JPS6112298A - ジペプチド類の連続製造法 - Google Patents
ジペプチド類の連続製造法Info
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- JPS6112298A JPS6112298A JP13247084A JP13247084A JPS6112298A JP S6112298 A JPS6112298 A JP S6112298A JP 13247084 A JP13247084 A JP 13247084A JP 13247084 A JP13247084 A JP 13247084A JP S6112298 A JPS6112298 A JP S6112298A
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技 術 分 野
本発明はＮ−置換フェニルアラニン又はＮ−置換アスパ
ラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステルとを
反応させてジペプチド類を連続的に収得する改良された
方法に関する。
ラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステルとを
反応させてジペプチド類を連続的に収得する改良された
方法に関する。
背 景 技 術
近年蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用ペプチドを合
成しようとする試みが活発になってきている。かかる蛋
白分解酵素を利用する反応は、合成反応と分解反応とが
平衡する平衡反応であり、平衡に関与していφ、化合物
を系外に除くことにより平衡を移動させることが可能で
ある。都合のよいとにペプチドの合成反応系（平衡系）
においては、多くの場合合成される縮合物のほうが原料
とする基質よりも疎水的なので、水に対する溶解度が低
く、多くの酵素法ペプチド合成はこの事実を利用して行
なわれている。また最近水と２相をなす有償溶媒を加え
て生成物を抽出により系外に除き、平衡を生成側に移動
させて反応を行なう方法が種々提案されている。
成しようとする試みが活発になってきている。かかる蛋
白分解酵素を利用する反応は、合成反応と分解反応とが
平衡する平衡反応であり、平衡に関与していφ、化合物
を系外に除くことにより平衡を移動させることが可能で
ある。都合のよいとにペプチドの合成反応系（平衡系）
においては、多くの場合合成される縮合物のほうが原料
とする基質よりも疎水的なので、水に対する溶解度が低
く、多くの酵素法ペプチド合成はこの事実を利用して行
なわれている。また最近水と２相をなす有償溶媒を加え
て生成物を抽出により系外に除き、平衡を生成側に移動
させて反応を行なう方法が種々提案されている。
ところで酵素法ペプチド合成において、酵素はくり返し
て再使用しなければコスト上問題があり、また安定性の
面からも酵素を固定化し工業化を可能にしようとする研
究がなされて来た。しかしながら生成物が沈澱として析
出することを利用した上記方法では、沈澱生成物と固定
化酵素との分離が困難なため実用上大きな障害となる。
て再使用しなければコスト上問題があり、また安定性の
面からも酵素を固定化し工業化を可能にしようとする研
究がなされて来た。しかしながら生成物が沈澱として析
出することを利用した上記方法では、沈澱生成物と固定
化酵素との分離が困難なため実用上大きな障害となる。
これに対し、系に右ｎ溶媒を加えて生成物を溶解したり
、抽出したりすると固定化酵素の使用が可能になると考
えられ、この着想からたとえばクール等は固定化α−キ
モトリプシンを用いて、水とジクロロメタンとの２相系
においてジペプチドの合成を行なっている（Ｐ、 Ｋｕ
ｈｌ 、 Ａ、 １（ｏｎｎｅｃｋｅ 、 Ｇ。
、抽出したりすると固定化酵素の使用が可能になると考
えられ、この着想からたとえばクール等は固定化α−キ
モトリプシンを用いて、水とジクロロメタンとの２相系
においてジペプチドの合成を行なっている（Ｐ、 Ｋｕ
ｈｌ 、 Ａ、 １（ｏｎｎｅｃｋｅ 、 Ｇ。
Ｄｏｒｉｎｇ、、”Ｈ，Ｄａｕｍｅｒ 、 Ｈ，−り、
、 Ｊａｋｕｂｋｅ。
、 Ｊａｋｕｂｋｅ。
Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ ｅｔｔｅｒｓ、 Ｖ
ｏｌ、 ２１ 、 ｐｐｓ ９３〜８９６ （１９８０
））。
ｏｌ、 ２１ 、 ｐｐｓ ９３〜８９６ （１９８０
））。
更に、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級
アルキ・ルエステルとからジペプチド類を一゛１造する
方法において、両者を水と混和しない右（１溶媒中、水
分を含有する固定化金属プロテア去−ケ（勺−モライシ
ン等）の存在下で反°応させる方法も提案されている（
特開昭５５− １３５５９５）。この方法は、酵素が右ｎ溶媒中で活性
が極めて低く、かつ不安定であるため、固定化酵素の細
孔内に水を含ませ、そこで酵素反応を行なわせるもので
ある。これは見かけ上有機溶媒の単一相系反応であるが
固定化酵素内部を水相と考えると、水の容量が有機溶媒
