal mit 20 ml Wasser. Man trocknet die in dieser Weise erhaltene Äthylacetatschicht mit trockenem Na triumsulfat und engt ein. Dann gibt man n-Hexan zu, bis die Flüssigkeit weiß und trüb wird. Dann läßt man die Äthylacetatschicht über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Man isoliert die gebildeten Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethyl esters durch Filtration und kristallisiert die Ver bindung aus einer Äthylacetat/n-Hexan-Mischung als Lösungsmittel um. Man erhält die Verbindung mit einer Ausbeute von 3,71 g (72,3%). Die physikali schen Kenndaten des in dieser Weise erhaltenen N-Benzyl oxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesters sind nachstehend angegeben:

Schmelzpunkt: 118 bis 124°C
Drehwert [α: -14,6 (c=1, Methanol)

Elementaranalyse C₂₂H₂₄N₂O₇
Berechnet:
C 61,67; H 5,65; N 6,54%;
gefunden:
C 61,53; H 5,72; N 6,48%.

Man trennt zunächst einen aliquoten Anteil der Äthylace tatschicht ab und löst das Material nach dem Eindampfen bis zur Trockne in einer wäßrigen Natriumacetatlösung (0,8 Gew.-%). Die in dieser Weise erhaltene Lösung unter wirft man einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie analyse, wobei sich zeigt, daß die Ausbeute an dem N-Ben zyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester bei der Reaktion 84,7% beträgt.

Die für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie analyse eingesetzte Vorrichtung und die angewandten Bedingungen sind nachstehend angegeben:

Vorrichtung: Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatograph der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. (TSK HLC 802),
Säule: 300 mm Länge, 7,5 mm Innendurchmesser,
Füllung: Stärkegel mit einer Teilchengröße von 5 µm der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. (TSK GEL, LS-170, P5),
Elutionsmittel: Wäßrige Natriumacetatlösung (0,8 Gew.-%),
Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min,
Druckabfall: 20 kg/cm,
Detektor: UV 254 nm.

Wenn nicht anders angegeben, werden diese Vorrichtung und die angegebenen Bedingungen auch bei den folgenden Beispielen zur Untersuchung der Reaktionsprodukte und der Bestimmung ihrer Ausbeuten verwendet.

Beispiel 2

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Reaktion in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch mit dem Unterschied, daß man die Thermoase in einer Menge von 9,0 g, Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,45 g, die 0,05 m Natriumacetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Menge von 90 ml ver wendet; das Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial (Amberlite XAD-7) durch 16,6 g eines anderen Trägermate rials der gleichen Klasse ersetzt (Amberlite XAD-8, das etwa 150 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, enthält); 2,14 g (8 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 2,87 g (16 mMol) L-Phenylalaninmethylester anstelle des DL-Phenylalaninmethylesters verwendet; 26 ml der mit Wasser gesättigten Äthylacetatlösung einsetzt und die Reaktion während 5 Stunden durchführt. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethyl ester in einer Ausbeute von 79,8%.

Die Enzymmenge, die auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobili sierten Enzym vorliegt, beträgt etwa 6 g. Der Wasserge halt dieses immobilisierten Enzyms ist annähernd der gleiche wie der anfängliche Wassergehalt des Trägermate rials.

Beispiel 3 (Vergleich)

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise mit den folgenden Unterschieden durch: Man verwendet anstelle der in Beispiel 2 eingesetzten Äthylacetatlösung 50 ml mit Wasser gesättigten Methyl isobutylketons; arbeitet bei einer Reaktionszeit von 3 Stunden; und bewirkt das Waschen des immobilisierten Enzyms nach Beendigung der Reaktion mit Methylisobutyl keton. Man erhält N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 41,0%.

Die Menge, in der das Enzym auf dem gemäß diesem Bei spiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegt, und der Wassergehalt des immobilisier ten Enzyms entsprechen im wesentlichen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 2.

