DK163365B - Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptidderivater - Google Patents

Description

DK 163365 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater af dipeptider af den i krav 1's indledning anførte art.

5 Der har i de" seneste år været en stigende interesse for dipeptider og dipeptid-derivater eventuelt indeholdende en aminosyrerest af D-konfiguration, med henblik på disses potentielle farmakologiske virkninger, som f.eks. antibiotika. Ligeledes har der været stor interesse for di-10 peptider indenfor områder som kunstig ernæring - såvel human som veterinær, sødemidler og indenfor agrokemien, som f.eks. insektbekæmpelsesmidler.

Sådanne dipeptider H-A-B-Y kan fremstilles ved hjælp af 15 kendte kemiske koblingsreaktioner, men fælles for alle disse metoder er, at det som regel er nødvendigt at beskytte de involverede aminosyrer - A og B - på henholdsvis aminogruppen og carboxylsyregruppen samt ofte også på sidekæderne, hvis disse bærer funktionelle grupper. På 20 grund af de anvendte reagenser og betingelser er der endvidere iboende risiko for sidereaktioner under det kemiske koblingstrin. Racemisering, fortrinsvis på A-komponen-ten, er en sådan væsentlig sidereaktion. Ved at erstatte det kemiske koblingstrin med et enzymatisk koblingstrin, 25 der forløber under milde betingelser, kan sådanne sidereaktioner og racemisering undgås, hvorved der dannes et stereokemisk rent produkt.

Tilstedeværelsen af amino- eller carboxybeskyttelsesgrup-30 per er obligatorisk både ved kemisk kobling og ved enzymatisk kobling under anvendelse af endoproteaser, og ifølge den kendte teknik også på substratets amino-funktion ved enzymatisk exoprotease-katalyseret dipeptidfrem-stilling.

Herved tilføres disse processer som forklaret nedenfor adskillige uønskede træk, der i alvorlig grad påvirker 35 2

DK 163365 B

deres procesøkonomi i industrielt omfang, hvilket er særligt tydeligt ved dipeptidfremstilling. Ulemperne opstår i forbindelse med beskyttelsesgruppernes indførelse, fjernelse og tilstedeværelse under processen, hvilket 5 forøger den samlede procesudgift og -tid samt udbyttet som sådant.

Typiske eksempler på almindeligt anvendte amino-beskyt-telsesgrupper er grupper af carbobenzoxy (Z-) og tertbut-10 oxycarbonyl- (Boc-) typen, der har en med aminosyreres-terne sammenlignelig molekylvægt. For det første skal beskyttelsesgrupperne indføres i udgangsmaterialerne ved hjælp af egnede, dyre midler i et separat reaktionstrin efterfulgt af et isoleringstrin. Tilstedeværelsen af 15 disse hydrofobe grupper har ofte en drastisk effekt på mellemprodukternes og reaktionsprodukternes opløselighed og kan påvirke både den type og mængde af opløsningsmidler, der kræves til deres behandling, og den lethed hvormed de kan oprenses og debeskyttes. Endvidere skal debe-20 skyttelsen ske i et separat trin efterfulgt af et oprensningstrin.

Der findes et antal reaktioner til dette formål men med undtagelse af katalytisk hydrogenering, der i sig selv 25 volder industrielle problemer, foregår disse reaktioner under voldsomme og ofte stærkt sure eller basiske betingelser, hvilket ofte forårsager en række sidereaktioner. Resultatet heraf vil være et urent produkt, medmindre dette underkastes krævende og omstændelig oprensning.

30

De sidste trin i denne forholdsvis lange række af syntesetrin kan således blive en ret omfattende debeskyttelse til opnåelse af de ønskede dipeptider. På grund af de · næsten uundgåelige sekundære reaktioner kræves desuden 35 ofte ret omstændige rensningsprocedurer for at opnå et produkt med den ønskede høje renhedsgrad.

3

DK 163365 B

Forsøg på at undgå aminoterminal-beskyttelse ved fremstillingen af dipeptider har omfattet mikrobiel gæring, f.eks. den i EP-A1-074095 og EP-A2-102529 beskrevne gæringsproces under dannelse af aspartam. Denne teknik er 5 fundamentalt 'forskellig fra syntetiske metoder og er afhængig af specifikke organismer for hvert peptid. Den er derfor ikke generelt anvendelig. Desuden er udbytterne ofte lave, og genvindingen fra gæringsmediet omstændelig.

10 Set i lyset af den totale procesøkonomi er det derfor en åbenlys fordel at kunne undgå beskyttelsesgrupper, også på amino- og carboxyterminalen. Det er formålet med nærværende opfindelse at muliggøre dette ved dipeptid-synte-se på basis af serin- og thiolcarboxypeptidase-katalyse.

15 Det kan være interessant at kunne fremstille et dipeptid, der har sidekædebeskyttelse, men ingen terminalbeskyttelse, og det vil fremgå, at dette også er muligt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, når man går ud fra sidekæ-debeskyttede men amino- henholdsvis carboxyubeskyttede 20 udgangsmaterialer. Herved kan der opnås de samme fordele ! med hensyn til milde reaktionsbetingelser og total procesøkonomi, som ved sidekædebeskyttede udgangsmaterialer.

Den C-terminale beskyttelsesgruppe kan om ønsket fjernes ' enzymatisk med det samme eller med et andet enzym end 25 det, der anvendtes til syntesen. Tilstedeværelsen af en beskyttelsesgruppe, f.eks. et amid, kan have betydning for forbindelsernes biologiske virkning, hvorfor den ikke altid fjernes. Om ønsket kan sidekædebeskyttelsesgruppen fjernes kemisk eller enzymatisk, i reglen under mildere 30 betingelser end det er muligt for aminobeskyttelsesgruppen.

Kendte er de enzymkatalyserede koblingsreaktioner, der tillader anvendelse af sidekæde-ubeskyttede aminosyrede-35 rivater og eventuelt en C-terminal ubeskyttet B-komponent (nucleophil). Der kan eksempelvis henvises til dansk patentskrift nr. 155613 (ans. nr. 5202/80) samt det tilsva- 4

DK 163365 B

rende EP patentskrift nr. 17 485 (EP-B1-17485).

I EP-B1-17485 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af peptider med den almene formel 5 A1"B1"Z1 hvori A^ betegner en N-terminalbeskyttet L-aminosyrerest eller en eventuelt N-terminalbeskyttet peptidrest med en 10 C-terminal L-aminosyrerest, og betegner en L-aminosy rerest, og er OH eller en C-terminal beskyttelsesgruppe, ved omsætning af en substratkomponent med en aminkom-ponent i nærvær af et enzym, og om ønsket fraspaltning af eventuelle terminalbeskyttelsesgrupper til dannelse af et 15 peptid med formlen

Al"Bl"Zl der er ejendommelig ved, at man omsætter en substratkom-20 ponent valgt blandt aminosyreestere, peptidestere, depsipeptider, eventuelt N-substituerede aminosyreamider eller peptidamider, og eventuelt N-terminalbeskyttede peptider 25 med formlen

A1-0R1, A^NR^' eller Aj-Xj-OH

hvori A^ har den ovenfor anførte betydning, 30 R^ betegner alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl eller et a-des-aminofragment af en aminosyrerest, R2 og r2' hver betegner hydrogen, alkyl, aryl, he-teroaryl eller aralkyl, og betegner en L-aminosyrerest, med en aminkomponent (nucleophil) valgt blandt 35 5

DK 163365 B

eventuelt N-substituerede L-aminosyreamider, L-ami-nosyrer og L-aminosyreestere, med formlen H-B^NRgRg' eller H-B^OR^ 5 hvori B^ har den ovenfor anførte betydning Rg og Rg’ hver betegner hydrogen, hydroxy, amino, alkyl, aryl, heteroaryl eller aralkyl, og er hydrogen, alkyl, aryl, heteroaryl eller 10 aralkyl i nærvær af et L-specifikt serin- eller thiolcarboxypep-tidase-enzym stammende fra gær eller af animalsk, vegetabilsk eller anden mikrobiel oprindelse, i en vandig op-15 løsning eller dispersion ved pH 5-10,5, fortrinsvis ved en temperatur på 20-50°C. Det foretrukne enzym er carb-oxypeptidase Y fra gær, i det følgende benævnt CPD-Y.

(Det bemærkes, at ovennævnte symbolbetydninger ikke er identiske med de ifølge EP-B1-17485 anvendte for at undgå 20 forveksling med de ifølge ansøgningen anvendte).

