JPS6339237B2 - - Google Patents

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JPS6339237B2
JPS6339237B2 JP55500907A JP50090780A JPS6339237B2 JP S6339237 B2 JPS6339237 B2 JP S6339237B2 JP 55500907 A JP55500907 A JP 55500907A JP 50090780 A JP50090780 A JP 50090780A JP S6339237 B2 JPS6339237 B2 JP S6339237B2
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amino acid
peptide
reaction
synthesis
enzyme
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JP55500907A
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Yatsuku Taningu Yohansen
Furetsudo Uidoma
Kurausu Buretsudamu
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KARURUBERUGU BAIOTEKUNOROJII Ltd AS
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Publication of JPS6339237B2 publication Critical patent/JPS6339237B2/ja
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Description

請求の範囲 １ Ａ―Ｂ―Ｚ （式中、ＡはＮ―末端保護したＬ―アミノ酸残
基又はＣ―末端アミノ酸を有する任意にＮ―末端
保護したペプチド残基を表わし、ＢはＬ―アミノ
酸残基を表わし、そしてＺはOH又はＣ―末端保
護基を表わす）を有するペプチドの酵素的製造方
法において、式Ａ―OR1を有するアミノ酸エステ
ル、ペプチドエステル又はデプシペプチド、式Ａ
―NR2R2″を有する任意にＮ―末端保護したアミ
ノ酸又はペプチドアミドおよび式Ａ―Ｘを有する
任意にＮ―末端保護したペプチド （上記式中、Ａは上記定義した通りであり、
R1はアルキル、アリール、ヘテロアリール、ア
ルアルキル又はアミノ酸残基のα―des―アミノ
フラグメントを表わし、R2およびR2′は水素、ア
ルキル、アリール、ヘテロアリール又はアルアル
キルであり、そしてＸはＬ―アミノ酸残基を表わ
す）から選択した基質成分を、式 Ｈ−Ｂ−NR3R3′ Ｈ−Ｂ−OR4 （式中、Ｂは上記定義した通りであり、R3お
よびR3′は水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、
アリール、ヘテロアリール又はアルアルキルであ
り、そしてR4は水素、アルキル、アリール、ヘ
テロアリール又はアルアルキルである）の任意に
Ｎ―置換したＬ―アミノ酸アミド、Ｌ―アミノ酸
およびＬ―アミノ酸エステルから選択したアミン
成分とを５から10.5のPHを有する水溶液又は分散
液中で酵母、又は動物、植物又は微生物由来のＬ
―特異性セリン又はチオールカルボキシペプチダ
ーゼ酵素の存在下で反応させることを特徴とす
る、上記製造方法。 ２ カルボキシペプチダーゼ酵素は酵母由来のカ
ルボキシペプチダーゼＹである、特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３ カルボキシペプチダーゼＹは複数の結合した
ベンジルスクシニル基を有する重合体樹脂マトリ
ツクスから成る親和性樹脂のアフイニテイクロマ
トグラフイにより精製した、特許請求の範囲第２
項記載の方法。 ４ カルボキシペプチダーゼ酵素はPenicillium
janthinellum由来のペニシロカルボキシペプチダ
ーゼＳ―１およびＳ―２、Aspergillus saitoi又
はAspergillus oryzae由来のカルボキシペプチダ
ーゼ、オレンジの葉又は皮由来のカルボキシペプ
チダーゼＣ、シトルス ナツダイダイ ハヤタ
（Citrus natsudaidai Hayata）由来のカルボキ
シペプチダーゼCN、ビーンの葉由来のフアセオ
リン、発芽大麦、発芽綿の木、トマト、スイカお
よびブロモレイン（パイナツプル）粉末由来のカ
ルボキシペプチダーゼから選択する、特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ５ カルボキシペプチダーゼ酵素を固定化する、
特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項
に記載の方法。 ６ 水溶液又は分散液は50容量％までの有機溶媒
を含む、特許請求の範囲第１項から第５項のいず
れか１項に記載の方法。 ７ 水溶液又は分散液はアルカノール、ジメチル
スルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、エ
チレングリコールおよびポリエチレングリコール
から選択した有機溶媒を含む、特許請求の範囲第
６項記載の方法。 ８ 基質成分は不活性置換基で任意に置換したベ
ンジルおよびC1〜4アルキルエステルから選択した
Ｌ―アミノ酸エステル又はペプチドエステルであ
る、特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか
１項に記載の方法。 ９ 基質成分はｐ―ニトロアニリドである、特許
請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項に記
載の方法。 １０ アミン成分は式 Ｈ−Ｂ−NHR3 （式中、R3は水素又はC1〜3アルキルであり、
ＢはＬ―アミノ酸残基である）を有するものであ
る、特許請求の範囲第１項から第９項のいずれか
１項に記載の方法。 １１ アミン成分は式 Ｈ−Ｂ−OR4 （式中、R4はC1〜3アルキルであり、ＢはＬ―
アミノ酸残基である）を有するものである、特許
請求の範囲第１項から第９項のいずれか１項に記
載の方法。 １２ １個以上のＣ―末端保護基が存在し、上記
反応で使用したものと同じカルボキシペプチダー
ゼ酵素により好ましくは酵素的に開裂する、特許
請求の範囲第１項から第１１項のいずれか１項に
