JPH04349883A - 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法 - Google Patents
修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法Info
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- JPH04349883A JPH04349883A JP3150851A JP15085191A JPH04349883A JP H04349883 A JPH04349883 A JP H04349883A JP 3150851 A JP3150851 A JP 3150851A JP 15085191 A JP15085191 A JP 15085191A JP H04349883 A JPH04349883 A JP H04349883A
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は修飾サ−モリシン様酵素
及び修飾サ−モリシン様酵素を使用するアルファ−Ｌ−
アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前
駆体の合成方法に関するものである。
及び修飾サ−モリシン様酵素を使用するアルファ−Ｌ−
アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前
駆体の合成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】人工甘味剤として知られるアルファ−Ｌ
−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
（アスパルテ−ム、以下ＡＰＭとする）の前駆体は、金
属酵素であるサ−モリシンを触媒として用い、Ｎ−ベン
ジルオキシルカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（以下、
Ｚ−Ａｓｐとする）とＬ−フェニルアラニンメチルエス
テル（以下、ＰＭとする）をジペプチド縮合反応させる
ことで合成できる（磯和ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｎｏ２８、ｐ ２６１１からｐ ２６
１２、１９７９年）。
−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
（アスパルテ−ム、以下ＡＰＭとする）の前駆体は、金
属酵素であるサ−モリシンを触媒として用い、Ｎ−ベン
ジルオキシルカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（以下、
Ｚ−Ａｓｐとする）とＬ−フェニルアラニンメチルエス
テル（以下、ＰＭとする）をジペプチド縮合反応させる
ことで合成できる（磯和ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｎｏ２８、ｐ ２６１１からｐ ２６
１２、１９７９年）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＡＰＭ前駆体は、中性
からアルカリ性条件下でエステル分解により甘みを有し
ない物質に容易に分解される。従って、前記の縮合反応
は酸性条件下で実施することが好ましいが、最適ｐＨを
中性付近に有するサ−モリシンは酸性条件下で十分な酵
素活性を発現できない。
からアルカリ性条件下でエステル分解により甘みを有し
ない物質に容易に分解される。従って、前記の縮合反応
は酸性条件下で実施することが好ましいが、最適ｐＨを
中性付近に有するサ−モリシンは酸性条件下で十分な酵
素活性を発現できない。
【０００４】このためサ−モリシンを使用する従来のＡ
ＰＭ前駆体の合成は、やむなく中性ｐＨ条件下で行われ
ているが、このときには多量のサ−モリシンを使用し、
反応時間を短縮してＡＰＭ前駆体のエステル分解を防い
でいる。
ＰＭ前駆体の合成は、やむなく中性ｐＨ条件下で行われ
ているが、このときには多量のサ−モリシンを使用し、
反応時間を短縮してＡＰＭ前駆体のエステル分解を防い
でいる。
【０００５】この方法によれば、ＡＰＭ前駆体のエステ
ル分解を一応防ぐことが可能であるが、反応時間の短縮
のため、一回の縮合反応に多量のサ−モリシンを使用し
なければならない等の課題がある。
ル分解を一応防ぐことが可能であるが、反応時間の短縮
のため、一回の縮合反応に多量のサ−モリシンを使用し
