NO157706B - Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av peptider. Mer spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av peptider ved bruk av en spesifikk gruppe enzymer som katalysatorer.

Det er kjent å gjennomføre synteser av peptider ved mer eller mindre elegante koblingsreaksjoner, både med henblikk på homo-

gen syntese og heterogen fastfasesyntese. Alle disse kjemiske metoder medfører imidlertid risikoen for uønskede sekundær-reaksjoner og racemisering, og det er derfor nødvendig å kontrollere de kjemiske reaksjoner omhyggelig for å minimalisere eller eliminere disse problemer. Videre må aminosyreside-

kjedene ofte beskyttes, noe som krever avblokkering som det siste kjemiske trinn for å fremstille de ønskede peptider. Avhengig av størrelsen av det syntetiserte peptid kan utbyttene være lave, og sekundærreaksjonene nødvendiggjør hyppig kompli-serte renseprosedyrer for å oppnå det rene peptid. Alle disse iboende problemer ved kjemisk peptidsynteser pluss den høye pris for enkelte av koblingsreagensene og blokkeringen av aminosyrederivatene betyr at sågar små syntetiske peptider,

f.eks. pentapeptider, er relativt kostbare å fremstille.

Fordi enzymer er meget spesifikke katalysatorer og proteoly-

tiske enzymer således er i stand til å hydrblysere peptidbindinger i proteiner, er det tidligere foretatt studier med henblikk på mulighetene å reversere denne hydrolysereaksjonen eller, med andre ord, å benytte enzymer som katalysatorer ved syntese av peptidbindinger. Bergmann og Fraenkel-Conrat (ref.

1) og Bergman og Fruton (ref. 2) gjennomførte en detaljert undersøkelse av dette og viste i 1937 at papain og kymotrypsin kunne katalysere koblingen av visse acylaminosyrer og amino-syreanilider. Disse studier er fortsatt og intensivert på

basis av to fundamentale forskjellige tilnærmelsesveier, nemlig en termodynamisk og en kinetisk.

Fundamentale trekk ved de termodynamiske metoder er bruken av

en egnet protease for katalysering av opprettelsen av den termodynamiske likevekt mellom reaktantene, og en fjerning av reak-

i

sjonsproduktet fra reaksjonsblandirigen. Således fant Isowa et al. (ref. 7-9) og US-PS 4 119 493 og GB-PS 1 523 546 og 1 533 129, Luisi et al. (ref. 12, 18) og Morihara (ref. 14) at forskjellige serin-, tiol- og metalloendoproteaser katalyserer syntesen av peptider fra beskyttede, men meget lett oppløslige di-, tri- og tetrapeptider, forutsatt at sluttproduktene faller ut fra reaksjonsblandingen fordi deres oppløslighet er lavere enn likevektkonsentrasjonen. Eksempler på slike synteser er vist i de følgende reaksjonsskjemaeir:

Imidlertid kan dette reaksjonspririsipp kunne benyttes som generell metode for syntese hvis, på s|amme måte som ved konvensjo-nelle kjemiske koblingsprosedyreralle aminosidekjedene med potensielt ioniserbare grupper blokkeres før reaksjonen og avblokkeres etter reaksjonen. MetIoden lider også under den mangel at den høye spesifisitet for de forskjellige enzymer krever bruk av forskjellige enzymer, avhengig av typen peptidbinding som skal syntetiseres, eller av aminosyrene som danner peptidbindingen. Selv om disse komplikasjoner kan overvinnes, involverer metoden forskjellige andre problemer fordi den krever en meget høy konsentrasjon av enz^m (100 mg/mmol peptid), lange reaksjonsperioder (1 til 3 dager) :og gir meget varierende utbytter (karakteristiske 20 til 80%, se de ovenfor nevnte US-

og britiske patenter).

Klibanov et al. (ref. 10) har foreslått å arbeide i et system som består av vann og et organisk joppløsningsmiddel som er ublandbart med vann. Denne prosedyre krever også en høy konsentrasjon av enzym og en lang reaksjonsperiode på opptil flere dager.

Den andre type enzymatisk syntese går ut fra det kinetiske aspekt ved reaksjonen. Det har vært vist for de fleste serin-og tiolproteaser at et acylenzymmellomprodukt dannes i et av de katalytiske trinn under hydrolysen av peptider eller peptidestere, som deretter hydrolyseres av vann ved det eller de etterfølgende trinn. Hvis andre nukleofiler enn vann er til stede under hydrolysen vil disse også ta i mot syregruppen fra acylenzymet, noe som resulterer i dannelse av en amidbinding. Dette er studert f.eks. av Fastrez og Fersht (ref. 3) som fant kymotrypsinkatalysert hydrolyse av N-acetyl-L-fenylalaninetyl-ester (Ac-Phe-OEt) i nærvær av forskjellige aminosyreamider. Reaksjonen er vist i skjema (4):

Først dannes et enzymsubstratkompleks fulgt av dannelse av acylenzymmellomproduktet(Ac-Phe-CT). Dette hydrolyseres av vann til Ac-Phe-OH, men hvis en nukleofil (R-NH2) også er til stede, vil acylenzymmellomproduktet underkastes aminolyse i tillegg til hydrolysen. Forutsetter vi at K3>> k_3 og K4>> k_4, avhenger forholdet mellom aminolyse og hydrolyse klart av k4/k3 så vel som av konsentrasjonen av nukleofil som konkurrerer med 55 M vann. Fastrez og Fersht fant at f.eks. 1 M alaninamid ved pH 10 er en 44 ganger sterkere nukleofil enn 55 M vann,

noe som resulterte i en fremherskende dannelse (mer enn 95%) av det viste N-acyldipeptidamid. Morihara og Oka (ref. 13-16)

har videre undersøkt dette prinsipp for enzymatisk peptidsyntese. Ved bruk av kymotrypsin og trypsin, syntetiserte de et antall

peptider fra N-acylaminosyreestere' og aminosyreavledede nukle-filer og viste at reaksjonen var rent kinetisk fordi det kunne oppnås høye utbytter, uavhengig av produktets oppløslighet.

De ovenfor angitte studier synes å antyde at prosesser basert på det kinetiske aspekt har flere fordeler i forhold til de termodynamiske prosesser: 1. Hurtigere reaksjon (i visse tilfeller ferdig i løpet av få minutter.

2. Mulighet for å bruke lave enzymkonsentrasjoner.

3. Aminosyresidekjedene må ikke Nødvendigvis blokkeres.

4. Immobiliserte og uoppløslige enzymer kan benyttes da peptidene er i oppløsning, noe som tillater automatisering.

Da imidlertid reaksjonsproduktene jkan være oppløslige, må syntesen være hurtigere enn den sekundære hydrolyse for produktet, slik at de kan separeres i tide.

Videre er de kjente kinetiske aspekter begrenset hva gjelder anvendeligheten fordi de spesifikke egenskaper for undersøkte enzymer krever bruk av forskjellige enzymer for syntese av de forskjellige peptidbindinger. I tillegg forårsaker syntese av store peptidmolekyler uavvendelig interne peptidbindigner i molekyler som skal hydrolyseres, uavhengig av den esterolytiske aktivitet av enzymene, på grunn av endopeptidaseaktiviteten for de enzymer som er benyttet til nå;

Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er å frembringe en enzymatisk peptidsyntese som eliminerer de mangler som er nevnt ovenfor, og mer spesielt en syntese som er av generell art slik at den ikke er begrenset til spesifikke aminosyrekomponenter,

og som ikke medfører noen risiko for etterfølgende hydrolyse av de interne peptidbindinger.

