FI70597B - Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av peptider - Google Patents

Description

[73^71 ΓΒ1 (ΛΛ\ KUULUTUSjULKAISU nncqrj •SSrff B (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT /UO yf C (45) Patentti myönnetty

Paterit noddelat 24 CD 1D2C

v (51) Kv.lk.*/lnt.Cl.‘ C 12 P 21/02, C 07 K 1/06, 7/0^ g U Q |^| | FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansökning 801035 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 01 . OA.80 (Fl) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 01 .0A.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 07.10.80

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. — 06.06.86

Patent- och register Styrelsen v ' Ansökan utlagd och utl.$kri(ten publicerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 06.04.79 Tanska-Danmark(DK) 1*4*0/79 (71) Carlsberg Biotechnology Ltd. A/S, Tagensvej 16, 2200 K^benhavn, Tanska-Danmark(DK) (72) Jack Taaning Johansen, Rungsted Kyst, Fred Widmer, Valby,

Klaus Breddam, Glostrup, Tanska-Danmark(DK) (7**) Oy Koister Ab (5*0 Menetelmä peptidien entsymaattiseksi valmistamiseksi -Förfarande för enzymatisk framstälIning av peptider

Keksintö koskee peptidien entsymaattista valmistusmenetelmää. Keksintö koskee erityisesti peptidien valmistusmenetelmää, jossa käytetään entsyymien spesifistä ryhmää katalysaattorina.

On tunnettua syntetisoida peptidejä enemmän tai vähemmän monimutkaisten reaktioiden avulla. Tämä pätee sekä homogeenisten synteesien että heterogeenisten kiinteässä faasissa tapahtuvien synteesien suhteen. Näihin kaikkiin kemiallisiin menetelmiin sisältyy kuitenkin ei-toivoittujen, sekundaaristen reaktoiden sekä rasemoin-nin vaara, ja sen tähden on välttämätöntä valvoa huolellisesti kemiallisia reaktioita näiden ongelmien vähentämiseksi tai poistamiseksi. Ennen kaikkea aminohappojen sivuketjut täytyy usein suojata, mikä edellyttää suojaavien ryhmien poistamista viimeisenä kemiallisena vaiheena haluttujen peptidien tuottamiseksi. Syntetisoidun peptidin koosta riippuen saannot voivat olla pieniä, ja sekundaariset reaktiot usein edellyttävät hankalia puhdistusmenetelmiä puhtaan peptidin saamiseksi. Kaikki nämä kemialliseen peptidisyntee-siin luonnostaan liittyvät ongelmat sekä useiden kytkentäreagenssien 2 70597 sekä suojaavien aminohappojohdannaisten korkea hinta ovat syynä siihen, että on suhteellisen kallista tuottaa jopa pieniä synteettisiä peptidejä, kuten pentapeptidejä.

Koska entsyymit ovat hyvin spesifisiä katalyyttejä ja proteo-lyyttiset entsyymit pystyvät hydrolysoimaan proteiinien peptidi-sidoksia, on tutkittu mahdollisuutta muuttaa tämän hydrolyysireak-tion suuntaa eli mahdollisuutta käyttää entsyymejä katalysaattoreina syntetisoitaessa peptidisidoksia. Bergmann ja Fraenkel-Conrat (viite 1) sekä Bergmann ja Fruton (viite 2) ovat tehneet tätä koskevan yksityiskohtaisen tutkimuksen sekä osoittaneet vuonna 1937, että papaiini ja kymotrypsiini saattoivat katalysoida tiettyjen asyy1iaminohappojen sekä aminohappoanilidien kytkentäreaktioita. Näitä tutkimuksia on jatkettu sekä syvennytty nojaten kahteen, periaatteessa erilaiseen lähestymistapaan, nimittäin termodynaamiseen sekä kineettiseen.

Termodynaamisten menetelmien perusperiaatteena on käyttää sopivia proteaaseja katalysoimaan reagoivien aineiden välille syntyvää termodynaamista tasapainoa sekä käyttää niitä reaktiotuotteen poistamisessa reaktioseoksesta. Täten Isowa et ai. (viitteet 7-9) ja US-patentti 4 119 493 sekä GB-patentit 1 523 546 ja 1 533 129, Luisi et ai. (viitteet 12, 18) sekä Morihara et ai. (viite 14) esittävät havainneensa, että useat seriini-, tioli- ja metalloendo-proteaasit katalysoivat peptidien synteesiä suojatuista, mutta helppoliukoisista di-, tri- sekä tetrapeptideistä edellyttäen, että lopputuotteet saostuvat reaktioseoksesta sen perusteella, että niiden liukoisuus on alhaisempi kuin tasapainokonsentraatio. Tällaisten synteesien esimerkkejä on kuvattu seuraavassa reaktiokaaviossa

1) Z-Leu-Phe-OH + Phe-ODPM Z-Leu-Phe-ODPM

ODPM = difenyylimetyylieetteri 2) Z-Arg(N02 )-OH + Phe-Val-OBu1 ~-moly511^1) Z-Arg (NC^Phe-Val-OBu^ 3) B0C-Val-Tyr(Bz)0H + Val-His ( Bz )-pro-Phe-OEt na^ars-e>

BOC-Val-Tyr(Bz)-Val-His(Bz)-Pro-Phe-OH

Z = karbobentsoksi, Bz = bentsoyyli, BOC = tert. butyylioksikar-bonyyli.

Il 3 70597

Kuitenkin tätä reaktioperiaatetta voidaan käyttää yleisenä synteesimenetelmänä vain, jos samalla tavalla kuin tavanomaista kemiallista kytkentämenetelmää käytettäessä kaikki aminohappojen sivuketjut, joissa on mahdollisesti ionisoituvia ryhmiä, on suojattu ennen reaktiota ja vapautettu reaktion jälkeen. Menetelmä on puutteellinen sikäli, että erilaisten entsyymien suuren spesifisyyden vuoksi on käytettävä erilaisia entsyymejä riippuen syntetisoitavan peptidisidoksen laadusta tai pikemminkin peptidisidoksen muodostavista aminohapoista. Vaikka nämä hankaluudet voidaan voittaa, menetelmään sisältyy useita muita ongelmia, koska se edellyttää hyvin suurta entsyymien konsentraatiota (10C mg/mmoolia peptidiä), pitkiä reaktioaikoja (1-3 päivää) ja tuottaa vaihelevia saantoja (tavallisesti 20-80 %, ks. em. US- ja GB-patentit).

Klivanov et ai. (viite 10) ovat ehdottaneet käytettävän järjestelmää, joka sisältää vettä sekä veden kanssa sekoittumattoman orgaanisen liuottimen. Tämä menetelmä myös edellyttää suurta entsyymin konsentraatiota sekä useiden päivien pituista reaktioaikaa.

