JPH01104192A - ビブリオリシン結合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、１９８６年１２月２２日にアキヴアーＴ−グ
ロス（Ａｋｉｖａ　Ｔ、　Ｇｒｏｓｓ）により出願され
た「酵素介在結合反応」という標題で現在出願中の米国
特許出願番号９４４．０２７の一部継続出願である。

ジベグチド類の酵素介在合成法はよく知られている。す
なわち米国特許４，１６５．３１．　ｌ。

４．４３６．９２５および４，２５６，８３６は、不溶
性付加化合物類、例えば１モルのフェニルアラニンメチ
ルエステルと１モルのＮ−保護されたアスパルチル−フ
ェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物、を製造
するための水性媒体中での合成法を記している。米国特
許４，２８４，７２１は、Ｎ−保護されたアスパルチル
酸とフェニルアラニン低級アルキルエステル類とが、水
−混和性共溶媒を含有していてもよい水−非混和性溶媒
の存在下で、酵素により結合できるということを教示し
ているが、その際に水−混和性溶媒の量は酵素の不活性
化または抑制を防ぐため制限されなければならない。米
国特許４，１１６，７６８および４．１１９．４９３は
、水性媒体中での共溶媒としての水−混和性溶媒の使用
に関する同様な教示を含んでいる。同様に、アンゲヴア
ンドテ・ヘミイ・インターナショナル・エディッション
・イン・イングリッシュ（Ａｎｇａｗ、　Ｃｈｅｍ、　
Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、）、２４　（１９８５）
、２号、８７頁には、水−混和性溶媒を共溶媒として水
と混合して使用できるがプロテアーゼ酵素の触媒活性は
共溶媒の濃度が増加するにつれて減少することおよびキ
モトリプシンを酵素として使用する場合には５０％以上
では合成が生じないことが示されている。考えられる例
外として、ポリオール（例えば１．４−ブタンジオール
）を使用すると、ある場合には酵素を安定化させるかも
しれない。Ｎ−ホルミルジペプチド類（例えばＮ−ホル
ミルアスパルターメ）およびポリペプチド類を製造する
ための酵素結合のために水性または水性−有機媒体を使
用することも、ＷＯ８６０４９４２およびヨーロッパ特
許公報０１４９５９４中に記されている。

種々の科学雑誌に掲載されている多数の文献にも、水お
よび水−混和性有機溶媒と組み合わせた酵素の使用が論
じられており、そして溶媒、水の量、酵素および基質の
選択により変動すると思われる収率が得られている。ま
た、酵素が固定されているかどうかも一つの要素でもあ
るようだ。

５０１５０のアセトニトリル／水溶媒系の使用は、ニル
ソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）およびモスバフ　ハ（Ｍｏｓｂ
ａｃｈ）によりバイオチクノロシイ・アンド・バイオエ
ンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｂｉｏｅｎｇ、）　
、２６　ｓ　　ｌ　１４６（１９８’４）中に記されて
いる。この文献には、ブタンジオール／水（９０／Ｉ　
Ｏ）の使用も記されている。溶媒としてのアセトニトリ
ルの使用はＪ、Ｂ、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）およびＪ
、Ｆ、ベック（Ｂｅｃｋ）の「有機化学における生化学
系の適ズ、Ｃ，Ｊ、シー（Ｓｉｈ、）およびり、ペール
マン（Ｐｅｒ　１ｍａｎ）編集）、１０７頁ｆｆ、ニュ
ーヨーク、Ｊ、ウィリー、１９７６；並びにＪ、Ｂ、ジ
ョーンズおよびＭ、Ｍ、メヘス（Ｍｓｈｅｓ）　、カナ
デイアン・ジャーナル・オブ・ケミストリイ（Ｃａｎ。

Ｊ、　Ｃｈｅｍ、）、５７．２２４５　（１９７９）中
で論じられている。水−非混和性／水混和性溶媒類の混
合物中でのし一７エニルアラニンメチルエステル（すな
わちＬ−ｐｈｅＯＭｅ）およびＮ−保護されたＮ−カル
ポベンジルオキシーアスパルチン酸（すなわちＺ−ａｓ
ｐ）との結合はバイオチク８９（１９８５）中に記され
ている。コネツケ（Ｋｏｎｎｅｃｋｅ）　他はモンテシ
ュリ７ツ・フユル・ヘミ　イ　（Ｍｏｎａｔｓｈｒｉｆ
ｔｓ　　ｆｕｒ　　Ｃｈｅｍｉｅ）　　、　　１１２　
．４６９−４８１　（１９８１）、４７５頁中で、溶媒
としてのアセトニトリルの使用に言及している。

