JPS6229996A - Ｎ−保護ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 - Google Patents
Ｎ−保護ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法Info
- Publication number
- JPS6229996A JPS6229996A JP16835185A JP16835185A JPS6229996A JP S6229996 A JPS6229996 A JP S6229996A JP 16835185 A JP16835185 A JP 16835185A JP 16835185 A JP16835185 A JP 16835185A JP S6229996 A JPS6229996 A JP S6229996A
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- alkyl ester
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、酵素法によるＮ−保護Ｌ−アスパルチル−し
一フェニルアラニン低級アルキルエステル（以下、ＰＡ
ＰＥと呼ぶ）の製造に関するものである。ここで、ＰＡ
ＰＥから保護基を除去したＩ２−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニン低級アルキルエステル（以下、ＡＰＥと
呼ぶ）は、甘味剤としての用途を有する。
一フェニルアラニン低級アルキルエステル（以下、ＰＡ
ＰＥと呼ぶ）の製造に関するものである。ここで、ＰＡ
ＰＥから保護基を除去したＩ２−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニン低級アルキルエステル（以下、ＡＰＥと
呼ぶ）は、甘味剤としての用途を有する。
（従来技術）
ＰＡＰＥの製造法としては、Ｎ−保護Ｌ−アスパラギン
酸無水物とＩ、−フェニルアラニン低級アルキルエステ
ルを反応させる化学的方法、タンパク質加水分解酵素（
プロテアーゼ）を触媒上してＮ−保護■、−アスパラギ
ン酸とＬ＝フェニルアラニン低級アルキルエステルを反
応させる酵素法、シュードモナス属に属するＡＰＥ生産
菌によってＡＰＥを生産する生物的方法がある。
酸無水物とＩ、−フェニルアラニン低級アルキルエステ
ルを反応させる化学的方法、タンパク質加水分解酵素（
プロテアーゼ）を触媒上してＮ−保護■、−アスパラギ
ン酸とＬ＝フェニルアラニン低級アルキルエステルを反
応させる酵素法、シュードモナス属に属するＡＰＥ生産
菌によってＡＰＥを生産する生物的方法がある。
前記した従来の酵素法は、金属プロテアーゼ、例えば、
サーモライシンを水性媒体中で、Ｎ−保護Ｌ−アスパラ
ギン酸とＬ−フェニルアラニン低級アルキルエステルに
作用させ、生成するＰＡＰＥとＬ−フェニルアラニン低
級アルキルエステルとの水難溶性付加化合物を沈澱吉し
て得るものである。この方法では、酵素は反応液中に溶
解しており、生成物は媒体中に析出してくるので、回分
反応操作には適しているが、背型あるいは樽型反応器を
用いる連続法には適していない。また、酵素自体がタン
パク質であるため、酵素は自らを分解する能力を有する
が、水性媒体に溶解した酵素は、その自己分解を起し易
く、触媒能の劣化を招きやすい。さらに、反応生成物は
、ＰＡＰＥと■、−フェニルアラニン低級アルキルエス
テルとの水難溶性アルキルエステルとの付加化合物であ
るため、フェニルアラニン低級アルキルエステルおよび
保護基を除去して甘味剤として価値あるΔＰＥに転換す
るためには、採取した上記付加化合物を、一旦、有機溶
媒もしくは有機溶媒および水の混合溶媒に溶解させる必
要があった。これらの難点のいくつかを解決する方法と
して、金属プロテアーゼを、不溶性担体、例えば、イオ
ン交換樹脂に固定化し、これを有機溶媒中で用いるもの
がある。ただし、この方法においても、酵素の環境、す
なわち固定化担体内部は水性媒体であり、本質的には水
性媒体中での反応であった。これらの公知の技術は、水
性媒体中での反応であることが共通している。この反応
を完全有機溶媒中で行ない、酵素を有機溶媒不溶性触媒
として用いることができれば、ＰＡＰＥの生産に関して
新しい技術を提供できるものと期待できる。
サーモライシンを水性媒体中で、Ｎ−保護Ｌ−アスパラ
ギン酸とＬ−フェニルアラニン低級アルキルエステルに
作用させ、生成するＰＡＰＥとＬ−フェニルアラニン低
級アルキルエステルとの水難溶性付加化合物を沈澱吉し
て得るものである。この方法では、酵素は反応液中に溶
解しており、生成物は媒体中に析出してくるので、回分
反応操作には適しているが、背型あるいは樽型反応器を
用いる連続法には適していない。また、酵素自体がタン
パク質であるため、酵素は自らを分解する能力を有する
が、水性媒体に溶解した酵素は、その自己分解を起し易
く、触媒能の劣化を招きやすい。さらに、反応生成物は
、ＰＡＰＥと■、−フェニルアラニン低級アルキルエス
テルとの水難溶性アルキルエステルとの付加化合物であ
るため、フェニルアラニン低級アルキルエステルおよび
保護基を除去して甘味剤として価値あるΔＰＥに転換す
るためには、採取した上記付加化合物を、一旦、有機溶
媒もしくは有機溶媒および水の混合溶媒に溶解させる必