容はよりかなり少ない水−有機溶媒２相系での反応とも
考えられる。
アルキ・ルエステルとからジペプチド類を一゛１造する
方法において、両者を水と混和しない右（１溶媒中、水
分を含有する固定化金属プロテア去−ケ（勺−モライシ
ン等）の存在下で反°応させる方法も提案されている（
特開昭５５− １３５５９５）。この方法は、酵素が右ｎ溶媒中で活性
が極めて低く、かつ不安定であるため、固定化酵素の細
孔内に水を含ませ、そこで酵素反応を行なわせるもので
ある。これは見かけ上有機溶媒の単一相系反応であるが
固定化酵素内部を水相と考えると、水の容量が有機溶媒
容はよりかなり少ない水−有機溶媒２相系での反応とも
考えられる。
本発明者らも上記水−有機溶媒２相系でのペプチド合成
につき鋭意検討を重ねてきたが、かかる合成反応では一
般に酵素の種類は勿論のこと、原料とする基質相互の関
連、２等基質の保護基の種類、用いる有機溶媒の種類と
その濃度乃至使用量（対水化）等の変化により、合成さ
れるペプチドの収率、反応速度等は大きく左右され、ま
た上記各因子の組み合せに依存して使用酵素の失活乃至
活性低下が甚しく、未だに各因子の最適な組み合せは解
明されておらず、従来提案された方法といえども、たま
たは好結果が得られる場合はあっても、再現性に乏しく
、また連続化反応を行なう時には酵素の失活が著しく工
業的実施のための連続化は実際上不適当であることを確
認した。本発明者らは引き続く研究の結果、特に有機相
に対する水相の容積比を１／１前後とし、Ｎ−置換フェ
ニルアラニンを有機相に、Ｎ−ｆｉｔ換アスパラギン酸
を水相に添加溶解させることにより、酵素の失活が抑制
（エマルジョン調製時及び反応の進行を通じて基質の分
配による系内ｐ Ｉ−１の変動が好ましい範囲に保持さ
れる）され、反応系内基質濃度の向上、これによる反応
速度、反応収率の向上を計り（り、しかも固定化酵素を
繰返し使用して、非常に効率よく目的とする所望のジペ
プチドを収得できるという新しい事実を発見し、この知
見を基礎どし−Ｃ先に特願昭５８−１５３４２５号に係
る発明を完成した。
につき鋭意検討を重ねてきたが、かかる合成反応では一
般に酵素の種類は勿論のこと、原料とする基質相互の関
連、２等基質の保護基の種類、用いる有機溶媒の種類と
その濃度乃至使用量（対水化）等の変化により、合成さ
れるペプチドの収率、反応速度等は大きく左右され、ま
た上記各因子の組み合せに依存して使用酵素の失活乃至
活性低下が甚しく、未だに各因子の最適な組み合せは解
明されておらず、従来提案された方法といえども、たま
たは好結果が得られる場合はあっても、再現性に乏しく
、また連続化反応を行なう時には酵素の失活が著しく工
業的実施のための連続化は実際上不適当であることを確
認した。本発明者らは引き続く研究の結果、特に有機相
に対する水相の容積比を１／１前後とし、Ｎ−置換フェ
ニルアラニンを有機相に、Ｎ−ｆｉｔ換アスパラギン酸
を水相に添加溶解させることにより、酵素の失活が抑制
（エマルジョン調製時及び反応の進行を通じて基質の分
配による系内ｐ Ｉ−１の変動が好ましい範囲に保持さ
れる）され、反応系内基質濃度の向上、これによる反応
速度、反応収率の向上を計り（り、しかも固定化酵素を
繰返し使用して、非常に効率よく目的とする所望のジペ
プチドを収得できるという新しい事実を発見し、この知
見を基礎どし−Ｃ先に特願昭５８−１５３４２５号に係
る発明を完成した。
発明の目的
本発明は上記発明に引き続く研究の結果完成されたもの
であり、特に連続的実施に適した新しい改良方法を提供
するものである。
であり、特に連続的実施に適した新しい改良方法を提供
するものである。
発明の栴成
即ち本発明はＮ−フェニルアラニン又はＮ−置換アスパ
ラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステルとを
反応させてジペプチド類を製造するに当り、上記両共質
を水と混和しない有機溶媒に溶ε７した原石液中に、固
定化金属プロテアーゼを懸濁させ、撹拌下に上記原料液
を反応系内に供給しつつ反応を行なわせ、反応液を連続
的に回収することを特徴とするジペプチド類の連続製造
法に係る。
ラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステルとを
反応させてジペプチド類を製造するに当り、上記両共質
を水と混和しない有機溶媒に溶ε７した原石液中に、固
定化金属プロテアーゼを懸濁させ、撹拌下に上記原料液
を反応系内に供給しつつ反応を行なわせ、反応液を連続
的に回収することを特徴とするジペプチド類の連続製造
法に係る。
本発明方法において一方の基質とするＮ−＠換フェニル
アラニン又はＮ−置換アスパラギン酸におけるＮ−置換
基は、ペプチド合成反応に慣用されるアミノ基保護基で
あり、その例としては代表的にはベンジルオキシカルボ
ニル基を例示できる。
アラニン又はＮ−置換アスパラギン酸におけるＮ−置換
基は、ペプチド合成反応に慣用されるアミノ基保護基で
あり、その例としては代表的にはベンジルオキシカルボ
ニル基を例示できる。
伯の代表的保護基としては例えばｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を例