記載の方法。 発明の背景 １ 発明の分野 本発明はペプチドの酵素的製造法に関する。更
に詳しく言えば本発明は触媒として特殊な酵素群
を使用するペプチド製造法に関する。 ２ 従来技術についての記述 ペプチド合成を、均一合成および不均一固体相
合成の両方に関して多かれ少なかれ精巧なカツプ
リング反応により行なうことは公知である。しか
し、これらすべての化学的方法は望ましくない二
次的な反応およびラセミ化の危険を含み、それ故
にこれら問題を最小にするあるいは除去するため
に化学反応を注意深く制御することが必要であ
る。その上、アミノ酸側鎖をしばしば保護せねば
ならないので、望むペプチドをつくるには最後の
化学工程として脱封鎖することが必要となる。合
成されたペプチドの大きさにより収率が低いこと
があり、二次的な反応は純ペプチドを得るために
面倒な精製手順をしばしば必要とする。化学的ペ
プチド合成のすべてのこれら固有の問題に加えて
カツプリング試薬および封鎖用アミノ酸誘導体の
幾つかの高価格は小さな合成ペプチド、例えばペ
ンタペプチドにおいてさえも製造が比較的高価に
なることを意味する。 酵素は非常に特異的な触媒であり、従つてタン
パク分解酵素はタンパク質におけるペプチド結合
を加水分解することができるので、この加水分解
反応を逆転させる、換言すれば酵素をペプチド結
合の合成における触媒として利用する、ことの可
能性について以前に研究が行なわれた。バーグマ
ン（Bergmann）およびフレンケル―コンラツト
（Fraenkel―conrat）（引用文献１）およびバー
グマンおよびフルートン（Fruton）（引用文献
２）はこれの詳細な調査を行ない、1937年にパパ
インおよびキモトリプシンがある種のアシルアミ
ノ酸およびアミノ酸アニリドのカツプリングを触
媒しうることを示した。これら研究は基本的に異
なる方法、即ち熱力学的な方法と速度論的な方法
とに基づいて継続され強化された。 熱力学的方法における基礎的特徴は反応体間の
熱力学的平衡の成立を触媒するための適当なプロ
テアーゼの使用および反応混合物からの反応生成
物の除去である。このようにして、イソワ
（Isowa）等（引用文献７〜９）および米国特許
第4119493号明細書および英国特許第1523546号お
よび第1533129号明細書、ルイジ（Luisi）等（引
用文献12，18）およびモリハラ（Morihara）等
（引用文献14）は幾つかのセリン、チオールおよ
びメタロエンドプロテアーゼが保護された、しか
し非常に容易に溶けるジ―、トリ―およびテトラ
ペプチドからのペプチドの合成を触媒することを
見出したが、ただしこれは最終生成物がそれらの
平衡濃度より低い溶解度のために反応混合物から
沈殿することを条件とする。このような合成の例
を次の反応概要で説明する。 しかしこの反応原理は、もし通常の化学的カツ
プリング手順におけるように、潜在的にイオン化
しうる基を有するあらゆるアミノ側鎖を反応前に
封鎖しそして反応後に脱封鎖するならば、初めて
一般的合成法として使用できる。この方法はまた
種々な酵素の高い特異性が、合成しようとするペ
プチド結合の、あるいはむしろペプチド結合を形
成しているアミノ酸の型により種々な酵素の使用
を必要とするという点で欠点がある。これらの複
雑な点を克服したとしても、この方法は酵素の非
常な高濃度（ペプチド１ミリモルにつき100mg）
と長い反応時間（１から３日まで）を必要としま
た非常に変動する収率（典型的には20〜80％、上
記米国および英国特許明細書参照）を与えるの
で、幾つかの他の問題を含んでいる。 クリバノフ（Klibanov）等（引用文献10）は
水および水と混和しない有機溶媒からなる系で行
なうことを提案した。この手順もまた高濃度の酵
素と数日までの長い反応期間を必要とする。 他の型の酵素的合成は反応の速度論的方法に頼
るものである。大抵のセリンおよびチオールプロ
テアーゼに対し、ペプチドまたはペプチドエステ
ルの加水分解の間の触媒段階の一つでアシル酵素
中間体が形成され、これが次にその後の段階ある
いは数段階で水により加水分解されるということ
が示されている。もしこの加水分解中に水以外の
求核試薬が存在すると、それらもまたアシル酵素
からアシル基を受け取りその結果アミド結合の形
成を起こすであろう。これは例えばフアストレツ
ツ（Fastrez）およびフエルシユ（Fersht）（引用
文献３）により研究されたが、彼等は種々なアミ
ノ酸アミドの存在下でのＮ―アセチル―Ｌ―フエ
ニル―アラニンエチルエステル（Ac―Phe―
OEt）のキモトリプシン接触加水分解を報告して
いる。この反応を概要(4)に示す。 概要(4) （CT＝キモトリプシン） 先ず酵素基質複合体が形成され、続いてアシル
酵素中間体（Ac―Phe―CT）が形成される。こ
れが水によりAc―Phe―OHに加水分解される
が、もし求核試薬（Ｒ―NH2）も存在すると、
アシル酵素中間体は加水分解に加えてアミノリシ
スも受けるであろう。k3≫k-3およびk4≫k-4を仮
定すると、アミノリシス対加水分解の比は明らか
にk4／k3にならびに55Mの水と競合する求核試薬
の濃度に依存する。フアストレツツおよびフエル
シユは、例えばPH10の1Mアラニンアミドが55M
の水より44倍強い求核試薬であり、この結果上記
Ｎ―アシルジペプチド―アミドを主に生成する
（95％より大）。モリハラおよびオカ（（引用文献
13〜16）はこの原理を酵素的ペプチド合成に更に
補外した。キモトリプシンおよびトリプシンを用
いることにより彼等はＮ―アシルアミノ酸エステ
ルおよびアミノ酸誘導求核試薬から多数のペプチ
ドを合成し、生成物の溶解度に関係なく高収率を
得ることができるので、この反応は純粋に速度論
的であることを実証した。 上記の研究は速度論的方法が熱力学的方法より
幾つかの長所を有することを示すようである。 １ より早い反応（ある場合には数分以内に完
了）。 ２ 低濃度の酵素を使用することの可能性。 ３ アミノ酸側鎖は必らずしも封鎖しなくてよ
い。 ４ ペプチドが溶液中にあるので固定された不溶
性酵素を使用でき、自動化を可能にする。 しかし反応生成物は可溶性かもしれないので、
それらを間に合つて分離できるように合成が生成
物の二次的な加水分解よりも早くなければならな
い。 その上、公知の速度論的方法は、調べた酵素の
特異的性質が種々なペプチド結合の合成に対し
種々な酵素の使用を要求するので、それらの応用
性において制限される。更にまた、大きいペプチ
ド分子の合成は、酵素のエステル分解活性に関係
なく今までに用いた酵素のエンドペプチダーゼ活
性のために常に分子の内部ペプチド結合を加水分