Muut entsymaattiset synteesityypit ovat riippuvaisia reaktion kineettisestä aloittamistavasta. Useimpien seriini- ja tioli-proteaasien suhteen on osoitettu, että yhdessä katalyyttisistä vaiheista peptidien tai peptidiestereiden hydrolyysin aikana muodostuu asyyli-entsyymi-välituote, joka sitten hydrolysoituu veden avulla seuraavassa vaiheessa tai seuraavissa vaiheissa. Jos hydrolyysin aikana on läsnä muita nukleof iilisiä yhdisteitä kuin vettä , ne myös ottavat asyylientsyymiltä vastaan asyyli-ryhmän, mistä on seurauksena amidi-sidoksen muodostuminen. Tätä ovat tutkineet esim. Fastrez ja Fersht (viite 3), jotka raportoivat kymotrypsiinin katalysoimasta N-asetyyli-L-fenyylialaniinietyyliesterin (Ac-Phe-OEt) hydrolyy-sistä erilaisten aminohappojen läsnäollessa. Reaktio on esitetty kaavioissa (4): 4 70597

^ Ac-Phe-OH + CT

Ac-Phe-OEt + CT< —- q k2 (Ac-Phe-OEt)'CT^=^Ac-Phe-CT^

"2 + EtOH

^ Ac-Phe-NH-R + CT

4

Kaavio (4) (CT = kymotrypsiini)

Ensin muodostuu entsyymi-substraatti-kompleksi, jonka jälkeen muodostuu asyyli-entsyymi (Ac-Phe-CT)-välituote.

Tämä hydrolysoituu vedellä AC-Phe-OH:ksi, mutta jos nukleofiilinen yhdiste (R-NHj) on myös läsnä, asyyli-entsyymi-välituote on hydrolyysin lisäksi aminolyysin kohteena. Olettaen että kg>>k_^ ja kJ+>>k_1+, aminolyysin suhde hydrolyysiin riippuu selvästi k^/kgista sekä nukleofiilisen yhdisteen konsentraatiosta, joka kilpailee 55 M veden kanssa. Fastrez ja Fersht havaitsivat, että esim. 1 M alaniiniamidi pH 10:ssä on 44 kertaa voimakkaammin nukleofiilinen kuin 55 M vesi, mistä on seurauksena, että vallitsevasti muodostuu (enemmän kuin 95 %) esitettyä N-asyylidipeptidi-amidia. Morihara ja Oka (viitteet 13-16) ovat edelleen käyttäneet hyväksi tätä lähtökohtaa entsymaattisessa peptidi-synteesissä. Kymotrypsiiniä ja trypsiiniä käyttäen he syntetisoivat joukon peptidejä N-asyyliaminohappoestereistä sekä nukleofiileistä peräisin olevasta aminohaposta sekä osoittivat reaktion olevan puhtaasti kineettisen, koska voitiin saada korkeat saannot , tuotteen liukoisuudesta riippumatta.

Yllämainitut tutkimukset näyttävät ilmaisevan , että kineettisillä aloittamistavoilla on useita etuja termodynaamisiin menetelmiin nähden: 1. Nopeampi reaktio (joissakin tapauksissa päättynyt muutamassa minuutissa) 2. Mahdollisuus käyttää alhaisia entsyymikonsentraatioita.

3. Aminohapposivuketjujen ei välttämättä tarvitse olla suojattuja.

4. Kun peptidit ovat liuoksessa, voidaan käyttää immobili-soituja ja liukenemattomia entsyymejä, minkä vuoksi au-tomatointi on mahdollista.

Il 5 70597

Kun kuitenkin reaktiotuotteet saattavat olla liukoisia, synteesin tulee olla nopeamman kuin tuotteen sekundaarinen hydrolyysi, niin että reaktiotuotteet voidaan erottaa ajoissa.

Ennen kaikkea, tunnetut kineettiset aloitustavat ovat rajoitettuja käyttökelpoisuutensa suhteen, koska tutkittujen entsyymien spesifiset ominaisuudet edellyttävät erilaisten entsyymien käyttöä erilaisten peptidi-sidosten synteesissä. Lisäksi suurten peptidi-molekyylien synteesi aiheuttaa aina poikkeuksetta molekyylin sisäisten peptidi-sidosten hydrolyysin, riippumatta entsyymien estereitä pilkkovasta aktiivisuudesta, mikä johtuu tähän saakka käytettyjen entsyymien endopeptidaasi-aktiivisuudesta.

Julkaisusta C.A. 8_7, No. 15 (1977), s. 253 , 113665k, tunnetaan menetelmä, jossa N-terminaalisesti suojattu peptidi, jonka kaava on diasetyyli-L-lys-D-ala-D-ala saatetaan reagoimaan aminohapon, glysiinin, kanssa yhdisteen läsnäollessa, joka osoittaa karboksipeptidaaniaktiviteettia ja jonka molekyylipaino on H6000, jolloin saadaan peptidi, jonka kaava on diasetyyli-L-lys-D-ala-gly

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää peptidien entsymaat-tiseksi valmistamiseksi, joiden kaava on

A-B-Z

jossa A on N-terminaalisesti suojattu aminohappotähde tai mahdollisesti N-terminaalisesti suojattu peptiditähde, jossa on C-terminaa-linen L-aminohappo, B on L-aminohappotähde ja Z on OH tai C-termi-naalinen suojaryhmä, jolloin substraattikomponentti saatetaan reagoimaan amiinikomponentin kanssa entsyymin läsnäollessa, ja haluttaessa terminaalisuojaryhmä tai -ryhmät lohkaistaan niin, että muodostuu kaavan A-B-Z mukainen peptidi.

Menetelmälle on tunnusomaista, että substraattikomponentti, joka on aminohappo- tai peptidiesteri, depsipeptidi, mahdollisesti N-substituoitu aminohappoamidi tai peptidiamidi tai mahdollisesti N-terminaalisesti suojattu peptidi ja jonka kaava on 6 70597

A-OR1 A-NR2R2> tai A-X-OH

. 1 jossa A tarkoittaa samaa kuin edellä, R on entsymaattisesti lohkaistavissa oleva ryhmä, joka on alkyyli, aryyli, heteroaryyli, 2 2 ’ aralkyyli tai aminohappotähteen ot-des-amino-framgenttia, R ja R tarkoittavat toisistaan riippumatta entsymaattisesti lohkaistavissa olevaa ryhmää, joka on vety, alkyyli, aryyli, heteroaryyli tai aralkyyli, ja X on aminohappotähde, saatetaan reagoimaan amiinikompo-nentin kanssa, joka on mahdollisesti N-substituoitu L-aminohappo-amidi, L-aminohappo tai L-aminohappoesteri ja jonka kaava on H-B-NR3R3' tai H-B-OR4 3.3» jolloin B tarkoittaa samaa kuin edellä, R ja R tarkoittavat toisistaan riippumatta entsymaattisesti lohkaistavissa olevaa ryhmää, joka on vety, hydroksi, amino, alkyyli, aryyli, heteroaryyli tai 4 . ....

aralkyyli, ja R on vety tai entsymaattisesti lohkaistavissa olevaa ryhmää, joka on alkyyli, aryyli, heteroaryyli tai aralkyyli, jolloin reaktio suoritetaan hiivasta saadun tai eläin-, kasvi- tai mikrobi-alkuperää olevan L-spesifisen seriini- taitiolikarboksipeptidaasi-entsyymin läsnäollessa vesipitoisessa liuoksessa tai dispersiossa, jonka pH on 5-10,5, edullisesti lämpötilassa 20-50°C.