I henhold til dette har foreliggende oppfinnelse til hensikt

å forbedre den kjente teknikk og a!n<g>å<r> således en fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av pep<i>tider med formelen:

j

der A betyr en N-endebeskyttet L-aminosyrerest eller en eventuell N-endebeskyttet peptidrest med en C-endebeskyttet L-aminosyre, B er en L-aminosyrerest og Z er OH eller en C-endebeskyttelsesgruppe, hvorved en substratkomponent omsettes med en aminkomponent i nærvær av et enzym, og, hvis ønskelig, endebeskyttelsesgruppen eller -gruppene spaltes slik at det dannes et peptid med formelen A-B-Z, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at en substratkomponent som er en aminosyre- eller peptidester, et depsipeptid, et eventuelt N-substituert aminosyreamid eller peptidamid eller et eventuelt N-endebeskyttet peptid, og som har formelen hvori A har den samme betydning som ovenfor, R er en enzymatisk avspaltbar gruppe, alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl eller et 2 21 a<->des-aminofragment av en aminosyrerest, R og R betyr uavhengig en enzymatisk avspaltbar gruppe hydrogen, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og X er en L-aminosyrerest, omsettes med en aminkomponent som er et eventuelt N-substituert L-aminosyreamid, en L-aminosyre eller en L-aminosyreester og som har formelen

3 3 *

hvori B betyr det samme som ovenfor, R og R uavhengig av hverandre betyr en enzymatisk avspaltbar gruppe, hydrogen, hydroksy, amino, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og R<4>

er hydrogen eller en enzymatisk avspaltbar gruppe alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, hvorved reaksjonen utføres i nærvær av et L-spesif ikt serin- eller tiolkarboksypeptidaseenzym oppnådd fra gjær eller fra dyr, planter eller mikrober i vannholdig oppløsning eller dispersjon med en pH-verdi på 5-10,5, fortrinnsvis ved en temperatur på 20 til 50°C.

Oppfinnelsen er basert på en fundamental endring i forhold til

I

den kjente teknikk, dvs. bruken av eksopeptidaser istedet for de enzymer som er benyttet til nå, som alle har vist over-

veiende eller i en i det minst betydelig endopeptidaseaktivi-

tet.

I

Det er funnet at de brukbare enzymer i tillegg til å være eksopeptidaser må vise en peptidaseaktiyitet med bred spesifisitet for derved å tillate en synteseaktivitet med tilsvarende bred spesifisitet, som ikke er begrenset; til en enkelt eller få typer peptidbindinger. Enzymene må være |i stand til å danne acylen-zymmellomprodukter av den type som er beskrevet ovenfor under det kinetiske aspekt, og må spesielt ha<1> slike karakteristika som vil tillate aminolyse av mellomprodukter under betingelser der

<<K^, jfr. skjema (4) ovenfor, for å unngå umiddelbar hydrolyse av de fremstilte peptider. Evnen t!il å danne acylenzymmellom-produkter kan også uttrykkes som eynen til å spalte den C-avsluttede beskyttende gruppe i den benyttede substratkomponent,

det vil i foreliggende tilfelle si'en esterase- eller amidaseaktivitet. For at syntese skal kunne skje må denne aktivitet dominere peptidaseaktiviteten for enzymet under de benyttede reaksjonsbetingelser.

i

j

Denne mangfoldighet av karakteristika finnes i den gruppe ekso-peptidase som kalles karboksypeptidase og som er i stand til å hydrolysere peptider med frie karboksylgrupper. Det er funnet at et antall slike karboksypeptidaser viser forskjellige enzy-

i

matiske aktiviteter som er meget avhengig av pH-verdien slik at de f.eks. i en basisk omgivelse ved en pH-verdi fra 8 til 10,5 viser hovedsakelig esterase- eller amidaseaktivitet, men ved en

I

pH-verdi fra 9 til 10,5 kun viser liten eller ubetydelig peptidase-aktivitet. Disse egenskaper kan fordelaktig benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fordi de bidrar til å oppnå gode utbytter.

i

Videre er det funnet at evnen til å danne de nevnte acylenzym-

I

mellomprodukter er spesielt utpreget i serin- eller tiolproteaser. En foretrukket gruppe karboksypeptidaser er derfor serin-eller tiolkarboksypeptidaser. Slike enzymer kan fremstilles av

i

i

gjærsopp eller de kan være av animalsk, vegetabilsk eller mikrobiell opprinnelse.

Et spesielt gunstig enzym er karboksypeptidase Y fra gjærsopp (CPD-Y). Dette enzym beskrives av Hayashi et al. (ref. 5) og av Johansen et al. (ref. 6) som utviklet en spesielt god rensemetode ved affinitetskromatografi på en affinitetsharpiks omfattende en polymerharpiksmatriks med koblede benzylsuccinylgrupper. CPD-Y som er et serinenzym, er karakterisert ved å ha det ovenfor angitte forhold mellom de forskjellige enzymatiske aktiviteter ved pH >9 og ved ikke å ha endopeptidaseaktivitet. I tillegg til spesifisiteten overfor C-avsluttede aminosyrer eller -estere med frie a-karboksylgrupper, kan CPD-Y således hydrolysere peptider hvori den C-avsluttede a-karboksylgruppe er blokkert i form av en estergruppe, f.eks. en alkyl- eller arylester, eller som en amidgruppe eller et N-substituert amid, f.eks. et anilid. Viktig er at enzymet hydrolyserer de fleste substrater, uavhengig av typen av C-avsluttet aminosyrerest. En annen fordel ved CPD-Y er at det er tilgjengelig i store mengder og viser relativt høy stabilitet. I tillegg til CPD-Y som er det foretrukne enzym på det nåværende tidspunkt kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres med andre karboksypeptidaser, slik som de er anført nedenfor. Storfekarboksypeptidaser A og B (CPD-A og CPD-B) er imidlertid ikke egnet fordi de er metallokarboksypeptidaser.

i

Som forklart ovenfor er syntesen basért på en reaksjon mellom

en såkalt substratkomponent, ogsa kalt syrekomponent eller donor, og inneholdende delen A, med én såkalt aminkomponent, også kalt nukleofil komponent eller akseptor, og inneholdende delen B, for derved å danne peptidet A-B.

i

Delen A som er en aminosyrerest eller en peptidrest kan, hvis ønskelig, være N-avsluttet amino som|er beskyttet for å unngå uønskede sekundære reaksjoner.

Behovet for aminobeskyttelse reduseres med økende kjedelengde for peptidresten og er så og si ikke: til stede når peptidresten består av tre aminosyrer, alt imidlertid avhengig av deres type og sekvens.

Eksempler på brukbare aminosyrer er alifatiske aminosyrer slik som monoaminomonokarboksylsyrer, f.eks. glysin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), norvalin (Nva), jleucin (Leu), isoleucin (iso-Leu) og norleucin (Nie), hydroksyaminosyrer slik som serin (Ser), treonin (Thr) og homoserin (homo-Ser), svovelholdige aminosyrer slik som metionin (Met) eller cystin (CysS) og cystein (CysH), monoaminodikarboksylsyrer slik som aspartinsyre (Asp), glutaminsyre (Glu), asparagin (Asn) jog glutamin (Gin), diamino-monokarboksylsyrer slik som ornitin^(Orn), lysin (Lys) og arginin (Arg), aromatiske aminosyrer slik som fenylalanin (Phe) og tyrosin (Tyr), såvel som heterocykliske aminosyrer slik som histidin (His) og tryptofan (Trp).

i

i

Som beskyttende grupper kan benyttes aminobeskyttende grupper som er vanlige innen peptidkjemien slik som benzoyl (Bz),

acetyl (Ac) eller tertiære alkoksykårbonylgrupper, f.eks. t-butyloksykarbonyl (BOC-), t-amyloksykarbonyl (T-AOC-), benzyl-

oksykarbonyl (Z-), p-metoksybenzyloksykarbonyl (PMZ-), 3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl (ZfOMe^-), 2,4,6-trimetylbenzyl-oksykarbonyl (TMZ-), p-fenylazobenzyloksykarbonyl (PZ-), p-toluensulfonyl (Tos-), o-nitrofenylsulfonyl (Nps-), eller lignende.