示できる。他方の基質とするフェニルアラニン低級アル
キルエステルの低級アルキル基も亦慣用されるアミノ酸
のカルボキシル保護基であり、その具体例としては炭素
数１〜４のアルキル基、特にメチル基を好ましく例示で
きる。２等原料基質は通常り体であるが、ＤＬ体であっ
てもよく、この場合り体のみが反応に関与する。また本
発明に利用する水と混和しない有機溶媒としては、具体
的には酢酸エチルを挙げることができる。
オキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を例
示できる。他方の基質とするフェニルアラニン低級アル
キルエステルの低級アルキル基も亦慣用されるアミノ酸
のカルボキシル保護基であり、その具体例としては炭素
数１〜４のアルキル基、特にメチル基を好ましく例示で
きる。２等原料基質は通常り体であるが、ＤＬ体であっ
てもよく、この場合り体のみが反応に関与する。また本
発明に利用する水と混和しない有機溶媒としては、具体
的には酢酸エチルを挙げることができる。
本発明方法においては、まず上記両原料基質を水と混合
しない石門？７Ｊ媒に溶解して原料液を調製づるつここ
で両原料基質の使用量即ち原料液中のｒ度は適宜に決定
され、反応速度の面からはできろだけ高Ｆ！度どするの
が好ましいが、通常例えばフェニルアラニン低級アルキ
ルエステルで゛は約４０〜４００ｍＭ濃度となる範囲と
するのが好ましく、これと反応させるべき例えばＮ−置
換アスパラギン酸では上記フェニルアラニン低級アルキ
ルエステルＦｆＡ度の約１／３〜２／３倍濃度となる範
囲とづるのが適当である。
しない石門？７Ｊ媒に溶解して原料液を調製づるつここ
で両原料基質の使用量即ち原料液中のｒ度は適宜に決定
され、反応速度の面からはできろだけ高Ｆ！度どするの
が好ましいが、通常例えばフェニルアラニン低級アルキ
ルエステルで゛は約４０〜４００ｍＭ濃度となる範囲と
するのが好ましく、これと反応させるべき例えばＮ−置
換アスパラギン酸では上記フェニルアラニン低級アルキ
ルエステルＦｆＡ度の約１／３〜２／３倍濃度となる範
囲とづるのが適当である。
本発明方法では、次いで上記の如くして調製される原料
液中に固定化金属プロテアーゼを懸濁さけ−１この！？
！消液形態で原料液中の両基質と固定化酵素とを接触反
応させる。ここで用いられる固定化ＦｆｆＪｉとしては
、例えば代表的にはサーモライシン等の金属プロテアー
ゼを常法に従い適当な支持体に固定した各種のものをい
ずれも使用できる。
液中に固定化金属プロテアーゼを懸濁さけ−１この！？
！消液形態で原料液中の両基質と固定化酵素とを接触反
応させる。ここで用いられる固定化ＦｆｆＪｉとしては
、例えば代表的にはサーモライシン等の金属プロテアー
ゼを常法に従い適当な支持体に固定した各種のものをい
ずれも使用できる。
上記適当な支持体としては例えばメルコーゲン（Ｍｅｒ
ｃｋｏａｅｌ Ｓ Ｉ １０００人、メルクくＥＭ
ｅｒｃｋ）社製）、アンバーライト ＩＲＣ５０（ロー
ム アンド ハース（Ｒｏｈｍ ’ ａｎｄＨａａｓ
Ｃｏ、）社製）、ダウエックス ＭＷＡ（ダウケミ
カル（ＤＯＷ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ 、 ）社
Ｗ！ａ）、ダウエックス ＭＳＣ（同上社製）、アンバ
ーライトＸＡＤ２（ローム アンド ハース社製）、ア
ンバーライトＸＡＤ７’（同上社製）、アンバーライト
ＸΔＤ８（同上社製）等の多孔性イオン交換樹脂担体を
例示できる。これらのうちではアンバーライトＸ Ａ
Ｄ ’７が最も好ましい。上記支持体へのサーモライシ
ン等の金属プロテアーゼの固定は、通常当分野でよく知
られている各種方法に従い行なうことができるが、特に
グルタルアルデヒド架橋法によるのが好ましい。該グル
タルアルデヒド架橋法におけるグルタルアルデヒド濃度
は、従来一般に採用されている２〜３％に比して約４〜
６倍の高濃度、特に約１２．５％前後とするのがよ（、
またサーモライシン等は例えばＮａ ３ｒ等の適当な溶
液に溶解して支持体に吸着後固定さゼるのが好ましい。
ｃｋｏａｅｌ Ｓ Ｉ １０００人、メルクくＥＭ
ｅｒｃｋ）社製）、アンバーライト ＩＲＣ５０（ロー
ム アンド ハース（Ｒｏｈｍ ’ ａｎｄＨａａｓ
Ｃｏ、）社製）、ダウエックス ＭＷＡ（ダウケミ
カル（ＤＯＷ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ 、 ）社
Ｗ！ａ）、ダウエックス ＭＳＣ（同上社製）、アンバ
ーライトＸＡＤ２（ローム アンド ハース社製）、ア
ンバーライトＸＡＤ７’（同上社製）、アンバーライト
ＸΔＤ８（同上社製）等の多孔性イオン交換樹脂担体を
例示できる。これらのうちではアンバーライトＸ Ａ
Ｄ ’７が最も好ましい。上記支持体へのサーモライシ
ン等の金属プロテアーゼの固定は、通常当分野でよく知
られている各種方法に従い行なうことができるが、特に
グルタルアルデヒド架橋法によるのが好ましい。該グル
タルアルデヒド架橋法におけるグルタルアルデヒド濃度
は、従来一般に採用されている２〜３％に比して約４〜
６倍の高濃度、特に約１２．５％前後とするのがよ（、