Keksintö eroaa olennaisesti tunnetusta tekniikasta. Se perustuu eksopeptidaasien käyttöön tähän saakka käytettyjen entsyymien sijaan, joilla kaikilla on vallitsevaa tai joka tapauksessa merkittävää endopeptidaasiaktiivisuutta.

On todettu, että paitsi että käyttökelpoisten entsyymien tulee olla eksopeptidaaseja, niillä täytyy olla laajasti spesifistä peptidaasi-aktiivisuutta sallien tällöin vastaavasti laajalti spesifistä synteettistä aktiivisuutta, joka ei rajoitu yhteen ainoaan tai joihinkin peptidisidos-tyyppeihin. Entsyymien tulee pystyä muodostamaan asyylientsyymi-välituotteita, jotka tyypiltään ovat sellaisia, joita edellä on kuvattu, kineettisen lähestymistavan yhteydessä, ja niillä tulee erityisesti olla ominaisuuksia, jotka sallivat välituotteen aminolyysin olosuhteissa, joissa k_1+<<kl+, vrt. kaavio (4) yllä, jotta vältetään tuotettujen peptidi-sidosten välitön hydrolyysi. Asyyli-entsyymi-välituotteiden muodostamiskyky voidaan myös ilmaista kykynä lohkaista C-päätteessä sijaitseva suo- li 7 70597 jaava ryhmä käytetyssä substraatti-komponentissa, t.s. tässä tapauksessa esteraasi- tai amidaasi-aktiivisuutena. Jotta synteesi tapahtuu, mainitun aktiivisuuden tulee käytetyissä reaktio-olosuhteissa ylittää entsyymin peptidaasi-aktiivisuus.

Tällaista ominaisuuksien moninaisuutta löytyy karboksipepti-daaseiksi mainittujen eksopeptidaasien ryhmästä, jotka pystyvät hydrolysoimaan peptidejä, joilla on vapaita karboksyyliryhmiä. On todettu, että monilla sellaisista karboksipeptidaaseista on erilaisia entsyymiaktiivisuuksia, jotka ovat hyvin riippuvaisia pH:sta, niin että esim. emäksisessä ympäristössä pH 8-10,5:ssä niillä on pääasiallisesti esteraasi- tai amidaasi-aktiivisuutta ja pH

9-10,5:ssä ei ole ollenkaan tai on vain merkityksetöntä peptidaasi-aktiivisuutta. Näitä ominaisuuksia on edullisesti käytetty keksinnön mukaisessa menetelmässä, koska ne auttavat hyvien saantojen saavuttamisessa.

Erityisen sopiva entsyymi on karboksipeptidaasi Y, joka on peräisin hiivasieniltä (CPD-Y). Hayashi et ai. (viite 5) sekä Johansen et ai. (viite 6) kuvaavat tätä entsyymiä, ja Johansen et ai. kehittivät erityisen sopivan puhdistusmenetelmän affiniteet-tikromatografiän avulla käyttäen affiniteettihartsia, joka käsittää polymeerisen hartsimatriisin, johon on liitetty bentsyylisukkinyy-liryhmiä. CPD-Y:lle, joka on seriini-entsyymi, on ominaista, että sillä on yllä mainittu suhde eri entsyymiaktiivisuuksien välillä, kun pH >9, ja sillä ei ole endopeptidaasiaktiivisuutta. Sen lisäksi, ! että se on spesifinen C-terminaalisten aminohappojen tai estereiden ' suhteen, joissa on vapaita oukarboksyyli-ryhmiä, CPD-Y voi myös hydrolysoida peptidejä, joissa C-päätteinen A-karboksyyli-ryhmä on suojattu esteriryhmän esim. alkyyli- tai aryyliesterin, amidiryhmän tai N-substituoidun amidin, esim. anilidin, muodossa. On tärkeää, että entsyymi hydrolysoi useimpia substraatteja riippumatta C-päät-teisen aminohappotähteen luonteesta. Eräs toinen CPD-Y:n etu on, että sitä voidaan saada suurissa määrin ja että se on suhteellisen stabiili.

CPD-Y:n lisäksi, joka on tällä hetkellä edullinen entsyymi, keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää muita karboksi-peptidaaseja, esim. seuraavia: 8 70597

Entsyymi Alkuperä

Sienet

Penisillokarboksipeptidaasi S-l Penicillium janthinellum

Penisillokarboksipeptidaasi S-2 Penicillium jahthinellum

Karboksipeptidaasi(t) Aspergillus saitoi

Karboksipeptidaasi(t) Aspergillus oryzae

Kasvit

Karboksipeptidaasit C Appelsiinipuun lehdet >

Appelsiinipuun kuoret

Karboksipeptidaasi CN Citrus natsudaidai Hayata

Faseoliini Ranskalaisen pavun lehdet

Karboksipeptidaasit(s) Itävästä ohrasta

Versovista puuvillakasveista

Tomaateista

Vesimeloneista

Bromelain ananasjauheesta Härän karboksipeptidaasit A ja B (CPD-A ja CPD-B) kuitenkaan eivät sovellu, koska ne ovat metallokarboksipeptidaaseja.

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan peptidi saattamalla ns. "substraattikomponentti" (kutsutaan myös "happokomponentiksi" tai "donoriksi") ns. "amiinikomponentin kanssa (kutsutaan myös "nukleofiilikomponentiksi" tai "akseptoriksi"). Ryhmä A substraat-tikomponentissa voi sisältää N-terminaalisen suojaryhmän ja näin onkin asianlaita kun A sisältää vain yhden aminohappotähteen.

Amino-ryhmän suojauksen tarve vähenee peptiditähteen ketjun pituuden kasvaessa, eikä suojausta tarvita, kun peptiditähde sisältää kolme aminohappoa, riippuen kuitenkin aminohappojen tyypistä sekä järjestyksestä.

Käyttökelpoisia aminohappoja ovat esim. alifaattiset aminohapot, kuten esim. monoaminokarboksyylihapot, esim. glysiini (Gly), alaniini (Ala), väliini (Vai), norvaliini (Nva), leusiini (Leu), isoleusiini (iso-Leu) sekä norleusiini (Nle), hydroksiaminohapot, kuten esim. seriini (Ser), treoniini (Thr) sekä homoseriini (homo-Ser), rikkiä sisältävät aminohapot, kuten esim. metioniini (Met) tai kystiini (CysS) ja kysteiini (CysH), monoaminodikarboksyyliha-pot, kuten esim. asparagiinihappo (Asp), glutamiinihappo (Glu), asparagiini (Asn) glutamiini (Gin), diaminomonokarboksyylihapot, li 9 70597 kuten esim. ornitiini (Orn), lysiini (Lys) sekä arginiini (Arg), aromaattiset aminohapot, kuten esim. Fenyylialaniini (Phe) sekä tyrosiini (Tyr) sekä heterosykliset aminohapot, kuten esim. histi-diini (His) sekä tryptofaani (Trp). Kaikki jäljempänä mainitut aminohapot ovat L-muodossa, mikäli ei muuta ilmoiteta.