他の興味ある文献は、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、８９．３８
５　（１９８１）ｉザ・ジャーナル・オブ・ザ・オーガ
ニック・ケミストリイ（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、）
、ｉ土、２７２８　（１９８６）；コレクション・オプ
・チェコスロヴアク・ケミカル・コミュニケーション（
ＣｏｌｌＣｚｅｃｈｏｓ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、）
　、４９．２３１　（１９８４）；およびプロシーデイ
ンダス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ
イエンセス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、）　、８０．３２４１　（１９８３）である。

文献では、一般的には酵素、そして特にプロテアーゼ、
が水−混和性および水−非混和性有機溶媒類の両者中で
使用されると示されているが、水−混和性溶媒の方が幾
分劣っているような一般的な概念があるようだ。すなわ
ち、「はとんどの酵素類は親水性の水−混和性有機溶媒
中では不活性であり、このことは酵素からそれらの溶媒
中への必要水の分配により容易に理解される」と述べら
れている（Ａ、Ｍ、クリバッフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）　
、ケムテック（Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）、３５４頁、１９８
６年６月）。

本発明は、水−混和性有機溶媒中でのプロテアーゼの使
用に基づいている。

本発明は、Ｎ−置換されたアスパルチン酸およびフェニ
ルアラニン低級アルキルエステルからなる群から選択さ
れＩ；２種の基質の間のペプチド結合生成に対して触媒
作用を与えるためメタロエンドプロテアーゼ酵素を使用
する方法である。該エステルのベンジル系炭素原子は、
１個以上の水素と容易に置換可能な不安定な基で、置換
されていてもよい。高いｐＨ水準における酵素の製造は
、プロテアーゼの活性を改良し、そして競合するエステ
ラーゼ活性を相当減退させる。本発明の方法には、上記
の方法を水−混和性有機溶媒の存在下で実施するやり方
も包括される。

水−混和性溶媒の使用は多くの利点を与える。

予期に反して、酵素に必要な水を枯渇させることなくこ
れらの溶媒類を使用することができるー。例えば連続的
方法を実施する場合には、酵素活性用に必要な水の量は
溶媒系の２−１０重量％にあたる水を保持することによ
り供給でき、残りは水−混和性溶媒またはそれと他の溶
媒との混合物である。閉鎖系（例えば連続的反応とは対
照的な本質的にはバッチ反応）では、酵素およびそれの
基質が上記の２−１０重量％を供給するのに充分な水を
放出するであろう。しかしながら、酵素を充分大量の本
質的には無水の水−混和性溶媒と接触させる場合には、
溶媒中の水の量を約２％以下に下げそして酵素を変性さ
せるのに充分な水が抽出されることを理解すべきである
。１０％以上の、例えば５０％程度の、水の量も使用で
きるが、そうすると水−混和°性溶媒を使用する際の利
点が減じられるかもしれない。

多くの反応では、水−混和性溶媒を単独溶媒としてまた
は共溶媒として使用すると一相の液体相を与えることが
でき、それにより溶媒が水と非混和性である場合に生じ
る相移動に関する制限が避けられる。例えば、水−混和
性溶媒を使用すると、しばしば反応速度が速まる。また
、多くの有用な水−混和性有機溶媒の比誘電率は５〜６
０（好適には３０〜６０）であり、そのことはｌ相の液
相生成に寄与しており、なぜならばほとんどのアミノ酸
誘導体が比較的有極性でありしかも該溶媒中に可溶性で
あるからである。例えば、フェニルアラニンのメチルエ
ステルはヘキサンまたは酢酸エチル中よりアセトニトリ
ル中の方にはるかに可溶性である。

水−混和性溶媒の使用は、反応平衡を移行させ得る。例
えば、酢酸エチル中ではＮ−ホルミルアスパルチン酸と
フェニルアラニンメチルエステルとの反応は約ｌＯ％の
収率を与えるが、アセトニトリル中では約８０％の収率
を与える。

固定されていてもまたは「遊離」形であっても、酵素は
水−非混和性溶媒とはちがい水−混和性溶媒中でははる
かに安定である。「安定性」とは、酵素が水の抽出また
は他の手段により変性に対して抵抗性であることを意味
する。「溶媒系」という語は液体相の溶媒部分を示すた
めに使用され、そして水−混和性溶媒およびそれと共に
使用される共溶媒、例えば水もしくは水−混和性溶媒、
を包含している。