Hvis der således ved fremgangsmåden ifølge EP-B1-17485 skal fremstilles et dipeptid, anvendes der som substratkomponent obligatorisk et N-terminalbeskyttet aminosyre-25 derivat, og den indgående aminosyre er obligatorisk en L-aminosyre.

Mere alment siges det, at behovet for N-terminal amino-gruppebeskyttelse af substratkomponenten aftager med sti-30 gende kædelængde af peptidresten og i det væsentlige bortfalder, når peptidresten består af 3 aminosyrer, dog afhængigt af disses art og sekvens.

Dette er illustreret i Breddam et al. "Influence of the 35 substrate structure on carboxypeptidase Y catalyzed peptide bond formation", Carlsberg Res. Commun., vol. 45. p. 361-67, 30th December 1980, hvor Ac-Ala-Ala-Ala-OMe og 6

DK 163365 B

H-Ala-Ala-Ala-OMe kobledes med H-Leu-NH2 i nærvær af CPD-Y under dannelse af Ac-Ala-Ala-Ala-LeuNH2 og H-Ala-Ala-Ala-LeuNH2 i udbytter på henholdsvis 90 og 80%.

5 Breddam et al. undersøgte også aminosyrekonfigurationens betydning for koblingsudbyttet ved CPD-Y katalyseret peptidsyntese, jfr. følgende tabel, hvor Ala betegner L-ala-nin og ala betegner D-alanin.

10 Substrat Produkt Udbytte (%) H-Ala-Ala-Ala-OMe H-Ala-Ala-Ala-Leu-NH2 80 H-Ala-ala-Ala-OMe H-Ala-ala-Ala-Leu-NH2 40 H-Ala-Ala-ala-OMe H-Ala-Ala-ala-Leu-NH2 0 15 _

Betingelser: 25 mM substrat, 0,1 M KC1, 1 mM EDTA, pH

9,5, CPD-Y = 12 »im, 0,2 M Leu-NH2.

Reaktionen afbrudt efter 20 min.

20

Det fremgår af tabellen, at hvis C-terminalen er på D-form, som i H-Ala-Ala-ala-OMe, sker der ingen peptidsyntese, fordi esteren ikke omsættes. Med D-aminosyren nabostillet til C-terminalen som i H-Ala-ala-Ala-OMe sker der 25 omsætning, men koblingsudbyttet reduceres til 40% sammenlignet med de 80% ved den rene L-konfiguration H-Ala-Ala-Ala-OMe.

Man har endvidere længe været klar over, at nogle endo-30 proteaser kan katalysere oligomerisering af visse N-ube-skyttede aminosyreestere med L-konfiguration, men det er aldrig tidligere blevet forsøgt udnyttet til fremstilling af dipeptider, der ikke er simple dimere. Resultaterne af sådanne observationer har som regel været en blanding af 35 en til tider lang række oligomere, og kun i tilfælde af produktudfældning har det været muligt at isolere et enkelt produkt.

7

DK 163365 B

Af denne grund har anvendelsen af endoproteaser til peptidfremstilling været begrænset til anvendelsen af amino-og carboxyterminalbeskyttede udgangsmaterialer, som beskrevet i US-A-4.086.136.

5

De ovennævnte amino- og carboxyterminalbeskyttede udgangsmaterialer er også obligatoriske, hvis der anvendes aspartat-endoproteaser, som beskrevet i US-A-3.972.773, eller metallo-endoproteaser, som beskrevet i EP-A1-10 0099585 ved fremstillingen af Z-AspPheOMe.PheOMe-salt.

Endelig har det indtil nu ikke været muligt med carboxy-peptidaser og som regel heller ikke med noget proteoly-tisk enzym (Klasse EC 3,4) at fremstille de diastereomere 15 dipeptider af DL, LD og DD-konfiguration eller peptider indeholdende β-aminosyrerester fra amino-ubeskyttede udgangsforbindelser. Der har været gjort forsøg med en anden klasse enzymer, aminoacyl-t-RNA-synthetase (Klasse EC 6,1), som eksemplificeret i EP-A1-086053. Her skal der 20 anvendes et specifikt enzym for hver type aminosyrerest, og endvidere er dyre Co-faktorer såsom ATP nødvendige. Samtidig er udbytterne meget ringe, så selvom en vis mængde dipeptidester eller amid blev isoleret og identificeret, krævede det typisk ti gange så meget co-faktor-25 overskud, flere hundrede gange så meget nucleophil-over-skud og flere hundrede gange så meget enzym-overskud baseret på vægt, jvf. eks. 1, hvor 1 mg Tyr omsættes med 4 g L-Phe-methylester i nærvær af 0,6 g tyrosyl-tRNA-syn-thetase under dannelse af 0,4 mg Tyr-Phe-OMe.

30

Det har nu overraskende vist sig, at de i EP-B1-17485 anvendte serin- og thiolcarboxypeptidaser er i stand til at udnytte N-ubeskyttede aminosyreestere som substratkomponent i kontrollerede reaktioner til syntese af dipeptider 35 og dipeptidderivater, og at det er muligt at undertrykke en eventuel oligomerisering af substratet.

8

DK 163365 B

Det har endvidere overraskende vist sig, at også N-ube-skyttede aminosyrederivater af D-konfiguration kan anvendes som substrater i disse reaktioner, således at det foruden LL-dipeptider også er muligt at syntetisere DL-5 dipeptider. Omsætningshastigheden for D-substrater er dog som regel noget lavere end for L-substrater under ens betingelser, men forskellen i hastighed er dog som illustreret nedenfor langt mindre end for de tilsvarende N-beskyttede aminosyreestere, hvor D-substratet omsættes 10 med en hastighed, der er langt mindre end hastigheden for L-substratet. Udbytterne er ofte lige så høje eller højere ved de ubeskyttede D-substrater i forhold til de ubeskyttede L-substrater som vist ved de følgende eksempler.

15 Endnu mere overraskende har det endvidere vist sig, at med substrater med D-konfiguration kan nucleophiler af D-konfiguration kobles ved hjælp af disse enzymer, der ellers vides at være L-specifikke på aminosiden af syntesepunktet. En aminosyreester, der inkorporeres på denne må-20 de, hydrolyseres ikke yderligere.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

25 Som eksempler på anvendelige aminosyrer kan nævnes ali-phatiske aminosyrer, såsom monoaminomonocarboxy1syrer, f.eks. glycin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), norvalin (Nval), leucin (Leu), isoleucin (iso-Leu) og norleucin (Nleu), hydroxyaminosyrer, såsom serin (Ser), threonin 30 (Thr) og homoserin (homo-Ser), svovlholdige aminosyrer, såsom methionin (Met) eller cystin (CysS) og cystein (CysH), monoaminodicarboxylsyrer, såsom asparaginsyre (Asp), glutaminsyre (Glu) og amider deraf, såsom aspara-gin (Asn) og glutamin (Gin), diaminomonocarboxylsyrer, 35 såsom omi thin (Orn) og lysin (Lys), arginin (Arg), aromatiske aminosyrer, såsom phenylalanin (Phe) og tyrosin (Tyr), samt heterocycliske aminosyrer, såsom histidin 9

DK 163365 B

(His), Prolin (Pro) og tryptophan (Trp). Som eksempler på anvendelige aminosyrer med mere usædvanlig . struktur kan nævnes penicillamin (Pen), aminophosphonsyrer, såsom ala-nin-phosphonsyre (AlaP) aminosulfonsyrer, såsom Taurin 5 (Tau), eller'ω-aminosyrer, såsom Ø-alanin (BAla). I substratkomponenten og i den nucleophile komponent kan aminosyren som nævnt også være på D-form.

Fordelene ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold 10 til de omtalte kendte metoder er minimal eller ingen si-dekædebeskyttelse, ingen N-beskyttelse af substratkomponenten, der kan have både D- og L-konfiguration, ingen risiko for racemisering, få syntesetrin og et forholdsvis rent slutprodukt, hvilket tilsammen åbner mulighed for en 15 yderst enkel og økonomisk fremstillingsmetode.