Beispiel 4

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 2 beschriebenen Weise unter Einhaltung der folgenden Unterschiede durch: Man verwendet die Thermoase bzw. das Calciumacetat-mono hydrat in einer Menge von 7,0 g bzw. 0,35 g; anstelle der N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure verwendet man 3,56 g (12 mMol) N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L- asparaginsäure; und man ersetzt den DL-Phenylalaninmethyl ester durch 4,30 g (24 mMol) L-Phenylalaninmethylester; man benützt 39 ml der mit Wasser gesättigten Äthylace tatlösung und hält die Reaktionstemperatur bei 25°C. Nach Beendigung der Reaktion trennt man das immobili sierte Enzym durch Absaugen unter Verwendung eines Glas filters ab und wäscht das immobilisierte Enzym mit 50 ml Äthylacetat. Man behandelt das Filtrat und die Waschflüssigkeit nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise und erhält bei der Isolierung des N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin methylesters 3,93 g Kristalle (Ausbeute=71,5%).

Die Menge des auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms vorliegenden Enzyms und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entsprechen den Werten des immo bilisierten Enzyms von Beispiel 2.

Die physikalischen Kenndaten des in dieser Weise erhal tenen N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenyl alaninmethylesters sind nachstehend angegeben:

Schmelzpunkt: 125 bis 129°C
Drehwert [α: -11,5 (c=1, Methanol)

Elementaranalyse C₂₃H₂₆N₂O₈
Berechnet:
C 60,25; H 5,72; N 6,11%;
gefunden:
C 60,43; H 5,80; N 5,90%.

Man bestimmt die Ausbeute der Bildung des N-p-Methoxy benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesters durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie nach der Verfahrensweise von Beispiel 1. Bei dieser Messung ergibt sich eine Ausbeute von 81,3%.

Beispiel 5

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der Verfahrensweise von Beispiel 4 mit den folgenden Unterschieden durch: Man ersetzt die in Beispiel 4 verwendete Natriumacetatpufferlösung durch 70 ml destilliertes Wasser; man ersetzt die N-p-Methoxy benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure durch 3,21 g (12 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure; verwendet 2,15 g (12 mMol) L-Phenylalaninmethylester; und arbeitet während einer Reaktionszeit von 24 Stunden. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethyl ester in einer Ausbeute von 74,8%.

Die Menge, in der das Enzym auf dem gemäß diesem Bei spiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegt, und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entsprechen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 2.

Beispiel 6

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise mit den folgenden Unterschieden durch: Man ersetzt das Äthylacetat durch eine mit Wasser ge sättigte Isopropylacetatlösung; arbeitet bei einer Re aktionsdauer von 21,5 Stunden; und verwendet als Wasch flüssigkeit für das Waschen des immobilisierten Enzyms nach Beendigung der Reaktion Isopropylacetat. Man er hält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin methylester in einer Ausbeute von 82,0%.

Die Menge des auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms vorliegenden Enzyms und der Wassergehalt des immo bilisierten Enzyms entsprechen den Werten des immobili sierten Enzyms von Beispiel 1.

Beispiel 7 (Vergleich)

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise mit den folgenden Unterschieden durch: Man setzt die Thermoase in einer Menge von 2 g und Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,1 g ein; man ersetzt die Natriumacetatpufferlösung durch 20 ml einer 0,05 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0; man ersetzt das Acryl säureester-Matrix-Trägermaterial durch 3 g trockene, poröse Glaskügelchen mit einem Porendurchmesser von 50 nm (500 Å) (CPG-10 der Firma Electro-Nucleonix Company) und bewirkt die Herstellung des immobilisierten Enzyms bei einer Reaktionsdauer von 1 Stunde. Man verwendet 0,08 g (0,3 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,109 g (0,61 mMol) L-Phenylalaninmethylester; er setzt das Äthylacetat durch 30 ml mit Wasser gesättig ten Chloroforms; arbeitet bei einer Reaktionsdauer von 21 Stunden und verwendet als Waschflüssigkeit für das Waschen des immobilisierten Enzyms nach Beendi gung der Reaktion Chloroform. Man erhält den N-Benzyl oxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 20,1%.