解させる原因となる。 発明の要約 本発明の目的は上述の諸欠点を除く酵素的ペプ
チド合成を提供することにあり、更に詳しく言え
ば特別なアミノ酸成分に限定されないように一般
的な性質がありかつ内部ペプチド結合の後の加水
分解の危険を含まない合成を提供することにあ
る。 手短かに言えば、本発明のこの目的および他の
目的は一般式 Ａ―Ｂ―Ｚ （式中、ＡはＮ―末端保護したＬ―アミノ酸残
基又はＣ―末端アミノ酸を有する任意にＮ―末端
保護したペプチド残基を表わし、ＢはＬ―アミノ
酸残基を表わしそしてＺはOH又はＣ―末端保護
基を表わす）を有するペプチドの製造法で達成で
きるが、この方法は、 (a) 式 Ａ−OR1、 （式中、Ａは上で定義した通りであり、R1は
アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルアル
キルまたはアミノ酸残基のα―des―アミノフラ
グメントを表わす）のアミノ酸エステル、ペプチ
ドエステルおよびデプシペプチド、 (b) 式 Ａ−NR2R2′ （式中、Ａは上で定義した通りであり、R2お
よびR2′は水素、アルキル、ヘテロアリール、ア
リールまたはアルアルキルを表わす）の任意にＮ
―末端保護したアミノ酸又はペプチドアミド、お
よび (c) 式 Ａ−ｘ （式中、Ａは上で定義した通りであり、ＸはＬ
―アミノ酸残基を表わす）の任意にＮ―末端保護
したペプチド、からなる群から選ばれる基質成分
を、５から10.5までのPHを有する水溶液または分
散液中カルボキシペプチダーゼ酵素の存在で、な
るべくは20から50℃の温度において、 (a) 式 Ｈ―Ｂ―NR3R3′ （式中、Ｂはアミノ酸残基であり、R3および
R3′は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはアルキ
ル、アリール、ヘテロアリールまたはアルアルキ
ルを表わす）の任意にＮ―置換したアミノ酸アミ
ド、および (b) 式 Ｈ−Ｂ−OR4、 （式中、Ｂはアミノ酸残基であり、R4は水素、
アルキル、アリール、ヘテロアリールおよびアル
アルキルを表わす）のアミノ酸およびアミノ酸エ
ステル、 からなる群から選ばれるアミン成分と反応させて
ペプチドをつくり、その後望むならば基―
NR3R3′または―OR4またはＮ―末端保護基を開
裂させることからなる。 望ましい態様の詳細な記述 本発明は従来の方法に関して基礎的な変化、即
ち今まで使用された酵素の代りに、すべて最も有
力なあるいは如何なる比率においても重要なエン
ドペプチダーゼ活性を示すエキソペプチダーゼの
使用に基づいている。 エキソペプチダーゼのほかに、有用な酵素は単
一のあるいは二、三の型のペプチド結合に限定さ
れない広い特異性のペプチダーゼ活性を示しそれ
によつて相当する広い特異性の合成活性を許すも
のでなければならないことが判つた。酵素は速度
論的方法の下で上記の型のアシル酵素中間体を形
成できなければならず、そして生成したペプチド
がすぐ加水分解されることを避けるためk-4≪k4
〔上記概要(4)参照〕である場合の条件下で中間体
のアミノリシスを許すであろう特性を特にもつて
いなければならない。アシル酵素中間体を生ずる
能力はまた用いた基質成分中のＣ―末端保護基を
開裂させる能力、即ち現在の場合ではエステラー
ゼまたはアミダーゼ活性として表現することもで
きる。行なうべき合成に対して、該活性は用いた
反応条件下で酵素のペプチダーゼ活性を支配しな
ければならない。 この特性の多重性は遊離カルボキシル基をもつ
ペプチドを加水分解しうるカルボキシペプチダー
ゼと呼ばれるエキソペプチダーゼの群中に見出さ
れる。幾つかのこのようなカルボキシペプチダー
ゼが異なる酵素活性を示すことが見出され、これ
らは例えば８から10.5までのPHにおける塩基性環
境において主としてエステラーゼまたはアミダー
ゼ活性を示しそして９から10.5までのPHでは全く
あるいは殆ど無意味なペプチダーゼ活性を示すよ
うに、PHに非常に依存する。これらの性質はそれ
が好収量の達成に寄与するので本発明方法に有利
に使用できる。 更にまた、前記のアシル酵素中間体を生ずる能
力はセリンまたはチオールプロテアーゼにおいて
特に著るしい。それ故に本発明方法で使用するカ
ルボキシペプチダーゼはＬ―特異性セリンまたは
チオールカルボキシペプチダーゼである。このよ
うな酵素は酵母真菌によりつくり出されるか、あ
るいは動植物または微生物由来でもよい。 特に便利な酵素は酵母真菌（CPD―Ｙ）から
のカルボキシペプチダーゼＹである。この酵素は
ハヤシ等（引用文献５）によりまたヨハンセン
（Johansen）等により（引用文献６）記述され、
これらの人は結合したベンジルスクシニル基を有
する重合体樹脂母組織からなる親和性樹脂上での
親和性クロマトグラフイーによる特に便利な精製
法を開発した。セリン酵母であるCPD―ＹはPH
＞９で異なる酵素活性の間の上記関係を有するこ
とによりそしてエンドペプチダーゼ活性を有しな
いことにより特徴づけられる。遊離α―カルボキ
シル基をもつＣ―末端アミノ酸またはエステルに
対するその特異性に加えて、CPD―ＹはまたＣ
―末端α―カルボキシル基がエステル基、例えば
アルキルまたはアリールエステルの形で、あるい
はアミド基またはＮ―置換アミド、例えばアニリ
ドとして封鎖されたペプチドも加水分解できる。
重要なことにこの酵素はＣ―末端アミノ酸残基の
型に関係なく大抵の基質を加水分解する。CPD
―Ｙのもう一つの利点はそれを大量に入手できそ
して比較的大きい安定性を示すことである。 現在特に適当な酵素であるCPD―Ｙに加えて、
本発明方法は他のカルボキシペプチダーゼ、例え
ば下記の一覧に載つたものについても実行でき
る。
【表】 紛
しかし牛のカルボキシペプチダーゼＡとＢ
（CPD―ＡおよびCPD―Ｂ）はこれらがメタロカ
ルボキシペプチダーゼであるので適当でない。 上で説明した通り、この合成はＡ部分を含有す
るいわゆる基質成分（酸成分または供与体とも呼
ばれる）とＢ部分も含むいわゆるアミン成分（求
核成分または受容体とも呼ばれる）とからペプチ
ドＡ―Ｂを生ずる反応に基づいている。 Ｌ―アミノ酸残基またはＣ―末端Ｌ―アミノ酸
を有するペプチド残基であるＡ部分は望むなら
ば、望ましくない副反応を避けるために保護した
Ｎ―末端アミノでよい。 ペプチド残基の鎖長を増すにつれてアミノ保護
の必要が減少し、ペプチド残基が三つのアミノ酸
からなる場合に本質的に無くなるが、これはそれ
らの型と順序に依り決まる。 有用なアミノ酸の例は脂肪族アミノ酸、例え
ば、モノアミノモノカルボン酸、例えばグリシン
