NL8001902A

NL8001902A - Werkwijze voor het bereiden van dipeptide.

Info

Publication number: NL8001902A
Application number: NL8001902A
Authority: NL
Original assignee: Sagami Chem Res; Ajinomoto Kk; Toyo Soda Mfg Co Ltd
Priority date: 1979-04-03
Filing date: 1980-04-01
Publication date: 1980-10-07
Also published as: CA1133841A; JPS55135595A; US4284721A; GB2049703B; DE3012693A1; JPS615399B2; IT8021154A0; FR2453137B1; IT1147338B; CH645341A5; DE3012693C2; GB2049703A; FR2453137A1; BE882603A

Description

-1- 21266/Vk/my * %

Aanvrager: Sagarai Chemical Research Center, Tokio, Japan Ajinomoto Co., Inc., , Tokio, Japan.

Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., Shin-nanyo-shi, Japan Korte aanduiding^: Werkwijze voor'hét bereiden van een .dipeptide.

5;

De uitvinding heeft -betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een dipeptide uit een N-gesubstitueerd ,asparaginezuur1 en een fenylalaline. lagere alkylester.

Enzymen zijn é’iwitachtige verbindingen die vitale reacties 10 katalyseren en als katalysator zeer actief zijn. In het algemeen echter zijn de enzymen niet alleen erg duur, maar ook onstabiel en daarom zijn ze slechts zeer beperkt toegepast bij reacties op industriële schaal.

Met het oog op de voortreffelijke katalytische werking van de enzymen is veel onderzoek gedaan naar de industriële toepassing hiervan, welke onder-15 zoekingen de laatste tijd steeds meer zijn geïntensiveerd. Als resultaat van deze onderzoekingen is het mogelijk geworden om de stabiliteit van de enzymen te verbeteren door ze te immobiliseren. Verder is het mogelijk geworden om ze meerdere keren te georuiken en toe te -passen op continue procédé*s waardoor het mogelijk is geworden om enzymen op industriële schaal 20 toe te passen. In een organisch oplosmiddel echter is de activiteit van de enzymen zeer laag. Bovendien worden ze gemakkelijk gedenatureerd en gedesactiveerd in een organisch oplosmiddel. Daarom is het gebruik van enzymen tot nu toe beperkt tot toepassing in een waterig medium . In verband hiermee is de toepassing van enzymen zeer beperkt.

25 Met betrekking -tot een enzymatische reactie in een or ganisch oplosmiddel is het bekend om een acetyl-L-tryptofaanethylester te bereiden uit acetyl-L-tryptofaan en ethylalkohol.

Verder is het reeds lang bekend om proteolytische enzymen te gebruiken om een peptide-bindingvormende reactie te bewerkstelligen in 30 een waterig medium. Er is echter geen publicatie bekend van een dergelijke reactie in een organsich oplosmiddel. In een eerder stadium is reeds een werkwijze voorgesteld waarbij een N-gesubstitueerd monoaminodicarbonzuur in reactie wordt gebracht met een aminocarbonzure ester in een waterig oplosmiddel in aanwezigheid van een proteoiytisch enzym. Vervolgens kon de 35 aldus verkregen dipeptide ester en de verkregen aminocarbonzure ester een additie-verbinding vormen en de additie-verbindingen werden afgescheiden . Deze werkwijze is beschreven in de Japanse octrooiaanvrage 92729/197¾

Ook is in het kader van deze onderzoekingen verdere studie verricht om O η Λ Λ Λ Λ Λ -2- 21266/Vk/rav dergelijke reacties uit te voeren en hierbij is gevonden dat een reactie waarbij een peptide binding wordt gevormd efficiënt kon worden uitgevoerd door een N-gesubstitueerd asparaginezuur en een fenylalaline lagere aikylester met elkaar in reactie te brengen in een organisch oplosmiddel 5 dat nagenoeg niet mengbaar was met water in aanwezigheid van een geïmmobiliseerd metaalhoudend proteinase dat water bevat. De werkwijze volgens de uitvinding is gebaseerd op. het resultaat van deze onderzoekingen en de werkwijze voor het bereiden van een dipeptide uit een N-gesubstitueerd asparaginezuur en een fenylalaline lagere aikylester wordt dan ook 10 hierdoor gekenmerkt dat het N-gesubstitueerd asparaginezuur ' en de lagere aikylester van fenylalaline met elkaar in reactie worden gebracht in een organisch oplsmiddel dat nagenoeg niet mengbaar is met water in aanwezigheid van een waterbevattend geïmmobiliseerd metaalhoudend proteinase.

Zodoende wordt een verbetering verkregen voor een werkwijze 15 voor het bereiden van dipeptiden uit een N-gesubstitueerd asparaginezuur en een fenylalaline lagere aikylester. De twee uitgangsstoffen worden met elkaar in reactie gebracht in aanwezigheid van een geïmmobiliseerd metaalhoudend proteinase (matallo-protelnase) in een organisch oplosmiddel dat (nagenoeg) niet mengbaar is met water. Het enzym kan uit het reactie-20 mengsel worden gewonnen en opnieuw worden toegepast. Het verlies aan stoffen door hydrolyse van de fenylaniline lagere aikylester wordt verminderd, zodat het gebruik van de fenylalaline lagere aikylester in een nagenoeg stoechiometrische hoeveelheid voldoende is om de reactie te bewerkstelligen waarbij een verbeterde opbrengst wordt verkregen en een ver-25 laging van de kosten wanneer het procédé op industriële schaal wordt toegepast.

Een van de doelstellingen volgens de» uitvinding is het verkrijgen van een werkwijze voor het bereiden van een dipeptide waarbij een N-gesubstitueerd asparaginezuur *· en fenylalanine lagere aikylester 30 in reactie met elkaar worden gebracht in een organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water in aanwezigheid van een waterbevattend geïmmobiliseerd metaalhoudend proteinase ter bereiding van een dipeptide ester.