「水−混和性有機溶媒」という語は、水といずれの割合
でも混和可能であり一相系を形成できる有機液体を意味
する。適当な有機溶媒の例には、アルコール＠（例、ｔ
ｌｆエタノール、１−７’ロバノールおよび２−プロパ
ツール）；ポリオール類（例えば１，４−ブタンジオー
ルおよびジエチレングリコール）；ニトリル類（例えば
アセトニトリル）；およびエーテル類（例えばジオキサ
ンおよびテトラヒドロ７ラン）：並びに他の溶媒、例え
ばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよび
アセトン、が包含される。

アセトニトリルが好適な水−混和性溶媒である。

本発明の別の態様は、アセトニトリルを種々のアミノ酸
類および酵素類と共に使用して酵素介在結合反応により
ジペプチド類およびポリペプチド類を製造できる方法で
ある。この反応で使用するのに適しているアミノ酸類の
例には下記のものが包含される＝１！肪族アミノ酸類、
例えばモノアミノモノカルボン酸類、例えばグリシン（
Ｇ　Ｉ　ｙ）、アラニン（Ａ　Ｉ　ａ）　、バリン（Ｖ
ａｌ）、ノルバリン（ｎｏ　ｒ−Ｖａ　ｌ）　、ロイシ
ン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（ｉｓｏ−Ｌｅｕ）、ノル
ロイシン（ｎｏｒ−Ｌｅｕ）；オキシアミノ酸類、例え
ばセリン（Ｓｅｔ）、スレオニン（Ｔｈ　ｒ）　、ホモ
−セリン（ｈｏｍｏ−３ｅｒ）；硫黄−含有アミノ酸類
、例えばメチオニン（Ｍｅｔ）またはシスチン（Ｃｙ　
ｓ　Ｓ）およびシスティン（Ｃｙ　ｓ　Ｈ）；モノアミ
ノジカルボン酸類、例えばアスパルチン酸（Ａｓｐ）お
よびグルタミン酸（Ｇｌｕ）；ジアミノモノカルボン酸
類、例えばオルニチン（Ｏｒ　ｎ）　、リシン（Ｌｙｓ
）、アルギニン（Ａｒｇ）；芳香族アミノ酸類、例えば
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、並
びに複素環式アミノ酸類、例えばヒスチジン（Ｈ４ｓ）
、トリプトファン（Ｔｒｐ）。（アミノ酸は当分野で普
通に使用されている記号により示される。） 溶媒の選択においては注意を払わなければならない。例
えば、酵素が金属を含有している場合には、溶媒は金属
と錯体形成するものであってはならない。ＤＭＦおよび
ＤＭＳＯはメタロプロテイナーゼ中の金属成分と錯体形
成するようであり、従ってそれらは好ましくは溶媒系の
５０％（モル基準で）以下に制限すべきであり、残りは
水または他の溶媒であることができる。溶媒は、それが
酵素または基質と化学的に反応しないという意味で、不
活性でなければならない。例えば、アセトンが溶媒であ
る場合には、基質または酵素のアミン基との反応を最少
にするような条件下でそれを使用すべきである。

アシル供与体として作用するアミノ酸類は一般的にＮ位
置に保護基を有している。適当なＮ−保護基の例は、ペ
プチド合成で通常使用されているもの、例えばターシャ
リー−アルコキシカルボニル基、例えばｔ−ブチルオキ
シカルボニル（ＢＯＣ−）、ｔ−アミルオキシカルボニ
ル（ｔ　−Ａ。

ｃ）＋不活性置換基で置換されていてもよいベンジルオ
キシカルボニル基、例えばベンジルオキシカルボニル（
Ｚ−）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（ＰＭ
Ｚ−）　、３．５−ジメトキシベンジルオキシカルボニ
ル（ｚ　（ｏＭｅ）ｚ−）、２．４．６−ドリメチルベ
ンジルオキシカルボニル（ＴＭＺ−）、ｐ−フェニルア
ゾベンジルオキシ力ルポニル（ＰＺ−）、ｐ−トルエン
スルホニル（ｔｏｓｙ＋−）；、ｏ−ニトロフェニルス
ルフェニル（Ｎ　ｐ　ｓ−）など、である。ホルミルも
使用できる。

ジペプチドまたはポリペプチドの生成においてアミノ部
分を供与するのに適しているアミノ酸類の例には、上記
のものは全て包含される。フェニルアラニンが好適であ
り、そして特にベンジル系炭素のところで置換された誘
導体類、例えばベンジル系炭素が例えば接触加水素分解
または電気化学的還元分解の如き方法により少なくとも
１個の容易に置換可能な基で置換されている誘導体類、
を使用できる。適当に置換されたフェニルアラニン誘導
体類の例には、式 ％式％ ［式中、 Ｐｈはフェニル（置換されているかまたは未置換）であ
り、 Ｘは一ＯＨｓ　　ＳＨ％　−Ｃ　Ｉｓ　−Ｂ　ｒｓ　−
Ｉｓ−ＯＣＯＣＨ３、−０ＣＯＯＣＨ３、−ＮＨ。