（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ノル
バリン（Nva）、ロイシン（Leu）、イソロイシン
（iso―Leu）、およびノルロイシン（NLe）、ヒド
ロキシアミノ酸、例えばセリン（Ser）、トレオ
ニン（Thr）、およびホモセリン（homo―Ser）、
含硫黄アミノ酸、例えばメチオニン（Met）また
はシスチン（Cys Ｓ）およびシステイン（Cys
Ｈ）、モノアミノジカルボン酸およびそのアミド、
例えばアスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸
（Glu）、アスパラギン（Asn）およびグルタミン
（Gln）、ジアミノモノカルボン酸、例えばオルニ
チン（Orn）、およびリジン（Lys）、アルギニン
（Arg）、芳香族アミノ酸、例えばフエニルアラニ
ン（phe）およびチロシン（Tyr）ならびに複素
環式アミノ酸、例えばヒスチジン（His）および
トリプトフアン（Trp）である。 保護基としてペプチド化学の中で普通のアミノ
保護基、例えばベンゾイル（Bz）、アセチル
（Ac）または第三アルコキシカルボニル基、例え
ばｔ―ブチルオキシカルボニル（BOC―）、ｔ―
アミルオキシカルボニル（ｔ―AOC―）、ベンジ
ルオキシカルボニル（Ｚ―）、ｐ―メトキシベン
ジルオキシカルボニル（PMZ―）、３，５―ジメ
トキシベンジルオキシカルボニル（Ｚ（OMe）2
―）、２，４，６―トリメチルベンジルオキシカ
ルボニル（TMZ―）、ｐ―フエニルアゾベンジル
オキシカルボニル（PZ―）、ｐ―トルエンスルホ
ニル（Tos―）、ｏ―ニトロフエニルスルフエニ
ル（Nps―）などを使用できる。 特に適当な保護基はベンジルオキシカルボニル
およびｔ―ブチルオキシカルボニルであるが、そ
れはこれら誘導体がつくり易く、使用が経済的で
あり、再び容易に開裂するからである。 上記のように基質成分は (a) 式 Ａ―OR1、 （式中、Ａは上で定義した通りであり、R1は
アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルアル
キルまたはアミノ酸残基のα―des―アミノフラ
グメントを表わす）を有するアミノ酸エステル、
ペプチドエステルおよびデプシペプチド、 (b) 式 Ａ―NR2R2′ （式中、Ａは上で定義した通りであり、R2お
よびR2′は水素、アルキル、アリール、ヘテロア
リールまたはアルアルキルを表わす） を有する任意にＮ―置換されたアミノ酸アミドお
よびペプチドアミド、および (c) 式 Ａ―Ｘ （式中、Ａは上で定義した通りであり、Ｘはア
ミノ酸を表わす） を有する任意にＮ―末端保護されたペプチド、 からなる群から選ぶことができる。 この文脈中、「アルキル」とはなるべくは１〜
６炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル、例
えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、
ブチル、イソブチル、tert.ブチル、アミル、ヘキ
シルなどを意味する。 「アリール」はフエニル、複素環式アリールな
どを意味する。「アルアルキル」はベンジル、フ
エネチル、などを意味する。基R2およびR2′およ
びR3およびR3′は同じでも異なつてもよい。 これら基のすべては酵素に関して不活性な置換
基、例えばハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨ
ード）、ニトロ、アルコキシ（メトキシ、エトキ
シなど）、またはアルキル（メチル、エチルなど）
で置換されてもよいが、ただしアミノ酸残基また
はペプチド誘導体がカルボキシペプチダーゼに対
する基質であることを条件とする。 このようにして、エステルの場合、基OR1はな
るべくはアルコキシ基、例えばメトキシ、エトキ
シまたはｔ―ブトキシ、フエニルオキシ―、およ
びベンジルオキシ基の中から選ぶのがよい。これ
ら基は任意に不活性置換基、例えばニトロ基（ｐ
―ニトロベンジルオキシ）で置換されてもよい。
もしアミノ酸残基またはペプチド誘導体がカルボ
キシペプチダーゼの基質であるならば他の基も同
様に使用できる。一例はいわゆるデプシペプチド
で、この場合Ｃ―末端アミノ酸はペプチド結合の
代りにエステル結合を介して結合される（例え
ば、ベンゾイルグリシン―フエニルラクテート
（Bz―Gly―ophe））。 特に適当なカルボン酸保護基はアルコキシ基、
特にメトキシ基であるが、あるいは換言すれば、
基質成分はアミノ酸メチルエステルを含むかある
いはこれからなるのがよい。それはこれら誘導体
がつくり易くまた同時に良い基質だからである。
しかし、例えばエチルエステル、プロピルエステ
ル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｔ
―ブチルエステル、ベンジルエステルまたはtert.
ブチルオキシエステルも全く等しく使用できる。 ペプチド残基Ａの構成成分である個々のアミノ
酸中に存在しうるイオン可能の基は、望むなら
ば、基の型に依り公知の方法で封鎖できる。しか
し、これは必ずしも必要でなく、本発明方法の利
点の精確に一つである。もし官能基を保護するこ
とを望むならば、ω―アミノ基（N〓）に適した
保護基は例えばN〓―ベンジルオキシカルボニル
（N〓―Ｚ）、ｔ―ブトキシカルボニル（N〓―
BOC）またはトシル（N〓―Tos）である。Arg
におけるＮ―グアニジノ基（NG）に適した保護
基はニトロ（NG―NO2）、NGベンジルオキシカ
ルボニル（NG―Ｚ）およびNG，NG―ベンジルオ
キシカルボニル（NG―Ｚ―Ｚ）である。Hisにお
けるイミダゾール環（Nim）に適した保護基は
Nim―ベンジル（Nim―Bzl）およびトシル（Nim
―Tos）である。ω―カルボキシル基に適した保
護基はω―ベンジルオキシ（―OBzl）である。
脂肪族または芳香族ヒドロキシアミノ酸における
水酸基に適した保護基はアルアルキル基、例えば
ベンジル（Bzl）である。Cyshにおけるメルカプ
ト基に適したＳ―保護基は例えばベンジル基
（Bzl）である。これら保護基は主要な反応中は
安定でなければならず、そして最終生成物から二
次的な反応を起こすことなく開裂し易くなければ
ならない。 本発明方法は原則として基質成分としてアミノ
酸を用いて実施できる。 本反応における第二の関係物質はいわゆるアミ
ン成分であつて、これは (a) 式 Ｈ―Ｂ―NR3R3′ （式中、Ｂはアミノ酸残基であり、R3とR3′は
水素、ヒドロキシ、アミノ、またはアルキル、ア