Foretrukne beskyttende grupper er benzyloksykarbonyl og t-butyloksykarbonyl fordi disse derivater er lette å fremstille, økonomiske i bruk og lette å spalte av igjen.

Som nevnt ovenfor kan substratforbindelsen velges blant:

(a) aminosyreestere, peptidestere og pepsipeptider med formelen hvori A er som angitt ovenfor og R betyr alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl eller et a-des-aminofragment av en aminosyrerest, (b) eventuelt N-substituerte aminosyreamider og peptidamider med formelen 2 2 * hvori A er som angitt ovenfor og R og R angir hydrogen, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og (c) eventuelt N-avsluttede beskyttende peptider med formelen

hvori A er som angitt ovenfor og X betyr en aminosyre.

I denne sammenheng betyr "alkyl" rettkjedet eller forgrenet alkyl, fortrinnsvis med 1 til 6 karbonatomer, f.eks. metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert.butyl, amyl, heksyl og lignende.

"Aryl" betyr fenyl, heterocyklisk aryl og lignende. "Aralkyl" 2 2 ' 3 betyr benzyl, fenetyl og lignende. Gruppen R og R og R og R 3 ' kan være like eller forskjellige.

Alle disse grupper kan være substituert med substituenter som er inerte med henblikk på enzymet, f.eks. halogen (fluor, klor, brom, jod), nitro, alkoksy (metoksy, etoksy osv.), eller alkyl (metyl, etyl osv.), forutsatt at aminosyreresten eller peptid-derivatet er et substrat for karboksypeptidase.

Når det gjelder estere velges såledejs gruppen Or\ fortrinnsvis blant alkoksygrupper slik som métoksy, etoksy eller t-butoksy, fenyloksy- og benzyloksygirup<p>er. Gruppene kan eventuelt være substituert med inerte substituenter slik som nitrogrupper (p-nitrobenzyloksy). Andre grupper kan også benyttes hvis aminosyreresten eller Ipeptidderivatet er et substrat for karboksypeptidase. Etjeksempel er de såkalte depsipeptider der den C-avsluttede aminosyre er bundet via en esterbinding i steden for en peptidbinding, f.eks. benzoyl-glycinfenyllaktat (BZ-Gly-OPhe).

Foretrukne karboksylsyrebeskyttende;grupper er alkoksygrupper, spesielt metoksygrupper, eller med andre ord: Substratkomponenten inneholder fortrinnsvis eller består av en aminosyremetylester, fordi disse derivater samtidig er lette å fremstille og gode substrater. Imidlertid kan man også benytte etylestere, propylestere, isopropylestere, butylestere, t-butylestere, benzylestere eller tert.butyloksyestere.

Det skal nevnes at ioniserbare grupper som kan være til stede

i de individuelle aminosyrer som er! bestanddeler i en peptidrest A, hvis ønskelig kan være blokkert på i og for seg kjent måte, avhengig av gruppetypen. Imidlertid er dette ikke alltid nødvendig, noe som nettopp er en av fordelene ved foreliggende fremgangsmåte. Hvis det er ønskelig å beskytte de funksjonelle grupper er egnede beskyttende grupper for w-aminogruppen (N^), f.eks. N^-benzyloksykarbonyl (Nu<->Z)!, t-butoksykarbonyl (N<w->BOC) eller tosyl (Nu<->Tos). Egnede beskyttende grupper for en guani-G G G

dinogruppe (N ) i Arg er nitro (N -;N0~), N -benzyloksykarbonyl

G G G G

(N -Z) og N ,N -dibenzyloksykarbonyjl (N -Z-Z). Egnede beskyttende grupper for imidazolringen (N<1>;<111>) i His er N<im->benzyl (N<im->Bzl) og tosyl (N<im->Tos). Egnede beskyttende grupper for oo-karboksylgruppene er u-benzyloksy (-OBzl). Egnede beskyttende grupper for hydroksylgruppen i alifatiske eller aromatiske hydroksyaminosyrer er aralkylgrupper slik som benzyl (Bzl). Egnede S-beskyttende grupper for mérkaptogruppen i CysH er f.eks. benzylgruppen (Bzl). De beskyttende grupper må være stabile under primærreaksjonen og lette å spalte av fra sluttproduktet

uten å forårsake sekundære reaksjoner.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan i prinsippet utføres med en hvilken som helst aminosyre som substratforbindelse.

Den andre deltager i reaksjonen er den såkalte aminokomponent som velges blant

(a) aminosyrer med formelen

(b) eventuelt N-substituerte aminosyreamider med formelen 3 3' hvori B er en aminosyrerest og R og R betyr hydrogen, hydroksy, amino eller alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og (c) aminosyreestere, tioestere eller selenoestere med formlene

hvori B er en aminosyrerest og R 4 betyr alkyl, aryl, heteroaryl og aralkyl.

Alkyl-, aryl- og aralkylgruppene kan være substituert og er definert som forklart i forbindelse med substratkomponenten.

Det fremgår at R^ = hydrogen representerer det frie amid, mens

3 3 3

R = OH er en hydroksamsyre, R = amino er et hydrazid og R = fenyl betyr et anilid.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har således den avgjørende fordel i forhold til f.eks. Isowa og Morihara (se ovenfor) at den kan utføres både med frie (ikke C-avsluttede beskyttede) aminosyrer og med aminosyrer som er C-avsluttede beskyttet, f.eks. ved omdanning til de tilsvarende amider, anilider, hydrazider, estere eller andre spesifiserte karboksylderivater av aminosyrer.

Hva angår aminkomponenten avhenger f.eks. reaksjonssekvens, utbytter osv. meget av hvorvidt komponentene tilføres som fri syre eller som et C-beskyttet derivat, f.eks. som amid. Dette skal illustreres i større detalj nedenfor i forbindelse med

i

eksemplene; det følgende generelle bilde synes imidlertid å foreligge: j

Når det gjelder de frie syrer synes det som om de hydrofobe aminosyrer, slik som alanin, leucin,) valin og fenylalanin så vel som syrer med en positiv ladet sidekjede, slik som lysin og arginin, er relativt lette jå innarbeide i kjeden i substratkomponenten, mens aminosyrer hvis sidekjeder inneholder enten karboksylgrupper (aspartinsyre eller glutaminsyre), hydroksylgrupper (serin og treonin) eller aminogrupper (asparagin og glutamin) er mere vanskelige i å innarbeide.

Heterocykliske aminosyrer slik som prolin og histidin er ekstremt vanskelige å innarbeide som friie syrer.