要があった。これらの難点のいくつかを解決する方法と
して、金属プロテアーゼを、不溶性担体、例えば、イオ
ン交換樹脂に固定化し、これを有機溶媒中で用いるもの
がある。ただし、この方法においても、酵素の環境、す
なわち固定化担体内部は水性媒体であり、本質的には水
性媒体中での反応であった。これらの公知の技術は、水
性媒体中での反応であることが共通している。この反応
を完全有機溶媒中で行ない、酵素を有機溶媒不溶性触媒
として用いることができれば、ＰＡＰＥの生産に関して
新しい技術を提供できるものと期待できる。
（解決すべき問題点）
そこで本発明は、粉末プロテアーゼ特にザーモライシン
を完全有機溶媒中で用いることにより上述の問題点を解
決したＰΔＰ Ｅを生産する方法を提供することを目的
よする。
を完全有機溶媒中で用いることにより上述の問題点を解
決したＰΔＰ Ｅを生産する方法を提供することを目的
よする。
（技術手段）
本発明は粉末プロテアーゼを触媒とし有機溶媒中でＮ−
保護Ｌ−アスパラギン酸と、■、−フェニルアラニン低
級アルキルエステルを反応させるこ七を特徴とする。Ｎ
−保護Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニル−γラニン低級
アルキルエステルの製造方法である。
保護Ｌ−アスパラギン酸と、■、−フェニルアラニン低
級アルキルエステルを反応させるこ七を特徴とする。Ｎ
−保護Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニル−γラニン低級
アルキルエステルの製造方法である。
まず、回分法では反応基質、すなわちＮ−保護Ｉ、アス
パラギン酸とＬ−フェニルアラニン低級アルキルエステ
ルを有機溶媒に溶解し、所定のｐＨおよび温度下で、粉
末プロテアーゼを添加して反応させる。ここで有機溶媒
は、上記反応基質ならびに生成物を溶解でき、かつ、プ
ロテアーゼの溶解ならびに失活を生じさせないものがよ
い。例えば酢酸エチルが優れた有機溶媒である。また、
媒体としての適性を損なわない程度にベンゼン等の単独
では媒体として適しない有機溶媒を混合することもでき
る。有機溶媒に反応基質を溶解した後、Ｔ） Ｈを調整
するが、それを容易にするためにメチルアルコール等の
低級アルコールを混合する。
パラギン酸とＬ−フェニルアラニン低級アルキルエステ
ルを有機溶媒に溶解し、所定のｐＨおよび温度下で、粉
末プロテアーゼを添加して反応させる。ここで有機溶媒
は、上記反応基質ならびに生成物を溶解でき、かつ、プ
ロテアーゼの溶解ならびに失活を生じさせないものがよ
い。例えば酢酸エチルが優れた有機溶媒である。また、
媒体としての適性を損なわない程度にベンゼン等の単独
では媒体として適しない有機溶媒を混合することもでき
る。有機溶媒に反応基質を溶解した後、Ｔ） Ｈを調整
するが、それを容易にするためにメチルアルコール等の
低級アルコールを混合する。
アルコールの添加は、酵素の活性発現に必要な少量の水
を有機溶媒に溶解させるためにも好ましい。
を有機溶媒に溶解させるためにも好ましい。
例えば、ベンゼンおよび酢酸エチルの混合（３：５）溶
媒に水を２容量％加える場合には２０容量％前後のメタ
ノール添加が適している。有機溶媒のその他の例として
ブチルエチルケトン、アセトン、ジオキサン、テトラハ
イドロフラン等の使用も可能である。
媒に水を２容量％加える場合には２０容量％前後のメタ
ノール添加が適している。有機溶媒のその他の例として
ブチルエチルケトン、アセトン、ジオキサン、テトラハ
イドロフラン等の使用も可能である。
次にＮ−保護Ｌ−アスパラギン酸は、アミノ基がフェニ
ル基を有する比較的バルキーな化合物アシル化等で保護
されたしアスパラギン酸を意味し、例エバ、ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸、あるいはＮ−Ｐ
−メトキシベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸等
をいう。
ル基を有する比較的バルキーな化合物アシル化等で保護
されたしアスパラギン酸を意味し、例エバ、ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸、あるいはＮ−Ｐ
−メトキシベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸等
をいう。
また、Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルニスチルとは
炭素数が８個以下のアルキル基エステルを意味する。
炭素数が８個以下のアルキル基エステルを意味する。
前記Ｎ−保護Ｌ−アスパラギン酸とＬ−７工ニルアラニ
ン低級アルキルエステルの反応に際し使用される混合割
合はＮ−保護Ｌ−アスパラギン酸１モルに対してＬ−フ
ェニルアラニン低級アルキルニステルハ０．１モルから
１モル、好マシく４０．３モルから０．７モルの範囲で
ある。
ン低級アルキルエステルの反応に際し使用される混合割
合はＮ−保護Ｌ−アスパラギン酸１モルに対してＬ−フ
ェニルアラニン低級アルキルニステルハ０．１モルから
１モル、好マシく４０．３モルから０．７モルの範囲で
ある。
また、前記粉末プロテアーゼの量は通常０．１ ｍｇ／
ｍ（１以上用いられ、この粉末プロテアーゼの使用量の
増加２ともに反応速度は速くなる。