リール、ヘテロアリールまたはアルアルキルを表
わす）の任意にＮ―置換されたアミノ酸アミド、
および (b) 式 Ｈ―Ｂ―OR4、 （式中、Ｂはアミノ酸残基であり、R4は水素、
アルキル、アリール、ヘテロアリールおよびアル
アルキルを表わす）のアミノ酸およびアミノ酸エ
ステル、 からなる群から選ばれる。 アルキル、アリール、およびアルアルキル基は
置換されていてよく、基質成分に関して説明した
ように定義される。 R3＝水素は遊離アミドを表わし、R3＝OHはヒ
ドロキロキサム酸であり、R3＝アミノはヒドラ
ジドであり、R3＝フエニルはアニリドを表わす
ことが判かる。 このように本発明方法は遊離（Ｃ―末端保護さ
れてない）アミノ酸およびＣ―末端保護されたア
ミノ酸の両方の場合について例えば対応するアミ
ド、アニリド、ヒドラジド、エステルまたは他の
明記されたアミノ酸カルボキシル誘導体に変換す
ることにより実施できるという例えばイソワおよ
びモリハラ（前掲引用中にあり）よりも勝れた決
定的利点を有する。 アミン成分、反応順序、収率などに関しては、
成分を遊離酸として導入するか、あるいはＣ―保
護誘導体として、例えばアミドとして導入するか
どうかに非常に依存する。このことを例に関して
下にもつと詳しく説明するが、次の一般的描写が
呼かび上がるようである。 疎水性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、
バリンおよびフエニルアラニンならびに陽電荷を
もつ側鎖を有する酸、例えばリジンおよびアルギ
ニンは基質成分の鎖の中に比較的容易にとり込ま
れるが、側鎖がカルボキシル基（アスパラギン酸
またはグルタミン酸）、水酸基（セリンおよびト
レオニン）またはアミド基（アスパラギンおよび
グルタミン）を含むアミノ酸は導入困難であると
いうことが遊離アミノ酸に対して当てはまる。 複素環式アミノ酸、例えばプロリンおよびヒス
チジンは遊離酸として取り込むことが困難であ
る。 もしＣ―末端保護アミノ酸、例えばアミノ酸ア
ミド、またはＮ―置換アミド、例えばヒドラジド
またはアニリドをアミン成分として使用するなら
ば違う問題となる。これを下に詳しく示すが、こ
の場合反応は構造に殆ど無関係であり、非常に高
収率（90％まで）さえ得られるがこの場合にもま
た複素環式アミノ酸は脂肪族のものよりも導入困
難であると極めて一般的に言えるかもしれない。 上記の通り、本発明方法はPH5.0〜10.5で、な
るべくはPHは8.0〜10.5で行なわれる。特に適当
なPH値はしばしば非常にせまい範囲内にあり、用
いた酵素の異なる酵素活性に対する最適PHおよび
最低PHに依存する。このPH値は上に説明したよう
に活性が釣り合うように選ぶべきであることが判
かる。 一般にペプチダーゼ活性はPH値を約9.0以下に
減らすと増加するので本法は収率の点からみて不
利になる。しかしある場合には、例えばBz―Ala
―GlyまたはBz―Ala―Gly―NH2の場合、生じ
たペプチドまたはペプチドアミドはカルボキシペ
プチダーゼに対し非常に良くない基質であるの
で、従つてエステラーゼ活性対基質成分として好
ましく用いられるアミノ酸エステルまたはペプチ
ドエステルが依然として支配し、それによつて
5.0付近またはそれより下のPH値においてさえも
合成が可能になる。一般に言つて、最適PHは実際
の出発物質、生じたペプチドおよび酵素により決
まる。 もしCPD―Ｙを酵素として使用するならばそ
のPH値は下に説明するようになるべくは8.0〜
10.5、特に9.0〜10.5とする。このPH値はカツプリ
ング反応中ずつと維持すべきであり、次に反応生
成物の沈殿化、保護基の開裂などのために変化さ
せることがある。これは反応媒質中に選ばれたPH
範囲に適した緩衝剤、例えば重炭酸塩緩衝剤、を
添加することにより与えられる。 しかし、選ばれる緩衝剤は適切なPHを保つ限り
反応にとつて特に制限はない。 PH値は反応中にHClのような酸またはNaOHの
ような塩基を添加することにより保つこともでき
る。 この反応は記述のように、水性反応媒質中で行
なわれるが、これは必要に応じ、50容量％までの
有機溶媒を含むことができる。特に適当な有機溶
媒はアルカノール、例えばメタノールおよびエタ
ノール、グリコール、例えばエチレングリコール
またはポリエチレングリコール、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフ
ラン、ジオキサンおよびジメトキシエタンであ
る。 反応媒質の組成の選択は特に反応成分およびペ
プチド生成物の溶解度、温度およびPHにより、ま
た酵素の安定性により左右される。 反応媒質はまた酵素を不溶性にするが酵素活性
の相当な部分を留める成分、例えばイオン交換樹
脂も含むことができる。別法として酵素は公知の
方法（Methods in Enzymology、44巻、1976年
参照）で、例えばある母組織、例えば架橋したデ
キストランまたはアガローズに、あるいはシリ
カ、ポリアミドまたはセルロースに結合すること
により、あるいはポリアクリルアミド、アルギネ
ートまたは繊維の中にカプセル化することにより
固定できる。そのほか酵素は化学的手段によりそ
の安定性または酵素特性を改良するように修正で
きる。 本反応における二つの関与体の濃度は後述のよ
うに広い範囲で変えることができる。基質成分の
特に適当な出発濃度は0.01〜１モルであり、アミ
ン成分に対しては0.05〜３モルである。 酵素濃度は同様に変化できるが、なるべくは
10-6〜10-4モルがよい。 本発明によれば反応温度は20〜50℃がよい。あ
る与えられた合成に対し最適の反応温度は実験に
より決定できるが、特に用いたアミン成分および
酵素によつて決まる。適当な温度は約35〜45℃が
普通であり、なるでくは約35℃である。20℃より
低い温度では反応時間が通常は不適当に長くな
り、一方50℃より上の温度はしばしば酵素および
（または）反応体の安定性あるいは反応生成物の
安定性に関して問題を起こす。 反応時間に対しても同様な変動があり、後述の
ように他の反応パラメーターに非常に大きく依存
する。本発明方法における標準反応時間は約10分
であるが、数時間までを要することがある。 アミン成分としてアミドまたは置換アミドを使
用する場合、合成を継続するために生じたペプチ
ドアミドからアミド基を特異的に開裂させること
がしばしば有利でありあるいは必要でさえあると
いうことをつけ加えねばならない。またこれに関
して、カルボキシペプチダーゼ、特にCPD―Ｙ
は上記のようにCPD―ＹがPH＞９でアミダーゼ
活性を発揮する一方カルボキシペプチダーゼ活性