Det er et vanskelig tilfelle hvis C-avsluttede beskyttede aminosyrer, f.eks. aminosyreamider, eller N-substituerte amider, f.eks. hydrazider eller anilider, benyttes som aminkomponenter. Dette skal utredes nærmere nedenfor; men det kan sies rent generelt at i dette tilfellet er reaksjonen sterkt avhengig av strukturen og tillater sågar at det oppnås meget høye utbytter (opptil 90%); imidlertid er også her heterocykliske amino-

syrer vanskeligere å innarbeide enn alifatiske.

i

i

Som angitt ovenfor gjennomføres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved en pH-verdi fra 5,0 til 10,5 og fortrinnsvis fra 8,0

til 10,5. Den foretrukne pH-verdi som ofte ligger innen et meget smalt område, avhenger av pH-optima og pH-minima for de forskjellige enzymatiske aktiviteter for det benyttede enzym,

her forstått at pH-verdien velges s'lik at virkningene avbalan-seres som forklart tidligere.

I

Generelt øker peptidaseaktiviteten med synkende pH-verdi under ca. 9,0, noe som derved gjør prosessen mindre fordelaktig når det gjelder utbytte. I noen tilfeller, f.eks. med Bz-Ala-Gly eller Bz-Ala-Gly-NH2, er imidlertid de dannede peptider eller peptidamider meget dårlige substrater for karboksypeptidase,

slik at esteraseaktiviteten i forhold til aminosyreesteren eller peptidesteren som fortrinnsvis brukes som substratkomponent,

fremdeles er overveiende, noe som gjør en syntese mulig selv ved pH-verdier omtrent så lave som 5,0. Generelt sagt avhenger den optimale pH-verdi av det angjeldende utgangsmateriale, de dannede peptider samt enzymet.

Hvis CPD-Y benyttes som enzym er pH-verdien fortrinnsvis 8,0 til 10,5 og fortrinnsvis 9,0 til 10,5 som forklart nedenfor.

Denne pH-verdi bør holdes under koblingsreaksjonen og kan deretter forandres for utfelling av reaksjonsproduktet, spalting av beskyttende grupper osv. Dette kan gjennomføres ved inn-arbeidelse av en egnet buffer for det valgte pH-område i reaksjonsmediet slik som en bikarbonatbuffer.

Imidlertid er den valgte buffer ikke vesentlig for reaksjonen, forutsatt at den riktige pH-verdi opprettholdes.

pH-verdien kan også holdes ved å tilsette en syre slik som HC1, eller en base slik som NaOH, under reaksjonen.

Reaksjonen gjennomføres som nevnt i et vandig reaksjonsmedium som, hvis ønskelig, kan inneholde opptil 50% av et organisk oppløsningsmiddel. Foretrukne organiske oppløsningsmidler er alkanoler, f.eks. metanol og etanol, glykoler, f.eks. etylenglykol eller polyetylenglykoler, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, tetrahydrofuran, dioksan og dimetoksyetan.

Valget av sammensetning av reaksjonsmediet avhenger spesielt av oppløslighet, temperatur og pH-verdi for reaksjonskompo-nentene og peptidproduktet, og av enzymets stabilitet.

Reaksjonsmediet kan også omfatte en komponent som gjør enzymet uoppløslig, men som bibeholder en betydelig del av enzym-aktiviteten, slik som en ionebytterharpiks. Alternativt kan enzymet immobiliseres på kjent måte, jf. "Methods of Enzymo-logy", vol. 44, 1976, f.eks. ved binding til en matriks slik som et kryssbundet dekstran eller agarose, eller til et sili-siumdioksyd, polyamid eller cellulose, eller ved innkapsling i polyakrylamid, alginater eller fibre. Ved siden av dette kan enzymet modifiseres på kjemisk niåte for å forbedre stabiliteten eller de enzymatiske egenskaper.

j

Konsentrasjonen av de to deltagere i reaksjonen kan variere innen vide grenser slik som forklart nedenfor. En fore-

trukket utgangskonsentrasjon for substratkomponenten er 0,01 til 1 molar og for aminkomponenten 0,05 til 3 molar.

Ifølge oppfinnelsen er reaksjonstemperaturen fortrinnsvis 20

til 50°C. Den gunstigste . reaksjonst:emperatur for en gitt syntese kan bestemmes ved forsøk, mén avhenger spesielt av den benyttede aminkomponent og enzymet. En egnet temperatur er vanligvis ca. 35 til 45°C, fortrinnsvis ca. 35°C. Ved temperaturer under 20°C vil reaksjonstiden vanligvis bli uhen-siktsmessig lang, mens temperaturer'over 50°C ofte gir prob-

i

lemer med henblikk pa stabiliteten i enzymet og/eller i reaktantene eller for reaksjonsproduktene.

i

Lignende variasjoner opptrer for reaksjonstiden som avhenger meget av de andre reaksjonsparametre slik det forklares nedenfor. Standard reaksjonstid ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ca. 10 minutter, men kan ta opp til et par timer.

Det skal tilføyes at nao r man benytte!r et amid eller et substituert amid som aminkomponent, er' det ofte fordelaktig eller sågar nødvendig å spalte av amidgruppen spesifikt fra det dannede peptidamid for å fortsette syntesen. Også i denne henseende er karboksypeptidase, spesielt CPD-Y, meget egnet, fordi som beskrevet ovenfor CPD-Y viser amidaseaktivitet ved pH > 9, mens karboksypeptidaseaktiviteten er neglisjerbar.

I

Etter det samme aspektet kan karboksypeptidase generelt benyttes for å spalte av gruppene R eller R1 som definert fra det dannede peptid, uansett om det er ønskelig å fortsette syntesen eller kun å oppnå et ferdig peptid som ikke er C-avsluttet beskyttet.

I

Slik det skal vises ytterligere nedenfor er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendbar for dannelse av et ubegrenset

i

i

i

antall dipeptider, oligopeptider og polypeptider, basert på

det samme oppfinneriske prinsipp, dvs. omsetning av en substratkomponent med en aminkomponent i form av en aminosyre eller et aminosyrederivat i nærvær av en karboksypeptidase.

Eksempler på velkjente oligopeptider eller polypeptider som

kan fremstilles i henhold til dette er enkefaliner, somatostatin, somatostatinanaloger og peptider med lignende biologiske aktiviteter samt det såkalte "sovepeptid" (Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu).

I visse tilfeller, f.eks. når det dreier seg om peptider som består av mer enn 5 aminosyrer, kan det være fordelaktig å syntetisere deler av det ønskede peptid i form av oligopeptid-fragmenter, f.eks. pentapeptider, med den egnede aminosyresekvens, og deretter å underkaste oligopeptidene en fragmentkondensasjon på en hvilken som helst kjent måte.

Det kan også for å forbedre f.eks. peptidenes oppløslighets-karakteristika være fordelaktig som N-avsluttet aminosyre å benytte arginin eller en annen ioniserbar aminosyre under syntesetrinnet og deretter spalte av arginin fra peptidet med et spesifikt enzym, f.eks. trypsin, når den ønskede aminosyresekvens ellers er i orden.

Disse og andre modifikasjoner utgjør også en del av oppfinnelsen .

Før fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal illustreres ved eksempler, skal utgangsstoffer, målemetoder osv. forklares generelt.