または−ＳＣＨ．であり、そして Ｒは炭素数が１〜４の低級アルキル基である］に相当す
るものが含まれる。

アミノを供与するアミノ酸は適当なＣ−末端保護基によ
り保護されている。アミン成分のカルボキシル基用の保
護基（Ｃ−末端保護基）には、アルコキシ基、例えばメ
トキシ（−０Ｍｅ）、エトキシ（−０Ｅｔ）ｉターシャ
リー−アルコキシ基、例えばｔ−ブトキシ（　−〇ーｔ
ーＢｕ）；並びに置換されていてもよいベンジルオキシ
基、例えばベンジルオキシ（−０Ｂｚｌ）、ｐ−二ト９
ベンジルオキシ（−０Ｂｚ　Ｉ　（ｐ−Ｎｏｔ））　、
ベンズヒドリルオキシ（−０Ｂｚｈ）、ベンジルアミノ
（−ＮＨＢｚ　Ｉ）　、２．４−ジメトキシベンジルア
ミノ（−ＮＨＤＭＢ）　、ベンズヒドリルアミノ（−Ｎ
ＨＢｚｈ）または置換されていないアミノ（−ＮＨ，）
などが包含される。また、アミドおよびヒドラジド基を
Ｃ−末端保護基として使用することもできる。

水−混和性有機溶媒類は本質的に無水のＦ生の」状態で
使用することもまたは水および／または他の有機溶媒類
（水−非混和性および水−混和性溶媒類の両者）と組み
合わせて使用することもできる点を理解すべきである。

水を使用する場合、その量は一般的に全溶媒系（水およ
び水−混和性溶媒）を基にして５０％以下にすべきであ
る。しかしながら、ある種の溶媒は金属イオンと錯体形
成しそしてそれにより種々のメタロプロテイナーゼ酵素
を不活性化させるようであり、従ってそのような溶媒類
と共に使用される水の量は一般的に溶媒系の５０重量％
以上でなければならない。錯体形成する溶媒の例には、
ＤＭＦおよびＤＭＳＯが含まれる。溶媒が乾燥状態すな
わち生の状態である場合、それは酵素を固定するために
使用される基質により吸収されている幾分かの水（例え
ば溶媒の約１０重量％まで）を含有しているであろう。

好適なアセトニトリル溶媒に関して言えば一般的に水の
量は最少値に保たれており、そして「生の」アセトニト
リルが良好な溶媒であることが見いだされており、その
場合、供給される水は基質から生じるものだけである。

しかしながら、連続的に実施する時には、アセトニトリ
ル溶媒中の水の量は少なくとも１０重量％の水準に保た
れなければならず、そして一般的には５〜５０重量％の
範囲内となるであろう。酵素の変性を避けるにはこの水
量が推奨され、そして基質の溶解も助けるであろう。該
方法を連続的に実施する場合には、希望により、水を基
質流を介して加えることもできる。

特にＮ−保護されたアスバルチン酸とフェニルアラニン
低級アルキルエステル類およびそれらのベンジル置換さ
れた誘導体類との結合（バッチ式または連続的方法）に
おいては、アセトニトリルを種々の量の水と共に加える
ことができるが、水の量が５０重量％以下であることが
好ましく、すなわらＣＨ３ＣＮ　／　Ｈ２０比は１以上
、好適には約２．５以上、でなければならない。

当技術の専門家に公知の方法を使用して、多数の要素、
例えば基質およびジペプチドまたはポリペプチド生成物
の溶媒中での溶解性、水または他の共溶媒の存在量、共
溶媒の酵素に対する影響および他の要素、を考慮にいれ
ると、それぞれの結合反応用の有機溶媒を最適に選択す
ることができる。