は無視できるので非常に適している。 その上、カルボキシペプチダーゼは一般に合成
を続けることを望もうがあるいは全くＣ―末端保
護されていない最終ペプチドを得ることを望もう
が、生じたペプチドから決定されるように基―
NR3R3′または―OR4を開裂させるために用いる
ことができる。 下に更に詳しく説明するように、本発明方法は
同じ発明の原理に基づいて、即ち基質成分をアミ
ン成分とアミノ酸またはアミノ酸誘導体の形でカ
ルボキシペプチダーゼの存在下に反応させること
により無限数のジペプチド、オリゴペプチドおよ
びポリペプチドの形成に応用できる。 従つて製造しうるよく知られたオリゴペプチド
またはポリペプチドの例はエンケフアリン、ソマ
トスタチン、ソマトスタチン類似体および同様な
生物活性を有するペプチド、およびいわゆる「ス
リープ ペプチド」（Trp―Ala―Gly―Gly―
Asp―Ala―Ser―Gly―Glu）である。 ある場合には、例えば５個のアミノ酸より多く
からなるペプチドを扱う場合、望むペプチドの部
分をオリゴペプチドフラグメントの形で、例えば
適当なアミノ酸順序をもつペンタペプチドを合成
し、このオリゴペプチドを公知の仕方でフラグメ
ント縮合させることが有利である。 例えば、生成したペプチドの溶解度特性を改善
するため、合成工程の間にＮ―末端アミノ酸とし
てアルギニンまたは他のイオン化しうるアミノ酸
を使用し、次にアルギニンをペプチドから、望む
アミノ酸順序が他の点では整つているとき、特異
的な酵素、例えばトリプシンで開裂させることも
有利である。 これらおよび他の修正も本発明の部分をなす。 本発明方法を例によつて説明する前に、出発物
質、測定法などを一般的に説明することにする。 出発物質 パン酵母からのカルボキシペプチダーゼＹをヨ
ハンセン（Johansen）等（引用文献６）の親和
力クロマトグラフイー法によつて単離し、凍結乾
燥した粉末（クエン酸ナトリウム中10％酵素）と
して得る。使用前に酵素を蒸留水で平衡させ溶離
するセフアデツクスＧ―25フアイン（1.5×25
cm）上で脱塩する。酵素濃度はＥ１％ 280nm＝14.8
を用いて分光光度法で決定した（引用文献６）。
７mg／ml（110μM）の原液を調製し、250―500μ
ずつ−21℃で貯蔵する。ベンゾイルアラニンメ
チルエステル（Bz―Ala―OMe）はバケム
（Bachem）、リースタール（Liestal）、スイスか
ら購入した。三フツ化ホウ素エーテレート複合体
（合成用）、溶媒および試薬（すべて分析用品等）
はメルク（Merck）、ダルムスタツト
（Darmstadt）、西ドイツから得た。すべてのアミ
ノ酸およびアミノ酸アミドおよびそれらの誘導体
はシグマケミカル社（Sigma Chemical
Company）、セントルイスUSAから得た。カル
ボベンジルオキシ―フエニルアラニンメチルエス
テル（Ｚ―phe―OMe）はヤマダ等（引用文献
20）の手順に従つてつくりシロツプのまゝ使用し
た。フエニルアラニンヒドラジドおよびアラニン
ヒドラジド塩酸塩はロツセ（Losse）等（引用文
献11）により記述されているようにエステルから
調製した。その未補正融点はそれぞれ86〜88℃
（文献値：82〜83℃（11））および182〜185℃（文
献値：184〜185℃（21））である。アスパラギン
アミド二塩酸塩はアスパラギン酸から古典的なア
ミノリシスによりフイツシヤー（引用文献４）に
従いジエチルエステルを経て得た（融点：210〜
214℃、文献値：214〜215℃（19））。他の出発物
質は上記の会社から提供されるかまたは類似の方
法で調製される。 生成物の収率決定 純度はシリカゲル60F254（メルク）上のTLCに
より定性的に決定した。用いた溶媒系はCHCl3／
CH3（CH2）OH／CH3COOH／H2O（11：５：
２：１）であり、スポツトは反応体の組成の見積
りに螢光の消光により可視化した。 反応体組成はRP―８、10μm（メルク）カラム
および可変波長UV検出器（モデル79875A）を具
えたヘウレツトパツカード（Hewlett Packard）
1084クロマトグラフを用い逆相HPLCにより定量
的に決定した。分離は10mM―NaAc、PH４中10
％CH3CNから100％CH3CNまで、あるいは
10mM―NaAc、PH４から100％CH3CNまでの溶
離系の適当な特別な傾斜を用いて行なつた。後者
の系はBz―Ala―Gly―OH、Bz―Ala―Ala―
OH、Bz―Ala―Ser―OHといつた化合物および
それらの各アミド（下記参照）に対して用いられ
る。流速は３ml／分、カラム温度は47℃、モニタ
ー波長は260nmである。収率は溶離プロフイルに
おけるピーク下の積分された面積から得た反応体
のモル比に基づき決定した。 生成物の同定 スポツトは適当な標準化合物を用いる薄層クロ
マトグラフイーにより同定した。幾つかの生成物
はHPLCとアミノ酸分析の組み合わせにより同定
した。この目的のため、反応混合物から10分後に
１mlずつを採り、反応を250μの6M―HClを加
えて中止させる。次にPHをNaOHで４に調節し、
混合物をHPLCにより、二つのポンプ、モデル
660溶媒プログラマー、モデルU6Kインジエクタ
ー、モデル450可変波長検出器〔レコーダー（ラ
ジオメーターREC61）と結合〕あるいはヘウレ
ツト パツカードレコーダー／インテグレーター
モデル3380Aを含むウオーターズの装置を用いて
分離した。溶離は255〜280nmの間の適当な波長
で走査することにより監視した。クロマトグラフ
イーは適当な勾配と1.5〜2.0ml／分の流速下にメ
タノール中20％（Ｖ／Ｖ）TEAP（トリエチルア
ンモニウムホスフエート緩衝剤）の溶離系TEAP
によるウオーターズＣ―18μ―ボンダパツクカラ
ムを用いる逆相である。TEAP緩衝剤はリビアー
（Rivier）（引用文献17）に従つて調製した。多く
の場合、メタノール中系0.1M―HAc、PH３―20
％（ｖ／ｖ）0.1M―HAc、PH３もまた十分な分
解能を与える。 Ｎ―アシルジペプチドを含む溶出液を手動で集
め、凍結乾燥によりあるいはビユツヒ ロートバ
ツプ（Bu¨chi Rotovap）上35〜45℃で乾固する。
残留物の少量の試料を真空中110℃で6M―HCl中
で36時間加水分解する。次に蒸発させた加水分解
物をデユルム（Durrum）Ｄ―500アミノ酸分析
計で分析する。 アミン成分として遊離アミノ酸を用いる合成 例 １ 0.6Mバリン―0.1M KCl―1mM EDTA（PH
9.8）２mlの溶液を100μ（0.1ミリモル）の1M