Karboksypeptidase fra bakegjær ble isolert ved affinitetskroma-tografiprosedyren ifølge Johansen et al. (ref. 6) og oppnådd

; som et lyofilisert pulver (10% enzym i natriumsitrat). Før

bruk ble enzymet avsaltet på "Sephadex G-25" av fin kvalitet (1,5 x 25 cm) ekvilibrert og eluert med destillert vann. Konsentrasjonen i enzymet ble bestemt spektrofotometrisk ved å

benytte ^280 nm = ^'^^ (ref. 6). En stamoppløsning på 7 mg/

ml (110 mM) ble fremstilt og lagret i' like store deler på 250-500 ul ved -21°C. Benzoylalaninmetylester (Bz-Ala-OMe)

var oppnådd kommersielt. Bortrifluorideteratkompleks (for syntese), oppløsningsmidler og reagenser var alle av analytisk kvalitet. Alle aminosyrer og aminosyreamider og deres derivater var kommersielle. Karbobenzyloksyfenylalaninmetylester (Z-Phe-OMe) ble fremstilt ifølge den prosedyre som er beskrevet av Yamada et al. (ref. 20) og ble benyttet som en sirup. Fenylalaninhydrazid og alaninhydrazidhydroklorid ble fremstilt fra estrene som beskrevet av Losse et; al. (ref. 11). De ukorrigerte smeltepunkter var 86-88°C (Lit.: 82-83°C (11)) og 182-185°C (Lit.: 184-185°C (21)). Asparaginamiddihydroklorid ble oppnådd fra aspartinsyre via dietylesteren i henhold til Fischer (ref. 4) ved klassisk aminolyse (smeltepunkt: 210-214°C, Lit.: 214-215°C (19)). Andre jutgangsstoffer ble oppnådd

i

fra de ovenfor angitte kompanier eller fremstilt på analog måte.

!

Renheten ble bestemt kvalitativt veditynnsjiktskromatografi

på "Silikagel 60F254"* Oppløsningsmiddelsystemet som ble benyttet var CHC13/CH3(CH2)3OH/CH3COOH/H20 (11:5:2:1) og punktene ble gjort synlige ved fluorescenstekrtikken for å bedømme reak-tantsammensetningen.

Reaktantsammensetningene ble bestemt kvantitativt ved omvendt fase HPLC ved bruk av en RP-8, 10 pm'kolonne og en "Hewlett Packard 1084" kromatograf utstyrt med en UV-detektor for variable bølgelengder av typen modell 79875 Ai Separering ble oppnådd ved å bruke egnede spesifikke gradienter for elueringssytemer fra 10% CH3CN i 10 mM-NaAc, pH 4 til'100% CH3CN eller fra 10 mM-NaAc, pH 4 til 100% CH3CN. Det sistnevnte system ble benyttet for forbindelser slik som Bz-Ala-Gly-OH, Bz-Ala-Ala-OH, Bz-Ala-Ser-OH eller deres respektive;amider, jf. nedenfor. Strømningshastigheten var 3 ml/min.,<:>kolonnetemperaturen 4 7°C

og monitorbølgelengden 260 nm. Utbyttene ble basert på basis av molforholdet for reaktantene som ble nådd fra de integrerte områder under signalene i elueringsprofilen.

i

Punktene ble identifisert ved tynnsjiktskromatografi med egnede standardforbindelser. Flere produkter ble identifisert ved en kombinasjon av HPLC og aminosyreanalyse. For dette formål ble 1 ml-andeler tatt fra reaksjonsblandingen etter 10 minutter, og reaksjonen ble avbrutt ved å tilsette 250 ul 6 M-HCL. pH-verdien ble deretter justert til 4 med NaOH og blandingen separert ved HPLC ved bruk av Waters utstyr inkludert to pumper, en "660 Solvent Programmer", en "U6K Injector", en "450 Variable Wavelength Detector" kombinert med en skriver "Radiometer

REC 61" eller en "Hewlett Packard Recorder/Integrator 3380A". Elueringen ble registrert ved scanning ved en egnet bølgelengde mellom 255-280 nm. Kromatografien var omvendt fase ved bruk av en "Waters C-18 u-Bondapak"-kolonne med elueringssystemet TEAP- 20% (v/v) TEAP (trimetylammoniumfosfatbuffer) i metanol under egnede gradienter og strømningshastigheter på 1,5-2,0 ml/min. TEAP-bufferen ble fremstilt i henhold til Rivier (ref.

17). I mange tilfeller ga systemet 0,1 M-HAc, pH 3 - 20%

(v/v) 0,1 M-HAc, pH 3 i metanol også tilstrekkelig oppløsning.

Avløpet inneholdende N-acyldipeptidene ble samlet manuelt og tørket ved lyofilisering eller på en "Buchi Rotovap" ved 35-45°C. Små prøver av restene ble hydrolysert i 6 M-HC1 ved 110°C i vakuum i 3 6 timer. De fordampede hydrolysater ble deretter analysert på en Durrum D-500 aminosyreanalysator.

Syntese med frie aminosyrer som aminkomponent

Eksempel 1

En oppløsning av 2ml 0,6 M valin-0,1 M KCl-lmM EDTA, pH = 9,8, ble blandet med 100 ul (0,1 mmol) av en 1 M Bz-Ala-OMe (oppløst i 96% etanol) sluttoppløsning. Reaksjonen ble gjennomført i en pH-stat ved 35°C og pH 9,8, i det pH-verdien ble holdt konstant ved automatisk tilsetning av 0,5 M NaOH. Reaksjonen ble initiert ved tilsetning av 0,7 mg karboksypeptidase Y

(150 U/mg, fremstilt av De Forenede Bryggerier). Etter en reaksjonstid på 30 min. ble reaksjonen avbrutt ved å justere pH-verdien til ca. pH = 1 med 6 M HC1. Reaksjonsproduktet ble renset og isolert ved hjelp av høytrykkskromatografi. Utbyttet av Bz-Ala-Val-OH var 40%. Kvantitativ aminosyreanalyse

I

i

etter hydrolyse av produktet i 6 M HC1 i 24 timer ga relativt 1,0 mol alanin og 1,0 mol valin.

l

Virkningen av pH-verdi, temperatur og konsentrasjon av substratkomponenten, aminkomponenten og CPD-j-Y på utbyttet i den ovenfor angitte reaksjon:

i

ble studert i 5 separate forsøksserier analoge med den ovenfor angitte prosedyre. En av parametrene nevnt nedenfor ble variert i hvert forsøk, mens de fire andre ble holdt konstant: 0,6 M valin, 55 mM Bz-Ala-OMe, 4,5 mM CPD-Y, pH 9,7, 35°C. Resultatene er vist i fig. 1. Det fremgår av fig. IA at pH-området for optimalt utbytte er heller smalt, i det det kun strekker seg over 0,5 pH-enheter. Det fremgår av figur IB at en økning i reaksjonstemperaturen forårsaket en så og si lineær økning av syntesen på bekostning av relativt lite hydrolyse.

Ved temperaturer over 4 5°C ble enzymaktivering og ikke-enzymatisk esterhydrolyse prohibitiv. Ved lavere temperaturer og pH-verdier opp til 10,0 var esterhydrolysen neglisjerbar innen standard reaksjonstid på 10 min. Den ble imidlertid betydelig når den enzymatiske reaksjonshastighet ble inhibert og krevet reaksjonstider på opp til 2 til 5 timer.

j

Mens utbyttene av Bz-Ala-Val-OH øket med høyere aminkomponentkon-sentrasjon (fig. ID), var det omvendte tilfellet for forholdet mellom utbytte og konsentrasjon av Isubstratforbindelsen Bz-Ala-OMe (fig. 1C). Den siste observasjon, sett sammen med utbytte-avhengigheten av høy konsentrasjon'(fig. 1E) foreslår et optimalt forhold mellom substrat og enzymkonsentrasjon.

I

Tidsforløpet for en typisk reaksjon, illustrert ved den ovenfor angitte reaksjon under betingelser litt under de optimale er vist i fig. 2. I nærvær av 0,5! M valin ble substratet Bz-Ala-OMe hurtig omdannet (i løpet a<y> 20 min.) til 38% Bz-Ala-Val-OH og 62% Bz-Ala-OH. Figuren visejr også at dipeptidet ikke ble hydrolysert ved pH 9,7 i nærvær av et overskudd av valin. Hvis

i

i

i

j

i

imidlertid pH-verdien ble justert til 5 til 8, ble all Bz-Ala-Val-OH hydrolysert i løpet av sekunder. Denne selektive oppførsel for CPD-Y ved pH-verdi er en viktig egenskap i forbindelse med dens brukbarhet ved peptidsynteser.