Foretrukne substratkomponenter er estere med formlen H-A- OR1, hvori A er som defineret i krav 1, R betegner lige-kædet eller forgrenet alkyl med 1-6 carbonatomer, såsom 20 methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert.butyl, amyl og hexyl, eller aralkylet benzyl. Særlig hensigtsmæssige nucleophilkomponenter er frie L-aminosy-rer eller aminosyreamider med formlen /Η2 25 Η-Β-Ν \Η3' hvor Β er som defineret i krav 1, R2 er H, og R3 er H eller C^-Cg alkyl, eller aminosyreestere med formlen H-B-OR4, hvor B er som defineret i krav 1, og hvor R4 beteg-30 ner ligekædet eller forgrenet alkyl med 1-6 carbonatomer, såsom ovennævnte. Som nævnt kan R1 være alkyl, aryl eller aralkyl eventuelt substitueret med hydroxy, nitro eller halogen.

35 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der afhængigt af den anvendte nucleofil intermediært dannes et peptid indeholdende gruppen 10

DK 163365 B

R2 / -N eller -OR* \ 5 * R’ hvor R2, R3 og R* har de i krav 1 angivne betydninger, hvorefter denne gruppe om ønsket fraspaltes under dannelse af en carboxylsyregruppe. Denne spaltning kan katalyseres af et andet eller af det samme enzym, som blev an-10 vendt til dannelsen af peptidet.

Enzymer kan også anvendes til fraspaltning af sidekæde-beskyttelsesgrupper. På tale som anvendelige enzymer kommer, afhængigt af beskyttelsesgruppens type, proteolytis-15 ke enzymer, lipaser og esteraser, jvf. "The peptides, Analysis, Synthesis, Biology" Vol 9, Special Methods in peptide Synthesis Part C. J.A. Glaas, Enzymatic Manipulation of Protecting Groups in Peptide Synthesis, Academic Press 1987.

20

Foruden med CPD-Y, der p.t. er det foretrukne enzym, og som er nærmere karakteriseret i EP-B1-17485, lader fremgangsmåden ifølge opfindelsen sig også gennemføre med andre serin- eller thiolcarboxypeptidaser, såsom de i ne-25 denstående oversigt anførte, idet disse betjener sig af en fælles virkningsmekanisme via acylenzymmellemproduk-ter.

30 35 11

DK 163365 B

Enzym Oprindelse

Svampe

Penicillocarboxypeptidase S-l Penicillium janthinellum S-2 5 Carboxypeptidase(r) fra Aspergillus saitoi

Aspergillus oryzae

Planter

Carboxypeptidase(r) C Orangeblade 10 Orangeskaller

Carboxypeptidase C^ Citrus natsudaidai

Hayata

Phased in Bønneblade

Carboxypeptidase(r) fra Spirende byg eller malt 15 Carboxypeptidase W fra Hvede

Carboxypeptidase(r) fra Spirende bomuldsplanter

Tomater

Vandmeloner

Bromelein (ananas) pulver 20

Det nære slægtskab mellem en række af de ovennævnte car-boxypeptidaser er diskuteret af Kubota et al, Carboxypeptidase C. J. Biochem., Vol. 74, No. (1973), p. 757-770. Carboxypeptidase fra malt, hvede og andre kilder er 25 beskrevet af Breddam, Carlsberg Res. Comm. Vol. 51, p.

83-128, 1986.

Den anvendte carboxypeptidase kan også være kemisk modificeret eller være en biosyntetisk mutant af en naturlig 30 form.

Som illustreret nærmere i det følgende er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ret enkel, blot er det vigtigt at holde en ret konstant pH-værdi i reaktionsblandingen. Denne 35 pH-værdi ligger mellem 5 og 10,5, dog fortrinsvis mellem 7 og 9,5 og afhænger iøvrigt af de konkrete udgangsmaterialer, det dannede dipeptid og enzymet.

12

DK 163365 B

Reaktionen foretages i et vandigt reaktionsmedium, der om ønsket kan indeholde af et organisk opløsningsmiddel, der er blandbart eller ublandbart med vand, og som er kompatibelt med det anvendte enzym under de givne betingelser 5 i mængder på indtil 10% eller mere. Foretrukne opløs ningsmidler er lavere alkoholer, dimethylformamid, dime-thylsulfoxid, dimethoxyethan, ethylenglycol og ethylace-tat.

10 Reaktionstemperaturen er fortrinsvis stuetemperatur og derover, 20-50®C, men temperaturer i intervallet 0-60°C er anvendelige, hvis de er fordelagtige under de øvrige givne betingelser.

15 Koncentrationen af de to reaktionskomponenter kan varieres inden for vide grænser, men oftest vil nucleophilkom-ponenten være i overskud, og for at undgå oligomerisering af substratkomponenten tilsættes denne ofte i mindre portioner fordelt over hele reaktionsforløbet. Hvis der an- f Ϊ 20 vendes en ester med formlen H-A-OR1 , hvor R1 betyder C^-C'IO alkyl, observeres der overraskende ingen oligomerisering, og der kan anvendes meget høje substratkoncentrationer uden sidereaktioner. Her kan der ud fra en enkelt udgangsforbindelse dannes et homodipeptid, hvor A = 25 B, uden oligomerisering, idet nucleophilen dannes in situ ved hydrolyse af denne ester.

Således kan udgangskoncentrationen for substratkomponenten typisk være 0,005 - 2 molær og for nucleophilkomponen-30 ten i de tilfælde, hvor denne tilsættes separat 0,005 - 3 molær. Det vil i de fleste situationer være muligt at genvinde overskud af nucleophilkomponenten og hydrolyseproduktet fra substratkomponenten til eventuel reesteri-ficering og genanvendelse. Komponenterne kan let føres 35 tilbage til processen, hvilket skyldes deres enkle struktur og fraværet af sidereaktioner og debeskyttelsestab.

13

DK 163365 B

Enzymkoncentrationerne kan ligeledes varieres, men er ofte noget højere (5-50 μιη) end de koncentrationer, der er brugbare ved anvendelse af N-beskyttede aminosyreester-substrater, men som illustreret i de efterfølgende eksem-5 pier kan mængden af enzym til gennemførelse af reaktionen dog nedsættes mere end tifold ved anvendelse af et stabilt immobiliseret enzympræparat, hvorved udnyttelse af enzymet i en kontinuert proces kan opnås.

10 Reaktionsmediet kan også indeholde salte, såsom NaCl, der har indflydelse på enzymets binding til substratet, samt et komplexbindingsmiddel for tilstedeværende metalioner, såsom EDTA, som stabiliserer enzymet.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til tegningen, hvor

Fig. 1 viser hydrolyseforløbet for henholdsvis L- og D-TyrOEt og L- og D-AcTyrOEt ved 50 mM koncentration 20 i 20% DMS0 indeholdende 1 mM EDTA ved pH 9,0 ka talyseret af 10 μΜ CPD-Y, og

Fig 2 viser reaktionsforløbet ved dannelse af homodipep-tidet L,L-MetMet ud fra L-MetOEt i udgangskoncentrationer på henholdsvis 0,05 M og 0,5 M ved pH 25 8,5 i nærvær af henholdsvis 13 μΜ og 39 μΜ CPD-Y.

De indledningsvis omtalte forskelle i omsætningshastigheden for D- og L-substrater er illustreret på fig. 1, der viser reaktionsforløbet for CPD-Y hydrolysen af en be-30 skyttet (Ac-TyrOEt) og ubeskyttet aminosyreester (TyrOEt) på D- og L-form.

Det ses af figuren, at mens L-AcTyrOEt hydrolyseres næsten momentant, er der efter 2 timers forløb kun sket en 35 ubetydelig hydrolyse (under 5%) af D-AcTyrOEt. 1 modsætning hertil er der kun små forskelle på hydro- 14

DK 163365 B

lyseforløbet for de ubeskyttede estere på L- og D-form.

Dette overraskende hydrolyseforløb afspejler sig i de efterfølgende eksempler, der illustrerer fremstillingen af 5 forskellige dipeptider ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af enzymerne CPD-Y og maltcar-boxypeptidase II (CPD-MII) og hvedecarboxypeptidase (CPD-W).

10 Som det fremgår af Fig. 2 observeres der ingen oligomeri-sering ved CPD-Y katalyseret homodipeptidsyntese af L,L-MetMet ud fra MetOEt.