Suojäävinä ryhminä voidaan käyttää amino-suojaryhmiä, jotka ovat yleisiä peptidikemiassa, kuten esim. bentsoyyli-(Bz) , asetyy- li-(Ac)taitertiäärisiä alkoksikarbonyyli-ryhmiä, esim. t-butyyli-oksikarbonyyliä (B0C-), t-amyylioksikarbonyyliä (t-AOC-), bentsyyli-oksikarbonyyliä (Z-), p-metoksibentsyylioksikarbonyyliä (PMZ-), 3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyliä (Z(0Me)2“)> 2,4,6-trimetyyli-bentsyylioksikarbonyyliä (TMZ-), p-fenyyliatsobentsyylioksikarbo-nyyliä (PZ-), p-tolueenisulfonyyliä (Tos-), o-nitrofenyylisulfonyy-liä (Nps-), tms.

Parempana pidettyjä suojaavia ryhmiä ovat bentsyylioksikar-bonyyli ja t-butyylioksikarbonyyli, koska näitä johdannaisia on helppo valmistaa, taloudellista käyttää ja helppo jälleen pilkkoa.

Termi "alkyyli" substituenttien R·1, R^ , R3 , R3, R3 ja R4 yhteydessä merkitsee suoraketjuista tai haarautunutta alkyyliä, edullisesti sellaista, jossa on 1-6 hiiliatomia, esim. metyyliä, etyyliä, propyyliä, isopropyyliä, butyyliä, isobutyyliä, tert.-butyyliä, amyyliä tai heksyyliä.

"Aryyli" merkitsee esim. fenyyliä tai heterosyklistä aryyliä, o

"Aralkyyli" merkitsee esim. bentsyyliä tai fenetvyliä. Ryhmät R

2 > 3 3 ? ja R sekä R 3a R saattavat olla sama tai erilaiset.

Kaikki nämä ryhmät voivat olla substituoituja substituen-teilla, jotka ovat inerttejä entsyymin suhteen, esim. halogeenilla (fluorilla, kloorilla, bromilla, jodilla), nitro-, alkoksi- (metok-si-, etoksi-, j.n.e.) ryhmällä tai alkyylillä (metyylillä, etyylillä j.n.e.), edellyttäen että aminohappotähde tai peptidi-joh-dannainen on karboksipeptidaasin substraatti.

. A

Substraattikomponentm ollessa esteri 0R -ryhmä on edullisesti alkoksi-ryhmä, kuten metoksi-, etoksi- tai t-butoksi-, fenyyli-oksi- ja bensyylioksi-ryhmä. Ryhmät voivat olla substituoituja iner-teillä substituenteilla, kuten nitro-ryhmillä (p-nitrobentsyyli-oksi). Voidaan yhtä hyvin käyttää muita ryhmiä, jos aminohappotähde ta peptidi-johdannainen on karboksipeptidaasin substraatti.

I.

70597 ' f' αο

Eräänä esimerkkinä ovat niin sanotut depsipeptidit, joissa C-ter-minaalinen aminohappo on liitetty peptidi-sidoksen sijasta esteri-sidoksen v-älityksellä, esim. bentsoyyli-glysiini-fenyylilaktaatti (Bz-Gly-O-des-Ni^-Phe).

Edullisia karboksyylihappoja suojaavia ryhmiä ovat alkoksi-ryhmät, erityisesti metoksi-ryhmät, toisin sanoen substraatti-komponentti sisältää ja muodostuu aminohappometyyliesteristä, koska nämä johdannaiset ovat helppoja valmistaa sekä hyviä substraatteja samanaikaisesti. Kuitenkin, esim. etyyliestereitä, propyyliesterei-tä, isopropyyliestereitä, butyyliestereitä, t-butyyliestereitä, bent-syyliestereitä tai tert .butyylioksiestereitä voidaan käyttää yhtä hy- ϊ vin. '

On mainittava, että ionisoituvat ryhmät, joita saattaa olla yksittäisissä aminohapoissa, jotka ovat peptiditähde A:n komponentteja, saatetaan, jos halutaan, suojata sinänsä tunnetulla tavalla riippuen ryhmän laadusta. Kuitenkaan suojausta ei aina tarvita, mikä on juuri eräs kyseessä olevan menetelmän eduista. Jos halutaan suojata toiminnallisia ryhmiä, ίί^-amino-ryhmän (N**) sopivia suojaavia ryhmiä ovat esim. N^-bentsyylioksikarbonyyli (N^-Z), t-butoksi-karbonyyli (Nw-B0C)tai. tosyyli (N^-Tos). N-guanidinoryhmän (N^)sopi-via suojaavia ryhmiä Arg:ssa ovat nitro (N -NC^), N -bentsyylioksikar-bonyyli (N^-Z) sekä , N^-dibentsyylioksikarbonyyli (N^-Z-Z). Histidiinissä olevan imidatsoli-renkaan (Nim) sopivia suojaavia ryhmiä ovat Nlm-bentsyyli (Nlm-Bzl) sekä tosyyli (Nlm-Tos). W-kar- *1 boksyyli-ryhmien suojaavia ryhmiä ovat U/-bentsyylioksi (-OBzl). i

Alifaattisten ja aromaattisten hydroksiaminohappojen hydroksyyli- ; ryhmien sopivia suojaavia ryhmiä ovat aralkyyli-ryhmät, kuten esim. bentsyyli (Bzl). CysH:n merkapto-ryhmän sopivia S-suojaryhmiä ovat esim. bentsyyliryhmä (Bzl). Suojaryhmien tulee olla stabiileja primaarisen reaktion kuluessa ja helposti lohkaistavissa lopullisesta tuotteesta aiheuttamatta sekundaarisia reaktioita. f

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan periaatteessa suorittaa * käyttäen mitä tahansa aminohappoa substraattina. Substraattikompo- ϊ i nentti on edullisesti L-aminohappo- tai peptidiesteri, joka on \ bentsyyli- tai C1_l+-alkyyliesteri, joka voi olla substituoitu iner- i teillä substituenteilla, tai substraattikomponentti voi edullisesti j myös olla p-nitroanilidi. i i

M

70597 11

Kun amiinikornponentti on mahdollisesti N-substituoitu amino- 3 3 happoamidi ja R = vety, kysymyksessä on vapaa amidi. Kun R = OH, 3 kysymyksessä on hydroksaanihappo, kun R = amino, kysymyksesssä on 3 hydratsidi ia kun R = fenyyli, kysymyksessä on anilidi. Edullisen amiinikomponentin kaava on H-B-NHR3 tai H-B-OR4 3 4 jossa R on vety tai C^^-alkyyli, R on C^^-alkyyli ja B tarkoittaa samaa kuin edellä.

Keksinnön mukaisen menetelmän ratkaisevana etuna esim. Isowan et ai. ja Moriharan et ai. menetelmään nähden on, että se voidaan toteuttaa sekä vapaiden (C-terminaalisesti suojaamattomien) aminohappojen että C-terminaalisesti suojattujen aminohappojen avulla esim. muuttamalla vastaaviksi amideiksi, anilideiksi, hydratsideik-si, estereiksi tai muiksi, aminohappojen karboksyyli-johdannaisiksi.