Een andere doelstelling volgens de uitvinding is het verkrijgen van een werkwijze voor het bereiden van een dipeptide waarbij een 35 N-gesubstitueerd asparaginezuur en een fenylalaline lagere aikylester in contact worden gebracht met een waterbevattend geïmmobiliseerd metalloproteinase in een organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water om beide .componenten aan elkaar te koppelen ter bereiding van het dipep-r 80 0 1 9 02 -3- 21266/Vtc/mv i 4 tide.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt de N-gesub-stitueerde groep van het N-gesubstitueerd asparaginezuur beschouwd als een beschermende groep voor de aminogroepen die gewoonlijk wordt gebruikt voor de peptidesynthese. Voorbeelden van de bij voorkeur toegepaste . 5 beschermende groepen zijn urethantype beschermende groepen zoals benzyl-oxyca^bonylgroep, p-methoxybenzyloxycarbonylgroep, t-butoxycarbonylgroep en dergelijke. De lagere alkylgroep van de fenylanaline lagere alkylester die toegepast wordt als ander uitgangsmateriaal is een alkylgroep met 1-4 koolstof atomen ai met name kan een methylgroep en een ethylgroep 10 worden genoemd als de bij voorkeur toe te passen groep. Verder kunnen beide stoffen gebruikt worden in een L of DL-configuratie Wanneer DL-isomeren worden toegepast is het alleeen de L-isomeer die deelneemt aan de reactie, terwijl de D-isomeer onveranderd in de oplossing achterblijft.

15 Het enzym dat toegepast wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding in de vorm van een geïmmobiliseerd enzym is een proteoly-tisch enzym met een metaalion bij het actieve centrum hiervan of met andere woorden een metallo-proteïnase. Voorbeelden van de enzymen zijn de .enzymen die verkregen worden uit micro-organismen zoals neutraal protease, 20 verkregen uit actinomyceten, prolysine, thermolysine, collagenase, cro-tulus atrox protease en dergelijke. Een ruw enzym zoals thermoase is ook geschikt om toegepast te worden bij de werkwijze volgens de uitvinding.

Bij het gebruik van dergelijke ruwe enzymen kan een aardappel*-remstof of een dergelijke inhibitor worden toegepast om de werking van het verontrei-25 nigende esterase of dergelijke te remmen. Volgens de werkwijze volgens de uitvinding echter verdient het de voorkeur om thermolysine of thermoase toe te passen.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding worden deze enzymen gebruikt in een geïmmobiliseerde vorm, waarbij de enzymen die verkregen 30 worden via een gewone immobilisatiemethode kunnen worden toegepast. Dergelijke immobilisatiebewerkingen omvatten een fysische adsorptiemethode, een ionische bindmethode, een covalente bindmethode, een insluitingsme-thode en een verknopingsmethode. De immobilisatiebewerking is echter niet beperkt tot deze werkwijze, maar de enzymen worden meestal overgebracht 35 op een poreuze drager die een zeer zwakke interactie heeft met de toegepaste enzymen.

De uitdrukking "geïmmobiliseerd enzym" heeft betrekking op onn 1 o n? 21266/Vk/mv een complex dat het enzym omvat en een drager.

De hoeveelheid enzym die aangerbacht wordt op een drager kan niet noodzakelijkerwijs worden bepaald op een eenvoudige drager omdat de enzymdragende mogelijkheid van de drager afhankelijk is van de 5 intensitiet van de interactie tussen de drager en het enzym. De hoeveelheid kan echter variëren van t 1 tot 2000 mg en gewoonlijk van 50 tot ongeveer 1000 mg per g drager berekend op droge basis. De bovenvermelde hoeveelheden moeten echter niet als beperkend worden beschouwd en met name de bovengrenzen moeten niet als beperkend worden opgevat, omdat een 10 drager die de enzymen kan bevatten in een hoeveelheid die hoger ligt dan de bovenvermelde hoeveelheden de voorkeur kan verdienen, wanneer een dergelijke drager beschikbaar is, omdat hierdoor een mogelijkheid verkregen wordt om het verbruik aan dragermateriaal te beperken. Omdat het enzym van het ge immobiliseerde enzym dat toegepast wordt volgens 15 de werkwijze van de uitvinding een zeer lage activiteit bewerkstelligt in een droog organisch oplosmiddel en niet stabiel is, is het noodzakelijk om de inwendige poriën van het geïmmobiliseerde enzym te vullen met water wanneer het ; gebruikt wordt in een organisch oplosmiddel. Het water dat aanwezig is in de poriën moet een pH-waarde hebben zodat het 20 voor het metallo-proteïnase mogelijk is om de activiteit hiervan uit te dragen. Omdat de optimale pH-waarde van het metallo-proteïnase gelegen is in het neutrale gebied, kan het water een buffer bevatten waarmee een gewenste pH-waarde tussen 5 en 9 kan worden gehandhaafd.

Hoewel er geen bepaalde beperking is met betrekking 25 tot het watergehalte van het geïmmobiliseerde enzym is het watergehalte gewoonlijk gelegen tussen 1 en ongeveer 500% berekend op het gewicht, bij voorkeur tussen 10 en ongeveer 200gew.%, gebaseerd op de drager op droge basis. Verder is het ook mogelijk om water te gebruiken dat op natuurlijk wijze ingesloten is in de drager wanneer het enzym aanwezig 30 is op de drager in een waterige oplossing ter bereiding van de geïmmobiliseerde enzympreparaten.