なければならない等の課題がある。
【０００６】更には、反応終了後、場合によっては生成
物中のエステル分解物を除去するなど、ＡＰＭ前駆体の
精製操作が必要になる等の課題もある。
物中のエステル分解物を除去するなど、ＡＰＭ前駆体の
精製操作が必要になる等の課題もある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前述の課題に鑑みて本発
明者らは、少なくとも酸性ｐＨ条件下において十分なサ
−モリシン様酵素活性を発現し得る酵素を得ることがで
きればこれら課題を解決し得ると考え、本発明を完成し
た。
明者らは、少なくとも酸性ｐＨ条件下において十分なサ
−モリシン様酵素活性を発現し得る酵素を得ることがで
きればこれら課題を解決し得ると考え、本発明を完成し
た。
【０００８】即ち本発明は、下記式に示される化合物（
以下、単に化合物という）がその分子中のカルボキシル
基に共有結合した修飾サ−モリシン様酵素である。 Ｈ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−Ｈ （ｎは自
然数） また本発明は、このような修飾サ−モリシン様酵素を使
用することを特徴とする、ＡＰＭ前駆体の合成方法であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
以下、単に化合物という）がその分子中のカルボキシル
基に共有結合した修飾サ−モリシン様酵素である。 Ｈ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−Ｈ （ｎは自
然数） また本発明は、このような修飾サ−モリシン様酵素を使
用することを特徴とする、ＡＰＭ前駆体の合成方法であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明は狭義のサ−モリシン（Ｋ．Ｔｉｔ
ａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
２３８巻、ｐ ３５からｐ ３７、１９７２年）は勿
論のこと、中性金属プロテア−ゼ（特開昭６２−２５３
７１９号）又はセレウス（Ｓｉｄｌｅｒ Ｗ． ら、Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３６７
巻ｐ６４３〜６５７ 、１９８６年）のような、サ−
モリシンと酷似の一次構造を有し、現実にＺ−Ａｓｐと
ＰＭの縮合反応を触媒し得る酵素についても適用できる
。更には、これら酵素のアミノ酸配列中のアミノ酸残基
の一部が欠失し、置換され又はアミノ酸配列中に他のア
ミノ酸残基が挿入されている類似酵素であってこれら酵
素と同様の活性を発現し得るものにについても適用でき
る。従って本明細書においては、サ−モリシン、中性金
属プロテア−ゼ、セレウス及びこれらの類似酵素を総称
してサ−モリシン様酵素と記載する。
ａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
２３８巻、ｐ ３５からｐ ３７、１９７２年）は勿
論のこと、中性金属プロテア−ゼ（特開昭６２−２５３
７１９号）又はセレウス（Ｓｉｄｌｅｒ Ｗ． ら、Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３６７
巻ｐ６４３〜６５７ 、１９８６年）のような、サ−
モリシンと酷似の一次構造を有し、現実にＺ−Ａｓｐと
ＰＭの縮合反応を触媒し得る酵素についても適用できる
。更には、これら酵素のアミノ酸配列中のアミノ酸残基
の一部が欠失し、置換され又はアミノ酸配列中に他のア
ミノ酸残基が挿入されている類似酵素であってこれら酵
素と同様の活性を発現し得るものにについても適用でき
る。従って本明細書においては、サ−モリシン、中性金
属プロテア−ゼ、セレウス及びこれらの類似酵素を総称
してサ−モリシン様酵素と記載する。
【００１０】サ−モリシン様酵素分子中のカルボキシル
基に導入する化合物は、下記式に記載されたような、カ
ルボキシル基と共有結合し得る、例えばアミノ基のよう
な官能基をその分子中に有するものである。 Ｈ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−Ｈ （ｎは自
然数） この式で示される代表的な化合物として、例えばグリシ
ンアミド、グリシンメチルエステル、ノルロイシン、タ
ウリン等又はエチレンアミン、ジエチレントリアミン、
トリエチレントリアミン等の有機アミン系化合物を例示
できる。なかでもジエチレントリアミン又はトリエチレ