Mitä tulee amiini-komponenttiin, reaktiojärjestykseen, saantoihin jne., ne riippuvat hyvin paljon siitä, ovatko komponentit vapaina happoina tai C-suojattuina johdannaisina esim. amideina.

Tätä valaistaan lähemmin jäljempänä esimerkkien yhteydessä; seuraa-vat yleiset piirteet tulevat kuitenkin ilmi:

Vapaiden aminohappojen suhteen pätee, että substraattikompo-nentin ketjuun on suhteellisen helppo liittää hydrofobisia aminohappoja, kuten alaniini, leusiini, väliini ja fenyylialaniini sekä happoja, joilla on positiivinen sivuketju, kuten lysiini ja argi-niini, kun taas on paljon vaikeampi liittää aminohappoja, joiden sivuketjussa on joko karboksyyli-ryhmiä (asparagiini- ja glutamii-nihappo), hydroksyyli-ryhmiä (seriini ja treoniini) tai amidi-ryhmiä (asparagiini ja glutamiini).

Heterosyklisiä aminohappoja, kuten proliinia ja histidiiniä on erittäin vaikea liittää vapaina happoina.

On eri asia, jos amiini-komponenttina käytetään C-terminaalisesti suojattuja aminohappoja esim. aminohappoamideja tai N-substituoituja amideja, esim. hydratsideja tai anilideja, mutta voidaan sanoa jokseenkin yleisesti, että tässä tapauksessa reaktio on mitä suurimmassa määrin riippumaton rakenteesta, ja voidaan saada vieläpä erittäin suuria saantoja aina (90 %:iin saakka); .

i · 12 70597 kuitenkin myös tässä tapauksessa heterosykliset aminohapot ovat vaikeammin liitettävissä kuin alifaattiset aminohapot.

Kuten yllä on esitetty keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan pH-arvossa 5,0 - 10,5, edullisesti pH-arvossa 8,0 - 10,5.

Edullinen pH-arvo, joka on usein hyvin kapealla alueella riippuu vastaavasti käytetyn entsyymin eri entsyymiaktiivisuuksien pH-optimista ja pH-minimista, jolloin on selvää, että pH-arvo olisi valittava niin, että aktiivisuudet ovat tasapainotetut kuten edellä on esitetty.

Yleensä peptidaasiaktiivisuus lisääntyy pH:n laskiessa alle arvon noin 9, jolloin menetelmä saannon suhteen on epäedullinen. Kuitenkin joissakin tapauksissa, esim. Bz-Ala-Gly-Gly:in tai Bz-Ala-Gly-N^ : n ollessa kysymyksessä muodostuneet peptidit tai peptidiamidit ovat karboksipeptidaasien huonoja substraatteja, niin että esteraasiaktiivisuus aminohappoesteriä tai peptidieste-riä vastaan, joita edullisesti käytetään substraattikomponenttina, on vallitsevana, jolloin synteesi on mahdollinen vieläpä pH-arvoil-la noin 5,0 ja sen alapuolella. Yleisesti sanoen, optimi pH riippuu varsinaisista lähtöaineista, muodostuneista peptideistä sekä entsyymistä.

Jos CPD-Y:tä käytetään entsyyminä, pH-arvo on edullisesti 8,0-10,5, erityisesti 9,0-10,5, kuten myöhemmin on selitetty.

Tämä pH-arvo pitäisi pitää yllä koko kytkemisreaktion ajan ja sitä voidaan sitten muuttaa reaktiotuotteen saostamiseksi, suojäävien ryhmien lohkaisemiseksi jne. Sopiva pH-arvo voidaan saada käyttämällä reaktioväliaineessa sopivaa puskuria, kuten bi-karbonaattipuskuria.

Valittu puskuri ei ole reaktion suhteen kriittinen tekijä olettaen, että sopiva pH säilyy.

pH-arvoa voidaan myös pitää yllä lisäämällä happoa, kuten esim. HCl:a, tai emästä, kuten NaQH:a, reaktion kuluessa.

Il 13 70597

Reaktio suoritetaan, kuten on mainittu, vesipitoisessa reak-tioväliaineessa, joka haluttaessa saattaa sisältää jopa 50 tilav.-% orgaanista liuotinta. Edullisia orgaanisia liuottimia ovat alkano-lit, esim metanoli ja etanoli, glykolit, esim. etyleeniglykoli tai polyetyleeniglykolit, dimetyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi, tet-rahydrofuraani, dioksaani sekä dimetoksietaani.

Reaktioväliaineen koostumuksen valinta riippuu erityisesti liukoisuudesta, lämpötilasta sekä reaktiokomponenttien pH:sta ja peptidi-tuotteesta sekä entsyymin stabiliteetista.

Reaktioväliaine voi myös sisältää aineosan, joka tekee entsyymin liukenemattomaksi, mutta säilyttää huomattavan osan entsyymin aktiivisuudesta, kuten esim. ioninvaihtohartsin. Vaihtoehtoisesti entsyymi voidaan immobilisoida tunnetulla tavalla, vertaa Methods of Enzymology, osa 44, 1976, esim. sitomalla sideaineeseen kuten silloitettuun dekstraaniin tai agaroosiin tai piidioksidiin, polyamidiin tai selluloosaan tai se voi olla kapseloitu polyakryyliami-din sisälle, alginaatteihin tai kuituihin. Lisäksi entsyymiä voidaan modifioida kemiallisin keinoin sen stabiliteetin sekä entsy-maattisten ominaisuuksien parantamiseksi.

Kahden reaktiossa olevan komponentin konsentraatio voi vaihdella laajoissa rajoissa, kuten myöhemmin on selitetty. Substraat-tikomponentilla on edullisesti 0,01-1 molaarinen ja aminokomponen-tilla 0,05-3 molaarinen lähtökonsentraatio.

Entsyymin konsentraatio voi yhtä hyvin vaihdella, mutta -6 -4 edullisesti olla 10 - 10 molaarinen.

Keksinnön mukaisesti reaktiolämpötila on edullisesti 20-50°C. Synteesille sopivin reaktiolämpötila voidaan määrätä kokeellisesti, mutta se riippuu erityisesti käytetystä amiini-komponentista sekä entsyymistä. Sopiva lämpötila tulee tavallisesti olemaan noin 35 - 45°C, edullisesti noin 35°C. Lämpötiloissa, jotka ovat 20°C:n alapuolella, reaktioaika tulee tavallisesti sopimattoman pitkäksi, kun taas yli 50°C:n lämpötilat aiheuttavat pulmia „ 70597 entsyymin ja /tai reagoivien aineosien tai reaktiotuotteiden stabiliuden suhteen.

Reaktioajan suhteen esiintyy samanlaista vaihtelua, mikä riippuu hyvin paljon muista reaktion parametreista, kuten myöhemmin on selitetty. Keksinnön mukaisen menetelmän normaali reaktioaika on noin 10 minuuttia, mutta se voi nousta muutamaan tuntiin.