Het oplosmiddel dat toegepast wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding is een organisch oplosmiddel dat (nagenoeg) niet mengbaar is met water . Het gebruik van een organisch oplosmiddel dat meng-35 baar is met water is niet gewenst, behalve om als additief te gebruiken voor een organisch oplosmiddel dat niet mangbaar is met water zoals hieronder nader z».l worden toegelicht, omdat wanneer het toegepast wordt, het water in de poriën van het geïmmobiliseerd enzym wordt gehouden en dan 800 1 802 t 9 -5- 21266/Vk/mv oplost in het organisch oplosmiddel en zodoende vervangen zou worden, hetgeen de reactie nadelig beïnvloedt,zelfs wanneer een organisch oplos» middel dat gebruikt wordt dat niet mengbaar is met water verdient het de voorkeur om het met water te verzadigen om er zeker van te zijn dat 5 het niet oplost en het -water verdrijft uit de poriën. In deze samenhang betekent het organisch oplosmiddel- dat niet mengbaar is met water dat toegepast wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding, een organisch oplosmiddel of een homogeen mengsel van het organisch oplosmiddel en water dat zeer weinig water oplost wanneer het in contact wordt gebracht met een kleine hoeveelheid water. Daarom geldt dat zolang de omstandigheden niet worden verstoord het mogelijk is om een organisch oplosmiddel toe te voegen dat mengbaar is met water aan het organisch oplosmiddel dat niet mangbaar is met water.

Verder is het bij de werkwijze volgens de uitvinding 15 noodzakelijk dat het organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water de mogelijkheid heeft on : de uitgangsstoffen en het reactieproduct hierin te doen oplossen. Voorbeelden van bij voorkeur toe te passen organische oplosmiddelen zijn een lager alkylhalide zoals chloroform, methyleendichloride, een ester van een carbonzuur zoals ethylacetaat, .20 isopropylacetaat, een keton zoals methylisobutylketon, een aromatische koolwaterstof zoals benzeen, tolueen en een mengsel hiervan. Zoals boven vermeld geldt dat zolang de omstandigheid gehandhaafd wordt dat het oplosmiddel niet mengbaar is met water een oplosmiddel zoals ethanol dat mengbaar is met water aan deze.oplosmiddelen kan worden toegevoegd.

25 . Het verdient de voorkeur om een hoge concentratie te bewerk stelligen van de uitgangsstoffen die toegepast worden bij de werkwijze volgens de uitvinding , omdat hoe hoger de concentratie is hoe hoger de reactiesnelheid zal zijn. Elk van de uitgangsstoffen wordt gewoonlijk gebruikt in een concentratie binnen de oplosbaarheid hiervan in het oplos-30 middel. Omdat de stoffen echter worden verbruikt als de reactie wordt bewerkstelligd, is het mogelijk om een deel van de uitgangsstoffen aanwezig te doen zijn in gesuspendeerde toestand in het oplosmiddel. Het is daarom aan _te bevelen om elke stof aanwezig te doen zijn in een concentratie die gelegen is tussen 0,001 M tot ongeveer 2 M in het alge-’ ^5 meen tussen ongeveer 0,01 M en ongeveer 0,5 M.

De hoeveelheid N-gesubstitueerd asparaginezuur en de hoeveelheid lagere alkylester van fenylanaline die toegepast wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding kan gewoonlijk aanwezig zijn in een onn 1 o Π9 -6- 21266/Vk/mv stoechiometrische verhouding van 1:1 in raolaire verhoudingen , wanneer beide substraten de L-configuratie hebben. In de praktijk kunnen deze stoffen toegepast worden in een verhouding die variëert van 10:1 tot 1:10 en bij voorkeur gelegen is tussen 3:1 en 1:5. Wanneer de stoffen 5 aanwezig zijn in de DL-configuratie kunnen ze toegepast worden in hoeveelheden die resulteren in een verhouding van de L-isomeren, afgeleid van de bovenvermelde verhouding.

Er -is geen bepaalde beperking ten opzichte van de hoeveelheid waterbevattend geïmmobiliseerd enzym dat toegepast wordt volgens 10 een werkwijze volgens de uitvinding. Een hogere concentratie hiervan maakt het mogelijk om de reactie binnen een kortere tijdsduur te beëindigen, terwijl een lagere concentratie hiervan een langere reactietijd noodzakelijk maakt. De hoeveelheid hiervan die toegepast moet worden is afhankelijk van de hoeveelheid van het enzym aangebracht op de drager 15 en de activiteit hiervan. Wanneer bijvoorbeeld een geïmmobiliseerd enzym bereid wordt uit het enzym en een drager die geen bepaalde interactie heeft met het enzym terwijl anderzijds een geïmmobiliseerd enzym wordt bereid uit een enzym en een drager die het enzym sterk adsorbeert zoals een matrix van een acrylzure ester, zal deze laatste een , grotere 20 hoeveelheid enzym bevatten dan de eerst vermelde combinatie. Daarom kan de laatst ‘‘genoemde combinatie een vergelijkbare invloed hebben wanneer deze in kleinere hoeveelheid wordt gebruikt dan de eerst genoemde combinatie. In het algemeen echter wordt voor een millimol uitgangsmateriaal 0,01 g tot ongeveer 20 g en bij voorkeur 0,1 tot ongeveer 5 g ge» 25 bruikt van het waterhoudende geïmmobiliseerde enzym.

De werkwijze volgens de uitvinding kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door het waterhoudende geïmmobiliseerde enzym te suspenderen in een organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water dat de beide uitgangsstoffen hierin bevat en vervolgens de reactie te laten plaats 30 hebben onder roeren. Na beëindiging van de reactie wordt het geïmmobiliseerde enzym en het reactiemengsel in de oplosssing ’dat het reactieproduct bevat Afgescheiden door het reactiemengsel te onderwerpen aan een filtratie en dergelijke.

De werkwijze volgens de uitvinding kan ook worden uitge-35 voerd met behulp van een kolom die gevuld in met het waterhoudende geïmmöbiliseerde enzym door het organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water en de twee uitgangsstoffen hierin bevat te leiden over de vulling van de kolom. Deze werkwijze maakt het mogelijk dat de reac- 800 1 9 02 *· * -7- 21266/Vk/mv tie continu wordt uitgevoerd en kan vooral met voordeel worden toegepast op industrieel gebied.

De reactietemperatuur ligt gewoonlijk tussen 10 °C en ongeveer 80 °C en bij voorkeur tussen 20 °C en ongeveer 50 °C.