またサーモライシン等は例えばＮａ ３ｒ等の適当な溶
液に溶解して支持体に吸着後固定さゼるのが好ましい。
この方法によれば同酵素を水ｍ液として支持体に吸着さ
せる場合に比し溶液濃度を約５０倍高くでき、支持体単
位当りの酵素吸着肖を増加でき、通常の方法にくらべ活
性、安定性の畠い固定化サーモライシンを得ることがで
きる。
せる場合に比し溶液濃度を約５０倍高くでき、支持体単
位当りの酵素吸着肖を増加でき、通常の方法にくらべ活
性、安定性の畠い固定化サーモライシンを得ることがで
きる。
かくしてｉｌｌされる固定化サーモライシンは、通常支
持体１ｇ （湿潤重量）当り、サーモライシン０．０２
〜０．５ＣＩを固定されており、そのｇ当りの力価（合
成活性）は約０．１５〜３．０単位／ ２！ｉｉ！ ｎ
りである。尚この合成活性は、後記実施例１と同一操作
により酵素反応させて生成するジペブヂド爪を高速液体
クロマトグラフィーにより測定することにより求められ
るものであり、その１単位とは４０℃下に１分間に１μ
モルのジペプチドを生成する固定化酵素量（湿潤重量）
を言う。
持体１ｇ （湿潤重量）当り、サーモライシン０．０２
〜０．５ＣＩを固定されており、そのｇ当りの力価（合
成活性）は約０．１５〜３．０単位／ ２！ｉｉ！ ｎ
りである。尚この合成活性は、後記実施例１と同一操作
により酵素反応させて生成するジペブヂド爪を高速液体
クロマトグラフィーにより測定することにより求められ
るものであり、その１単位とは４０℃下に１分間に１μ
モルのジペプチドを生成する固定化酵素量（湿潤重量）
を言う。
本発明では特に上記固定化サーモライシン等の固定化酵
素を用いた両基質の反応を、反応容器中の両基質濃度、
固定化酵素内のｐＨ１反応生成物濃度及び固定化酵素が
夫々、反応系内で実質的に均−乃至一定となる条件下に
実施することが重要である。これは反応系を撹拌しつつ
原料液を連続的（又は間歇的）に供給し、反応液を連続
的に回収することにより行なわれ、これによりはじめて
酵素の失活を確実に防止して、迅速に且つ高収率で目的
どするペプチドを連続的に合成、収得できる。しかるに
上記固定化酵素を用いるといえども、これを通常のカラ
ムに充填し、これに原料液を流す時には、比較的速やか
に酵素が失活し、経時的に目的ペプチドの収量が低下し
、工業的実施が不適となる。即ち上記カラム反応器を利
用する場合、本発明者の研究によれば、カラム入口と出
口とで反応系内液の濃度および固定化酵素内部のｐＨが
異なり不均一であり、更にＮ−置換アスパラギン酸の濃
度は入口付近で高（出口付近では低く、また生成物と固
定化酵素内部のｐＨは逆に出口付近で高くなっている。
素を用いた両基質の反応を、反応容器中の両基質濃度、
固定化酵素内のｐＨ１反応生成物濃度及び固定化酵素が
夫々、反応系内で実質的に均−乃至一定となる条件下に
実施することが重要である。これは反応系を撹拌しつつ
原料液を連続的（又は間歇的）に供給し、反応液を連続
的に回収することにより行なわれ、これによりはじめて
酵素の失活を確実に防止して、迅速に且つ高収率で目的
どするペプチドを連続的に合成、収得できる。しかるに
上記固定化酵素を用いるといえども、これを通常のカラ
ムに充填し、これに原料液を流す時には、比較的速やか
に酵素が失活し、経時的に目的ペプチドの収量が低下し
、工業的実施が不適となる。即ち上記カラム反応器を利
用する場合、本発明者の研究によれば、カラム入口と出
口とで反応系内液の濃度および固定化酵素内部のｐＨが
異なり不均一であり、更にＮ−置換アスパラギン酸の濃
度は入口付近で高（出口付近では低く、また生成物と固
定化酵素内部のｐＨは逆に出口付近で高くなっている。
このためカラム入口近傍では固定化酵素に対する液中基
質量が多く、酵素内＋）Ｈが低く、これにより該酵素の
安定化因子であるＣａ２＋が上記基質により容易に取り
去られ、かくして酵素の失活が比較的速やかに惹起され
るものと考えられる。
質量が多く、酵素内＋）Ｈが低く、これにより該酵素の
安定化因子であるＣａ２＋が上記基質により容易に取り
去られ、かくして酵素の失活が比較的速やかに惹起され
るものと考えられる。
上記反応時の温度は通常２０〜４０℃とされるのがよい
。撹拌は固定化酵素が系内に均一に分散され、沈澱ゼず
しかも崩壊等を生じないことを前提として、通常比較的
ゆるやかな条件で行なうか又は振盪しながら行なうこと
ができ、反応時間中常に連続づ−る必要はなく、断続的
に行なうこともできる。また固定化金属プロテアーゼの
使用量は特に制限されず、支持体に固定化された酵素の
鼻、その活性等に応じて適宜決定され、これが多いと反
応時間が短縮され、また少ないとそれだ【ブ反応時間が
長くなる。
。撹拌は固定化酵素が系内に均一に分散され、沈澱ゼず
しかも崩壊等を生じないことを前提として、通常比較的
ゆるやかな条件で行なうか又は振盪しながら行なうこと
ができ、反応時間中常に連続づ−る必要はなく、断続的
に行なうこともできる。また固定化金属プロテアーゼの
使用量は特に制限されず、支持体に固定化された酵素の
鼻、その活性等に応じて適宜決定され、これが多いと反
応時間が短縮され、また少ないとそれだ【ブ反応時間が
長くなる。
本発明のりＹましい一実施態様によれば、例えばフェニ