ントリアミンは、以下に記載する水溶解性の向上という
観点や、サ−モリシン様酵素との結合の容易さという観
点から好ましい化合物である。
基に導入する化合物は、下記式に記載されたような、カ
ルボキシル基と共有結合し得る、例えばアミノ基のよう
な官能基をその分子中に有するものである。 Ｈ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−Ｈ （ｎは自
然数） この式で示される代表的な化合物として、例えばグリシ
ンアミド、グリシンメチルエステル、ノルロイシン、タ
ウリン等又はエチレンアミン、ジエチレントリアミン、
トリエチレントリアミン等の有機アミン系化合物を例示
できる。なかでもジエチレントリアミン又はトリエチレ
ントリアミンは、以下に記載する水溶解性の向上という
観点や、サ−モリシン様酵素との結合の容易さという観
点から好ましい化合物である。
【００１１】前記した化合物でその分子中のカルボキシ
基を修飾することにより、酸性ｐＨ条件下で活性を発現
し得る修飾サ−モリシン様酵素が提供されるが、化合物
としてジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン
等の分子中に２から３の繰り返し構造部分を有する化合
物（化合物を示す式中のｎが２から３）を使用すること
で、その水溶解性を同時に向上させることができる。
基を修飾することにより、酸性ｐＨ条件下で活性を発現
し得る修飾サ−モリシン様酵素が提供されるが、化合物
としてジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン
等の分子中に２から３の繰り返し構造部分を有する化合
物（化合物を示す式中のｎが２から３）を使用すること
で、その水溶解性を同時に向上させることができる。
【００１２】本発明の修飾サ−モリシン様酵素の中でも
、トリエチレントリアミンをその分子中のカルボキシル
基に共有結合させたものは、水溶解性と酸性条件下での
酵素活性が大きく向上する。例えば未修飾のサ−モリシ
ンが最大酵素活性をｐＨ７．０から７．５で示すのに対
し、当該修飾酵素はより酸性側のｐＨ６．０で最大酵素
活性を示すのである。しかもｐＨ６．０における酵素活
性の相対値は、未修飾サ−モリシンの活性を１とした場
合に１．６と非常に優れている。他方、水溶解性似つい
ても、未修飾のサ−モリシンと比較して大きく改善され
る。
、トリエチレントリアミンをその分子中のカルボキシル
基に共有結合させたものは、水溶解性と酸性条件下での
酵素活性が大きく向上する。例えば未修飾のサ−モリシ
ンが最大酵素活性をｐＨ７．０から７．５で示すのに対
し、当該修飾酵素はより酸性側のｐＨ６．０で最大酵素
活性を示すのである。しかもｐＨ６．０における酵素活
性の相対値は、未修飾サ−モリシンの活性を１とした場
合に１．６と非常に優れている。他方、水溶解性似つい
ても、未修飾のサ−モリシンと比較して大きく改善され
る。
【００１３】サ−モリシン様酵素分子中のカルボキシル
基への化合物の結合は、縮合試薬を使用することで容易
に行える。縮合試薬としては、例えばジシクロヘキシル
カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等に代表されるカル
ボジイミド類が例示出来る。水溶解性の低いカルボジイ
ミド類を使用する場合には、アセトン等の水溶解性の高
い有機溶媒にいったん溶解して用いると良い。
基への化合物の結合は、縮合試薬を使用することで容易
に行える。縮合試薬としては、例えばジシクロヘキシル
カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等に代表されるカル
ボジイミド類が例示出来る。水溶解性の低いカルボジイ
ミド類を使用する場合には、アセトン等の水溶解性の高
い有機溶媒にいったん溶解して用いると良い。
【００１４】縮合試薬を用いる化合物とサ−モリシン様
酵素の結合は、化合物の結合率の観点から低いｐＨ条件
下で行うことが好ましいが、サ−モリシン様酵素の安定
性の観点をも考慮して、ｐＨ４から６、好ましくはｐＨ
５の条件下で行うことが好ましい。
酵素の結合は、化合物の結合率の観点から低いｐＨ条件
下で行うことが好ましいが、サ−モリシン様酵素の安定
性の観点をも考慮して、ｐＨ４から６、好ましくはｐＨ
５の条件下で行うことが好ましい。
【００１５】縮合試薬を用いた化合物の結合について一
例を記載すれば、例えば縮合試薬と化合物をｐＨ４から
６程度の適当な緩衝液に溶解し、４から２５℃の温度範