Generel metode for eksempel 1-15 eksemplificeret nedenfor 15

Reaktionerne, udført i analytisk skala med et reaktions-volumen på 1 ml, blev udført i en pH-stat, idet den valgte pH-værdi blev holdt konstant ved automatisk tilsætning af 1 N NaOH. Reaktionstemperatur var stuetemperatur, hvor 20 ikke andet er anført. I tabellen er desuden opført reaktantkoncentrationer, indhold af organisk opløsningsmiddel, produkt og udbytte. Reaktionstider ligger typisk mellem 0,5 og 5 timer, og enzymkoncentrationerne er typisk 10-20 μπι, hvor intet andet er anført.

25

Produktidentifikation og bestemmelse af produktudbytte blev udført ved hjælp af reverse-phase HPLC (Waters 6000 A pumper, 660 gradientblander, UK 6 injektor) på en C^g NOVA PAK kolonne (Waters, RCM) under anvendelse af pas-30 sende gradienter af elueringssystemer indeholdende 50 mM triethylammoniumphosphat, pH 3,0 fra 0% til 80% acetoni-tril med et flow på 2 ml/min. Elueringen blev fulgt ved hjælp af en UV-detektor (Waters 480) ved 230 nm, 254 nm, 278 nm eller 290 nm.

Produkterne identificeredes ved aminosyreanalyse af fraktioner fra HPLC-analysen, der svarede til den formodede 35

DK 163365 B

15 produkttop og/eller ved HPLC-sammenligning med et kemisk syntetiseret referenceprodukt. Disse blev fremstillet efter kendte principer, som regel via reaktion mellem BOC-A-OSu - tert.butyloxycarbonyl - succinimidester-derivatet 5 af substrataminosyren - og den anvendte nucleophilkompo-nent efterfulgt af deblokering af den N-terminale amino-syrerest. Det var i alle tilfælde muligt at adskille LL-og DD-dipeptider fra de diastereomere DL- og LD-dipeptid-produkter.

10

Produktudbytterne blev for de produkter, der kun kan de-tekteres ved 230 nm, bestemt ved hjælp af absorptions/ koncentrationskurven for den kemisk syntetiserede referenceforbindelse. For de øvrige produkter blev udbytterne 15 bestemt på basis af forholdet mellem de integrerede arealer under toppene i elueringskromatogrammet, svarende til henholdsvis produkt og den reaktant, der absorberer ved den pågældende bølgelængde.

20 Som eksempel på denne metode gengives fremstilling af D,L-PheØAlaOMe i henhold til eksempel 12 nedenfor.

Fremstilling af D,L-phenylalanin-betaalaninmethylester (D,L-phegAlaOMe) i henhold til eksempel 12 25 I en pH-stat afvejedes D-phenylalaninethylesterhydrochlo-rid (11,4 mg; 50 mrtol) og betaalaninmethylesterhydrochlo-rid (70 mg; 0,5 mmol). Dette blev opløst i 800 μΐ demineraliseret vand og 10 1 af en 100 mM EDTA-opløsning blev 30 tilsat, hvorefter pH blev justeret til 9,0 med ca. 40 μΐ 6N NaOH. Der blev udtaget 25 al til kontrol (opbevares ved stuetemperatur) og 5 ul 0-prøve til HPLC-kørsel. Reaktionen startedes ved tilsætning af 60 ul carboxypep-tidase-Y-opløsning (333 uM) til slutkoncentration på ca.

35 20 μΜ. pH blev holdt konstant på 9,0 med 1 M NaOH, gennem reaktionen ialt ca. 100 ul. Reaktionstemperaturen var stuetemperatur. Reaktionstiden var ca. 30 min, hvorefter 16

DK 163365 B

ca. 90% af substratet var forbrugt. 83% heraf var omdannet til produktet. Aminosyreanalyse af fraktioner fra HPLC-analyse, der svarede til den formodede produkttop, viste den forventede sammensætning.

5

Reaktionsbetingelserne i fremstillingseksemplerne 16-25 beskrives i de enkelte eksempler. Reaktionerne blev fulgt på analytisk HPLC som beskrevet. Enzymkoncentrationerne er generelt lavere og reaktionstiderne længere end i de 10 tilsvarende analytiske eksempler, men det er ikke forsøgt at optimere reaktionsbetingelserne.

15 20 25 30 35

Carboxypeptidase Y ) katalyseret syntese af LL-dipepti- der med L-tyrosinethylester (50 mM) som substratkomponent 5 og frie aminosyrer som nucleophiler

Eksempel 1 17

DK 163365 B

a

Nucleophil (Kone.) Medium pH Produkt Udbytte %

Alanin (1/9 M) Vand 9,5 TyrAlaOH 10 10 Arginin (0,8 M) Vand 9,5 TyrArgOH 31

Cystein (1 M) Vand 8,0 TyrCysOH 30 LD-Cystein (2 M) Vand 8,0 TyrCysOH(LL) 40

Leucin (0,2 M) Vand 8,0 TyrLeuOH 1

Lysin (2 M) Vand 9,5 TyrLysOH 18 15 Methionin (0,3 M) Vand 8,0 TyrMetOH 8

Methionin (0,3 M) Vand 9,0 TyrMetOH 9

Methionin (0,3 M) 30% DMS0 9,0 TyrMetOH 15

Methionin (0,3 M) 15% EtOH 9,0 TyrMetOH 7

Glutamin (0,8 M) Vand 9,5 TyrGlnOH 8 20 Penicilamin (0,5 M) Vand 8,0 TyrPenOH 7

a) 10 um, 1 mM EDTA

25 30 35

Carboxypeptidase Y ) katalyseret syntese af LL-dipepti- der med L-methionin (0,3 M) som nucleophilkomponent i 5 vand ved pH 9,0

Eksempel 2 18

DK 163365 B

a

Substrat (50 mM) Produkt Udbytte %

Leucin methylester LeuMetOH 30 10 Leucin isoproylester LeuMetOH 36

Methionin ethylesterb) MetMetOH 25

Phenylalanin methylester PheMetOH 16

Phenylalanin ethylester PheMetOH 19

Phenylalanin isopropylester PheMetOH 23 15 Serin isopropylester0) SerMetOH 21

Tryptophan methylester TrpMetOH 26

Tyrosin benzylester ) TyrMetOH 19

20 a) 10 um, 1 mM EDTA

b) 5 mM

°) Reaktionstid > 20 h

d) 30% DMSO

25 30 35

Carboxypeptidase Y ) katalyseret syntese af LL-dipepti- der med L-tyrosinethylester (50 mM) som substratkomponent 5 og L-aminosyreamider eller -estere som nucleophiler

Eksempel 3 19

DK 163365 B

Sub- Nucleophil (Kone.) Medium pH Produkt Udbyt- strat te % 10 TyrOEt Leucinamid (0,2 M) 30% DMSO 9,5 TyrLeuNH2b) 42

TyrLeuOH 4

TyrOEt Lysinamid (0,3 M) Vand 9,5 TyrLysNH2 20

TyrLysOH 22

TyrOEt Argininamid (0,2 M) Vand 9,0 TyrArgNH2 50 15 TyrOEt Valinamid (0,3 M) Vand 9,0 TyrValNH2 77

TyrOEt Leucin methylester (0,2 M) 30% DMSO 9,0 TyrLeuOH 6

20 a) 20 am, 1 mM EDTA

u °) Reaktionstid > 20 h, 50% substrat omsat 25 30 35

Eksempel 4 20

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af LL-homodi-peptider fra en enkelt udgangsforbindelse i vand ved pH 5 8,5

Substrat (Kone.) Produkt Udbytte %

Methionin methylester (0,5 M)b)c) MetMetOH 14 10 Methionin ethylester (0,5 M) MetMetOH 16

Methionin isopropylester (0,5 M MetMetOH 14

Tyrosin methylester (0,2 M) TyrTyrOH c) 1

Tyrosin ethylester (0,2 M) TyrTyrOH c) 1

Phenylalanin ethylester (0,2 M^)e) PhePheOH 2 15 Alaninamid (0,2 M)f)^) AlaAlaN^ a) 10 μπ CPD-Y, 1 mM EDTA ^) Polymerisation 20 C) Udfældning d) pH 9,0

e) 30% DMSO

f) 50 um CPD-Y, 1 mM EDTA 25 30 35

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af DL-dipepti- der med D-tyrosinethylester (50 mM) som substrat og frie 5 L-aminosyrer som nucleophiler i vand