ルアラニン低級アルキルエステルと、Ｎ−冒１５アスパ
ラギンｈ１とを反応させる場合、後者１ご対し前者を約
１．５〜３倍モル量含有する原料液を：”ｌ 整し、そ
の１Ｑに対して固定化サーモライシン杓１００〜５００
ｇを用い、約１００〜３００ｒｐｍの撹拌下に、２０〜
４０℃の温度で、固定化酵素容積基準のＳＶが約０．３
〜２．０／時間となる条件下に連続反応を行なう。
ルアラニン低級アルキルエステルと、Ｎ−冒１５アスパ
ラギンｈ１とを反応させる場合、後者１ご対し前者を約
１．５〜３倍モル量含有する原料液を：”ｌ 整し、そ
の１Ｑに対して固定化サーモライシン杓１００〜５００
ｇを用い、約１００〜３００ｒｐｍの撹拌下に、２０〜
４０℃の温度で、固定化酵素容積基準のＳＶが約０．３
〜２．０／時間となる条件下に連続反応を行なう。
また伯の好ましい実施態様では、上記と同様のの原料液
を単位時間当り１容積宛供給しつつ、生成物１容積宛回
収しつつ、反応系内液を約１ｏ容積宛系内に循環させ、
この循環によって系内を強制撹拌し、Ｓ■約０．６〜４
．０７時間で反応させる。
を単位時間当り１容積宛供給しつつ、生成物１容積宛回
収しつつ、反応系内液を約１ｏ容積宛系内に循環させ、
この循環によって系内を強制撹拌し、Ｓ■約０．６〜４
．０７時間で反応させる。
上記各反応により得られるジペプチドは、有機溶媒溶液
として得られ、これを分取し、濃縮晶析さぜるか又は抽
出等の操作を行なうことにより容易に分離することがで
き、これは更に通常の単離精製手段により精製すること
もできる。
として得られ、これを分取し、濃縮晶析さぜるか又は抽
出等の操作を行なうことにより容易に分離することがで
き、これは更に通常の単離精製手段により精製すること
もできる。
かくして本発明方法によれば、Ｎ−置換フェニルアラニ
ンとフェニルアラニン低級アルキルエステルどの反応に
よりＮ−置換フェニルアラニン−フェニルアラニン低級
アルキルエステルを、またＮ−置換アスパラギン酸とフ
ェニルアラニン低級アルキルエステルとの反応によりＮ
−［換アスパラギン酸−フェニルアラニン低級アルキル
エステルを夫々効率よく収得でき、之等は生理活性を有
する種々のペブヂドの合成反応試薬として、また特に後
者は砂糖の約２００倍の甘さを持つ合成甘味剤であるし
一アスパルヂルーＬ−フェニルアラニンメチルエステル
（アスパルテーム）の前駆体として有用なものである。
ンとフェニルアラニン低級アルキルエステルどの反応に
よりＮ−置換フェニルアラニン−フェニルアラニン低級
アルキルエステルを、またＮ−置換アスパラギン酸とフ
ェニルアラニン低級アルキルエステルとの反応によりＮ
−［換アスパラギン酸−フェニルアラニン低級アルキル
エステルを夫々効率よく収得でき、之等は生理活性を有
する種々のペブヂドの合成反応試薬として、また特に後
者は砂糖の約２００倍の甘さを持つ合成甘味剤であるし
一アスパルヂルーＬ−フェニルアラニンメチルエステル
（アスパルテーム）の前駆体として有用なものである。
実 施 例
以下本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
尚実施例においては、以下の方法により調？＋した固定
化サーモライシンを用いた。
化サーモライシンを用いた。
く固定化サーモライシンの調製〉
７．５ｇのサーモライシン（大和化成株式会社製、力価
９４７０ＰｔＪ／ｍ（］）を、５５ＭＮａ Ｓｒ及び’
ｌ ６．６ｍ Ｍ Ｃａ ＣＧ！２を含む１／４０Ｍ
１〜リス塩酸塩緩衝液＜ｏ Ｈ７，５）１２０脱に水冷
下に溶解し、この液に固定化担体であるアンバーライト
ＸＡＤ−７（ローム・アンド・ハース社製）３０ｏ（湿
潤重量）を加え、４℃で１７時間静かに振盪を行ないな
がら酵素を担体に吸着させた。上澄液の残存酵素蛋白量
をビューレット法で定量した所、初発酵素量の約７０％
の酵素が押体に吸着されていた。
９４７０ＰｔＪ／ｍ（］）を、５５ＭＮａ Ｓｒ及び’
ｌ ６．６ｍ Ｍ Ｃａ ＣＧ！２を含む１／４０Ｍ
１〜リス塩酸塩緩衝液＜ｏ Ｈ７，５）１２０脱に水冷
下に溶解し、この液に固定化担体であるアンバーライト
ＸＡＤ−７（ローム・アンド・ハース社製）３０ｏ（湿
潤重量）を加え、４℃で１７時間静かに振盪を行ないな
がら酵素を担体に吸着させた。上澄液の残存酵素蛋白量
をビューレット法で定量した所、初発酵素量の約７０％
の酵素が押体に吸着されていた。
上記上澄液７５瞠を除去した残りの固定酵素懸濁液に２
５％ゲルタールアルデヒド溶液７５ｍＱを加え、４℃で
約３時間振盪して架橋反応を行ない、その後冷却した０
、１Ｍトリス塩Ｒ塩緩衝液（ｐＨ７，５，５ｍＭ−Ｃａ
ＣＱ２を含む）約１Ｑ及びＩＭ−Ｎａ ＣＱを含む同緩
衝液約１Ｑで交互に２回洗浄して、固定化サーモライシ
ンを得た。
５％ゲルタールアルデヒド溶液７５ｍＱを加え、４℃で
約３時間振盪して架橋反応を行ない、その後冷却した０
、１Ｍトリス塩Ｒ塩緩衝液（ｐＨ７，５，５ｍＭ−Ｃａ
ＣＱ２を含む）約１Ｑ及びＩＭ−Ｎａ ＣＱを含む同緩
衝液約１Ｑで交互に２回洗浄して、固定化サーモライシ
ンを得た。
得られた固定化酵素は４℃で保存した。
実施例 １
５ ＩＩＩＭ Ｃａ ＣＱ ２を含む０．０５Ｍ−Ｙ