Die Enzymmenge, die auf dem immobilisierten Enzym vor liegt, beträgt etwa 0,7 g, während der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms etwa 150 Gew.-%, auf Trockenbasis, beträgt.

Beispiel 8

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit den folgenden Unterschieden durch: Man verwendet 1,0 g Thermoase und 0,05 g Calciumacetat monohydrat; ersetzt die Natriumacetatpufferlösung durch 10 ml einer 0,05 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0; ersetzt das Acrylsäureester- Matrix-Trägermaterial durch 3 g trockene poröse Glaskügel chen mit einem Porendurchmesser von 50 mm (500 Å) (CPG-10 der Firma Electro-Nucleonix Co.); arbeitet bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms bei einer Reaktionsdauer von 1 Stunde; verwendet 3,94 g (22 mMol) L-Phenylalaninmethyl ester und 43 ml der mit Wasser gesättigten Äthylacetat lösung; und bewirkt die Reaktion innerhalb von 65 Stun den. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 74,2%.

Die Menge des auf dem nach der Verfahrensweise dieses Beispiels hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms vorliegenden Enzyms und sein Wassergehalt ent sprechen den Werten des immobilisierten Enzyms von Beispiel 7.

Beispiel 9

Man führt die Reaktion nach der in Beispiel 8 beschrie benen Verfahrensweise mit dem Unterschied durch, daß man das nach der Verfahrensweise von Beispiel 8 nach Beendigung der Reaktion abgetrennte und zurückgewonnene immobilisierte Enzym für die Reaktion verwendet und die Reaktion während 93 Stunden durchführt. Man erhält den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethyl ester in einer Ausbeute von 88,0%.

Beispiel 10

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Durchführung der Reaktion nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise mit den folgenden Unter schieden durch:

Man verwendet die Thermoase in einer Menge von 4 g und Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,2 g; man setzt die 0,05 m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Menge von 40 ml ein; ersetzt das Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial durch 15 ml (11,7 g) eines feuchten hydrophilen Gels (Toyo pearl 5 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., das etwa 230 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, enthält und Carboxymethylgruppen aufweist); man bewirkt die Herstellung des immobilisierten Enzyms während 1 Stunde; ersetzt das L-Isomere der N-Benzyloxycarbonyl-asparagin säure durch die DL-Isomeren und arbeitet bei einer Re aktionsdauer von 22 Stunden. Man erhält den N-Benzyl oxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 41,0%.

Die auf dem gemäß diesem Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 0,9 g, während der Wassergehalt des immo bilisierten Enzyms annähernd dem anfänglichen Wasserge halt des Trägermaterials entspricht.

Beispiel 11

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise mit den folgenden Unterschieden durch: Anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Acrylsäureester- Matrix-Trägermaterials verwendet man 15 ml (11,7 g) eines feuchten hydrophilen Gels (Toyopearl 5 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), das etwa 230 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, und Diäthylaminoäthylgruppen aufweist; die Herstellungsdauer des immobilisierten Enzyms beträgt 5 Stunden; man ersetzt die L-Isomeren der N-Benzyloxycarbonylasparaginsäure und des Phenylalanin methylesters, die bei Beispiel 1 verwendet wurden, durch die entsprechenden DL-Isomeren; und führt die Umsetzung während 22,5 Stunden durch. Man erhält den N-Benzyloxy carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 25,5%.

Die auf dem gemäß dem vorliegenden Beispiel hergestell ten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 1,0 g, während der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms annähernd dem Wassergehalt des anfänglich eingesetzten Trägermaterials entspricht.