メタログロチアーゼ類がペプチド結合生成に関与するこ
とは知られている。本発明では、ビブリオ・プロテオリ
チクス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）
ＡＴＣＣ５３５５９を上記の水−混和性有機溶媒系と共
に使用する。このグロテアーゼは「ビブリオリシン」と
称されてきており、そしてここでもその名前で呼ぶこと
にする。■、プロテオリチクスの他の菌株もＡＴＣＣま
たは個人的な生産源から入手できるが、希望する酵素を
製造しないかもしれない。■、プロテオリチクス　ＡＴ
ＣＣ５３５５９菌株は、メリーランド州　２０８５２、
ロックヴイル、パークローン・ドライブ、１２３０１の
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに保管
されている。培養物は利用に関しては何の制限なしに保
管されており、そして本件の譲渡人であるＷ、Ｒ、ブレ
ース・アンド・カンバニイはこの培養物をＡＴＣＣを通
じて現在出願している特許の認可の下で公的に永久に利
用できることが保証されている。酵素は精製された形で
用いる必要はなく、ビブリオリシン素を含有しておりそ
して１種以上の他の酵素も含んでいるかもしれない多少
粗製状態の調合物（例えば濃縮され部分的に精製された
発酵肉汁）であってもよい。

公知の如く、多くのプロテアーゼ酵素はエステラーゼ活
性も示す。この活性は場合によっては水−混和性有機溶
媒の適当な選択により減少させることができる。例えば
、アセトニトリルはエステラーゼ活性を減少させる際に
ある程度の効果を示す。また、エステラーゼ活性が別の
蛋白質により起因するような場合、または両者の位置が
同じ分子上にあると仮定してエステラーゼ活性の位置が
プロテアーゼ位置とは異なっている場合、ざらにエステ
ラーゼ活性を減少させるために抑制剤を使用することも
できる。適当な抑制剤はカラスムギ、ファバ、インゲン
マメおよびトマトから抽出できる。抽出方法は、日本農
芸化学会誌、３１，３８頁（１９５７）中に開示されて
いる。抑制剤は純粋物質である必要はなく、粗製抽出物
であってもよい。

また、ビブリオリシン調合物中に存在しているエステラ
ーゼ活性を、ｐＨを高めた条件下で酵素を製造すること
により減少させることもできる。

ビブリオ・グロテオリチクス　ＡＴＣＣ５３５５９を、
約８．０〜約８．６の、好適には約８．４〜約８．６の
、ｐＨにおいて培養することにより、エステラーゼ不純
物をほとんどまたは全く含有していないビブリオリシン
酵素を入手できる。高められたｐＨにおける製造は、こ
こでは望ましくないエステラーゼ活性の製造減少および
望ましいプロテアーゼ（ビブリオリシン）活性の製造増
加の両方をもたらすことを示している。エステラーゼ活
性が減少するにつれて、ビブリオリシンは上記の如く粗
製形でまたは精製形で利用できる。

プロテアーゼ酵素は本発明では結合された形または遊離
形で使用できる。「結合された」という語は、酵素が適
当な不溶性担体上に固定されて回収および再使用可能な
錯体を形成することを意味する。適当な固定方法には、
物理的吸着、イオン結合、共有結合、架橋結合およびそ
の後の吸着、または本質的に反応媒体中に不溶性である
担持物質中でのもしくは該物質上での酵素の別の包囲方
法などが包含される。適当な基質には、ケイ素系物質（
例えば多孔性シリカ）、非−ケイ素系セラミックス（例
えばアルミナ）、または天然もしくは合成有機重合体物
質（例えばアンベルライトＸＡＤ−７、ポリアクリルア
ミド共重合体、アガロース、およびアルギネート）が包
含される。

それとは対照的に、「遊離」酵素は結合されておらず、
そしてそれは溶媒系中に溶解または懸濁させることがで
きる。アセトニトリル中では、酵素を最初に結合させた
り上記の如く基質上に固定させたすせずに、懸濁した固
体沈澱状態で使用できる。固体酵素は、アセトニトリル
の存在下で実施例■に記されているようにして沈澱させ
ることにより、製造される。

高濃度の基質アミノ酸類を準備して反応を納得のいく反
応速度で実施することが好ましい。結合反応用には、各
基質は水中でのそれの溶解度内の濃度で使用される。し
かしながら、反応が進行するにつれて原料が消費される
ため、懸濁状態の基質部分を有することもできる。溶液
中では基質原料はそれぞれ約０．ＯＯＩＭ〜約２Ｍの範
囲内の、好適には約０．１Ｍ〜約１Ｍの間の、濃度にお
いて存在すべきである。

Ｎ−置換されたアスパルチン酸／フェニルアラニン低級
アルキルエステル結合反応に関しては、両方の基質がＬ
配置である時には酸／エステルモル比は１：ｌのモル比
であり得る。実際には、それらはｌＯ：ｌ−１：１０の
間の、好適には３：１−１：５の間の、範囲にわたる比
で使用できる。