Eksempel 5 21

DK 163365 B

Nucleophil (Kone.) pH Produkt Udbytte % 10 Arginin (1 M) 9,0 tyrArgOH 75

Cystein (1 M) 8,0 tyrCysOH 86 LD-cystein (2 M) 8,0 tyrCysOH(DL) 45

Leucin (0,2 M) 8,0 tyrLeuOH 22

Methionin (1 M) 9,0 tyrMetOH 65 15 Penicilamin (1 M)13) 8,0 tyrPenOH 27

a) 10 um, 1 mM EDTA

k) Reaktionstid > 20 h 20 25 30 35

CarboxypeptIdase Y a) katalyseret syntese af DL-dipepti- der med L-methionin (0,3 M) som nucleophilkomponent 1 5 vand ved pH 9,0

DK 163365B

Eksempel 6 22 D-substrat (50 mM) Produkt Udbytte % 10 leucin methylester leuMetOH 50 leucin isopropylester leuMetOH 71 methionin ethylester metMetOH 68 phenylalanin ethylester pheMetOH 71 phenylalanin isopropylester pheMetOH 72 15 serin isopropylester serMetOH b) 46 tryptophan ethylester trpMetOH 72 a) 15 um, 1 mM EDTA 20 D) Reaktionstid 5 dage 25 30 35

DK 163365B

Eksempel 7 23

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af D,L-dipep-tidamider med D-tyrosin eller D-phenylalaninethylester 5 (50 mM) som 'substratkomponent og L-aminosyreamider som nucleophilkomponenter i vand

Substrat Nucleophil (Kone.) pH Produkt Udbytte % 10 _ tyrOEt Leucinamid (0,2 M) 9,0 tyrLeuNH^ 82 tyrLeuOH 2 tyrOEt Valinamid (0,3 M) 9,0 tyrValN^ 94 tyrOEt Argininamid (0,2 M) 9,0 tyrArgNH- 86 15 pheOEt Alaninamid (0,8 M) 9,0 pheAlaN^J 50

a) 15 μm, 1 mM EDTA

b) Nogen polymerisation 20 25 30 35

Eksempel 8 24

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af D,D-homodi-peptidestere fra D-substratesterkomponenter i vand ved pH 5 9,0, der også fungerer som nucleophilkomponent D-substrat (Kone.) Produkt Udbytte % tyrosin ethylester (0,05 M) tyrtyrOEt 9 10 phenylalanin ethylester (0,1 M) phepheOEt 10 tyrosin ethylglycolester (0,05 M) tyrtyrOEtOH 1 methionin methylester (0,1 M) metmetOMe 3 15 a) 15 m, 1 mM EDTA 20 25 30 35

Eksempel 9 25

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af LL-dipepti-der med sidekædebeskyttede carboxyterminaleaminosyrer med 5 L-TyrOEt (50 mM) som substratkomponent og sidekædebeskyttede L-aminosyrer og amider som nucleophiler

Nucleophil (Kone.) pH Medium Produkt Udbytte 10 Acetamidomethyl (1 M) 8,5 Vand iyrCys(-SAcm)0H 10 acetamidomethyl cysteinamid (0,4 M) 8,5 Vand TyrCys(-SAcm)NH2 12

TyrCys(-SAcm)0H 1 Ø-benzyl- 15 asparaginsyre (0,1 M)b) 9,0 30% DMSO TyrAsp(0Bzl)0H 13 ε Trifluoracetyl- lysin (0,1 M)b) 8,5 30% DMSO TyrLys(Tfa)0H 12 r-tertbutyl- glutaminsyreamid (0,1 M)b) 8,0 30% DMSO TyrGluiOtBu)!^ 3 20 TyrGlu(0tBu)0H 12 r-methyl- glutaminsyre (0,3 M) 8,5 Vand TyrGlu(OMe)0H 20 r-methyl- glutaminsyre (0,3 M) 8,5 Vand TyrGlu(0Et)0H 18 25_____

a) 10 am, 1 mM EDTA

b) 25 mM substrat, 20 *im 30 35

Eksempel 10 26

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af DL-dipepti-der med sidekædebeskyttede carboxytermlnale aminosyrer 5 med D-Tyr0Et'(50 mM) som substratkomponent og sidekædebeskyttede L-aminosyrer og amider som nucleophiler

Nucleophil (Kone.) pH Medium Produkt Udbytte % 10 Acetamidomethyl cystein ( 1 M) 8,5 Vand tyrCys(-SAcm)CH 75

Acetamidomethyl cystein- amid (0,4 M) 8,5 Vand tyrCys(-SAcm)NH2 71 tyrCys(-SAcm)0H 6 Ø-benzyl asparaginsyre (0,1 Mb) 9,0 30% DMSO tyrAsp(0Bzl)0H 54 15 e trifluoracetyl- lysin (0,1 M)b 8,5 30% DMSO tyrLys(Tfa)0H 51 r-tertbutyl glutamin- syreamid (0,1 M)b 8,0 30% DMSO tyrGlu(0tBu)NH2 42 tyrGlu(0tBu)0H 10 20 ι-methyl glutamin- syre (0,3 M) 8,5 Vand tyrGlu(0Me)0H 75 T-ethyl glutamin- syre (0,3 M) 8,5 Vand tyrGlu(0Et)0H 71 25 a) 10 um, 1 mM EDTA °) 25 mM substrat, 20 m 30 35

Eksempel 11 27

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af LL-dipeptid-er med sidekædebeskyttede aminoterminale-aminosyrerester 5 fra sidekædebeskyttede substratkomponenter (25 mM) og L-methionin (0,3) som nucleophilkomponent i 30% DMSO ved pH

9,0

Substrat Produkt Udbytte 10 % L-asparaginsyre dibenzylester Asp(OBzl)MetOH 65 L-glutaminsyre dibenzylester c) Glu(0Bzl)Met0H 70 15 a) 20 am, 1 mM EDTA, reaktionstid > 20 h k) ved 35% omsætning c) Ved 60% omsætning 20 25 30 35

Eksempel 12 28

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af dipeptides-tere og amider indeholdende ω-aminosyrer fra L- og D-ami-5 nosyreester-substrater ved 50 mM i vand med Ø-alanin og Æ-alaninamid som nucleophiler

Sub- Nucleophil (Kone.) pH Produkt Ud- strat bytte 10 % tyrOEt &-Alaninmethylester (0,2 M) 8,5 tyrBAlaOMe 51 tyrOEt /5-Alaninmethylester (0,5 M) 8,5 tyrBAlaOMe 72 pheOEt 5-Alaninmethylester (0,5 M) 9,0 pheBalaOMe 83 15 PheOEt Ø-Alaninmethyl (0,5 M) 9,0 PheBAlaOMe 15 pheOEt J5-Alaninamid (0,5 M) 9,0 pheBAlaNH2 70

PheOEt 0-Alaninamid (0,5 M) 9,0 PheBAlaNH2 3

20 a) 20 fim, 1 mM EDTA

25 30 35

Eksempel 13 29

DK 163365 B

Carboxypeptidase Y a) katalyseret syntese af LL- og DL-dipeptider med hydroxyalkylestere af L- og D-tyrosin og 5 L-phenylalanfn (50 mM) som substratkomponenter og fri L-methionin (0,3 M) som nucleophil i vand/ ethylenglycol-blandinger ved pH 9,0

Substrat % glycol (vol/vol) Produkt Udbytte % 10___

TyrOEtOH 0 TyrMetOH 10

TyrOEtOH 40 TyrMetOH 8

TyrOEtOH 60 ) TyrMetOH 5 tyrOEtOH 0 tyrMetOH 56 15 PheOEtOH 0 PheMetOH 16

a) 5 nm, 1 mM EDTA

b) 10 μπι, 1 mM EDTA

20 25 30 35

Eksempel 14 30

DK 163365 B

Syntese af LL-dipeptider katalyseret af carboxypeptidaser fra byg og hvede ved 50 mM udgangs-L-substrat esterkon-5 centration ve'd pH 8,0 i vand og L-aminosyrer som nucleo-philkomponenter

Enzym Substrat Nucleophil (Kone.) Produkt Udbytte % 10 _ CPD-MII3) PheOEt Methionin (0,4 M) PheMetOH 10 CPD-W*3) PheOEt Arginin (0,8 M) PheArgOH 8