―Bz―Ala―OMe（96％エタノールに溶解）溶液
と混合する。反応は35℃、PH9.8においてPHスタ
ツトで行ない、PH値を0.5M NaOHの自動添加に
より一定に保つ。反応はカルボキシペプチダーゼ
Ｙ（150U／mg、De Forenede Bryggerier製）0.7
mgを加えることにより開始させる。30分の反応時
間後、PHを6M HClで約PH＝１に調節することに
より反応を打切る。反応生成物を高圧クロマトグ
ラフイーにより精製し単離する。Bz―Ala―Val
―OHの収率は40％である。生成物を6M HCl中
24時間の加水分解後の定量的アミノ酸分析は相対
的にアラニン1.0モルとバリン1.0モルを与えた。 上記反応： において収率に及ぼすPH、温度、および基質成
分、アミン成分およびCPD―Ｙの濃度の影響を、
上記手順と類似して五つの別々の実験系列で調べ
た。下記パラメーターの一つを各実験で変え、一
方他の四つを一定に保つ：バリン0.6M、Bz―
Ala―OMe55mM、CPD―Y4.5mM、PH9.7、35
℃。結果を第１図に示す。最良収率のためのPH範
囲はかなりせまく、僅か0.5PH単位にわたり広が
つていることが第１Ａ図から判かる。反応温度の
増加は比較的少ない加水分解のために殆ど直線的
な合成の増加を起こすことが第１Ｂ図から判か
る。45℃以上の温度においては、酵素の不活性化
と非酵素的なエステル加水分解が禁止的になる。
より低い温度と10.0までのPH値においては、10分
間の標準反応時間内でエステル加水分解は無視で
きる。しかし、酵素反応の速度が抑制され２〜５
時間までの反応時間を要求するときこれは重要に
なつてくる。 Bz―Ala―Val―OHの収率は高いアミン成分
濃度で増加するが（第１Ｄ図）、収率と基質成分
Bz―Ala―OMeの濃度との間の関係に対しては
この逆となる（第１Ｃ図）。後者の観察は、高い
酵素濃度に対する収率の依存性と共に考えると
（第１Ｅ図）、基質対酵素濃度の最適比を示してい
る。 上記反応により示された最適に近い条件下での
典型的反応の時間進行を第２図に示す。0.5Mバ
リンの存在で、基質Bz―Ala―OMeは迅速に
（20分以内で）Bz―Ala―Val―OH38％とBz―
Ala―OH62％とに変換される。この図はまた、
ジペプチドが過剰のバリンの存在下でPH9.7にお
いて加水分解されないことを示す。しかし、もし
PHを５〜８に調節すると、すべてのBz―Ala―
Val―OHが数秒のうちに加水分解される。高PH
におけるこのCPD―Ｙの選択的挙動はペプチド
合成におけるその有用性に対する重要な性質であ
る。 例 ２ リジン3M―KCl0.1M―EDTA1mM（PH9.8）２
mlの溶液を100％メタノール400μおよび1Mの
Ｚ―phe―OMe（100％メタノールに溶解）100μ
（0.1ミリモル）と混合する。反応を例１に記述し
たように行ない、カルボキシペプチダーゼ―
Y0.7mgの添加により開始させる。30分の反応時
間後、PHを6M HClで１に調節する。反応生成物
を高圧クロマトグラフイーにより精製し単離す
る。Ｚ―phe―Lys―OHの収率は60％である。例
１に記述したような定量的アミノ酸分析はこの生
成物が相対的にリジン1.0モルとフエニルアラニ
ン1.0モルを含むことを示した。 例１および２と同様にして、表に掲げたペプ
チドを記載の出発物質から調製した。この実験は
ラジオメーターPH―スタツトで行ない、収率は
HPLC（上記参照）で決定した。条件はCPD―
Y4.5μM、PH9.7および35℃である。
【表】
【表】
【表】 アミン成分としてアミノ酸アミドを用いる合成 例 ３ メチオニンアミド（Met―NH2）0.6M―KCl
0.1M―EDTA 1mM（PH9.8）２mlの溶液を96％メ
タノール中Bz―Ala―OMe 1M100μ（0.1ミリ
モル）と混合する。反応を例１に記述したように
行ない、カルボキシペプチダーゼ―Y0.7mgを加
えることにより開始させる。30分の反応時間後、
6M HClでPHを１に調節する。反応生成物を高圧
クロマトグラフイーにより精製し単離する。Bz
―Ala―Met―NH2の収率は95％である。例１に
記述したように、定量的アミノ酸分析はこの生成
物が相対的にAla1.0モル、Met1.0モルおよび
NH31.0モルを含むことを示した。 この反応の進行を第３図に示すが、該図から20
分以内に基質は殆ど完全にジペプチド約95％まで
変換され、５％はBz―Ala―OHに変換される。 例 ４ バリンアミド（Val―NH2）0.4M―KCl0.1M
―EDTA1mM（PH9.5）２mlの溶液を96％エタノ
ール中Bz―Ala―OMe 1M溶液100μ（0.1ミリ
モル）と混合する。反応を例１に記述したように
行なう。反応生成物Bz―Ala―Val―NH2は反応
中に沈殿する。20分の反応後PHを１に調節し、沈
殿を遠心により単離する。生成物を96％エタノー
ル１mlに溶かし、高圧クロマトグラフイーにより
精製し単離する。Bz―Ala―Val―NH2の収率は
95％であるのに対し、例１に示したように、アミ
ン成分として遊離酸を用いたときにはそれは僅か
40％であつた。例に記述のように、定量的アミノ
酸分析は生成物が相対的にAla1.0モル、Val1.0モ
ルおよびNH31.0モルを含むことを示した。 PHおよびバリンアミド濃度に対する反応順序の
依存性を図４に示す。反応を上記合成と同様に行
ない、一定のパラメーターはバリンアミド0.6M、
Bz―Ala―OMe55mM、CPD―Y4.5μM、PH9.7、
35℃とする。 図４Ｂから、その収率は図１Ｄとは対照的にバ
リンアミド濃度における変動に本質的に鈍感であ
ることが判かる。該図１Ｄは変動するバリン濃
度、基質濃度（55mM）と少なくとも等モルまた
はそれより高い濃度についての収率を示す。 図４Ａからバリンアミドの効果的PH範囲は9.0
までひろがり、収率がひどく減少するPH9.8の鋭
い上限があることが判かる。 例３および４と同様に、表に載せたペプチド
は記述の出発物質からつくられる。これら実験は
次の条件：CPD―Y4.5μM；PH9.6および35℃で
行なうが、基質濃度は表中に記述されている。
【表】
【表】
【表】 例 ５ アミン成分としてアミノ酸ヒドラジドを用いる
合成 例３および例４と同様にして表に載せたペプ
チドを記載の出発物質からつくる。実験は次の条
件：CPD―Y4.5μM、PH9.6および35℃で行なつ
た。
【表】 例 ６ アミン成分としてアミノ酸エステルを用いる合
成 アミノ酸エステルを用いる合成は例１，２，３
および４と同様にしてラジオメーターPHスタツト