原料がＤＬ配装である場合には、それらは上記の如きＬ
−異性体類の比を生じるような量で使用できる。

本発明は例えば、水を含有している固定された酵素を再
出発原料も含んでいる水と混和性である有機溶媒中に懸
濁させ、そして次に撹拌しながら反応を進行させること
により、実施できる。反応の完了時に、生成物を含有し
ている媒体を濾過または他の分離方法にかけることによ
り、固定された酵素および反応生成物を含有している懸
濁液または溶液を分離できる。

本発明はまた、水を含有している固定された酵−素を充
填しであるカラム中に２種の出発原料を含有している水
−混和性有機溶媒を流すことによっても、実施できる。

この方法では反応を連続的に実施でき、そしてこれは本
発明の工業的用途には有利である。

反応温度は普通的ｌＯ〜約３５℃の間の、好適には約２
０〜約２５℃の間の、範囲である。

反応時間は、２種の基質の濃度、固定された酵素の量、
予め決められた転化速度などに依存している。しかしな
がら、普通は約０．５〜約２００時間の、好適には約２
〜約２４時間の、反応時間で充分である。

希望する生成物がアスパルチルメとしテ知うしているジ
ペプチドである場合には、反応生成物すなわちＮ−置換
されたアスパルチル−し−フェニルアラニンメチルエス
テルを例えば反応混合物の濃縮およびその後の結晶化、
抽出などの如き一般的な手段により単離できる。反応混
合物は固定された酵素から、当接術で公知の適当な方法
により分離できる。分離後に、固定された酵素を再使用
できる。

本発明を実施する際には、アミノ酸基質はＤＬ配装また
はＬ配置であってよい。酵素がＬ異性体に固有でありし
かもＤＬ異性体を使用する場合には、Ｌ異性体だけが反
応中番コ沈澱し、一方り異性体は未反応のまま反応媒体
中に残存している。酵素が立体固有性を有していない場
合には、Ｄ異性体も使用でき、例えばり、Ｌ固有性を有
していないセリンの如き酵素を用いるならアミノ供与体
（例えばアラニンまたはフェニルアラニン）はＤであっ
てもよい。

実施例１．ビブリオ・プロテオリチクス　ＡＴＣＣ５３
５５９の発酵によるビブリオ リシンの製造 １、種培養物の製造 Ａ、製造　１００ｍｆｆの種媒体を５００＋ｌ！１２の
目盛り付きエル、レンマイヤー・フラスコ中に加え、そ
して１２１℃のオートクレーブ中に２０分間入れた。

Ｂ、接種　−７０’Ｏの１個の微生物のアンプルを水道
水の下で解凍し、次に種フラスコに無菌的に移した。

Ｃ１■　接種フラスコを２５８ｒｐｍ／２７０Ｃにおい
て１８時間培養した。

Ｄ、６４０ｎ、ｍ、において測定された成長度は４．０
〜６．０の間の光学濃度であり、肉汁のｐＨは約８．０
であった。

２、大規模発酵　１．５リツトルの発酵基中で、１．０
リツトル容量 Ａ、艮菫　全ての媒体成分（ポリベグトン−４０ｇ１海
塩−２０ｇ　、　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２ｏ−０，４
ｇ％Ｐ−２０００−０−２ｍ＜２）を容器にかえ、そし
て殺菌するまではｐＨは調節しなかった。それはｐＨ７
，０近くであるはずである。オートクレーブ中で殺菌す
る場合には、１．０リツトル容器を１２１℃の温度にお
いて４５分間殺菌すべきである。

Ｂ、接種 （１）第一セットおよび二重検査操作条件：ａ、６Ｎ　
ＮａＯＨを用いてｐＨを ８．６にする。

ｂ、温度−２７°Ｃ０ ｃ、ＲＰＭ−１０００゜ ｄ、溶解された酸素は１．０−ＬＰＭ 空気において１００％と読む。

（２）ｌｏｍＱの種肉汁を用いて接種。

Ｃ０操作 （１）上記の条件を保つ。

（２）溶解された酸素はピーク需要量で約７５−８０％
に低下するであろう。

（３）下記の事項を監視する： ａ、光学的密度−６４０ｎｍ吸収値で 読みとる。約１２−１４時間で約 １０−１２　０．０．ニ８ケルヒー ク。

ｂ、メタロエンドペプチダーゼの製造 −約０．１単位／秒。

３、ビブリオリシンの収穫および濃度 的１０−１４時間の発酵時に、生成物酵素はＦＡＧＬＡ
試験により測定された約０．ｌｏｍＱ、２０ｇ／’）ッ
トルの滴定値に達した。細胞が発展段階（約１０−２５
％）となるまで溶解する前に肉汁を収穫した。