囲内でサ−モリシン様酵素を添加し数時間放置する。こ
の操作により得られる修飾サ−モリシン様酵素を含む溶
液に、反応を停止するため、ｐＨを４から６程度に調整
した酢酸ナトリウム緩衝液等を添加し、ゲル濾過、限外
濾過、透析等を行って残存試薬を除去する。なお、調製
された修飾サ−モリシン様酵素は、凍結乾燥、スプレ−
ドライ等を施しておくことで長期間の保存が可能である
。
例を記載すれば、例えば縮合試薬と化合物をｐＨ４から
６程度の適当な緩衝液に溶解し、４から２５℃の温度範
囲内でサ−モリシン様酵素を添加し数時間放置する。こ
の操作により得られる修飾サ−モリシン様酵素を含む溶
液に、反応を停止するため、ｐＨを４から６程度に調整
した酢酸ナトリウム緩衝液等を添加し、ゲル濾過、限外
濾過、透析等を行って残存試薬を除去する。なお、調製
された修飾サ−モリシン様酵素は、凍結乾燥、スプレ−
ドライ等を施しておくことで長期間の保存が可能である
。
【００１６】より具体的に、本発明の修飾サ−モリシン
様酵素の中でも水溶解性や酸性条件下での酵素活性が優
れたトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）修飾されたサ
−モリシンを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとする
）を用いて調製する方法について記載すれば、１ｍｇの
サ−モリシン当たりそれぞれ０．１ＭのＥＤＣ及びＴＥ
ＴＡを使用し、ｐＨ４から６条件下、２０度程度の温度
条件下で反応させることが例示できる。
様酵素の中でも水溶解性や酸性条件下での酵素活性が優
れたトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）修飾されたサ
−モリシンを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとする
）を用いて調製する方法について記載すれば、１ｍｇの
サ−モリシン当たりそれぞれ０．１ＭのＥＤＣ及びＴＥ
ＴＡを使用し、ｐＨ４から６条件下、２０度程度の温度
条件下で反応させることが例示できる。
【００１７】本発明のＡＰＭ前駆体の合成方法は、以上
説明した修飾サ−モリシン様酵素をを使用してＺ−Ａｓ
ｐとＰＭをジペプチド縮合反応させることを特徴とする
。なおこの合成方法は、ＡＰＭ前駆体の塩を合成する方
法をも包括するものである。
説明した修飾サ−モリシン様酵素をを使用してＺ−Ａｓ
ｐとＰＭをジペプチド縮合反応させることを特徴とする
。なおこの合成方法は、ＡＰＭ前駆体の塩を合成する方
法をも包括するものである。
【００１８】合成は、例えば特開昭６２−２５３７１９
号に記載されたのと同様の条件で実施することが可能で
あるが、より酸性条件下、好ましくはｐＨ６からｐＨ６
．５条件下で実施すると良い。
号に記載されたのと同様の条件で実施することが可能で
あるが、より酸性条件下、好ましくはｐＨ６からｐＨ６
．５条件下で実施すると良い。
【００１９】また、本発明の合成方法においては、酸性
ｐＨ条件下での酵素活性の点から、トリエチレントリア
ミンで修飾された修飾サ−モリシン様酵素を使用するこ
とが好ましい。
ｐＨ条件下での酵素活性の点から、トリエチレントリア
ミンで修飾された修飾サ−モリシン様酵素を使用するこ
とが好ましい。
【００２０】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、これらの実施例は本発明を説明する
ための一例であり、本発明を限定するものではない。な
おサ−モリシン活性の測定は、萩原らのカゼイン−フォ
−リン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉ
ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、ｅｄ．ｂｙ Ｓ．Ａｋａｂ
ｏｒｉ，Ａｓａｋｕｒａ Ｓｈｏｔｅｎ，Ｔｏｋｙｏ、
第 ２巻、ｐ２３７、１９５６年）に従って行った。
施例を記載するが、これらの実施例は本発明を説明する
ための一例であり、本発明を限定するものではない。な
おサ−モリシン活性の測定は、萩原らのカゼイン−フォ
−リン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉ
ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、ｅｄ．ｂｙ Ｓ．Ａｋａｂ
ｏｒｉ，Ａｓａｋｕｒａ Ｓｈｏｔｅｎ，Ｔｏｋｙｏ、
第 ２巻、ｐ２３７、１９５６年）に従って行った。