ＥＳ（２−シアノモルホリノ）エタンスルホン酸・モノ
水和物、同仁化学研究所製）溶液と、等容積の酢酸エチ
ルとを分液漏斗を用いて平衡化（４０℃）さゼ、酢酸エ
チルで飽和されたＹＥＳ溶液と、同ＭＥＳ溶液で飽和さ
れた酢酸エチル溶液とを調製した。
ＥＳ（２−シアノモルホリノ）エタンスルホン酸・モノ
水和物、同仁化学研究所製）溶液と、等容積の酢酸エチ
ルとを分液漏斗を用いて平衡化（４０℃）さゼ、酢酸エ
チルで飽和されたＹＥＳ溶液と、同ＭＥＳ溶液で飽和さ
れた酢酸エチル溶液とを調製した。
上記で得たＭＥＳ溶液飽和の酢酸エチル溶液５０ｍ１２
に、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（１−−ＰＩ
＋ｅＯＭｅ ）１．４３２ｇ （１６０ｍ Ｍ＞又
は２．１４８（１（２４０ｍ Ｍ）と、Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン？Ｉ９ （Ｚ−Ｌ−
Ａｓｐ）１．０６９ｏ （８０ｍ Ｍ）とを溶解して
基質溶液を調製した。
に、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（１−−ＰＩ
＋ｅＯＭｅ ）１．４３２ｇ （１６０ｍ Ｍ＞又
は２．１４８（１（２４０ｍ Ｍ）と、Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン？Ｉ９ （Ｚ−Ｌ−
Ａｓｐ）１．０６９ｏ （８０ｍ Ｍ）とを溶解して
基質溶液を調製した。
一方、上記で（ｑた酢酸エチル飽和のＭＥＳ溶液のｐ
Ｈを４Ｎ ＮａＯＨで６．０に調整し、この波１００
口Ｑに固定化酵素３（１（湿潤重量）を約１時間浸漬し
、固定化酵素担体内部の水相を同波で平ｔＦｉ化させ、
ガラスフィルターで付着水を充分除去した。
Ｈを４Ｎ ＮａＯＨで６．０に調整し、この波１００
口Ｑに固定化酵素３（１（湿潤重量）を約１時間浸漬し
、固定化酵素担体内部の水相を同波で平ｔＦｉ化させ、
ガラスフィルターで付着水を充分除去した。
この固定化酵素全量を、上記で調製した基質溶液（Ｌ−
ＰｈｅＯＭｅ ２４０ｍ Ｍ＋Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ８０ｍＭ
）が満されている供給口と取出口のついた円筒フラスコ
状反応器（容１２５ｍＱ、ウイー］〜ン礼製、ダブルア
ーム付セルスター）に懸濁させる。反応器を４０℃に保
持した恒温槽内に固定し、回転子を回して反応器内液を
撹拌しながら反応を開始させた。反応開始４時間後、基
質の一方を供給口より以下のように供給しつつ、取出口
より供給量と等量の反応液を抜き出した。即ち、ポンプ
により３０秒間０．４ｍ１２／分の流量で基質を供給し
、その後３分間回転子で撹拌を行ない、更に次の３分間
別のポンプで反応液を所定音１ （８ｍＱ）に減るまで
吸出す操作を繰返した。上記各操作の切換えはタイマー
により自動的に行なった。この方法における平均流」は
２鵬／時間、固定化酵素容積基準のＳＶは約０．７ｈｒ
−１であった。
ＰｈｅＯＭｅ ２４０ｍ Ｍ＋Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ８０ｍＭ
）が満されている供給口と取出口のついた円筒フラスコ
状反応器（容１２５ｍＱ、ウイー］〜ン礼製、ダブルア
ーム付セルスター）に懸濁させる。反応器を４０℃に保
持した恒温槽内に固定し、回転子を回して反応器内液を
撹拌しながら反応を開始させた。反応開始４時間後、基
質の一方を供給口より以下のように供給しつつ、取出口
より供給量と等量の反応液を抜き出した。即ち、ポンプ
により３０秒間０．４ｍ１２／分の流量で基質を供給し
、その後３分間回転子で撹拌を行ない、更に次の３分間
別のポンプで反応液を所定音１ （８ｍＱ）に減るまで
吸出す操作を繰返した。上記各操作の切換えはタイマー
により自動的に行なった。この方法における平均流」は
２鵬／時間、固定化酵素容積基準のＳＶは約０．７ｈｒ
−１であった。
反応器出口の反応液を経時的にサンプリングし、下記に
示す条件で高速液体クロマトグラフィーを行ない、生成
物量を定量した。
示す条件で高速液体クロマトグラフィーを行ない、生成
物量を定量した。
〈高速液体クロマトグラフィー〉
装 置：高速流体クロマトグラフ
（島津製作所製 ＬＣ−３Ａ型）
カラム：内径１０ｍ１１１×長さ３００ｍｍ充填剤：Ｔ
ＳＫ−ＧＥＬ ’ＬＳ−４１０Ｋ（ＯＤＳ−シリカ
東洋曹達社製） 溶 媒ニアセトニトリルー水（５５：４５、リン酸でｌ
）Ｈを２．５に調整） 検 出：紫外吸収（２５４ｏｍ） 結果を第１図に示す。第１図において横軸は連続反応時
間（時間）を、縦軸は生成物収率（％）を示す。
ＳＫ−ＧＥＬ ’ＬＳ−４１０Ｋ（ＯＤＳ−シリカ
東洋曹達社製） 溶 媒ニアセトニトリルー水（５５：４５、リン酸でｌ
）Ｈを２．５に調整） 検 出：紫外吸収（２５４ｏｍ） 結果を第１図に示す。第１図において横軸は連続反応時
間（時間）を、縦軸は生成物収率（％）を示す。
上記第１図より明らかな通り、上記本発明方法によれば
約７日間の連続反応期間中、Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ基準で約９