Eksempel 2

En oppløsning av 2 ml 3M lysin - 0,1 M KC1 - 1 mM EDTA, pH<1>

9,8, ble blandet med 400 ul 100% metanol og 100 pl eller 0,1 mmol IM Z-Phe-OMe (oppløst i 100% metanol). Reaksjonen ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1 og initiert ved tilsetning av 0,7 mg karboksypeptidase-Y. Etter en reaksjonstid på 30 min. ble pH-verdien justert til 1 med 6 M HC1. Reaksjonsproduktet ble renset og isolert ved hjelp av høytrykkskroma-tografi. Utbyttet av Z-Phe-Lys-OH var 60%. Kvantitativ aminosyreanalyse slik som beskrevet i eksempel 1 viste at produktet relativt sett inneholdt 1,0 mol lysin og 1,0 mol fenylalanin.

Analogt med eksemplene 1 og 2 ble de peptider som er anført i tabell I fremstilt fra de angitte utgangsstoffer. Forsøkene ble utført i en radiometer pH-stat og utbyttene ble bestemt ved HPCL (jf. det foregående), betingelsene var 4,5 uM

CPD-Y; pH 9,7 og 35°C.

Syntese med aminosyreamider som aminkomponent

Eksempel 3

En oppløsning av 2 ml 0,6 M metioninamid (Met-NI^) 0,1 m KC1

- 1 mM EDTA, pH 9,8, ble blandet med 100 pl eller 0,1 mmol av en 1 M Bz-Ala-OMe-oppløsning i 96% metanol. Reaksjonen ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1 og initiert ved tilsetning av 0,7 mg karboksypeptidase-Y. Etter en reaksjonstid på 30

min. ble pH-verdien jusert til 1 med 6 M HC1. Reaksjonsproduktet

ble renset og isolert ved hjelp av høytrykkskromatografi. Utbyttet av Bz-Ala-Met-NH2 var 95%. j Kvantitativ aminosyreanalyse, slik som beskrevet i eksempel 1, viste at produktet relativt sett inneholdt 1,0 mol Ala, 1,0 mol Met og 1,0 mol NH3 . I

Reaksjonsforløpet er vist i fig. 3 hvorfra det fremgår at i

løpet av 20 min. var substratet så og si totalt omdannet til ca. 95% dipeptxd og 5% var hydrolyseIrt txl Bz-Ala-OH.

Eksempel 4

En oppløsning av 2 ml 0,4 M valinamid (Val-NH2) - 0,1 M KC1 -

1 mM EDTA, pH 9,5, ble blandet med 100 yl eller 0,1 mmol av en 1 M Bz-Ala-OMe-oppløsning i 96% metanol. Reaksjonen ble gjennomført som beskrevet i eksempeh. 1. Reaksjonsproduktet Bz-Ala-Val-NH2 falt ut under reaksjbnen. Etter 20 minutters reaksjon ble pH-verdien justert til '1, og det utfelte materialet ble isolert ved sentrifugering. Prjoduktet ble oppløst i 1 ml 96%-ig etanol og renset og isolert |ved høytrykkskromatografi. Utbyttet av Bz-Ala-Val-NH2 var 95%,j mens, slik som vist i eksempel 1, det kun var 40% når den frie syre ble benyttet som aminkomponent. Kvantitativ aminosyreanalyse, slik som beskrevet i eksempel 1, viste at produktet relativt sett inneholdt 1,0

mol Ala, 1,0 mol Val og 1,0 mol NH^.

j

Reaksjonssekvensens avhengighet aVjpH-verdi og valinamidkonsentrasjonen er vist i fig. 4. Reaksjonen ble utført analogt

i

med en ovenfor angitt syntese, i det de konstante parametre var: Valinamid 0,6 M, Bz-Ala-OMe 55 mM, CPD-Y 4,5 MM, pH 9,7, 35°C. :

Det fremgår av fig. 4B at utbyttet<:>i det vesentlige er uføl-

somt overfor variasjonen av valinamidkonsentrasjonen i motset-ning til fig. ID, som viser utbyttet med varierende valin-konsentrasjon, ved minst en konsentrasjon ekvimolar med eller høyere enn substratkonsentrasjonenl (55 mM).

I

Det fremgår av fig. 4A at det effektive pH-område for valinamidet

i

i

l

i

strekker seg ned til 9,0 og at det er en skarp øvre grense ved pH 9,8 over hvilken utbyttet sterkt reduseres.

Analogt med eksemplene 3 og 4 ble peptidene som er anført i tabell II fremstilt fra de angitte utgangsstoffer. Forsøkene ble utført under de følgende betingelser: 4,5 uM CPD-Y; pH 9,6 og 35°C, mens substratkonsentrasjonen er angitt i tabellen.

b) Produktet ble utfelt.

Eksempel 5

Syntese med aminosyrehydrazider som aminforbindelse Analogt med eksemplene 3 og 4 ble de i tabell III anførte peptider fremstilt fra de anførte utgangsstoffer. Forsøkene ble gjennomført under følgende betingelser:

4,5 yM CPD-Y, pH 9,6 og 35°C.

Eksempel 6

Syntese med aminosyreestere som aminkomponent

Forsøkene med aminosyreestere ble utført analogt med eksemplene 1, 2, 3 og 4 i en radiometer pH-stat ved pH 9,0-9,7 og 23-35°C. Produkter og utbytter ble bestemt ved HPLC. CPD-Y-konsentrasjonen var fra 4,5 til 11 uM. i

i

Tabell IV viser peptider som ble frémstilt fra de angitte utgangsstoffer. I

Det går fram av tabellen at i noen (tilfeller oppnås en viss oligomerisering. Fordi utbyttene generelt er meget høye, synes aminosyreestere å være ekstremt brukbare hvis oligomeriseringen ytterligere kan begrenses.

i

Eksempel 7 j

L- og D- stereoisomerer av aminokomponenten

Analogt med eksempel 1, 2, 3, 4 og 6 ble peptidene som er angitt i tabell V fremstilt fra de angitte utgangsstoffer. Det fremgår at kun L-isomerene er innarbeidet: Dette er et meget interessant trekk hva angår prosessøkonomien, 1 fordi det som et resultat ikke er nødvendig å rense utgangsaminosyrene med henblikk på å oppnå den rene L-isomer. !

i

Eksempel 8

Variasjon av substratestergruppen

Analogt med eksemplene 1, 2, 3 og 4 ble de i tabell IV angitte peptider fremstilt fra de anførte utgangsstoffer.

Resultatene viser fleksibilitet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hva angår anvendelige substrater.

i

I

Eksempel 9

Depsipeptider som substrater i

Analogt med eksemplene 3 og 4 ble de peptider som er angitt i tabell VII fremstilt fra de anførtje utgangsstof f er. Betingelsene var 4,5 m CPD-Y, pH = 7,6 pg 25°C.

i

Det fremgår at det oppnås meget høye utbytter.

i

Eksempel 10 I

Peptider som substratkomponenter j

Analogt med eksemplene 1, 2, 3 og 4 ble de peptider som er angitt i tabell VIII fremstilt. Forsøkene ble utført i en radiometer pH-stat og utbyttene ble bestemt ved HPLC. Betingelsene var 4-25 uM CPD-Y, pH = 7,6 og 25°C.

j

Peptidsyntese som en funksjon av pH- verdien

I de tilfeller der de syntetiserte peptider er et dårlig substrat for CPD-Y kan syntesen gjennomføres ved pH-verdier under det foretrukne område 9-10,5.