Beispiel 12

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Umsetzung nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit den folgenden Unterschieden durch: Man verwendet anstelle der in Beispiel 1 verwendeten 0,05 m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 25 ml einer 0,1 m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0; man ersetzt das in Beispiel 1 verwendete Acrylsäureester-Matrix-Trägermaterial durch 15 ml (11,7 g) eines feuchten hydrophilen Trägermaterials, das eine schwache Wechselwirkung mit dem Enzym zeigt (Toyopearl 5 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), das etwa 230 Gew.-% Wasser, auf Trockenbasis, enthält; und gibt bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms 0,6 g Kartoffel-Inhibitor zu. Man erhält den N-Benzyl oxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester in einer Ausbeute von 55,5%.

Die auf dem gemäß diesem Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 0,8 g, während der Wassergehalt dieses immo bilisierten Enzyms annähernd dem Wassergehalt des ursprüng lich eingesetzten Trägermaterials entspricht.

Beispiel 13

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit den folgen den Unterschieden durch: Man verwendet die Thermoase in einer Menge von 2,0 g und das Calciumacetat-monohydrat in einer Menge von 0,1 g; man ersetzt die Natriumacetat-Pufferlösung durch 20 ml destilliertes Wasser; man ersetzt das Acrylsäureester- Matrix-Trägermaterial durch 11,7 g eines feuchten hydro philen Gels (Toyopearl 5 der Firma Toyo Soda Manufactu ring Co., Ltd.) das etwa 230 Gew.-% Wasser auf Trocken basis enthält und Epoxidgruppen aufweist; und man ver setzt die Suspension mit einer wäßrigen Natriumhydroxid lösung, um ihren pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Die Menge und der Wassergehalt des immobilisierten Enzyms entspre chen den in Beispiel 12 verwendeten Mengen.

Weiterhin führt man die Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 durch, mit dem Unterschied, daß man 2,14 g (8 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 2,87 g (16 mMol) L-Phenylalaninmethylester einsetzt, 26 ml mit Wasser gesättigtes Äthylacetat verwendet und bei einer Reaktionszeit von 28,5 Stunden arbeitet. Mit Hilfe dieser Reaktionsweise erhält man den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspar tyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 82,9%.

Beispiel 14

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Durchführung der Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 unter Anwendung der folgenden Unterschiede durch:

Man ersetzt die Thermoase durch 0,45 g Thermolysin mit einem Titer von 8 080 PU/mg (ein Produkt der Daiwa Kasei K.K.); man ersetzt das Acrylsäureester-Matrix-Trägermate rial durch 15,6 g eines feuchten hydrophilen Gels (Toyopearl 7 der Firma Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) mit einem Wassergehalt von etwa 230 Gew.-%, auf Trocken basis. Man erhält N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenyl alaninmethylester in einer Ausbeute von 59,8%.

Die Menge des auf dem gemäß dem vorliegenden Beispiel hergestellten und verwendeten immobilisierten Enzyms des vorliegenden Enzyms beträgt etwa 0,15 g, während der Was sergehalt des immobilisierten Enzyms annähernd dem des eingesetzten Trägermaterials entspricht.

Beispiel 15

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Reaktion nach der in Beispiel 4 beschriebenen Ver fahrensweise mit den folgenden Unterschieden durch: Man ersetzt die in Beispiel 4 verwendete Natriumacetat- Pufferlösung durch 70 ml destilliertes Wasser; ersetzt die N-p-methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure durch 2,80 g (12 mMol) N-tert.-Butoxycarbonyl-L-asparaginsäure; und arbeitet bei einer Reaktionstemperatur von 40°C und einer Reaktionszeit von 23 Stunden. Das in dieser Weise her gestellte und verwendete immobilisierte Enzym besitzt den gleichen Enzymgehalt und den gleichen Wassergehalt wie das immobilisierte Enzym von Beispiel 4.