【００２１】実施例１
市販のサ−モリシン（大和化成株式会社製）を１ｍｌ当
たり４ｍｇ溶解した溶液を試料溶液として使用した。２
５０マイクロリットルの試料溶液に対し、５０マイクロ
リットルの１Ｍ塩化カルシウム溶液、５００マイクロリ
ットルの１０％ＴＥＴＡ溶液（ｐＨ５．０）、３０ｍｇ
の塩化ナトリウム、２００マイクロリットルの蒸留水を
添加して攪拌し、更に１２ｍｇのＥＤＣを添加した。
たり４ｍｇ溶解した溶液を試料溶液として使用した。２
５０マイクロリットルの試料溶液に対し、５０マイクロ
リットルの１Ｍ塩化カルシウム溶液、５００マイクロリ
ットルの１０％ＴＥＴＡ溶液（ｐＨ５．０）、３０ｍｇ
の塩化ナトリウム、２００マイクロリットルの蒸留水を
添加して攪拌し、更に１２ｍｇのＥＤＣを添加した。
【００２２】この溶液を４℃で一晩放置し、後に１Ｍの
酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）を添加して室温で１時間放
置し、透析を行って残存する試薬を除去してＴＥＴＡで
修飾されたサ−モリシンを調製した。
酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）を添加して室温で１時間放
置し、透析を行って残存する試薬を除去してＴＥＴＡで
修飾されたサ−モリシンを調製した。
【００２３】以上のようにして調製された修飾サ−モリ
シンについて、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０の
各ｐＨでの酵素活性を測定した。また、対比のため未修
飾のサ−モリシンについても同様のｐＨでの酵素活性を
測定した。結果を図１に詳細に示す。
シンについて、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０の
各ｐＨでの酵素活性を測定した。また、対比のため未修
飾のサ−モリシンについても同様のｐＨでの酵素活性を
測定した。結果を図１に詳細に示す。
【００２４】この結果、未修飾のサ−モリシンがｐＨ７
．０から７．５で最大活性を示したのに対し、ＴＥＴＡ
で修飾されたサ−モリシンは、ｐＨ６．０で最大活性を
示すなど、酸性条件下における活性の向上が示された。 またｐＨ６．０における未修飾サ−モリシンとＴＥＴＡ
修飾サ−モリシンの活性の相対値は、未修飾サ−モリシ
ン１に対して修飾サ−モリシンでは１．６であった。
．０から７．５で最大活性を示したのに対し、ＴＥＴＡ
で修飾されたサ−モリシンは、ｐＨ６．０で最大活性を
示すなど、酸性条件下における活性の向上が示された。 またｐＨ６．０における未修飾サ−モリシンとＴＥＴＡ
修飾サ−モリシンの活性の相対値は、未修飾サ−モリシ
ン１に対して修飾サ−モリシンでは１．６であった。
【００２５】ＴＥＴＡ修飾サ−モリシンと未修飾サ−モ
リシンの溶解性について、その１００ｍｇを１０ｍｌに
水に溶解した後６６０ｎｍの吸光度から調査した。
リシンの溶解性について、その１００ｍｇを１０ｍｌに
水に溶解した後６６０ｎｍの吸光度から調査した。
【００２６】その結果、未修飾サ−モリシンは吸光度が
０．４であったのに対し、修飾サ−モリシンでは０．０
１であった。このことは、修飾によりサ−モリシンの水
溶解性が向上していることを示す。
０．４であったのに対し、修飾サ−モリシンでは０．０
１であった。このことは、修飾によりサ−モリシンの水
溶解性が向上していることを示す。
【００２７】実施例２
実施例１で得られたＴＥＴＡ修飾サ−モリシンと未修飾
サ−モリシンを使用して、ＡＰＭ前駆体の合成を行った
。
サ−モリシンを使用して、ＡＰＭ前駆体の合成を行った
。
【００２８】０．１ ＭＺ−Ａｓｐ及び０．１ ＭＰＭ
を含む、トリス−塩酸でｐＨを６．０に調整した反応液
１ｍｌに対し、ＴＥＴＡ修飾サ−モリシン又は未修飾サ
−モリシンをそれぞれ３マイクロ Ｍとなるように添加
し、３７℃条件下で３０分間反応を行った後、逆相高速
液体クロマトグラフィ−（東ソ−（株）製、ＯＤＳ−８
０Ｔｍ）を使用して合成されたＡＰＭ前駆体を定量した
。
を含む、トリス−塩酸でｐＨを６．０に調整した反応液
１ｍｌに対し、ＴＥＴＡ修飾サ−モリシン又は未修飾サ
−モリシンをそれぞれ３マイクロ Ｍとなるように添加
し、３７℃条件下で３０分間反応を行った後、逆相高速
液体クロマトグラフィ−（東ソ−（株）製、ＯＤＳ−８
０Ｔｍ）を使用して合成されたＡＰＭ前駆体を定量した
。
【００２９】この結果、ｐＨ６．０条件下で未修飾サ−
モリシンにより合成されたＡＰＭ前駆体の量に対して、