5 De reactietijd is afhankelijk van de concentratie van de twee substraten, de hoeveelheid geïmmobiliseerd enzym, de hoeveelheid enzym die aangebracht is op de drager en op de van te voren bepaalde omzettingsgraad en dergelijke. Gewoonlijk wordt de reactietijd echter gehouden op ongeveer 0,5 tot ongeveer 200 urenjbij voorkeur is de reac-10 tietijd gelegen ïtussen 2 en 100 uren, hetgeen voldoende is.

Het reactieproduct de N-gesubstitueerde L-aspartyl-L-fenylalaline lagere alkylester kan worden afgescheiden door conventionele bewerkingen zoals indampen of kristallisatie, extractie en dergelijke uit het reactiemengsel dat afgescheiden wordt van het gexmmobliliseerde 15 enzym door een hiervoor geschikte werkwijze na de reactie die uitgevoerd wordt volgens de werkwijze volgens de uitvinding . Verder geldt dat wanneer het geïmmobiliseerde enzym is afgescheiden uit het reactiemengsel, de suspensie nog een voldoende activiteit heeft om opnieuw te worden toegepast.

20 De dipeptiden die verkregen worden volgens de werkwijze volgens de uitvinding zijn geschikte materialen, bijvoorbeeld het dipeptide met een methylgroep als lagere alkylgroep, uit welk dipeptide een zoetmaker kan worden verkregen en asparatyl-L-fenylalalinemethyles-ter met een 200 keer hogere zoetheid in vergelijking met sucrose, 25 welke stof kan worden verkregen door verwijdering van de. N-sUbstituent door een hiervoor geschikt procédé toe te passen.

Zoals duidelijk zal zijn uit het hierboven vermelde kan een peptidebindingsreactie worden bewerkstelligd in een organischOplosmiddel door het toepassen van de werkwijze volgens de uitvinding waardoor het terugwinnen en opnieuw gebruiken van het enzym zonder problemen kan worden bewerkstelligd. Omdat verder de hydrolyse van de fenyl-alaline lagere alkylester wordt onderdrukt bij de reactie die uitgevoerd wordt im een organisch oplosmiddel is er een lagere mate van verlies aan uitgangsstoffen in vergelijking met de werkwijzen die uitgevoerd 25 wordt in een waterig medium. Bovendien geldt dat wanneer beide uitgangsstoffen in de L-configuratie aanwezig zijn de stoechiometrische verhouding van het N-gesubstitueerde asparaginezuur tot de fenylaïanine lagere alkylester gelegen is bij 1:2 aangegeven als de molaire verhouding, o λ η λ η Λ o . -8- 21266/Vk/mv wanneer de reactie in het waterige medium wordt uitgevoerd zoals beschreven in de Japanse octrooiaanvrage 92729/1978, terwijl de verhouding 1:1 molaire verhouding is bij de werkwijze volgens de uitvinding. Zodoende kan met de werkwijze volgens de uitvinding de fenylalinine lagere 5 alkylester in een lagere hoeveelheid worden toegepast. Dit is van groot voordeel wanneer de werkwijze op industriële schaal wordt uitgevoerd.

Verder geldt dat bij de werkwijze volgens de uitvinding wanneer de uitgangsstoffen in de DL-configuratie worden gebruikt een verrijking van de D-iscmeer of de D-isomeren kan worden bewerkstelligd 10 wanneer een van de beide stoffen of beide stoffen die als uitgangsmateriaal worden gebruikt in reactie worden gebracht ter bereiding van het dipep-tide.

De bovenvermelde en andere doelstellingen, verschijnselen en voordelen volgens de uitvinding zullen nader worden toegelicht aan de 15 hand van de hieronder vermelde* voorbeelden, die niet als beperkend moeten worden opgevat.

Voorbeeld I

Eerst werd 3,0 g 'Thermoase (zuiverheid: 1,6 10^ Pü/g) en 0,15 g calciumacetaatmonohydraat toegevoegd aan 25 ml 0,05 M natrium-20 acetaat bufferoplossing bij een pH van 7,5 en samen, gemengd.Een centrifugale sedimentatie werd uitgevoerd om de bovenstaande vloeistof en het onoplosbare materiaal van elkaar te scheiden. Aan de bovenstaande vloeistof die aldus was verkregen werd toegevoegd 30 ml (20 g) natte acrylzure ester-matrix-drager ("Amberlite XAD-7," merknaam, met ongeveer _230 gew.% 25 watergehalte op droge basis) en het verkregen mengsel werd gedurende 1 nacht geroerd ter verkrijging van een waterige suspensie-oplossing van een geïmmobiliseerd enzym. Het geïmmobiliseerde enzym dat water bevatte, werd afgescheiden door filtratie onder verlaagde druk onder toepassing van een glasfilter. De opgebrachte hoeveelheid enzym in het geïmmobili-30 seerde enzym werd bepaald en bleek 3 g te zijn van de oorspronkelijke hoeveelheid enzym en de enzymatische activiteit van het filtraat werd gemeten door het toepassen van een verteringsmethode. Het watergehalte in het geïmmobiliseerde enzym dat aldus was verkregen , was nagenoeg gelijk aan het watergehalte in de drager zoals in het begin is vermeld. Dezelfde 35 methode voor het bepalen van de opgebrachte hoeveelheid enzym werd toegepast in de andere voorbeelden die hierna zijn vermeld.

Het aldus verkregen geïmmobiliseerde enzym werd toegevoegd aan 37 ml ethylacetaat-oplossing eerst verzadigd met water, die 3,21 g 8001902 ί · ? -9- 21266/Vk/mv (12 mmol) N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur bevatte en 4,14 g (23 mmol) L-fenylalalinemethylester. Vervolgens werd een reactie uitgevoerd onder zacht roeren gedurende 23 uren bij een temperatuur van 40 °C. Na het beëindigen van de reactie werd het geïmmobiliseerde enzym afgescheiden 5 door een filtratie onder verlaagde druk onder toepassing van een glasfilter en gewassen met 50 ml ethylacetaat.