15 a) 20 tun, 1 mM EDTA, 2 M NaCl b) 10 um, 1 mM EDTA

Eksempel 15 20 Syntese af DL-dipeptider katalyseret af carboxypeptidaser fra byg og hvede ved 50 mM udgangskoncentration af D-Phe-nylalaninethylester ved pH 8,0 i vand og frie L-aminosy-rer som nucleophilkomponenter 25 Enzym Substrat Nucleophil (Kone.) Produkt Udbyt te % CPD-MIIa) pheOEt Methionin (0,4 M) pheMetOH 15 CPD-Wb) pheOEt Arginin (0,8 M) pheArgOH 13 30 CPD-Vjh) pheOEt Methionin (0,4 M) pheMetOH 40 a) 20 μΐη, 1 HIM EDTA, 2 M NaCl b) 10 um, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, Reaktionstid > 20 h, 35 omsætning mindre end 50%

Eksempel 16 31

DK 163365 B

Fremstilling af L,L-tyrosylcystein, TyrCysOH 5 Fremgangsmåde L-tyrosinethylester hydrochlorid (1,5 g, 6 mmol) og L-cystein (15,2 g, 125 mmol) opløses i 110 ml 0,1 M KC1-opløsning, indeholdende 1 mM EDTA. pH indstilles til 8,0 10 med triethylamin. Reaktionen startes ved tilsætning af 7,5 ml carboxypeptidase Y-opløsning (16 mg/ml), og pH holdes på 8,0 under hele reaktionsforløbet ved tilsætning af triethylamin under kontinuert omrøring ved stuetemperatur. Resten af substratet (13,5 g, 54 mmol) tilsættes 15 i portioner å 1,5 g i løbet af en time. Efter 0,5 time påbegynder udfældningen af tyrosin, og efter 3,5 time standses reaktionen ved opvarmning til 45°C i 20 min.

Den dannede tyrosin frafiltreres, og filtratet oprenses 20 ved R-præparativ HPLC (Waters Prep. L C/system 500A) under anvendelse af to kolonner (5,7 x 30 cm) pakket med 60 um g-partikler og 50 mM eddikesyre som eluent. Op- samlede fraktioner indeholdende rent produkt inddampes i vakuum til tørhed under tilsætning af absolut ethanol 25 flere gange. Remanensen opslæmmes i diethylether, hvorefter 3,88 g L,L-tyrosincystein (14 mmol, 22%) kunne isoleres ved filtrering og tørring.

Identifikation 30

Chlorid og acetat kunne ikke påvises. D.v.s. produktet forefindes som zwitterion.

Aminosyreanalyse efter sur hydrolyse og derivering af Cys 35 med acrylonitril gav:

Tyr (1,00)

Cys (1,08) 32

DK 163365 B

Renhed TLC viste kun en plet efter derivering af cystein-5 sidekæden med acrylonitril på kiselgel 60-F under anvendelse af ninhydrin-detektion (Rf 0,73, eluent: ethylace-tat, butanol, eddikesyre og vand (1:1:1:1:)).

HPLC-renhed: 99,5% (nucleosil 7 C^g, 0,1 M ammoniumphos-10 phat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).

UV-kvantisering: 98,5% (293 nm, tyrosin absorbans i 0,1 M NaOH).

15 Eksempel 17

Fremstilling af L,L-methionylmethionin, MetMetOH Fremgangsmåde 20 L-methioninethylester hydrochlorid (24,6 g, 115 mmol) og L-methionin (20,6 g, 138 mmol) opløses i 190 ml 0,1 M KCl-opløsning indeholdende 1 mM EDTA. pH indstilles til 9,0 med natriumhydroxid-opløsning, og reaktionen startes 25 ved tilsætning af 14,2 ml carboxypeptidase Y-opløsning (20 mg/ml). Reaktionen omrøres natten over ved stuetemperatur, og pH holdes konstant på 9,0 ved tilsætning af natriumhydroxidopløsning ved hjælp af en PH-stat. pH indstilles til 3,0 med HCl-opløsning ved reaktionens ophør.

30

Udfældet methionin frafiltreres, og filtratet oprenses ved R-præparativ HPLC som beskrevet i eksempel 16. Opsam-lede fraktioner indeholdende rent produkt koncentreres ved inddampning og frysetørres til slut. Herved fremkom-35 mer 10,6 g (37,8 mmol, 33%) L-methionyl-L-methionin som et hvidt amorft pulver.

33

DK 163365 B

Identi fikation

Chlorid kunne ikke påvises og acetat kun i en mængde af 1,9% (på vægtbasis). D.v.s. produktet forefindes overve-5 jende på zwitterion-form. Aminosyreanalyse efter sur hydrolyse påviste methionin men ingen fri methionin i uhy-drolyserede prøver.

Renhed 10 HPLC-renhed: 99,8 (nucleosil 7 Clg, 0,1 M ammoniumphos-phat, pH 3,0/acetonitril, 220 run).

Kvantisering ved reaktion med trinitrobenzensulfonsyre 15 (TNBS) og UV-detektion: 92,5%.

Vandindhold ifølge Karl Fisher: 1,5%.

Eksempel 18 20

Fremstilling af L,L-tyrosylvalinamid, TyrValN^

Fremgangsmåde 25 L-tyrosinethylester-hydrochlorid (16,0 g, 65 mmol) og L-valinamid-hydrochlorid (60 g, 390 mmol) opløses i 1150 ml vand og 65 ml 20 nM EDTA tilsættes. pH indstilles til 9,0 med natriumhydroxid-opløsning. Reaktionen startes ved tilsætning af 12 ml carboxypeptidase Y-opløsning (20 30 mg/ml). Reationen omrøres ved stuetemperatur i fire timer, og pH holdes konstant på 9,0 ved tilsætning af natriumhydroxid-opløsning. Efter endt omsætning standses reaktionen ved forhøjelse af pH til 11.

35 Det denaturerede enzym frafiltreres og reaktionsblandingen fortyndes og oprenses ved efterfølgende anion-bytning på en Dowex A61x4 søjle og kationbytning på en Dowex 34

DK 163365 B

A650Wx4 søjle under anvendelse af henholdsvis natrium- og ammoniumacetat-saltgradienter, og afsaltes til slut. Produktfraktioner kombineres og inddampes i vakuum til tørhed under tilsætning af absolut ethanol flere gange, 5 hvorved der fremkommer 11,2 g L,L-tyrosylvalinamid (40 mmol, 62%) som et hvidt pulver.

Identifikation 10 Der blev påvist 1,8% (på vægtbasis) acetat, D.v.s. produktet er overvejende på zwitterionisk form.

Aminosyreanalyse efter sur hydrolyse gav følgende resultat: 15

Tyr (1,01)

Val (0,99)

Renhed 20 HPLC-renhed: 99,5 (Novapak C^g, 0,1 M ammoniumphosphat indeholdende alkylsulfonat, pH 4,5/acetonitril, 220 nm).

UV-kvantisering: 97,8% (293 nm, tyrosin absorbans i 0,1 M 25 NaOH).

Eksempel 19

Fremstilling af D, L-tyrosyl-arginin, D,L-tyrArgOH 30

Fremgangsmåde 105 g L-arginin (105 g, 603 mmol) opløses i 400 ml vand. pH indstilles til 9,0 med HCl-opløsning. Der tilsættes D-35 tyrosinethylester-hydrochlorid (6,1 g, 25 mmol) og 5 ml 0,1 M EDTA, og pH genindstilles til 9,0. Reaktionen startes ved tilsætning af 7 ml carboxypeptidase Y-opløsning 35

DK 163365 B

(20 mg/ml), og pH holdes konstant på 9,0 ved tilsætning af NaOH-oplØsning. Reaktionen standses efter fire timer ved indstilling af pH til 3 med HCl-opløsning.

5 Reaktionsblaridingen fortyndes og oprenses ved kation-ud-bytning på en Dowex A650Wx4 søjle under anvendelse af en ammoniumacetat·* saltgradient, og af sal tes til slut. Opsam-lede produktfraktioner koncentreres ved inddampning og frysetørres til slut, hvorved der fremkommer 6,45 g D,L-10 tyrosyl-arginin (19 mmol, 77%) som et hvidt pulver.

Identifikation

Acetat og chlorid kunne ikke påvises. D.v.s. produktet 15 forefindes som zwitterion.

Aminosyreanalyse efter sur hydrolyse gav følgende resultat:

Arg (1,03) 20 Tyr (0,97)

Renhed HPLC-renhed: 99,5% (Novapak Clg, 0,1 M ammoniumphosphat 25 med alkylsulfonsyre, pH 4,5/acetonitril, 220 nm).