ＴＥＴＡ修飾サ−モリシンにより合成されたＡＰＭ前駆
体の量は１．４倍と大きく向上していた。
モリシンにより合成されたＡＰＭ前駆体の量に対して、
ＴＥＴＡ修飾サ−モリシンにより合成されたＡＰＭ前駆
体の量は１．４倍と大きく向上していた。
【００３０】実施例３
市販のサ−モリシン（大和化成株式会社製）を１ｍｌ当
たり４ｍｇ溶解した溶液を試料溶液として使用した。２
５０マイクロリットルの試料溶液に対し、５０マイクロ
リットルの１Ｍ塩化カルシウム溶液、５００マイクロリ
ットルの１０％ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）溶液
（ｐＨ５．０）、３０ｍｇの塩化ナトリウム、２００マ
イクロリットルの蒸留水を添加して攪拌し、更に１２ｍ
ｇのＥＤＣを添加した。
たり４ｍｇ溶解した溶液を試料溶液として使用した。２
５０マイクロリットルの試料溶液に対し、５０マイクロ
リットルの１Ｍ塩化カルシウム溶液、５００マイクロリ
ットルの１０％ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）溶液
（ｐＨ５．０）、３０ｍｇの塩化ナトリウム、２００マ
イクロリットルの蒸留水を添加して攪拌し、更に１２ｍ
ｇのＥＤＣを添加した。
【００３１】この溶液を４℃で一晩放置し、後に１Ｍの
酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）を添加して室温で１時間放
置し、透析を行って残存する試薬を除去してＤＥＴＡで
修飾されたサ−モリシンを調製した。
酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）を添加して室温で１時間放
置し、透析を行って残存する試薬を除去してＤＥＴＡで
修飾されたサ−モリシンを調製した。
【００３２】以上のようにして調製された修飾サ−モリ
シンについてｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０の各
ｐＨでの酵素活性を測定した。また、対比のため未修飾
のサ−モリシンについても同様のｐＨでの酵素活性を測
定した。
シンについてｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０の各
ｐＨでの酵素活性を測定した。また、対比のため未修飾
のサ−モリシンについても同様のｐＨでの酵素活性を測
定した。
【００３３】この結果、未修飾のサ−モリシンがｐＨ７
．０から７．５で最大活性を示したのに対し、ＤＥＴＡ
で修飾されたサ−モリシンは、ｐＨ６．０で最大活性を
示したが、その値は未修飾サ−モリシンのｐＨ７．０か
らｐＨ７．５での最大活性に比較して１０％程度低下し
ていた。
．０から７．５で最大活性を示したのに対し、ＤＥＴＡ
で修飾されたサ−モリシンは、ｐＨ６．０で最大活性を
示したが、その値は未修飾サ−モリシンのｐＨ７．０か
らｐＨ７．５での最大活性に比較して１０％程度低下し
ていた。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、簡単な化学的修飾によ
り、未修飾サ−モリシン様酵素に比較して酸性ｐＨ条件
下での酵素活性が向上した修飾サ−モリシン様酵素が提
供される。一般に酵素を工業的に使用する場合に、酵素
の最適ｐＨとその基質や反応生成物が安定的に存在する
ｐＨが異なることが多々あるが、本発明によれば、サ−
モリシン様酵素を使用するものであって、基質や反応生
成物の安定ｐＨが酸性領域に存在するような反応系に好
適なサ−モリシン様酵素が提供される。
り、未修飾サ−モリシン様酵素に比較して酸性ｐＨ条件
下での酵素活性が向上した修飾サ−モリシン様酵素が提
供される。一般に酵素を工業的に使用する場合に、酵素
の最適ｐＨとその基質や反応生成物が安定的に存在する
ｐＨが異なることが多々あるが、本発明によれば、サ−
モリシン様酵素を使用するものであって、基質や反応生
成物の安定ｐＨが酸性領域に存在するような反応系に好
適なサ−モリシン様酵素が提供される。
【００３５】従って、反応生成物がより安定な酸性条件
下でサ−モリシン様酵素を作用させることが可能となる
。
下でサ−モリシン様酵素を作用させることが可能となる
。
【００３６】サ−モリシン様酵素の最適ｐＨとその基質
や反応生成物が安定的に存在するｐＨが異なる場合とし
て、人工甘味料として知られるＡＰＭの前駆体をサ−モ
リシンを用いて合成する反応がある。この反応は、Ｚ−
ＡｓｐとＰＭの縮合反応であるが、反応生成物であるＡ