最初に、肉汁全体を遠心して細胞部分を分離した。次に
上澄み液を、アミコン５ＩＯＹｒＯまたは５ＩＹＩＯ限
外濾過カートリツジを使用して、７０−１００倍に濃縮
した。

ビブリオリシン酵素はしばしば１種以上のアミノペプチ
ダーゼを不純物として含んでいる。アミノペプチダーゼ
活性（下記で定義されている）が約０．７単位／秒以下
に低下するまでビブリオリシン濃縮物を周囲温度（例え
ば２５℃）で約１１．５のｐＨにおいて約６時間保つこ
とにより、これらの酵素の望ましくないエステラーゼ活
性を減じることができた。最後に、処理されたエステラ
ーゼを含んでいないビブリオリシン濃縮物をそれの伝導
性の読みが１．０ｍＳ以下になるまで脱イオン水で洗浄
した。アミノペプチダーゼ活性は下記の工程により試験
できた： アミノペプチダーゼ アミノペプチダーゼ（エステラーゼ）活性は、Ｌ−ロイ
シン−ｐ−ニトロアニリド（ミズーリ州、セントルイス
のシグマ・ケミカル・カンパニイ）の放出によるＯ５ｎ
ｍにおける吸収率の増加を監視することにより、測定で
きた［プレスコツト（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ）　、　Ｊ　、
　Ｍ、他、バイオヶミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）　、２４　：　５３５０−５３５６（１９８５）
Ｊ、該試験は、０．７ｍ（ｌの０．００１Ｍロイシンｐ
−ニトロアニリド、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７
，０４）および適当量の酵素を使用して、実施された。

活性単位は下記の如く定義されているニ アミノペプチダーゼ単位／ｍＱ △絶対７労×（クヴエット容量＋試料容量）×１０９．
６６ｘ（試料容量） ここで容量はマイクロリットルで測定され、そして９．
６６はＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドに関するマイ
クロモル吸光係数である。

ビブリオリシン活性 ビブリオリシン活性の測定用に、アゾカゼイン（ミズー
リ州、セントルイスのシグマ−ケミカル・カンパニイ）
を基質として使用できた。ビブリオリシンを、ｌ　、Ｏ
ｍ　ｇ　／　ｍＱのアゾカゼインを含有してい゛る５０
ｍＭトリス−ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）と共に培養し
た。３７℃における１０分間の培養後に、０，５ミリリ
ツトルの１０重量／容量％のトリクｃ７ｒ：１酢酸を加
え、直後に混合し、そして混合物を氷の上で１０分間保
った。混合物を次に遠心し、そして生成した上澄み液の
光学濃度を４２０ｎｍにおいて、緩衝されたアゾカゼイ
ン溶液中に酵素または不活性化された酵素を含有してい
ない対照用と対比して測定した。

実施例Ｉ［、Ｎ−ホルミルーアスバルチン酸の結合実施
例Ｉに記されている如くして製造されたビブリオ・プロ
テオリチクスからの発酵肉汁を濃縮し、そして洗浄した
。発酵肉汁中の中性プロテアーゼをアンベルライトＸＡ
Ｄ−７上で下記の工程により固定した：アンベルライト
ＸＡＤ−７樹脂ビーズをエタノールおよび次に水で洗浄
して、微細物を除去した。洗浄されたビーズを０．０５
ＭＭＥＳ−０，０２Ｍ　ＣａＣｌ、溶液（ＭＥＳは２［
Ｎ−モルホリノコニタンスルホン酸）中に再懸濁させた
。アンベルライトＸＡＤ−７を真空濾過することにより
過剰の水を除去した後に、ビーズ（ｌｏｏｇ）を９．０
ｇのビブリオリシンを含有している４℃の１００＋ＩＱ
の０．０５Ｍ　ＭＥＳ−０，０２ＭＣａＣ＋２緩衝液中
に懸濁させた。−夜振盪した後に、固定されたビブリオ
リシンをＭＥＳ−ＣａＣＩ□緩衝液で充分洗浄し、そし
て次に真空濾過した。

Ｎ−ホルミルーアスパルチン酸（１，９３ｇ）およびＬ
−フェニルアラニンメチルエステル（６，２ｇ）をアセ
トニトリル中に溶解させて、１５０ｍＣの最終的な量と
した。１４．５ｇの湿っている固定された中性プロテア
ーゼを添加した後に、室温で２４時間反応させた。最終
生成物濃度（Ｎ−ホルミル−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステル）をＨＰＬＣにより測定する
と、１１．７ｇ／Ｑであった。溶媒を真空中で蒸発させ
、残渣を酢酸エチル中に溶解させ、そしてＩ　ＮＨＣｌ
で２回洗浄した。水相を該酢酸塩で処理した。−緒にし
た有機相を食塩水で洗浄し、そして無水Ｍｇ５Ｏ，上で
乾燥した。溶媒を蒸発させると無色の固体が得られ、そ
れをジクロロエタンから結晶化させた。それはＮ−ホル
ミルーアスパルターメであると同定された。