Het filtraat en het waswater werden samen gemengd en gewassen met 20 ml 1-N zoutzuur, welke wassing twee keren werd uitgevoerd en een keer gewassen met 20 ml water. De aldus verkregen ethylacetaat-laag 10 werd gedroogd over natriumsulfaatanhydride en ingedampt. Hieraan werd n-hexaan toegevoegd zodat de vloeistof een witte troebele toestand aangaf. Vervolgens werd de ethylacetaat-laag gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Hieruit werden kristallen van N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenyl-alaninemethyles ter verkregen en afgescheiden door filtratie en 15 vervolgens herkristalliseerd in een ethylacetaat-ri-hexaanmengsel als oplosmiddel. De opbrengst bedroeg 3,71 g , hetgeen overeenkomt met 72,3%.

De karakteristieke eigenschappen van de N-benzyloxycarbo-nyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester die aldus is verkregen , zijn hieronder vermeld:

20 Smeltpunt: 118-124 °C

: -14,6 (concentratie is 1, oplosmid del methanol),

De gegevens uit de elementaire ;analyse zijn voor de verbinding met formule C22H24^2^7: 25 C(%) H(%) N(%) berekend 61,67 5,65 6,54 gevonden 61,53 5,72 6,48 30

Van de ethylacetaat-laag werd eerst een monster genomen en na tot droog te zijn ingedampt,opgelost in een waterige oplossing van 0,8 gew.% natriumacetaat. De aldus verkregen oplossing werd onderworpen aan een vloeistofchromatografische analyse (high speed) ter bepaling van 25 de opbrengst, waaruit bleek dat 84,7% N-bezyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester was verkregen.

De meetapparatuur en de omstandigheden waarbij de vloeistof*-chromatografische analyse (high speed) werden uitgevoerd zijn: O Π fl Λ ΟΛΟ -10- 21266/Vk/rav apparatuur: een high speed-vloeistofchromatograaf vervaardigd door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., (TSK HLC 802, merkaandui-ding) kolom: 7,5 mm binnendiameter en 300 mm hoogte 5 vulling: zetmeelgel met een deeltjesgrootte van 5 yum, bereid door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., (TSK-gel, LS-170, P5, merkaanduiding) eluens:· een waterige oplossing van natriumacetaat, (0r8 gew.%) 10 stroomsnelheid : 0,8 ml/minuut 2 drukverlies: 20 kg/cm detector: UV 254 nm

Tenzij anders is aangegeven is de apparatuur en de omstandigheden zoals boven vermeld ook toegepast bij de hierna volgende 15 voorbeelden ter bevestiging van de reactieproducten en ter bepaling van de opbrengst.

Voorbeeld II

De bereiding van het geïmmobiliseerde enzym en de reactie werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I, 20 met uitzondering hiervan dat de hoeveelheid Thermoase en de hoeveelheid calciumacetaatmonohydraat respectievelijk waren 9,0 g en 0,45 g, de hoeveelheid 0,05 M natriumacetaat bufferoplossing met een pH van 7,5 was 90 ml, de acrylzure matrixdrager (Amberlite XAD-7, merkaanduiding) werd vervangen door 16,6 g van een andere drager van een vergelijkbaar 25 product (Amberlite XAD-8, merkaanduiding, met ongeveer 150 gew.% water berekend op droge basis, de hoeveelheid N-benzyloxycarbonyl-L-asparagine-zuur was 2,14 g (8 mmol) en L-fenylalaninemethylester werd vervangen door 2,87 g (16 mmol) DL-fenylanalinemethylester-. De hoeveelheid van de in water verzadigde ethylacetaatoplossing werd gesteld op 26 ml en de reactie 30 duur was 5 uren. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspar.tyl-L-fenyl-alaninemethylester verkregen met een opbrengst van · 79,8 %.

De enzymhoeveelheid die aangebracht werd op het gexmmobili-eerde enzym, bereid en toegepast in dit voorbeeld was ongeveer 6 g. Het watergehalte hiervan was nagenoeg hetzelfde als het watergehalte in de 35 drager bij het begin van de bewerking.

Voorbeeld III

De bereiding van het geïmmobiliseerde enzym en de reactie werden uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II, 8001902 -11- 21266/Vk/mv met uitzondering hiervan dat in plaats van de ethylacetaatoplossing die toegepast werd in voorbeeld II 50 ml met water verzadigde methylisobutyl-keton werd gerbuikt. De reactietijd bedroeg 3 uren en het wassen van het geïmmobiliseerde enzym na beëindigen van de reactie werd uitgevoerd met 5 methylisobutylketon. N-benzyloxycarbaiyl -L-aspartyl-E.-fenylalaninemethyl-ester werd verkregen met een opbrengst van 41,0 %.

De hoeveelheid enzym op het geïmmobiliseerde enzym , bereid en toegepast in dit voorbeeld en het watergehalte van het geïmmobiliseerde enzym waren nagenoeg gelijk aan de hoeveelheden die vermeld zijn in voor-10 beeld II.

Voorbeeld IV.

De bereiding van geïmmobiliseerd enzym en de reactie werden uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld II, met uitzondering hiervan dat de hoeveelheid thermoase en de hoeveelheid caleium-15 acetaatmonohydraat respectievelijk 7,0 «g ai 0,35 g waren. In plaats van N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur werd 3,56 g (12 mmol) N-p-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur gebruikt terwijl DL-fenylaianinemethyl-ester werd vervangen door 4,30 (24 mmol) L-fenylalininemethylester. De hoeveelheid met water verzadigde ethylacetaatoplossing was 39 ml en de 20 reactietemperatuur 25 °C Na beëindigen van de reactie werd geïmmobiliseerd enzym afgescheiden door filtratie onder verlaagde druk onder toepassing van een glasfilter en vervolgens werd het geïmmobiliseerde enzym gewassen met 50 ml ethylacetaat. Het filtraat en de wasvloeistof werden op dezelfde wijze behandeld als aangegeven is in voorbeeld I en 25 N-p-methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester werd afgescheiden ter verkrijging van 3,93 g kristallen, hetgeen overeenkomt met een opbrengst van 71,5%.