ｍ（１以上用いられ、この粉末プロテアーゼの使用量の
増加２ともに反応速度は速くなる。
粉末プロテアーゼの粉末の粒子径は、５０〜４００メツ
シユのものが使用され、また、プロテアーゼの種類とし
て特に金属プロテアーゼが好適である。
シユのものが使用され、また、プロテアーゼの種類とし
て特に金属プロテアーゼが好適である。
次に有機溶媒のｐＨは、反応転化率を高めるとともに副
反応を抑制する為、５〜８の範囲が適当で、特に好まし
くはｐＨは５．５〜６．５の範囲である。ｐ Ｈの調整
は、塩酸等の鉱酸あるいは酢酸等の有機酸、およびアミ
ン類あるいは水酸化ナトリラム等の無機アルカリを用い
て行なう。
反応を抑制する為、５〜８の範囲が適当で、特に好まし
くはｐＨは５．５〜６．５の範囲である。ｐ Ｈの調整
は、塩酸等の鉱酸あるいは酢酸等の有機酸、およびアミ
ン類あるいは水酸化ナトリラム等の無機アルカリを用い
て行なう。
同様に反応温度は、２０〜７０℃が適当であるが、好ま
しくは４０〜５０℃である。特に温度が７０℃を越える
と、反応転化率が大幅に低下することとなる。
しくは４０〜５０℃である。特に温度が７０℃を越える
と、反応転化率が大幅に低下することとなる。
なお１−１°味剤として有用な△ＰＥを生産するために
は、本発明の方法で生成したＰＡＰＥとＬ−フェニルア
ラニン低級アルキルエステルの付加化合物を公知の技術
、例えば酸性による分解に供すればよい。分解反応を行
なうときの媒体は、ＰＡＰＥ合成に用いた媒体をそのま
ま用いることができる。
は、本発明の方法で生成したＰＡＰＥとＬ−フェニルア
ラニン低級アルキルエステルの付加化合物を公知の技術
、例えば酸性による分解に供すればよい。分解反応を行
なうときの媒体は、ＰＡＰＥ合成に用いた媒体をそのま
ま用いることができる。
粉末プロテアーゼを完全有機溶媒中で用いる本発明の方
法は、水難溶性のアミノ酸およびその誘導体を反応基質
あるいは生成物上するペプチド合成反応およびペプチド
分解反応に利用できる。
法は、水難溶性のアミノ酸およびその誘導体を反応基質
あるいは生成物上するペプチド合成反応およびペプチド
分解反応に利用できる。
実施例１
媒体として、酢酸エチル・ベンゼン・メタノール・水の
混合有機溶媒（混合容量比５０：２９：１９：２）を用
い、０．１モルのし一フェニルアラニンメチルエステル
および０，０５モルのベンジルオキシカルボニル−し−
アスパラギン酸を反応基質とする回分法によるＰＡＰＥ
の合成を行なった。
混合有機溶媒（混合容量比５０：２９：１９：２）を用
い、０．１モルのし一フェニルアラニンメチルエステル
および０，０５モルのベンジルオキシカルボニル−し−
アスパラギン酸を反応基質とする回分法によるＰＡＰＥ
の合成を行なった。
第１図は、０．５．１．０ ：Ｊ６よび５ｍｇ／ｍＡ粉
末ザーモライシンによるベンジルオキシカルボニル−し
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルと
１．−７エニルアラニンメチルエステルの付加化合物生
成の経時変化をｐ Ｈ６，０について示したものである
。付加化合物の生成は液体クロマトグラフィーならびに
ＮＭＲスペクトルから同定した。 次に第２図は、粉末
ザーモライシン仕込み量と反応初速度の関係を示したも
のである。酵素仕込量に比例して、大きな初速度が得ら
れた。
末ザーモライシンによるベンジルオキシカルボニル−し
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルと
１．−７エニルアラニンメチルエステルの付加化合物生
成の経時変化をｐ Ｈ６，０について示したものである
。付加化合物の生成は液体クロマトグラフィーならびに
ＮＭＲスペクトルから同定した。 次に第２図は、粉末
ザーモライシン仕込み量と反応初速度の関係を示したも
のである。酵素仕込量に比例して、大きな初速度が得ら
れた。
第３図は、７０℃における上記付加化合物の生成経時変
化を示したものである。４０℃での反応に比較して、低
い転化率で反応が停止する傾向にある。
化を示したものである。４０℃での反応に比較して、低
い転化率で反応が停止する傾向にある。
（発明の効果）
−Ｌ述の如く本発明は有機溶媒中で反応を行う為、酵素
の自己分解による触媒能の劣化の問題がなく、また生成
物が溶媒中に溶解している為、連続法に有利に適用でき
る。
の自己分解による触媒能の劣化の問題がなく、また生成
物が溶媒中に溶解している為、連続法に有利に適用でき
る。
更に本発明は触媒である酸素が粉末であるため、触媒と
生成物あるいは未反応基質との分離が容易である。また
、充填層型背型反応器、流動層型反応器あるいは触媒が
分散した側型反応器にょるＰＡＰＥの連続生産も可能で
ある。
生成物あるいは未反応基質との分離が容易である。また
、充填層型背型反応器、流動層型反応器あるいは触媒が
分散した側型反応器にょるＰＡＰＥの連続生産も可能で
ある。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第３図は反応時間と転化率の関係を示すグラ
フ、第２図は、酵素濃度と反応初速度の関係を示すグラ
フである。 反応時ｒ！ＴＩ （１＋ｒ）
フ、第２図は、酵素濃度と反応初速度の関係を示すグラ
フである。 反応時ｒ！ＴＩ （１＋ｒ）
Claims (1)
- 粉末プロテアーゼを触媒とし、有機溶媒中で、Ｎ−保護
Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニン低級アルキ
ルエステルを反応させることを特徴とするＮ−保護Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエス
テルの製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16835185A JPS6229996A (ja) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Ｎ−保護ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16835185A JPS6229996A (ja) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Ｎ−保護ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6229996A true JPS6229996A (ja) | 1987-02-07 |
Family
ID=15866455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16835185A Pending JPS6229996A (ja) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Ｎ−保護ｌ−アスパルチル−ｌ−フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6229996A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0272564A2 (en) * | 1986-12-22 | 1988-06-29 | Hampshire Chemical Corporation | Enzyme mediated coupling reactions |
| JPH0239895A (ja) * | 1988-07-28 | 1990-02-08 | Daiwa Kasei Kk | ジペプチドの連続製造法 |
| FR2669638A1 (fr) * | 1990-11-24 | 1992-05-29 | Miwon Co Ltd | Procede de preparation de dipeptides. |
| EP0640687A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-01 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Methods of using, storing and transporting metal protease enzyme in a stabilized form |
| KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
-
1985
- 1985-07-30 JP JP16835185A patent/JPS6229996A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0272564A2 (en) * | 1986-12-22 | 1988-06-29 | Hampshire Chemical Corporation | Enzyme mediated coupling reactions |
| JPH0239895A (ja) * | 1988-07-28 | 1990-02-08 | Daiwa Kasei Kk | ジペプチドの連続製造法 |
| JPH0530439B2 (ja) * | 1988-07-28 | 1993-05-10 | Daiwa Kasei Kk | |
| FR2669638A1 (fr) * | 1990-11-24 | 1992-05-29 | Miwon Co Ltd | Procede de preparation de dipeptides. |
| EP0640687A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-01 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Methods of using, storing and transporting metal protease enzyme in a stabilized form |
| US5739023A (en) * | 1993-08-27 | 1998-04-14 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Stabilized neutral metalloprotease composition, a method of making the composition, and a method of transporting the composition |
| KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
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