実施例■−懸濁させた固体酵素 実施例■で製造されたビブリオリシンの静かに撹拌され
ている溶液（５−０＋＋１＜２．１０−１１ｍｇの蛋白
質／ｍ１２）に、アセトニトリル（４５＋＋＋１２）を
０°Ｃにおいて滴々添加した。生成した沈澱を遠心によ
り集めた。この粗製酵素調合物を８０ｍＭのホルミルア
スパルチン酸および２４０ｍＭのＬ−フェニルアラニン
メチルエステルの９５％アセトニトリル溶液に加えた。

反応混合物を５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析結果は、混
合物が６５ｍＭのホルミルアスパルターメを含有してい
ることを示した。

本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。

１、アミノ酸もしくはＮ−末端保護基を有するぺブチド
またはそれらの塩の酸成分を、ペプチド結合の生成に介
在するビブリオリシンの存在下で、アミノ酸もしくはＮ
−末端保護基を有するペプチドまたはそれらの塩のアミ
ン成分と反応させることによる、ジペプチドまたはポリ
ペプチドの製造方法。

２、反応を水−混和性溶媒の存在下で実施する、上記ｌ
に記載の方法。

３、溶媒がアセトニトリルである、上記１に記載の方法
。

４、溶媒の少なくとも５０重量％がアセトニトリルであ
りそして残りが水である、上記２に記載の方法。

５、溶媒の少なくとも５０重量％がアセトニトリルであ
りそして残りが水、１種以上の水−混和性有機溶媒また
はそれらの混合物である、上記２に記載の方法。

６、水−混和性溶媒が１価または多価アルコール、ニト
リル、エーテルまたはそれらの混合物である、上記２に
記載の方法。

７、アミノ酸成分がＮ−置換されたアスパルチン酸また
はそれの塩およびベンジル炭素原子が水素または１種以
上の水素で容易に置換可能な不安定な基で置換されてい
るフェニルアラニン低級エステルである、上記ｌに記載
の方法。

８、Ｎ−保護基がホルミルまたはベンジルオキシカルボ
ニルである、上記７に記載の方法。

９、フェニルアラニンペンシル炭素がヒドロキシルで置
換されている、上記７に記載の方法。

１０、エステルの低級アルキル置換基がメチルである、
上記７に記載の方法。

１１、方法をエステラーゼ抑制剤の存在下で実施する、
上記１に記載の方法。

１２、Ｎ−保護基がターシャリーーアルコキシ力ルボニ
ル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−トルエンスルホニ
ル、０−ニトロフェニルスルホニルまたはホルミルであ
る、上記７に記載の方法。

１３、フェニルアラニン低級アルキルエステルが式 ％式％ ［式中、 Ｐｈはフェニルであり、 Ｘは−○Ｈ，−３Ｈ，−ＣＩ、−Ｂｒ、　−１、−Ｐ　
ＣＯＣＨｓ、−０ＣＯＯＣＨ，、−ＮＨ。

またはＳＣＨ，であり、そして Ｒは炭素数が１〜４のアルキル基であるｊに相当する、
上記１に記載の方法。

１４、Ｘが−ＯＨであり、モしてＲがメチルである、上
記１３に記載の方法。

１５、ビブリオリシンをビブリオ・プロテオリチア７！
、ＡＴＣＣ５３５５９の培養物から製造する、上記１に
記載の方法。

１６、ｐＨが約８．０〜約８．６の間である条件下でビ
ブリオリシンを製造する、上記１５に記載の方法。

１７、該ｐＨが約８．４〜約８．６の間である、上記１
６に記載の方法。

１８、反応温度が約１０〜約３５°Ｃの間である、上記
１に記載の方法。

１９゜ビブリオリシンを懸濁された固体沈澱状で使用す
る、上記３に記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、アミノ酸もしくはＮ−末端保護基を有するペプチド
   またはそれらの塩の酸成分を、ペプチド結合の生成に介
   在するビブリオリシンの存在下で、アミノ酸もしくはＮ
   −末端保護基を有するペプチドまたはそれらの塩のアミ
   ン成分と反応させることによる、ジペプチドまたはポリ
   ペプチドの製造方法。