Olisi lisättävä, että kun käytetään amidia tai substitu-oitua amidia amiini-komponenttina, olisi usein edullista tai vieläpä välttämätöntä synteesin jatkumisen kannalta lohkaista amidi-ryhmä spesifisesti muodostuneesta peptidiamidista. Myös tässä suhteessa karboksipeptidaasi, erityisesti CPD-Y soveltuu hyvin, koska, kuten yllä on kuvattu, CPD-Y:llä on amidaasi-aktii-visuutta pH >9:ssä, kun taas siltä puuttuu karboksipeptidaasi-aktiivisuus.

Lisäksi karboksipeptidaasia saatetaan yleisesti käyttää pilkottaessa edellä määriteltyjä ryhmiä R tai R muodostetusta peptidistä, jos halutaan jatkaa synteesiä tai saada vain lopullinen peptidi, jota ei ole C-terminaalisesti suojattu.

Kuten alempana edelleen kuvataan, keksinnön mukainen menetelmä soveltuu rajoittamattoman dipeptidi-, oligopeptidi- ja polypeptidi-joukon muodostamiseen saman keksinnön mukaisen periaatteen perusteella, nimittäin että substraatti-komponentti reagoi aminohapon tai aminohappo-johdannaisen muodossa olevan amiini-komponentin kanssa karboksipeptidaasin läsnäollessa.

Esimerkkejä hyvin tunnetuista oligopeptideistä tai poly-peptideistä, joita voidaan tuottaa sen mukaisesti, ovat enkefa- > liinit, somatostatiini, somatostatiini-analogit ja peptidit, joilla on samanlaista biologista aktiivisuutta, ja niinsanottu "sleep peptidi" (Trp-Ala-Gly-Gly-Asp.Ala-Ser-Gly-Glu).

Tietyissä tapauksissa, esim. kun on kysymys peptideistä, joissa on enemmän kuin viisi aminohappoa, saattaa olla edullista syntetisoida halutun peptidin osia oligopeptidi-fragmenttien muodossa esim. pentapeptidinä, joissa on sopivat aminohappo-sekvenssit ja alistaa oligopeptidit fragmenttikondensaatioon jollain sinänsä tunnetulla tavalla.

Il is 70597 f i

Saattaa olla myös edullista esim. muodostuneiden peptidien liukoisuusominaisuuksien parantamiseksi käyttää N-terminaalisina aminohappona arginiinia tai jotain muuta ionisoituvaa aminohappoa synteesivaiheiden aikana ja sitten, lohkaista arginiini peptidistä spesifisen entsyymin esim. trypsiinin avulla, kun toivottu ami- .

nohapposekvenssi on muutoin järjestyksessä.

Nämä ja muut muunnelmat muodostavat myös osan keksintöä. Ennenkuin keksinnön mukaista menetelmää valaistaan esimerkein, selitetään lähtöaineita, mittausmenetelmiä j.n.e. yleisin termein.

Lähtöaineet

Karboksipeptidaasi Y leipomohiivasta eristettiin affini-teettikromatografiamenetelmällä Johansen et ai. mukaisesti (viite 6) ja saatiin lyofilisoituna jauheena (10 % entsyymiä natriumsitraatissa). Ennen käyttöä entsyymistä poistettiin p suolat hienolla Sephadex G-25:llä (1,5 x 25 cm) tasapinnoitettiin ja eluoitiin tislatulla vedellä. Entsyymin konsentraatio määri- 1% tettiin spektrofotometrisesti käyttäen nm = 14,8 (viite 6).

Valmistettiin varastoliuos, jossa oli 7 mg/ml:n konsentraatio (110 ^uM), ja se säilytettiin 250 - 500 ^ul:n erissä, - 21°C:ssa. Bentsoyylialaniinimetyyliesteri (Bz-Ala-0Me) ostettiin Bachemilta, Liestal, Sveitsi. Booritrifluoridieteraatti-kompleksi (synteesiä varten), liuottimet ja reagenssit (kaikki analyyttistä puhtausastetta) olivat Merckiltä, Darmstadt, Länsi-Saksa. Kaikki aminohapot ja aminohappoamidit sekä niiden johdannaiset olivat Sigma Chemical Companyn, St. Louis, USA. Karbobentsyylioksi-fenyyli-alaniinimetyyliesteri (Z-Phe-0Me) valmistettiin Yamada et ai.

(viite 20) menetelmän mukaisesti ja sitä käytettiin siirappina. Fenyylialaniinihydratsidi ja alaniinihydratsidin hydrokloridi valmistettiin estereistä kuten Losse et ai. ovat kuvanneet (viite 11). Korjaamattomat sulamispisteet olivat 86-88°C (kirjall.: 82-83°C (11) ja 182-185°C (kirjall.; 184-185°C (21)) vastaavasti. Asparagiiniamidin dihydrokloridi saatiin asparagiinihaposta dietyyliesterin kautta Fischerin mukaan (viite 4) klassisen aminolyysin avulla (sp.: 210-214°C, kirjall.: 214-215°C (19)).

Muut lähtöaineet hankittiin yllä mainituilta yhtiöiltä tai valmistettiin analogisella tavalla.

-------------- , ί 16 70597

Tuotteen saantojen määrittäminen

Puhtaus määritettiin kvalitatiivisesti TLC:n avulla (ohutlevykromatografiän avulla) piihappogeeli 60 F^^zllä (Merck). Liuotinj är jestelmänä käytettiin CHClg/CHgiC^) gOH/- , CH^COOH/^O (11:5:2:1) ja täplät visualisoitiin fluoresenssin heikentämisen avulla reagoivan aineen määrittämiseksi.

Reagoivien aineiden koostumukset määritettiin kvantitatiivisesti käänteisfaasi-suurpaineliuoskromatografiän avulla (HPLC) käyttäen pylvästä, joka oli RP-8, 10 ^um (Merck) ja Hewlett Packard 1084 kromatograafia, joka oli varustettu muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisimella (malli 79875A). Erotus saatiin aikaan \.

käyttämällä sopivia spesifisiä eluutiojärjestelmien gradientteja : 10 % CHgCN:sta 10 mM Na-asetaatissa, pH 4 100 % CHgCN:iin tai (· 10 mM Na-asetaatista, pH 4, 100 % CHgCN:iin. Viimeksi mainittua järjestelmää käytettiin esim. Bz-Ala-Gly-OH:lie, Bz-Ala-Ala-0H:lle, Bz-Ala-Ser-OH:lie ja niiden vastaaville amideille, vertaa alla. Virtausnopeus oli 3 rnl/min, pylvään lämpötila oli 47°C ja tarkkailulaitteen aallonpituus oli 260 nm. Saannot määritettiin reagoivien aineiden moolisuhteen perusteella, joka saatiin eluutioprofiilin huippujen intergroiduista alueista.