Vandindhold ifølge Karl Fisher: 3,4% 30 35 36

DK 163365 B

Eksempel 20

Fremstilling af D,L-phenylalanylmethionin, D,L-pheMetOH under anvendelse af immobiliseret carboxypeptidase Y 5

Immobiliseringsprocedure

Carboxypeptidase Y blev immobiliseret på Eupergit C efter den af producenten anbefalede procedure. Immobiliseringen 10 blev udført i en phospha tpuf fer ved pH på 7,5 og resterende aktive gel-grupper blev blokeret med ethanolamin ved pH 8,0 og efterfølgende vask.

93% af enzymet blev bundet til gelen, der indeholdt 2,5 15 mg protein/ml. Det Eupergit C-koblede enzym blev opbevaret i 10 mM PIPES, 1 mM EDTA, 0,05% hydroxybenzoesyre-ethylester, pH 7,0 ved 4°C.

Fremstillingsprocedure 20 D-phenylalaninethylester-hydrochlorid (5,7 g, 25 mmol) og L-methionin (29,8, 200 mmol) blev opløst i 400 ml ^0.

Der blev tilsat 5 ml 0,1 N EDTA, og pH blev indstillet til 9,0 med natriumhydroxid-opløsning til et reaktionsvo-25 lumen på 500 ml. Reaktionsblandingen blev omrørt kontinuert, og pH blev holdt konstant på 9,0 med natriumhydroxid-opløsning, mens opløsningen blev ført over en søjle af immobiliseret CPD-Y med en strømningshastighed på 3 ml/min. Søjlen indeholdt immobiliseret CPD-Y på Eupergit 30 C, fremstillet som ovenfor beskrevet, og var 2,5 cm x 5,5 cm med et volumen på 27 ml, indeholdende ialt 67 mg CPD- Y. Cirkulationen fortsattes i 10 h. pH blev derpå indstillet til 7 med HCL-opløsning, og produktet blev oprenset på R-præparativ HPLC som beskrevet i eksempel 16.

Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt blev kombineret, inddampet i vakuum og til slut frysetørret, 35 37

DK 163365 B

hvorved der fremkom 3,5 g (12 mmol, 48%) D,L-phenylala-nylMethionin som et hvidt amorft pulver.

Enzympræparations-stabilitet 5

Eksperimentet kunne gentages flere gange med den samme enzym-gel-præparation uden bemærkelsesværdig nedgang i omsætningshastighed og sammenlignelige resultater. Enzymet er således ret stabilt ved reaktionsbetingelseme, 10 hvilket yderligere forbedrer procesøkonomien.

Produktidentitet

Produktet indeholdt intet chlorid men 7,0% (på vægtbasis) 15 acetat, og var således delvis på acetat form.

Aminosyreanalyse påviste fravær af frie aminosyrer og efter sur hydrolyse:

Met (0,98) 20 Phe (1,03)

Den specifikke optiske rotation under anvendelse af natrium D-linie ved 25°C og c=0,25 i vand var -128,9° 25 Produktrenhed

HPLC: 99,6% (nucleosil 7 C^g, 0,1 M ammoniumphosphat, pH

3/acetonitril, 220 nm).

30 Vandindhold ifølge Karl Fisher: 2,8% 35

Eksempel 21 38

DK 163365 B

Fremstilling af D,D-phenylalanylphenylalaninethylester hydroohlorid, D,D-phepheOEt.HC1 5

Fremgangsmåde D-phenylalaninethylester hydrochlorid (2,5 g, 11 mmol) blev opløst i 45 ml vand, hvorefter der blev tilsat 0,5 10 ml 0,1 N EDTA. pH blev indstillet til 9,0 med natriumhydroxid-opløsning, idet substratet i begyndelsen indgår som en delvis olieagtig suspnsion. Reaktionen blev startet ved tilsætning af 3,4 ml carboxypeptidase Y-opløsning (20 mg/ml) og blev omrørt i 2,5 time ved stuetemperatur.

15 pH blev holdt på 9,0 med natriumhydroxid-opløsning. Reaktionen blev standset ved indstilling af pH til 3 med HC1-opløsning.

Reaktionsblandingen blev filtreret og oprenset ved R-præ-20 parativ HPLC, som beskrevet i eksempel 16.

Opsamlede produktfraktioner blev koncentreret ved ind-dampning i vakuum og frysetørret med tilsat HCl-opløs-ning, hvorved der fremkom 0,49 g (1,3 mmol, 12%) som et 25 hvidt amorft pulver.

Identifikation

Produktet indeholdt 9,2% (på vægtbasis) chlorid og intet 30 acetat. D.v.s. produktet forefindes som hydrochlorid.

Aminosyreanalyse efter sur hydrolyse påviste phenylalanin og ingen phenylalanin inden sur hydrolyse.

35 Produktet kunne hydrolyseres yderligere med en base, hvorved der fremkom et produkt, der var chromatografisk forskelligt fra D,L-PhePheOH, og selve produktet eluerede 39

DK 163365 B

med en L,L-PhePheOEt-standard i det anvendte HPLC-system.

Til slut blev den specifikke optiske rotation under anvendelse af natrium D-linie ved 25°C og c=0,5 i eddikesy-5 re bestemt til -42,7°. Dette til sammenligning med en ren L,L-PhePheOEt-standard, der gav +52,1° under samme betingelser. Forskellen menes her at skyldes det fremstillede peptids lavere renhed.

10 Renhed HPLC-renhed: 82,3% (nucleosil 7 Clg, 0,1 M ammoniumphos- phat, pH 3/acetonitril, 220 nm).

15 De påviste urenheder var chromatografisk forskellige fra substrat, substrathydrolyse, produkthydrolyse eller dia-stereomere deraf.

Vandindhold ifølge Karl Fisher: 7,5%.

20

Eksempel 22

Fremstilling af D-tyrosyl-Ø-alanin, D-Tyr-Ø-Ala-OH via esteren D-tyrosyl-Æ-alaninmethylester ved enzymatisk 25 deblokering

Fremgangsmåde 30 D-tyrosinethylester (1,07 g, 5,1 mmol) og Ø-alaninmethyl- ester (4,14 g, 40,1 mmol) opløses i 57 ml ^0 indeholdende 60 Mmol (22,3 mg) dinatrium EDTA og 3 mmol (363,3 mg) TRIS. Reaktionen startes ved tilsætning af 3,40 ml af en opløsning af carboxypeptidase-Y (353 uM) og holdes på 35 pH 8,3 under hele reaktionsforløbet.

Efter 2 timer indstilles pH til 3,0 ved tilsætning af 1 N

40

DK 163365 B

saltsyre. Reaktionsblandingen, fortyndes til 100 ml og oprenses med RP-præparativ HPLC (Waters Prep LC/System 500Ά) under anvendelse af en søjle (5,7 x 30 cm) pakket med 60 urn C-18 partikler og 50 mM eddikesyre/ethanol-5 blandinger.

Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt blev koncentreret under reduceret tryk og frysetørret til slut.

10 Ved fremgangsmåden blev der opnået 0,78 g D-tyrosyl-Æ-alaninmethylesteracetat (2,7 mmol, 58%).

Renhed 15 HPLC-renhed: 98,0% (Nucleosic 7 C-18, 0,1 M ammoniumphos- phat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).

20 Identifikation

Animosyreanalyse viste fravær af frie aminosyrer men efter sur hydrolyse fremkom følgende resultat: 25 Ø-Ala (1,04) D-Tyr (0,96)

Fremgangsmåde 30 Dipeptidmethylesteren (0,65 g, 2,3 mmol) blev opløst i 40 ml H2O indeholdende 4 ml 0,5 M phosphatpuffer (pH 7,0). Reaktionen blev startet ved tilsætning af 2,8 ml af en opløsning af svineleveresterase (PLE, 357 uM) og blev holdt på pH 7,0 under hele reaktionsforløbet.

Efter 4 timer blev pH indstillet til 3,0 ved tilsætning af 10 N saltsyre. Reaktionsblandingen blev fortyndet til 35

DK 163365B

41 70 ml og oprenset med RP-præparativ HPLC (Waters Prep LC/System 500A) under anvendelse af en søjle (5,7 x 30 cm) pakket med 60 »m C-18 partikler og 50 mM eddikesy-re/ethanol-blandinger.

5

Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt blev koncentreret under reduceret tryk og frysetørret til slut.

Ved denne fremgangsmåde blev der opnået 0,50 g D-tyrosyl-10 Ø-alaninacetat (1,5 mmol, 65%).