De hoeveelheid enzym in het geïmnobiliseerde enzym, bereid en toegepast zoals aangegeven in dit voorbeeld en het watergehalte hier-30 van waren ongeveer gelijk aan de waarden vermeld in voorbeeld II. De karak·* taristieken van de N-p-methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanine-methylester aldus verkregen zijn hieronder vermeld.

Smeltpunt: 125-129 °C

25: .-11,5 (C=1, methanol) 35 De gegevens met betrekking tot de elementair analyse voor de verbinding met formule 023H26H 20q zijn: 800 1 9 02 -12- 21266/Vk/mv C(%) H(%) N(%) berekend ' 60,25 5,72 6,11 gevonden 60,43 5,80 5,90 5 De opbrengst aan N-p-raethoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanine-methylester werd gemeten met· behulp van vloeistofchromatografie (high speed) op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I. Uit deze meting bleek dat de opbrangst 81,3 %- brdroeg.

Voorbeeld V

10 De bereiding van geïmmobiliseerd enzym en de reactie werden bewerkstelligd op dezelfde wijze /als aangegeven is in voorbeeld IV met uitzondering hiervan dat de natriumacetaatbuffer-oplossing gebruikt in voorbeeld IV werd vervangen door 70 ml gedestilleerd water. N-p-methoxy» benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur werd vervangen door 3,21 g (12 mmol) 15 N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en de hoeveelheid L-fenylanaline-methylester werd veranderd in 2,15 g (12 mmol) en de reactietijd bedroeg 24 uren. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylanalinemethyl-ester verkregen met een opbrengst van 74,8 %.

De hoeveelheid enzym in het geïmmobiliseerde enzym , bereid 20 en toegepast in dit voorbeeld en het watergehalte hiervan waren ongeveer gelijk aan de gegevens zoals vermeld in voorbeeld II.

Voorbeeld VI

De bereiding van geïmmobiliseerd enzym en de reactie hiermee werden op dezelfde“wijze uitgevöerd als aangegevén is in voorbeeld I, met uit-25 zondering hiervan dat ethylacetaat werd vervangen door een met water verzadigde isopropylacetaatoplossing. De reactietijd werd veranderd tot 21,5 uren en de wasvloeistof gebruikt voor het wassen van het geïmmobiliseerde enzym na het beëindigen van de reactie was isopropylacetaat. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalSninemethylester ver-30 kregen met een opbrengst van 82,0%.

De hoeveelheid enzym in het gelnmobiliseerde enzym, de bereiding hiervan v.erL.de toepassing in dit voorbeeld ai het watergehalte waren ongeveer gelijk aan die in voorbeeld I.

Voorbeeld VII

35 Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid en de reactie hiermee werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I, met uitzondering hiervan dat de hoeveelheid Thermoase en calciumacetaat-monohydraat werden veranderd in respectievelijk 2 g en 0,1 g. De natrium- 800 1 9 02 -13- 21266/Vk/mv acetaat-buff eroplossing werd vervangen door 20 ml 0,05 M tris-zout-zure bufferoplossing met een pH van 8,0. De acrylzure ester-matrir-dra-ger werd vervangen door 3 g droge poreuze glaskorrels met een poriën-diameter van 500 A, bereid door Electro-Nucleonix Company "CPG-10”. De 5 tijdsduur van de bereiding van het geïmmobiliseerde enzym werd gewijzigd in 1 uur. De hoeveelheid N*-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalaninemethylester werden gewijzigd in .0,08 g ( 0,3 mmol) en respectievelijk 0,109 g (0,61 mmol). Het ethylacetaat werd vervangen door 30 ml met water verzadigde chloroform, de reactietijd werd inge-steld op 21 uren en de wasvloeistof die gebruikt werd voor het wassen van het geïmmobiliseerde enzym na het beëindigen van de reactie werd gewijzigd in chloroform. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-as-partyl-L-fenylaianinemethylester verkregen met een opbrengst van 20,1 %* 15 De hoeveelheid enzym in het geïmmobiliseerde enzym was on geveer 0,7 g en het watergehalte ongeveer 150 gew.% berekend op "droge basis.

Voorbeeld VIII

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid en de reactie 20 hiermee werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I met uitzondering hiervan , dat de hoeveelheden Thermoase en calcium- acetaatmonohydraat respectievelijk 1,0 g en'0,'05 g waren. De natrium- acetaat-bufferoplossing werd vervangen door 10 ml bufferoplossing van 0,05 M triszoutzuur met een pH van 8,0, de acrylzure ester matrix 25 als drager werd vervangen door 3 g droge poreuze glaskorrels met een 0 poriëndiameter van 500 A, bereid door Electro Nuclecnix Co., , "CPG-10" , en de tijdsduur voor de bereiding van het geïmmobiliseerde enzym werd gewijzigd in 1 uur. De hoeveelheid L-fenylalaninemethylester was 3,94 g ( 22 mmol) en de met water verzadigde ethylacetaatoplossing was 43 ml 2° en de reactieduur bedroeg 65 uren. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester verkregen met een opbrengst van 74,2 %.

De hoeveelheid enzym in het geïmmobiliseerde enzym en de bereiding hiervan en toepassing evenals het watergehalte waren ongeveer 35 gelijk aan die in voorbeeld VII.

Voorbeeld IX

De reactie werd op dezelfde wijze uitgevoerd als aangegeven in voorbeeld VIII, met uitzondering hiervan dat het geïmmobiliseerde fl Π Λ A no -14- 21266/Vk/mv enzym werd afgescheiden en teruggewonnen na beëindiging van de reactie uitgevoerd in voorbeeld VIII en opnieuw werd gebruikt. De reactie werd bewerkstelligd gedurende 93 uren * De opbrengst aan N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester bedroeg 88,0 %.