Tuotteiden identifiointi Täplät identifioitiin ohutlevykromatografiän perusteella !' sopivien standardi-yhdisteiden avulla. Monet tuotteet identi- : fioitiin HPLC:n (suurpaineliuoskromatografiän) sekä amino-happoanalyysin yhdistelmän avulla. Tätä tarkoitusta varten reaktioseoksesta otettiin 1 ml:n erät 10 minuutin kuluttua ja , reaktio keskeytettiin lisäämällä 250 ^ul 6 M HCl:a. pH säädet- j tiin sitten 4:ksi Na0H:n avulla ja seos erotettiin HPLC:n avulla käyttäen Watersin laitteistoa, johon kuului kaksi pumppua,

Malli 660 liuotin ohjelmoija, Malli U6K injektori, Malli 450 :

muutuvan aallonpituuden detektori yhdistettynä piirturiin (Radiometer REC 61) tai Hewlett Packardin piirturi/integraattorin Malli 3380A. Eluutiota tarkkailtiin ajamalla spektri sopivalla aallonpituudella 255-280 nm:n välillä. Käytettiin käänteisfaasi-kromatografiaa sekä Waters C-18 ^u-Bondapak-pylvästä, ja eluu- I

tiojärjestelmänä oli TEAP - 20 % (tilav./tilav.) TEAP (trietyy- i7 70597 liammoniumfosfaattipuskuri) metanolissa, ja käytettiin sopivia gradientteja sekä virtausnopeuksia 1,5-2,0 ml/min. TEAP-puskuri valmistettiin Rivierin (viite 17) mukaan. Monissa tapauksissa saatiin riittävä erottuminen aikaan, kun käytettiin järjestelmää, jossa oli 0,1 M etikkahappoa, pH 3-20 % (tilav./tilav.) 0,1 M etikkahappoa, pH 3 metanolissa.

Effluentti, joka sisälsi N-asyylipeptidejä, koottiin käsin ja kuivattiin lyofilisoiden tai Buchi pyöröhaihduttajalla 35-45°C:ssa. Jäännöksestä hydrolysoitiin pieniä näytteitä 6 M HCl:ssa, 110°C:ssa, tyhjössä, 36 tunnin ajan. Haihdutetut hydrolysaatit analysoitiin Durrum D-500 aminohappoanalysaatto-rissa.

Synteesi, jossa käytettiin vapaita aminohappoja amiini-komponentt ina

Esimerkki 1 • ' Ψ 2 ml liuosta, jossa oli 0,6 M valiinia-0,1 M KCl:a - ImM EDTA:a, pH 9,8 sekoitettiin 100 ^ul:n kanssa (0,1 mmoolia) 1 M Bz-Ala-OMe-liuosta (liuotettuna 96 %:iseen etanoliin). Reaktio suoritettiin pH-määrityslaitteessa 35°C:ssa ja pH 9,8:ssa, samalla kun pH-arvo pidettiin vakiona lisäämällä automaattisesti 0,5 M Na0H:a. Reaktio aloitettiin lisäämällä 0,7 mg karboksipepti-daasi Y:tä (150 U/mg, valmistanut De Forenede Bryggerier). 30 minuutin pituisen reaktioajan jälkeen reaktio pysäytettiin säätämällä pH noin yhdeksi 6 M HCl:n avulla. Reaktiotuote puhdistettiin ja eristettiin suurpainekromatografiän avulla. Bz-Ala-Val-0H:n saanto oli 40 %. 6 M HCl:ssa 24 tunnin ajan suoritetun tuotteen hydrolyysin jälkeen kvantitatiivinen aminohappoanalyysi tuotti 1 moolia alaniinia suhteessa 1 mooliin valiinia.

pH:n lämpötilan ja substraatin, amiini-komponentin sekä CPD-Y:n konsentraation vaikutus saantoon yllä esitetyssä reaktiossa: is 70597

Bz-Ala-OMe + H-Val-OH £2¾ Bz-Ala-Val-OH + CH,OH [5] tutkittiin viidessä eri koesarjassa yhdenmukaisesti yllämainitun menetelmän kanssa. Yksi allamainituista parametreistä muuttui kussakin kokeessa, kun muut neljä pidettiin vakiona: 0,6 M väliini, 5 5 mM Bz-Ala-OMe, *+, 5 mM CPD-Y, pH 9,7, 35°C. Tulokset on esitetty kuvassa 1. Kuvan IA perusteella voidaan todeta, että optimi saannolle pH-alue on suhteellisen kapea, ulottuen vain yli 0,5 pH-yksikköä. Kuvasta IB voidaan havaita, että reaktio-lämpötilan kohottaminen aiheutti melkein lineaarisen hydrolyy-sin lisääntymisen suhteellisesti vähäisemmän hydrolyysin perusteella. yli 4-5°C:n lämpötiloissa entsyymin inaktivoitumisesta 'ja ei-entsymaattisesta hydrolyysistä tuli ehkäiseviä tekijöitä.

Alemmissa lämpötiloissa sekä pH-arvoissa aina 10,Oraan saakka esterihydrolyysi oli kielteinen 10 minuutin standardi reaktio-aikana. Tuli kuitenkin ilmeiseksi, että entsymaattisen reaktion nopeus inhiboitui ja vaati 2-5 tunnin pituisen reaktioajan.

Samalla kun Bz-Ala-Val-0H:n saannot lisääntyivät suuremman amiini-komponentin konsentraation myötä (kuva ID), tilanne oli käänteinen saannon ja substraatti-komponentin Bz-Ala-0Me:n konsentraation välillä (kuva 1C). Viimeksi mainittu havainto yhdessä saannon riippuvuuden kanssa suuresta entsyymi-konsentraa-tiosta (kuva IE) viittaa substraatin ja entsyymin konsentraa-tioiden optimi-suhteeseen.

Tyypillisen reaktion aikakäyrä kuvattuna yllämainitun reaktion avulla lähes optimiolosuhteissa on esitetty kuvassa 2.

0,5 M valiinin läsnäollessa substraatti Bz-Ala-0Me muuttui nopeasti (20 minuutissa) 38 %:ksi Bz-Ala-Val-OH:a ja 62 %:ksi Bz-Ala-0H:a. Kuva ilmaisee myös, että dipeptidi ei hydrolysoitunut pH 9,7:ssä valiinin ylimäärän läsnäollessa. Jos pH kuutenkin säädettiin 5-8:ksi, kaikki Bz-Ala-Val-OH hydrolysoitui muutamassa sekunnissa. Tällainen selektiivinen CPD-Y:n käyttäytyminen korkeassa pH:ssa on tärkeä ominaisuus CPD-Y:n käyttökelpoisuuden suhteen peptidi-synteesissä.

i9 70597

Esimerkki 2 2 ml:a liuosta, jossa on 3M lysiiniä - 0,1 M KCl:a - 1 mM EDTA:a, sekoitettiin 400 ^ul:n kanssa 100 %:ista metanolia sekä 100 ^ul:n kanssa (0,1 mmoolia) 1 M Z-Phe-0Me:a (liuotettuna 100 %: iseen metanoliin). Reaktio suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja aloitettiin lisäämällä 0,7 mg karboksipeptidaasi-Y:a.