ＰＭ前駆体は酸性条件下で安定であるのに、サ−モリシ
ンの最適ｐＨは中性（ｐＨ７から７．５）である。
や反応生成物が安定的に存在するｐＨが異なる場合とし
て、人工甘味料として知られるＡＰＭの前駆体をサ−モ
リシンを用いて合成する反応がある。この反応は、Ｚ−
ＡｓｐとＰＭの縮合反応であるが、反応生成物であるＡ
ＰＭ前駆体は酸性条件下で安定であるのに、サ−モリシ
ンの最適ｐＨは中性（ｐＨ７から７．５）である。
【００３７】このため、縮合反応をサ−モリシンの最適
ｐＨで行えば生成物であるＡＰＭ前駆体が分解されてそ
の回収率が低下する等の不都合が生じ、酸性条件下で反
応を行えば酵素活性が十分に発現されない結果、ＡＰＭ
前駆体の合成率自体が低下するのである。
ｐＨで行えば生成物であるＡＰＭ前駆体が分解されてそ
の回収率が低下する等の不都合が生じ、酸性条件下で反
応を行えば酵素活性が十分に発現されない結果、ＡＰＭ
前駆体の合成率自体が低下するのである。
【００３８】従って、特にこのようなＡＰＭ前駆体の合
成反応に対し、本発明は、まさに好適な修飾サ−モリシ
ン様酵素を提供するものである。即ち本発明の修飾サ−
モリシン様酵素は、酸性ｐＨ条件下における酵素活性が
未修飾サ−モリシン様酵素に比較して大きく向上してい
るから、ＡＰＭ前駆体がより安定な酸性条件下での縮合
反応を可能にする。即ち本発明は、従来採用されている
方法に比較して、よりサ−モリシン様酵素による縮合の
ための反応時間を長くでき、使用する酵素量を減少でき
又は合成物中のエステル分解物を除去する操作を必要と
しないＡＰＭ前駆体の合成方法を提供するのである。
成反応に対し、本発明は、まさに好適な修飾サ−モリシ
ン様酵素を提供するものである。即ち本発明の修飾サ−
モリシン様酵素は、酸性ｐＨ条件下における酵素活性が
未修飾サ−モリシン様酵素に比較して大きく向上してい
るから、ＡＰＭ前駆体がより安定な酸性条件下での縮合
反応を可能にする。即ち本発明は、従来採用されている
方法に比較して、よりサ−モリシン様酵素による縮合の
ための反応時間を長くでき、使用する酵素量を減少でき
又は合成物中のエステル分解物を除去する操作を必要と
しないＡＰＭ前駆体の合成方法を提供するのである。
【００３９】反応時間を長くすることができればＡＰＭ
前駆体の合成率を向上させることが可能であるし、使用
する酵素量を減少させることができればＡＰＭ前駆体の
製造コストを低減させることが可能であるし、更にエス
テル分解物の除去が不要であれば、結局はＡＰＭ前駆体
の合成のために要する時間等を短縮できるなるなど、本
発明は大きな意義を有するものである。
前駆体の合成率を向上させることが可能であるし、使用
する酵素量を減少させることができればＡＰＭ前駆体の
製造コストを低減させることが可能であるし、更にエス
テル分解物の除去が不要であれば、結局はＡＰＭ前駆体
の合成のために要する時間等を短縮できるなるなど、本
発明は大きな意義を有するものである。
【００４０】本発明の修飾サ−モリシン様酵素は、これ
まで記載したように酸性ｐＨでの活性が向上されている
以外にも、水溶解性も向上している。このことは、例え
ばサ−モリシン様酵素を使用する反応系であって、生成
物が沈殿するような場合には沈殿物の回収と同時に酵素
の分離（回収）を行え、更に反応溶液中の酵素濃度を高
めることも可能になる。このことにより、例えば短期間
に酵素反応を終了させることが必要な場合等には、従来
以上に大量のサ−モリシン様酵素を溶液中に添加するこ
とも可能となる。
まで記載したように酸性ｐＨでの活性が向上されている
以外にも、水溶解性も向上している。このことは、例え
ばサ−モリシン様酵素を使用する反応系であって、生成
物が沈殿するような場合には沈殿物の回収と同時に酵素
の分離（回収）を行え、更に反応溶液中の酵素濃度を高
めることも可能になる。このことにより、例えば短期間
に酵素反応を終了させることが必要な場合等には、従来
以上に大量のサ−モリシン様酵素を溶液中に添加するこ
とも可能となる。
【図１】図１は、本発明の実施例１の結果を示すもので
ある。横軸は反応を行ったｐＨ条件を、縦軸はＴＥＴＡ
修飾サ−モリシン又は未修飾サ−モリシンの活性を、ｐ
Ｈ６．０におけるＴＥＴＡ修飾サ−モリシンの活性を１
００％とした時の相対値（％）で示したものである。図
中、１番のはＴＥＴＡ修飾サ−モリシンについての結果
を、２番の直線は未修飾サ−モリシンについての結果を
示す。本図からは、未修飾サ−モリシンがｐＨ７．０か
ら７．５程度の中性ｐＨ条件下で高い酵素活性を発現す
るのに対し、ＴＥＴＡ修飾サ−モリシンはｐＨ６．０を