5 Voorbeeld X

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid en de reactie hiermee uitgévoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I met uit -zondering hiervan dat de hoeveelheden Thermoase en calciumacetaatmono- -hydraat respectievelijk 4 g en 0,2 g waren. De hoeveelheid bufferoplos-10 sing van 0,05 M natriumacetaat met een pH van 7,5 was 40 ml. De acryl-zure ester-matrix drager werd vervangen door 15 ml (11,7 g) nat hydrofiel gel (Toyopearl 5, merknaam, . bereid door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., met ongeveer 230 gew.% water berekend op droge basis), met carboxy·» raethylgroepen. De tijdsduur voor de bereiding aan het geïmmobiliseerde 15 enzym was 1 uur .Het L-isomeer van N-benzyloxycarbonylasparaginezuur werd vervangen door DL-isomeren hiervan en de.reactietijd ingesteld op 22 uren. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester verkregen met een opbrengst van 41,0%.

De enzymhoeveelheid in het geïmmobiliseerde enzyn, bereid 20 en toegepast in dit voorbeeld was ongeveer 0,9 g en het watergehalte hiervan was nagenoeg gelijk aan de. hoeveelheid water die in het begin' in de drager aanwezig was.

Voorbeeld XI

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid en . de reactie 25 hiermee uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I met uitzondering hiervan dat in plaats van de acrylzure ester matrix, toegepast in voorbeeld I 15 ml (11,7 g) nat hydrofiel gel (Toypearl 5, merknaam > bereid door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., werd gebruikt met ongeveer 230 gew.% water berekend op droge basis) met een diethyΙ-ΒΟ aminoethylgroep. De tijdsduur voor de breiding van het geïmmobiliseerde enzym was 5 uren . De L-isomeren van N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en de fenylalaninemethylester» beide toegepast in voorbeeld I, werden vervangen door de DL-isomeren hiervan. De reactietijd bedroeg 22,5 uren. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester 35 verkregen met een opbrengst van 25,5%.

De ..hoeveelheid enzym in het geïmmobiliseerde enzym , bereid en toegepast in dit voorbeeld,was ongeveer 1,0 g terwijl het watergehalte hiervan nagenoeg gelijk was aan het watergehalte van de drager 8001902 “15- 21266/Vk/mv zoals in het begin toegepast..

Voorbeeld XII

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid en de reactie hiermee werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld 5 I, met uitzondering hiervan dat in plaats van de bufferoplossing 0,05 M natriumacetaat met een pH van-7»5, toegepast in voorbeeld I, werd gebruikt 25 ml van een bufferoplossing van 0,1 M natriumacetaat en een pH van 6,0. De acrylzure ester-rmatrix drager, toegepast in voorbeeld I werd vervangen door 15 ml (11,7 g) natte hydrofiele drager die een zeer 10 zwakke interactie vertoonde met het enzym ( Toyopearl 5, merknaam, bereid door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., met ongeveer 230 gew.% water berekend op droge basis) en bij de bereiding van het geïmmobiliseerde enzym werd 0,6 g aardappel-inhibitor toegevoegd. Zodoende werd N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester verkregen met 15 een opbrengst van 55,5 %.

. De hoeveelheid enzym aanwezig in het geïmmobiliseerde enzym, bereid en toegepast in dit ivoorbeeld was ongeveer 0,8 g terwijl het water-gehalte hiervan nagenoeg gelijk was aan het watergehalte in de drager zoals in het begin toegepast.

20 Voorbeeld XIII

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I, met uitzondering hiervan dat de hoeveelheden Thermoase en calciumacetaatmonohydraat respectievelijk 2,0 g en 0,1 g waren. De natriumacetaat-bufferoplossing werd vervangen door 25 20 ml gedestilleerd water. De drager, hetgeen een acrylzure estermatrix was, werd vervangen door 11,7 g nat hydrofiel gel (Toyopearl 5, merknaam, bereid door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.,, met ongeveer 230 gew.% water berekend op droge basis) met een epoxydegroep en een waterige oplossing van natriumhydroxyde werd toegeroegd aan de suspensie om deze in te 30 stellen op een pH van 8,0. De hoeveelheid en het watergehalte van het geïmmobiliseerde enzym waren gelijk aart die in voorbeeld XII.

Verder werd de reactie uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven in voorbeeld I, met uitzondering hiervan dat bij de hoeveelheden N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur en L-fenylalaninemethylester 35 respectievelijk waren 2,14 g ( 8 mmol) en 2,87 g ( 16 mmol). De hoeveelheid met water verzadigde ethylacetaat was 26 ml en de reactietijd brdroeg 28,5 uren Door deze reactie werd de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenyl-alaninemethylester verkregen met een opbrengst van 82,9 %.

8001902 -16- 21266/Vk/mv

Voorbeeld XIV

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid . en de reactie hiermee werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I, met uitzondering hiervan dat ' Thermoase werd vervangen door 0,45 g thermoly-5 sine met een zuiverheid van 8080 PU/mg, hetgeen een product is van

Daiwa Kasei K.K.. In plaats van de .drager, hetgeen een acrylzure ester matrix drager was,werd 15,6 g nat hydrofiel gel (Toyopearl 7, merkaandui-ding),bereid door Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., met ongeveer 230 gew. % water, berekend op droge basis) gebruikt. Zodoende werd N-benzyl-10 oxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalininemethylester verkregen met een opbrengst van 59,8%.

De hoeveelheid enzym in het gelranobiliseerde enzym, bereid en toegepast in dit voorbeeld was ongeveer 0,15 g terwijl het waterge-halte hierVan nagenoeg gelijk was aan het watergehalte in het beginsta-15 dium.