Man vermischt das Filtrat, aus dem das immobilisierte Enzym entfernt wurde mit der Waschflüssigkeit. Dann iso liert man nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 den N-tert.-Butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester, der in einer Ausbeute von 1,4 g (29,6%) erhalten wird.

Die physikalischen Kenndaten des erhaltenen N-tert.-Butoxy carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester sind nach stehend angegeben:

Schmelzpunkt: 149-150°C
Drehwert [α]: -15,3 (c=1, Methanol)

Elementaranalyse C₁₉H₂₆N₂O₇
Berechnete Werte:
C 57,85; H 6,65; N 7,10%;
Gefundene Werte:
C 58,03; H 6,56; N 7,05%.

Man entnimmt einen aliquoten Anteil der Äthylacetatschicht, löst das Material nach dem Trocknen in einer Natriumacetat lösung (0,8 Gew.-%) und unterwirft es der in Beispiel 1 beschriebenen Analyse. Es zeigt sich, daß man den N-tert.- Butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 62,6% erhält.

Beispiel 16 (Vergleich)

Man führt die Herstellung des immobilisierten Enzyms und die Durchführung der Reaktion nach der Verfahrensweise von Beispiel 7 mit dem Unterschied durch, daß man anstelle des Chloroforms als Lösungsmittel für die Peptidbindungen Bildungsreaktion Toluol verwendet. In diesem Beispiel er hält man den N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylala ninmethylester in einer Ausbeute von 10,5%.

Beispiel 17

Man bereitet das immobilisierte Enzym nach der Verfahrens weise von Beispiel 1, mit dem folgenden Unterschied: Man verwendet Thermoase in einer Menge von 21,0 g und Calziumacetat-monohydrat in einer Menge von 1,05 g; man ersetzt die Natriumacetat-Pufferlösung durch 210 ml destil liertes Wasser; man verwendet 100 g des Acrylsäureester- Matrix-Trägermaterials (Amberlite XAD-7, das 230% Wasser auf Trockenbasis enthält); und bewirkt das Rühren der das Trägermaterial enthaltenden Enzymlösung während 4 Stunden.

Die auf dem in dieser Weise gebildeten immobilisierten Enzym vorliegende Enzymmenge beträgt etwa 20 g. Der Was sergehalt des immobilisierten Enzyms entspricht annähernd dem anfänglichen Wassergehalt des Trägermaterials.

Man beschickt eine Glassäule des Strömungstyps mit einem Innendurchmesser von 24 mm und einer Höhe von 300 mm, die an ihrer Außenseite mit einem Wärmeisolationsmantel aus gerüstet ist, mit dem in dieser Weise erhaltenen immo bilisierten Enzym. Dann führt man 700 g einer mit Wasser gesättigten und bei 35°C gehaltenen Äthylacetatlösung, die 74 g L-Phenylalaninmethylester und 55 g N-Benzyloxy carbonyl-L-asparaginsäure enthält, mit einer Strömungs geschwindigkeit von etwa 0,3 ml pro Minute durch die Säule, währenddem man die Temperatur des Mantels für die Reaktion bei 40°C hält. 17 Stunden nach Beginn der Reaktion enthält der Abstrom der Säule N-Benzyloxycarbonyl- L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 54,3%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden durch Umsetzen einer N-substi tuierten Asparaginsäure mit einem Phenyalanin-C_1-4-alkylester in Gegenwart einer Metalloproteinase, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in ei nem mit Wasser gesättigten Carbonsäureester in Gegenwart einer Wasser enthal tenden, immobilisierten Metalloproteinase durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-sub stituierte Asparaginsäure eine mit einer Schutzgruppe des Urethan-Typs, bevor zugt mit einer Benzyloxycarbonylgruppe, einer p-Methoxybenzyloxycarbonyl gruppe oder einer tert.-Butoxycarbonylgruppe, substituierte Asparaginsäure ein setzt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Phenylalaninmethylester einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Metalloproteinase Thermolysin einsetzt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Metalloproteinase Thermoase einsetzt.