５％の収率が常に安定して維持された（図中テＨで示す
）。
約７日間の連続反応期間中、Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ基準で約９
５％の収率が常に安定して維持された（図中テＨで示す
）。
また８白目に基質溶液のＬ−ＰｈｅＯＭｅとＺ−Ｌ−Ａ
Ｓｐの比を２：１ （１６０ｍＭ：８０ｍＭ）に減らし
、ＳＶをＱ、５ｈｒ’として反応を継続したところ、前
記と同様に１０日月末で９５％の収率が安定して維持さ
れた（図中１ｖ−−一口で示ず）。
Ｓｐの比を２：１ （１６０ｍＭ：８０ｍＭ）に減らし
、ＳＶをＱ、５ｈｒ’として反応を継続したところ、前
記と同様に１０日月末で９５％の収率が安定して維持さ
れた（図中１ｖ−−一口で示ず）。
比較例 １
実施例１ど同様にして酢酸エチル飽和のＹＥＳ−Ｎａ
０）−１溶液（ｐ、Ｈ６，０＞で平衡化した固定化ｎ？
素３ａ （湿潤重量）を、４０℃に調節された恒）３
惜に）１潰された有機溶媒用カラム（内径１．１ｃｍ、
山善株式会社製）に充填し、これ４に実施例１と同様に
して￥１４製した基質溶液Ｌ−ＰｂｅＯＭｅ ２４０ｍ
Ｍ＋Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ８０ｍ Ｍ）を、カラム出口から
有機溶媒用ポンプ（協和精密社製）で吸引することによ
り、以下のように送入して反応を行なわせた。即ち基質
溶液を先づ３０秒間０．４１１１Ｑ／分の速度で流し、
そのＦ２６分間停止という操作を交互に繰返した。この
方法における平均流量は４ｍｌ／時間であり、固定化酵
素容積基準のＳＶは約１．４ｈ−’であった。
０）−１溶液（ｐ、Ｈ６，０＞で平衡化した固定化ｎ？
素３ａ （湿潤重量）を、４０℃に調節された恒）３
惜に）１潰された有機溶媒用カラム（内径１．１ｃｍ、
山善株式会社製）に充填し、これ４に実施例１と同様に
して￥１４製した基質溶液Ｌ−ＰｂｅＯＭｅ ２４０ｍ
Ｍ＋Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ８０ｍ Ｍ）を、カラム出口から
有機溶媒用ポンプ（協和精密社製）で吸引することによ
り、以下のように送入して反応を行なわせた。即ち基質
溶液を先づ３０秒間０．４１１１Ｑ／分の速度で流し、
そのＦ２６分間停止という操作を交互に繰返した。この
方法における平均流量は４ｍｌ／時間であり、固定化酵
素容積基準のＳＶは約１．４ｈ−’であった。
カラム出口で反応液を経時的にサンプリングし、実施例
１と同一条件で高速液体クロマトグラフィーを行ない、
生成物量を定量した。
１と同一条件で高速液体クロマトグラフィーを行ない、
生成物量を定量した。
結果を第２図に示す。該第２図より、反応初期ではＺ−
Ｌ−ＡＳＩ）基準による生成物（Ｎ−ベンゼンオキシカ
ルボニル−し−アスパラチル−Ｌ−）工二ルアラニン（
Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ ） 、アスパルテ
ームの前駆体）の収率は、約９８％であったが、反応時
間の経過と共に収率は低下し、４８時間後には２２％に
低下した。
Ｌ−ＡＳＩ）基準による生成物（Ｎ−ベンゼンオキシカ
ルボニル−し−アスパラチル−Ｌ−）工二ルアラニン（
Ｚ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ ） 、アスパルテ
ームの前駆体）の収率は、約９８％であったが、反応時
間の経過と共に収率は低下し、４８時間後には２２％に
低下した。
この時点で基質の供給を停止し、室温で０．１Ｍ−トリ
ス塩Ｗ！Ｉ塩緩衝液（ｐＨ７，５，５ｍＭ−ＣａＣＱ２
を含む）で洗浄し、カラム入口と出口ての固定化酵素の
残存活性を測定した所、それぞれ０．５％及び４７．３
％であり、失活の著しいものであった。
ス塩Ｗ！Ｉ塩緩衝液（ｐＨ７，５，５ｍＭ−ＣａＣＱ２
を含む）で洗浄し、カラム入口と出口ての固定化酵素の
残存活性を測定した所、それぞれ０．５％及び４７．３
％であり、失活の著しいものであった。
実施例 ２
実施例１において、Ｌ −ＰｈｅＯＭｅ ２００ｍ Ｍ
及びＺ−Ｌ−ＡＳｐ８０１１１ Ｍの基質溶液を用い、
その１０脱当り固定化酵素３ｇを利用し、４０℃下、Ｓ
ｖ約１ ｈｒ−＋（２、８ｍＱ／ｈｒ） （１）条件下
ニ反応ヲ行なった。
及びＺ−Ｌ−ＡＳｐ８０１１１ Ｍの基質溶液を用い、
その１０脱当り固定化酵素３ｇを利用し、４０℃下、Ｓ
ｖ約１ ｈｒ−＋（２、８ｍＱ／ｈｒ） （１）条件下
ニ反応ヲ行なった。
その結果反応開始２８０時間後も、９０％以上の高収率
が維持された。
が維持された。
これに対し、上記と同条件下に、比較例１のカラムを用
いる方法を実施した場合、反応開始８０時間での目的物
収率は約３０％に低下した。
いる方法を実施した場合、反応開始８０時間での目的物
収率は約３０％に低下した。
第１図は実施例１に示す方法における反応時間と収率の
関係を示すグラフであり、第２図は比較例１に示す方法
における同グラフである。 （以 上）
関係を示すグラフであり、第２図は比較例１に示す方法
における同グラフである。 （以 上）
Claims (1)
- （１）Ｎ−置換フェニルアラニン又はＮ−置換アスパラ
ギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステルとを反
応させてジペプチド類を製造するに当り、上記両基質を
水と混和しない有機溶媒に溶解した原料液中に、固定化
金属プロテアーゼを懸濁させ、撹拌下に上記原料液を反
応系内に供給しつつ反応を行なわせ、反応液を連続的に
回収することを特徴とするジペプチド類の連続製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13247084A JPS6112298A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | ジペプチド類の連続製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13247084A JPS6112298A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | ジペプチド類の連続製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6112298A true JPS6112298A (ja) | 1986-01-20 |
| JPS621719B2 JPS621719B2 (ja) | 1987-01-14 |
Family
ID=15082124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13247084A Granted JPS6112298A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | ジペプチド類の連続製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6112298A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0272564A2 (en) * | 1986-12-22 | 1988-06-29 | Hampshire Chemical Corporation | Enzyme mediated coupling reactions |
| EP0640687A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-01 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Methods of using, storing and transporting metal protease enzyme in a stabilized form |
| KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101569595B1 (ko) | 2010-09-28 | 2015-11-16 | 도레이 카부시키가이샤 | 에폭시 수지 조성물, 프리프레그 및 섬유 강화 복합 재료 |
-
1984
- 1984-06-26 JP JP13247084A patent/JPS6112298A/ja active Granted
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0272564A2 (en) * | 1986-12-22 | 1988-06-29 | Hampshire Chemical Corporation | Enzyme mediated coupling reactions |
| JPS63169993A (ja) * | 1986-12-22 | 1988-07-13 | ハンプシャー・ケミカル・コーポレーション | 酵素によるペプチド結合の生成反応 |
| EP0640687A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-01 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Methods of using, storing and transporting metal protease enzyme in a stabilized form |
| US5739023A (en) * | 1993-08-27 | 1998-04-14 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Stabilized neutral metalloprotease composition, a method of making the composition, and a method of transporting the composition |
| KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS621719B2 (ja) | 1987-01-14 |
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