Eksempel 11

Analogt med eksemplene 1 og 3 ble de peptider som er angitt i tabell IX fremstilt i en pH-stat ved de anførte pH-verdier.

Betingelsene var 15 yM CPD-Y og 25°C.

Forskjellige andre aminkomponenter

i

Eksempel 12

Analogt med eksemplene 3 og 4 blej de peptider som er angitt i tabell X fremstilt. Forsøkene ble utført i en pH-stat og utbyttene ble bestemt ved HPLC. Betingelsene var 4,5 vM CPD-Y, pH 9,5 og 25°C.

Eksempel 13

Syntese av peptider med karboksypeptidase fra bygg

Spirende bygg, f.eks. i form av malt, inneholder to forskjellige peptidaser angitt som CP-1-1 og CP-2-1 (se Lee E. Ray, Carlsberg Res. Comm. 41, 169-182 (1976)).

CP-1-1 og CP-2-1 ble isolert som beskrevet av L.E. Ray og de peptider som er anført i tabell XI ble fremstilt analogt eksemp-j lene 1, 2, 3 og 4 ut fra de angitte utgangsstoffer. Betingelsene var 6 yM CP-1-1 eller CP-2-1, pH 8,0 og 25°C.

Eksempel 14

Karboksypeptidase- Y- katalysert deamidering av peptidamider

Til en oppløsning av 2 ml 15 mM Bz-Ala-Leu-NH2 i 0,1 M KC1 -

1 mM EDTA, pH 9,7, 25°C og 10% dimetylformamid ble det tilsatt

2 mg CPD-Y. Reaksjonsforløpet som vist i fig. 5 ble fulgt ved HPLC som beskrevet i eksempel 1. Det fremgår at Bz-Ala-Leu-NH2 etter 20 minutter helt var omdannet til ca. 68% Bz-Ala-Leu-OH og 32% Bz-Ala-OH. Aminosyreanalysen på reaksjonsblandingen viste at Bz-Ala-OH hovedsakelig ble dannet ved spalting av Leu-NH2 fra Bz-Ala-Leu-NH2.

Eksempel 15

Sammenligning av peptidestersubstrater med og uten N- avsluttende beskyttede grupper.

Analogt med eksemplene 3 og 4 ble peptidene som er angitt i tabell XII fremstilt under de følgende betingelser: 50 mM substrat, 5 yM CPD-Y, pH 9,5 og 25°C.

I

Tabell XII '

Sammenligning av karboksypeptidase-Y-katalysert syntese av peptider ved bruk av peptidestere med og uten N-avsluttede beskyttede grupper som substrat, j

i

i

Eksempel 16

Syntese i nærvær av organiske oppløsningsmidler

Analogt med eksemplene 1, 2, 3, 4| og 6 ble peptidene som er angitt i de følgende tabeller XIII,| XIV og XV fremstilt fra de angitte utgangsstoffer med og uten angitte konsentrasjoner av organiske oppløsningsmidler.

i

Betingelsene var: 50 mM substrat, 5 yM CPD-Y, pH 9,6 og 30°C.

i

Tabell XIII i

Karboksypeptidase-Y-katalysert syntese av peptider med 50 mM Bz-Ala-OMe som substrat og frie aminosyrer som aminkomponent med og uten 20% metanol (MeOH) i !0,1 M KCL, 1 mM EDTA.

i

Tabell XIV

Karboksypeptidase-Y-katalysert syntese av Bz-Ala-Thr-OH fra Bz-Ala-OMe (50 mM) og treonin med varierende konsentrasjon av polyetylenglykol-300 (PEG-300).

Betingelser: CPD-Y 4 yM, pH 9,6 og 25°C.

Tabell XV

Karboksypeptidase-Y-katalysert syntese av peptider fra 50 mM Bz-Ala-OMe og de anførte aminosyreestere som aminkomponent i 30% polyetylenglykol-0,1 M KCL, 1 mM EDTA. De andre betingelsene var: CPD-Y = 8 yM, pH 9,6 og 25°C.

Eksempel 17

Uoppløslige ( immobilisert) karboksypeptidase- Y

i

CPD-Y ble bundet til Concanavalin A-Sepharose 4b (Pharmacia Fine Chemicals) fulgt av kryssbinding mIellom CPD-Y og Concanavalin A med glutaraldehyd som beskrevet av Hsiao og Royer (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 198, 379-385 (1979)). CPD-Y-konsentrasjonen var 3 mg pr<1>, ml. pakket Sepharose.

Analogt med eksemplene 1 og 3 ble! peptidene som er angitt i tabell XVI fremstilt under de følgende betingelser: 50 mM substrat, 0,25 ml CPD-Y gel (5 \ iM CPD-Y), pH 9,7 og 35°C.

Etter fjerning av enzymet ved filtrering ble produkter og utbytter bestemt ved HPLC.

I

Eksempel 18

Peptidamider som substrater

En oppløsning av 5 mM Bz-Ala-Leu-NH,, i 0,1 M KC1 - 1 mM EDTA og 10% dimetylformamid pH 10,0, 25°C, ble blandet med 0,25 M valinamid.

Reaksjonen ble initiert ved å tilsette 40 pm CPD-Y og gjennom-ført analogt eksemplene 3 og 4. Bz-Ala-Leu-Val-NH2 ble isolert ved HPLC i et utbytte på 65%.

Reaksjonen ble gjentatt ved å benytte 5 mM Bz-Ala-Phe-N^ som substratkomponent. Bz-Ala-Phe-Val-N^ ble isolert ved HPLC i et utbytte av 44%.

Eksempel 19

Syntese av met- enkefalin

Den trinnvise syntese av met-enkefalin ut fra 5 g Bz-Arg-OEt

og ved bruk av CPD-Y som katalysator, er angitt i følgende skjema:

I

Skjema: Syntese av Met-Enkefalin ved bruk av karboksypeptidase-Y (CPD-Y) som katalysator.<1> Prosentvise utbytter for hvert trinn er gitt i parentes.

CPD-Y katalysert kondensering og deamidering ble gjennomført

i

i ren vandig fase og Bz-Arg ble valgt som oppløseliggjørende beskyttende gruppe som kunne fjernes i det siste trinn med trypsin som vist ovenfor. Etter å( ha utvidet peptidet med et aminosyreamid fulgt av deamideringj ble det neste peptidester-substrat syntetisert med absolutt etanol og vannfri HC1.

Etter hvert trinn ble reaktantene isolert ved preparativ HPLC. På denne måte ble overskudd av aminkomponent og hydrolyse "biprodukter" også gjenvunnet.

i

REFERANSER

1) Bergmann M. & H. Fraenkel-Conrat: The role of specificity in the enzymatic synthesis of proteins.

J. Biol. Chem. 119, 707-720 (1937). 2) Bergmann M. & J.S. Fruton: Some synthetic and hydrolytic experiments with chymotrypsin.

J. Biol. Chem. 124, 321-329 (1938). 3) Fastrez, J. & A.R. Fersht: Demonstration of the Acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin.

Biochemistry 12, 2025-2034 (1973).

4) Fischer E.: Ueber die Ester der Aminosåuren.

Chem. Ber. 34, 433-454 (1901). 5) Hayashi R., Y. Bai & T. Hata: Kinetic Studies of carboxypeptidase Y. I. Kinetic parameters for the hydrolysis of synthetic substrates.