頂点としす酸性ｐＨ条件下で高い酵素活性を発現するこ
とが分かる。更には、ｐＨ６．０の酸性条件下では、未
修飾サ−モリシンの活性に比較して約１．４倍の活性を
有していることも分かる。
ある。横軸は反応を行ったｐＨ条件を、縦軸はＴＥＴＡ
修飾サ−モリシン又は未修飾サ−モリシンの活性を、ｐ
Ｈ６．０におけるＴＥＴＡ修飾サ−モリシンの活性を１
００％とした時の相対値（％）で示したものである。図
中、１番のはＴＥＴＡ修飾サ−モリシンについての結果
を、２番の直線は未修飾サ−モリシンについての結果を
示す。本図からは、未修飾サ−モリシンがｐＨ７．０か
ら７．５程度の中性ｐＨ条件下で高い酵素活性を発現す
るのに対し、ＴＥＴＡ修飾サ−モリシンはｐＨ６．０を
頂点としす酸性ｐＨ条件下で高い酵素活性を発現するこ
とが分かる。更には、ｐＨ６．０の酸性条件下では、未
修飾サ−モリシンの活性に比較して約１．４倍の活性を
有していることも分かる。
Claims (3)
- 【請求項１】下記式に示される化合物がその分子中のカ
ルボキシル基に共有結合した修飾サ−モリシン様酵素。 Ｈ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−Ｈ （ただし
、ｎは自然数） - 【請求項２】化合物がエチレンアミンテトラミンである
請求項１に記載の修飾サ−モリシン様酵素。 - 【請求項３】請求項１に記載の修飾サ−モリシン様酵素
を使用することを特徴とする、アルファ−Ｌ−アスパラ
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合
成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3150851A JPH04349883A (ja) | 1991-05-28 | 1991-05-28 | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3150851A JPH04349883A (ja) | 1991-05-28 | 1991-05-28 | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349883A true JPH04349883A (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=15505766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3150851A Pending JPH04349883A (ja) | 1991-05-28 | 1991-05-28 | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04349883A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995016029A1 (en) * | 1993-12-07 | 1995-06-15 | Sagami Chemical Research Center | Mutants of a thermostable neutral protease from bacillus |
| US5496710A (en) * | 1992-06-08 | 1996-03-05 | Sagami Chemical Research Center | Protease |
-
1991
- 1991-05-28 JP JP3150851A patent/JPH04349883A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496710A (en) * | 1992-06-08 | 1996-03-05 | Sagami Chemical Research Center | Protease |
| WO1995016029A1 (en) * | 1993-12-07 | 1995-06-15 | Sagami Chemical Research Center | Mutants of a thermostable neutral protease from bacillus |
| US5728544A (en) * | 1993-12-07 | 1998-03-17 | Sagami Chemical Research Center | Protease II |
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