でPH9.0〜9.7、23〜35℃において行なつた。生成
物および収率はHPLCにより決定した。CPD―
Ｙ濃度は4.5から11μMである。 表は記載の出発物質からつくられたペプチド
を載せている。 幾つかの場合にはある種のオリゴマー化が得ら
れることが判かる。収率は一般に非常に高いの
で、もしオリゴマー化を更に制限できるならば、
アミノ酸エステルは極めて有用なようである。
【表】
【表】 例 ７ アミン成分のＬおよびＤ―立体異性体 例１，２，３，４および６と同様にして、表
に記載のペプチドを記載の出発物質からつくる。 Ｌ―異性体だけが取り入れられることが判か
る。これは工程の経済性からみて非常に興味ある
特徴であるが、それは純粋なＬ―異性体を得ると
いう考えで出発アミノ酸を精製する必要が結局な
いからである。
【表】 例 ８ 基質エステル基の変化 例１，２，３、および４と同様に、表に記載
のペプチドを記載の出発物質からつくる。 結果は適用できる基質に関して本発明方法の融
通性を証明している。
【表】 例 ９ 基質としてのデプシペプチド 例３および４と同様に、表に記載のペプチド
を記載の出発物質からつくつた。条件はCPD―
Y4.5μM、PH＝7.6および25℃である。 非常に高い収率が得られることがわかる。
【表】
【表】 例 10 基質成分としてのペプチド 例１，２，３、および４と同様に、表に記載
のペプチドをつくる。実験はラジオメーターPH―
スタツトで行ない、収率はHPLCにより決定し
た。条件はCPD―Y4〜25μM、PH＝7.6および25
℃である。
【表】 PHの関数としてのペプチド合成 合成されたペプチドがCPD―Ｙに対するわる
い基質である場合、合成を特に適当な９〜10.5よ
り低いPH値で行なうことができる。 例 11 例１および３と同様に、表記載のペプチドを
記載のPH値でPH―スタツトでつくる。 条件はCPD―Y15μMおよび25℃である。
【表】 種々な他のアミン成分 例 12 例３および４と同様に、表に記載のペプチド
をつくる。実験はPH―スタツトで行ない、収率は
HPLCにより決定した。条件はCPD―Y4.5μM、
PH9.5および25℃である。
【表】 例 13 大麦からのカルボキシペプチダーゼを用いるペ
プチド合成 例えば麦芽の形の発芽中の大麦はCP―１―１
およびCP―２―１と呼ばれる二つの異なるペプ
チダーゼを含む〔リー イー・レイ（Lee E.
Ray）、Carlsberg Res.Comm.41，169〜182
（1976）を見よ〕。 CP―１―１およびCP―２―１はエル．イー．
レイにより記述されたようにして単離し、例１，
２，３、および４と同様にして表XIに記載のペプ
チドを記載の出発物質からつくつた。条件はCP
―１―１またはCP―２―１ 6μM、PH8.0および
25℃である。
【表】
【表】 例 14 ペプチドアミドのカルボキシペプチダーゼ―Ｙ
接触脱アミド 0.1M KCl―1mM EDTA、PH9.7、25℃および
10％ジメチルホルムアミド中Bz―Ala―Leu―
NH2 15mM ２mlの溶液へ２mgのCPD―Ｙを加
える。第５図に示したように反応の進行を例１に
記載のようにHPLCにより追跡した。20分後Bz
―Ala―Leu―NH2は完全にBz―Ala―Leu―OH
約68％とBz―Ala―OH32％に変換された。反応
混合物についてのアミノ酸分析はBz―Ala―OH
がBz―Ala―Leu―NH2からLeu―NH2の開裂に
より主として生じたことを示した。 例 15 Ｎ―末端保護基を有するペプチドエステル基質
と有しないものとの比較 例３および４と同様に、表XIIに記載のペプチド
を次の条件：基質50mM、CPD―Y5μM、PH9.5
および25℃でつくつた。
【表】 例 16 有機溶媒存在下での合成 例１，２，３，４および６と同様にして、下記
の表，およびに記載のペプチドを記
載の出発物質から記載濃度の有機溶媒を用いてつ
くつた。条件は基質50mM、CPD―Y5μM、PH
9.6および30℃である。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】 例 17 不溶性（固定）カルボキシペプチダーゼ―Ｙ CPD―Ｙをシヤオ（Hsiao）およびロイヤー
（Royer）〔Archives of Biochemistry and
Biophysics，198巻、379〜385（1979）〕により記
述されているようにコンカナバリンＡ―セフアロ
ース4B〔フアルマシア フアイン ケミカルズ
（Pharmacia Fine Chemicals）〕に結合し、次に
グルタルアルデヒドによりCPD―Ｙとコンカナ
バリンＡとの間に橋かけ結合する。CPD―Ｙ濃
度に包装されたセフアロース１mlにつき３mgであ
る。 例１および３と同様に、表に記載のペプチ
ドを下記の条件下でつくつた。基質50mM、CPD
―Ｙゲル0.25ml（CPD―Y5μM）、PH9.7および35
℃。過により酵素を除去後生成物および収率を
HPLCにより決定した。
【表】 例 18 基質としてのペプチドアミド 0.1M KCl―１mmEDTAおよび10％ジメチルホ
ルムアミド中の５mmBz―Ala―Leu―NH2溶液、
PH10.0、25℃を0.25Mのバリンアミドと混合し
た。 反応は40μmCPD―Ｙを添加して開始させ、例
３および４と同様に行なつた。Bz―Ala―Leu―
Val―NH2を65％の収率でHPLCにより単離し
た。 反応は基質成分として５mmBz―Ala―Phe―
NH2を使用して反復した。Bz―Ala―Phe―Val
―NH2は44％の収率でHPLCにより単離した。 例 19 met―エンケフアリンの合成 ５ｇのBz―Arg―UEtで出発し、触媒として
CPD―Ｙを使用するmet―ケフアリンの順次の合
成を次の概畧工程図で示す。
【表】 ンの合成。
各工程に対する収率％は括弧内に示す。
CPD―Ｙ触媒縮合および脱アミノ化工程は純
粋の水性相で行ない、Bz―Arg―は可溶化保護
基として選択し、これは上記のように最後の工程
でトリプシンにより除去した（明細書第23頁第10
行〜第15行）。アミノ酸アミドによりペプチドを
伸ばし次いで脱アミノ化後、次のペプチドエステ
ル基質は無水メタノールおよび無水HClにより合
成した。各工程後反応体は分取HPLCにより単離
した。このようにして過剰のアミン成分および加
水分解「副生物」も回収できた。 引用文献 １ バーグマン エム．＆エツチ．フレンケル―
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