Identifikation

Aminosyreanalyse viste fravær af frie aminosyrer, men ef-15 ter sur hydrolyse fremkom følgende resultat: i-Ala (1,04) D-Tyr (0,96) 20 Acetat-indhold med HPLC: 1,2% (w/w). Chlorid blev ikke påvist.

Specifik optisk rotation: -34,9° (C = 0,01 i 0,1 N HCL under anvendelse af natrium D-linien på 20°C).

25

Renhed HPLC-renhed: 98,7% (Nucleosic 7 C-18, 0,1 M ammonium- phosphat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).

30 35

Eksempel 23 42

DK 163365 B

Fremstilling af b-alany1-L-methionin katalyseret med g Λ carboxypeptidase-Y under anvendelse af b-alanin-benzyl-5 ester som siibstratkomponent og fri methioninsyre som nucleophilkomponent i vand ved 2 forskellige pH-værdier

Kone. af 10 substrat Nucleophil pH Udbytte (%) 25 mM 0,4 M 8,0 5b) 25 mM 0,4 8,5 8 15__ a) 50 nM CPD-Y, 2 mM Na2-EDTA.

b) Bestemt ved mindre end 50% omsætning.

20 25 30 35 43

DK 163365 B

Eksempel 24

Fremstilling af dipeptider katalyseret med carboxy- a \ peptidaser ' under anvendelse af D-aminosyre-ethylestere 5 som substratk'omponenter og aminomethyl fos for syre (AMP) og 2-aminoethylsulfonsyre (2-AES) som nucleophilkomponenter i vand ved forskellige pH-værdier.

Enzym Substrat Nucleophil pH Udbytte (%) 10 _ CPD-Y D-tyr-OEt (50 mM) AMP (0,2 M) 9,3 2 CPD-W D-tyr-OEt (50 mM) AES (0,5 M) 8,5 4b) 15 a) 20 hM CPD-W, 2 mM Na2 EDTA og 0,1 M NH4C1 (pH indstillet) b) Bestemt i forhold til hydrolyse via en standard ved 20 mindre end 100% omsætning.

25 30 35

Eksempel 25 44

DK 163365 B

Fremstilling af L,L-TyrValNH2 katalyseret med carboxy-peptidase Y i høje koncentrationer af organisk opløs-5 ningsmiddel Under anvendelse af L-Tyrosinethylester som substratkomponent og L-Valinamid som nucleophilkomponent ved pH 8,5.

Kone. af u \ « \ 10 substrat Nucleophil Opløsningsm. ' Udbytte (%) ' 25 mM 0,5 M 92% glycerol 53 15 a) Bestemt ved 80% omsætning, 100 uM CPD-Y, 2 mM Na2-EDTA.

b) Opløsningsmiddelkoncentrationen beregnes som for- 20 holdet mellem vand og organisk opløsningsmiddel, ekskl. faste stoffer i opløsning.

25 30 35

Claims (13)

45 DK 163365 B Patentkrav ;

1. Fremgangsmåde til fremstilling af dipeptidderivater med den almene formel 5 H-A-B-Y hvor A betyder en eventuelt sidekædebeskyttet L- eller D-α-aminosyrerest eller ω-aminosyrerest, og B betyder en 10 eventuelt sidekædebeskyttet L- eller D-a-aminocarboxyl-syrerest eller o-aminosyrerest, der kan være den samme eller forskellig fra A, en L- eller D-aminophosphonsyre-rest eller en L- eller D-aminosulfonsyrerest og Y er OH eller en C-terminal beskyttelsesgruppe eller syreaddi-15 tionssalte og hydrater deraf, kendetegnet ved, at man omsætter en substratkomponent, der er et aminosy-rederivat med formlen R2

20 H-A-OR1 eller H-A-N \ R3 hvori A har den ovenfor angivne betydning, R1 betyder hydrogen, alkyl, aryl eller aralkyl eventuelt substitu- 2 5 eret med hydroxy, nitro eller halogen eller et a-des-ami- no-fragment af en aminosyre, og R2 og R3 er ens eller forskellige, og hver betyder hydrogen, alkyl, aryl eller aralkyl eventuelt substitueret med hydroxy, nitro eller halogen, 30 a med en nucleophilkomponent, der, når A = B, kan dannes in situ og er valgt blandt (a) aminosyrer med formlen OD 46 DK 163365 B H-B-OH hvor B er som defineret ovenfor 5 (b) aminosyreamider med formlen R2 / H-B-N \ , io r3 hvor B er som defineret ovenfor, R2 har den ovenfor an- T givne betydning og R3 har den ovenfor for R3 angivne betydning, med undtagelse af at når R2 betyder hydrogen, , _ kan R3 også betyde hydroxy eller amino 15 (c) aminosyreestere med formlen H-B-OR4 20 hvor B er som defineret ovenfor, og R4 betyder alkyl, aryl eller aralkyl og (d) ligekædede eller forgrenede aminophosphonsyrer eller __ aminosulfonsyrer med formlen 25 NH2CxH2xP03H2 eller NH2CxH2xS03H hvori x er 1-6 30 i nærvær af en serin- eller thiolcarboxypeptidase fra gær eller af animalsk, vegetabilsk eller anden mikrobiel oprindelse, i en vandig opløsning eller suspension, eventuelt indeholdende et organisk opløsningsmiddel og/eller __ et enzymbindingsfremmende salt og/eller et komplexbin-ob dingsmiddel, idet der under omsætningen opretholdes en i 47 DK 163365 B det væsentlige konstant pH-værdi mellem 5 og 10,5, hvorefter man om ønsket fraspalter en tilstedeværende sidekæ-debeskyttelsesgruppe eller en C-terminal beskyttelsesgruppe og/eller om ønsket overfører det opnåede dipeptid-5 derivat i et"syreadditionssalt eller hydrat deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte carboxypeptidase er carboxypeptidase Y fra gær. 10

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den anvendte carboxypeptidase er renset ved affi-nitetschromatografi over en affinitetsresin bestående af et polymert resinskelet med et antal tilkoblede benzyl- 15 succinylgrupper.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den anvendte carboxypeptidase er carboxypeptidase a fra hvede penicillocarboxypeptidase S-l eller S-2 fra

20 Penicillium janthinellum, en carboxypeptidase fra Aspergillus saitoi eller Aspergillus oryzae, en carboxypeptidase C fra orangeblade eller orangeskaller, carboxypeptidase CN fra Citrus natsudaidai Hayata, phaseolin fra bønneblade eller en carboxypeptidase fra spirende byg, 25 malt, spirende bomuldsplanter, tomater, vandmeloner eller Bromelein (ananas) pulver.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at den anvendte carboxypeptidase er kemisk modifice- 30 ret eller er en biosyntetisk mutant af en naturlig form.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at den anvendte carboxypeptidase er immobiliseret. 35

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes en vandig. 48 DK 163365 B reaktionsopløsning eller -dispersion indeholdende fra 0 til 50% af et organisk opløsningsmiddel.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet 5 ved, at det anvendte organiske opløsningsmiddel er valgt blandt alkanoler, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, di-methoxyethan, ethylenglycol og ethylacetat.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 10 kendetegnet ved, at der som substratkomponent anvendes en D- eller L-aminosyreester valgt blandt ben-zylestere eller ligekædede eller forgrenede C-^-Cg alkyl-estere, der eventuelt er substitueret med hydroxy, nitro eller halogen. 15

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der som nucleophil-komponent anvendes en aminosyre eller et aminosyreamid med formlen 20 H-B -OH eller H-B -NHR3 Μ f hvori R8 er hydrogen eller C^-C^ alkyl, og B er en L-aminosyrerest. 25

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som nucleophilkomponent anvendes en ester med formlen

30 H-B'-OR4' " » hvori B er en aminocarboxylsyrerest, og R4 er C^-Cg alkyl.

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der i det dannede dipeptid findes en C-terminal beskyttelsesgruppe, og at gruppen 49 DK 163365 B fraspaltes enzymatisk, fortrinsvis ved hjælp af det samme carboxypeptidaseenzym, som anvendtes ved den forudgående reaktion.

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der i det dannede dipeptid findes en eller flere sidekæde-beskyttelsesgrupper, og at gruppen eller grupperne fraspaltes enzymatisk, fortrinsvis ved hjælp af en esterase, en lipase eller et 10 proteolytisk enzym. 15 20 25 30 35