J. Biochem. 77, 69-79 (1975). 6. Johansen, J.T., K. Breddam & M. Ottesen: Isolation of carboxypeptidase Y by affinity chromatography.

Carlsberg Res. Commun. 41, 1-14 (1976).

7. Isowa Y., M. Ohmori, T. Ichikawa, H. Kurita, M. Sato &

K. Mori: The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes.

Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2762-2765 (1977).

8. Isowa Y., M. Ohmori, M. Sato & K. Mori: The enzymatic synthesis of protected valine-5 angiotensin II amide-1. Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2766-2772 (1977). 9) Isowa Y., T. Ichikawa & M. Ohmori: Peptide synthesis with proteinases. Fragment condensation of ZLeuGlnGlyOH or ZGlnGlyOH with HLeuValNHz 0 using i metalloproteinases.

Bull. Chem. Soc. Japan 51, 271-276 (1978).

i

10) Klibanov A.M., G.P. Samokhin, K. Martinek & J.V. Berezin: A new Approach to preparative enzymatic synthesis. Biotech. Bioeng. 19, 1351-1361!(1977).

j

11) Losse G., H.-J. Hébel & C. Kastner: Racematspaltung von Aminosaureamiden und hydraziden.

J. Prak. Chemie, 4. Reihe, Band 8, 345-350 (1959).

i

12) Luisi P.L., R. Saltman, D. Vlach & R. Guarnaccia: Co-oligopeptides of glycine arid aromatic amino acids with variable distance between the laromatic residues. VIII. Enayamatic synthesis of N-protected dipeptide esters.

J. Mol. Catalysis 2, 133-138 (|1977).

13) Morihara K. & T. Oka: a-chymotrypsin as the catalyst for

i

peptide synthesis.

Biochem. J. 163, 531-542 (1977).

14) Oka T. & K. Morihara: Peptide bond synthesis catalyzed by a-chymotrypsin. I

J. Biochem. 84, 1277-1283 (1978).

i

15) Oka T. & K. Morihara: Trypsin as a catalyst for peptide synthesis. '

J. Biochem. 82, 1055-1062 (1977).

16) Oka T. & K. Morihara: Protease as a catalyst for peptide synthesis: Synthesis in the absence of product precipita-tion. j

Symp. on Peptide Chemistry in Japan, Osaka, pp. 79-84 (1977).

17) Rivier J.E.: Use of trialkyl<1> ammonium phosphate (TAAP) buffers in reverse phase HPLC for high resolution and high

I

i

recovery of peptides and proteins.'

J. Liq. Chrom. 1, 343-366 (1978). 18) Saltman R., D. Vlach & P.L. Luisi: Co-oligopeptides of aromatic amino acids and glycine with variable distance between the aromatic residues. Enzymatic synthesis of N-protected peptide amides.

Biopolymers 16, 631-638 (1977). 19) Smith E.L. & D.J. Spackman: Leucine aminopeptidase V. Activation specificity and mechanism of action.

J. Biol. Chem. 212, 271-299 (1955). 20) Yamada T., N. Isono, A. Inui, T. Miyazama, S. Kuwata & H. Watanabe: Esterification of N-(benzyloxykarbonyl)-amino acids and amino acids using BF^-etherate as catalysts. Bull. Chem. Soc. Japan 51, 1897-1898 (1978). 21) Zeller E.A., L.A. Blanksma & J.A. Carbon: Ueber de Wirkung von optisch aktiven Hydraziden auf die Diaminoxydase. Heiv. Chim. Acta. 40, 257-260 (1957).

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av peptider med formelen der A betyr en N-endebeskyttet L-aminosyrerest eller en eventuell N-endebeskyttet peptidrest med en C-endebeskyttet L-aminosyre, B er en L-aminosyrerest og Z er OH eller en C-endebeskyttelsesgruppe, hvorved len substratkomponent omsettes med en aminkomponent i nærvær av et enzym, og, hvis ønskelig endebeskyttelsesgruppen eller -gruppene spaltes av slik at et peptid med formelen A-B-Z dannes,! karakterisert ved at en substratkomponent som er en aminosyre- eller peptidester, et depsipeptid, et eventuelt N-substituert aminosyreamid eller peptidamid eller et eventuelt N-endébeskyttet i peptid, og som har formelen <1> hvori A har den samme betydning som ovenfor, R er en enzymatisk i avspaltbar gruppe, alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl eller et 2 2' a-des-aminofragment av en aminosyrerest, R og R betyr uavhengig hydrogen eller enzymatisk avspaltbar gruppe, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og X er| en L-aminosyrerest, omsettes med en aminkomponent som er et eventuelt N-substituert L-aminosyreamid, en L-aminosyre eller en' L-aminosyreester og som har formelen hvori B betyr det samme som ovenfor, R og R uavhengig av hverandre betyr hydrogen, hydroksy," amino eller én enzymatisk avspaltbar gruppe, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og R<4 >er hydrogen eller en enzymatisk avspaltbar gruppe alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, hvorved reaksjonen utføres i nærvær av et L-spesifikt serin- eller tiolkarboksypeptidaseenzym oppnådd fra gjær eller fra dyr, planter eller mikrober i vannholdig oppløsning eller dispersjon med en pH-verdi på 5-10/5, fortrinnsvis ved en temperatur på 20 til 50°C.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som karboksypeptidaseenzym benytter karboksypeptidase Y, oppnådd fra gjær.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendte karboksypept i - dase Y er renset ved hjelp av affinitetskromatografi på en affinitetsharpiks omfattende en polymer harpiksmatriks med et antall koblede benzylsuccinylgrupper.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man s6m karboksypeptidaseenzym anvender Penicillkarboksypeptidase S-1 eller -S-2 oppnådd fra organismen Penicillium Janthinellum, Karboksypeptidase oppnådd fra organismen Aspergillus saitoi eller Aspergillus oryzae, Karboksypeptidase C oppnådd fra appelsinblader eller appelsinskall, Karboksypeptidase C oppnådd fra Citrus natsudaidai Hayata, Faseolain, oppnådd fra bønneblader eller karboksypeptidase oppnådd fra spirende korn, spirende bomullsplanter, tomater, vannmeloner eller Promelain (ananas)-pulver.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at man anvender et immobilisert karboksypeptidaseenzym.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at man benytter en vannholdig oppløsning eller blanding som inneholder 50 volum-% organisk oppløsningsmiddel.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man benytter en vannholdig oppløsning eller dispersjon som inneholder et organisk oppløsningsmiddel som er en alkanol, dimetylsulfoksyd, dimetylformamid, dioksan, tetrahydrofuran, dimetoksyetan, etylenglykol eller polyetylenglykol.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at man som substratkomponent benytter en L-aminosyre- eller peptidester, som er en benzyl- eller _4alkylester, eventuelt substituert med inerte substituenter.

9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at man som substratkomponent anvender p-nitroanilid. i

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakter) isert ved at man som i aminkomponent benytter en forbindelse med formelen der R 3 er hydrogen eller C^^ailkyl og B er en L-aminosyrerest.

11. Fremgangsmåte ifølge et <i>hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at man som aminkomponent benytter en forbindelse med formelen der R 4 er C^^alkyl og B er en L-aminosyrerest. I

12. Fremgangsmåte ifølge et ihvilket som helst av de foregående krav, karakter jisert^ved at man benytter forbindelser med en eller fle;<i>re tilstedeværende C-endebeskyt-tende grupper idet gruppen eller gruppene kan spaltes enzymatisk, fortrinnsvis med samme fcarboksypeptidaseenzym, som an-vendes i den foregående reaksjon.