Voorbeeld XV

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid t en de reactie hiermee werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld IV met uitzondering hiervan dat het natriumacetaat in de bufferoplossing,toege-20 past in voorbeeld I,vervangen werd door 70 ml gedestilleerd water. N-p-metho-xybenzyloxycarbonyl-L-asparaginezuur werd vervangen door 2,80 g (12 mmol) N-t-butoxycarbonyl-L-asparaginezuur , terwijl de reactietemperatuur 40 °C bedroeg en de reactietijd 23 uren. Het aldus bereide geïmmobiliseerde enzym werd in dit voorbeeld toegepast en had dezelfde 25 enzymhoeveelheid en watergehalte als aangegeven is in voorbeeld IV.

Het filtraat verkregen met het geïmmobiliseerde enzym werd verwijderd en de hierbij gebruikte wasvloeistof werd daarmee gemengd.

Vervolgend werd uit het vloeistofmengsel N-t-butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester afgescheiden op dezelfde wijze als aange-30 geven is in voorbeeld I. De opbrengst bedroeg 1,4 g ( 29,6%). De karakteristieken van de N-t-butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylaA^ine- methylester waren zoals hieronder is vermeld:

Smeltpunt: 149-150 °C

[<] ^: -15,3 (C=1, methanol) 35 De gegevens met betrekking ntot de elementair analyse voor de verbinding met formule c-jgH26^2^7 zi^n: 800 1 9 02 A “ -17- 21266/Vk/mv C(%) H(%) N(%) berekend 57,85 6,65 7,10 · gevonden 58,03 6,56 .7>05 · 5

Verder werd een monster genomen van de ethylacetaatlaag en na drogen en oplossen in een natriumacetaatoplossing (0,8 gew.%) onderworpen aan een analyse op dezelfde wijze als aangegeven is in voorbeeld I. Hieruit bleek dat N-t-butoxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylala- .

10 ninemethylester was verkregen met een opbrengst van 52,6%.

Voorbeeld XVI

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid en de reactie hiermee werd uitgevoerd op dezelfde wijze als aangegeven in voorbeeld VII, met uitzondering hiervan dat chloroform, het oplosmiddel dat gebruikt 15 werd voor de peptidebindingsvormigsreactie, werd vervangen door tolueen.

In dit voorbeeld werd M-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanine-methylester verkregen met een opbrengst van 10,5 %.

Voorbeeld XVII

Het geïmmobiliseerde enzym werd bereid op dezelfde wijze 20 als aangegeven in voorbeeld I, met uitzondering hiervan dat de hoeveelheid Thermoase en calciumacetaatmonohydraat respectievelijk waren 21,0 g en 1,05 g. De bufferoplossing van het natriumaeetaat werd vervangen door 210 ml gedestilleerd water. De hoeveelheid acrylzure ester-matrix drager (Amberlite XAD-7, merkaanduiding, met 230 gew.% water op droge 25 basis) was 100 g en de tijdsduur van het roeren van de enzymoplossing met de drager was 4 uren. De hoeveelheid enzym op het geïmmobiliseerde enzym, aldus verkregen, was ongeveer 20 g. Het watergehalte hiervan was nagenoeg gelijk aan het watergehalte van de drager in het begin van de bewerking.

30 Een glazen kolom voor een doorstroming met een binnendia-

meter van 24 mm en een hoogte van 300 mn en voorzien van een mantel aan de buitenkant voor thermische isolatie, werd( gevuld met het aldus verkregen geïmmobiliseerde enzym. Vervolgens werd 700 g ethylace-taat oplossing verzadigd met water en gehouden op 35 °C met 74 g 35 L-fenylalanineme thy1es ter en 55 g N-benzyloxycarbcnyX-L-asparaginezuur door de kolom geleid met een stroomsnelheid van ongeveer 0,3 ml per minuut terwijl de mantel werd gehouden op een temperatuur van 40 °C

min o n? - 5 -18- 21266/Vk/mv voor de reactie. Vervolgens na 17 uren vanaf het begin van de reactie werd bepaald dat de stroom uit de kolom N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester bevatte met een opbrengst van 54,3%.

-conclusies- 80 0 1 9 02

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van een dipeptide uit een N-gesubstitueerd- asparaginezuur en een fenylalanine lagere alkylester, 5 met het kenmerk, dat het N-gesubstitueerde asparaginezuur en de lagere alkylester van fenylalanine met elkaar in reactie worden gebracht in een organisch oplosmiddel, dat nagenoeg niet mengbaar is met water in aanwezigheid van een waterbevattend geïmmobiliseerd metaalhoudend proteinase.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat N-gesubstitueerde asparaginezuur en de fenylalanine lagere alkylester met elkaar in contact worden gebracht met het waterhoudend geïmmobiliseerd metallo-protelnase in het organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water, '.waarbij de beide componenten worden gekoppeld. 15

3, Werkwijze volgens conclusie 1-2 , met het kenmerk, dat de substituent van het N-gesubstitueerde asparaginezuur een urethan type substituenb'. is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat de substituent een benzyloxycarbonylgroep, een p-methoxybenzyloxy- 20 carbonylgroep of een t-hu toxycarbonylgroep is.

5. Werkwijze volgens conclusie 1-4 , met het kenmerk, dat het N-gesubstitueerde asparaginezuur gebruikt wordt in een L-configuratie en/of DL-configuratie.

6. Werkwijze volgens conclusie 1-5 , met het kenmerk, dat 25 de fenylalanine lagere alkylester gebruikt wordt in een L-configuratie en/of een DL-configuratie.

7. Werkwijze volgens conclusie 1-6, met het kenmerk, dat de lagere alkylgroep van de fenylalanine lagere alkylester een methyl-groep is.

8. Werkwijze volgens conclusie 1-7, met het kenmerk, dat het metèllo-protelnase thermolysine is.

9. Werkwijze volgens conclusie 1-7, met het kenmerk, dat het metallo-protelnase thermoase is.

10. Werkwijze volgens conclusie 1-9, met het kenmerk, dat 35 het organisch oplosmiddel dat niet mengbaar is met water een lager alkyl- halide , een ester van een carbonzuur, een keton, een aromatische koolwaterstof of een mengsel hiervan is. 8001902