30 minuutin pituisen reaktioajan kuluttua, pH säädettiin yhdeksi 6 M HCl:lla. Reaktiotuote puhdistettiin ja eristettiin suurpaine-kromatografiän avulla. Z-Phe-Ly-0H:n saanto oli 60 %. Kvantitatiivisen aminohappo-analyysin perusteella, kuten on kuvattu esimerkissä 1, tuote sisälsi suhteellisesti 1,0 moolia lysiiniä ja 1,0 moolia fenyylialaniinia.

Yhdenmukaisesti esimerkkien 1 ja 2 kanssa valmistettiin taulukossa I mainitut peptidit mainituista lähtöaineista. Kokeet suoritettiin Radiometer pH-laitteessa (pH-stat) ja saannot määritettiin HPCL:n avulla (kts. edellä). Olosuhteet olivat 4,5 ^,uM CPD-Y:a; pH 9,7 ja 35°C.

Taulukko I

20 70597

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi vapaiden aminohappojen ollessa amiini-komponenttina.

Substraatti Amiini-komponentti Tuote Saanto % (kons.) (konsentraatio)

Bz-Ala-OMe Glysiini (3,0 H) Bz-Ala-Gly-OH 62 (55 mM) Alaniini (1,9 M) Bz-Ala-Ala-OH 65 Väliini (0,6 M) Bz-Ala-Val-OH 40 (Esim. 1)

Leusiini (0,17 M) Bz-Ala-Leu-OH 24

Fenyylialaniini Bz-Ala-Phe-OH 27 (0,16 H)

Seriini (3,2 M) Bz-Ala-Ser-OH 50

Treoniini (0,7 M) Bz-Ala-Thr-OH 24

Metioniini (0,6 M) Bz-Ala-Met-OH 46

Lysiini (1,5 H) Bz-Ala-Lys-OH 56

Arginiini (0,8 M) Bz-Ala-Arg-OH 26

Asparagiinihappo Bz-Ala-Asp-OH 0 (1,0 M)

Asparagiini (0,6 M) Bz-Ala-Asn-OH 5

GlutamiinihapDO Bz-Ala-Glu-0H 0 (1,2 M)

Glutamiinihappo- Bz-Ala- 30

Y-metyyliesteri Glu(0Me)-0H

__(1,0 M)____

Bz-Ala-OMe Isoleusiini (0,15 M) Bz-Ala-Ile-OH 40 (50 mM) Glutamiini (0,5 M) Bz-Ala-Gln-OH 20

Asparagiinihappo- Bz-Ala- 30 t-butyyliesteri Asp(O-Z-Bu)-

(0,3 M) OH

Tryptofaani (0,05 M) Bz-Ala-Trp-OH 10

Histidiini (1,0 M) Bz-Ala-His-OH 15 Z-Phe-OMe Väliini (0,6 M) Z-Phe-Val-OH 6 (55 mM}

Lysiini (3,0 M) Z-Phe-Lys-OH 60 ____(Ex. 2)__

Bz-Phe- Väliini (0,6 M) Bz-Phe-Gly- 40

Gly-OMe Val-OH

(30 mM) • .- 1 .......---1 * 1 1 1 -------- 1Γ

Taulukko I (jatkoa) 2i 70597 * .... .... — —..... γ . . ...

Substraatti Amiini-komponentti Tuote Saanto % (kons.) (konsentraatio) Z-Ala-OMe Glysiini (2,0 M) Z-Ala-Gly-OH 30 (1U mM) Alaniini (0,7 M) Z-Ala-Ala-OH 60

Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Leu-OH 21

Lysiini (1,5 H) Z-Ala-Lys-OH 60

Bz-Gly-OMe Glysiini (2,0 M) Bz-Gly-Gly-OH 63 (20 mM) Leusi-ini (0,15 M) Bz-Gly-Leu-OH 21

Bz-Tyr-OEt Väliini (0,5 M) Bz-Tyr-Val-OH 30 (25 mM) Alaniini (1,9 M) Bz-Tyr-Ala-OH 46

Arginiini (0,8 M) Bz-Tyr-Arg-OH 35

. I. —Pl.· Il I I .1 I I — .1-1- I .1 —— — I — M II· .. I— I I I

Ac-Phe-OEt Alaniini (0,8 M) Ac-Phe-Ala-OH 85 (50 mM)____ Z-Ala-Ala- Glysiini (2,0 M) Z-Ala-Ala-Gly- 40

OMe (10 mM) OH

Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Ala-Leu- 0

OH

Fenyylialaniini Z-Ala-Ala-Phe- 0

(0,15 M) OH

a. ----- . ...... .—— Z-Ala-Phe- Glysiini (2,0 M) Z-Ala-Phe-Gly- 35

OMe (10 mM) OH

Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Phe-Leu- 0 ____OH__ Z-Ala-Ser- Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Ser-Leu- 40

OMe (10 mM) OH

Z-Ala-Val- Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Val-Leu- 25

OMe (10 mM) OH

Lysiini (1,5 M) Z-Alu-Val-Lys- 60 ____OH__ Z-Ala-NLeu- Glysiini (2,0 M) Z-Ala-NLeu-Gly- 60

OMe (10 mM) OH

Leusiini (0,15 M) Z-Ala-NLeu-Leu- 16 ^___22__ Z-Ala-Met- Glysiini (2,0 M) Z-Ala-Met-Gly- 50

OMe (10 mM) OH

Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Met-Leu- 15 ____OH__ Z-Ala-Trp- Glysiini (2,0 M) Z-Ala-Trp-Gly- 23

OMe (10 mM) OH

Leusiini (0,15 M) Z-Ala-Trp-Leu- 3 __'_ OH__

Taulukko I (jatkoa) 22 70597

Substraatti Amiini·-komponentti (kons.) (konsentraatio) Tuote Saanto % Z-Ala-Trp- Fenyylialaniini (0,15 M) Z-Ala-Trp- 0

OMe Phe-OH

(10 mM) Lysiini (1,5 M) Z-Ala-Trp- 36 ____Lys-OH__ Z-Ala-Ala- Leusiini (0,15 M) Z-Ala-AI a- 0

Tyr-OMe Tyr-Lcu-OH

(10 mM) Lysiini (1,5 M) Z-Ala-Ala- 23

Tyr-Lys-OH

• Alaniini (1,7 M) Z-Ala-Ala- 31 __Tyr-Ala-OH__ 23 70597

Synteesi aminohappoamidit amiini-komponenttina

Esimerkki 3.

2 ml:a liuosta, jossa on 0,6 M metioniiniamidia (Met-NH^)-0,1 M KCl:a - 1 mM EDTA:a, pH 9,8, sekoitettiin 100 ^ul:n kanssa (0,1 mmoolia) 1 M Bz-Ala-0Me liuosta 96 %:isessa metanolissa.

Reaktio suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja aloitettiin lisäämällä 0,7 mg karboksipeptidaasi-Y:a. 30 minuutin pituisen reaktioajan kuluttua, pH säädettiin yhdeksi 6 M HCl:lla. Reaktiotuote puhdistettiin ja eristettiin suurpainekromatografiän avulla. Bz-Ala-Met-NH2:n saanto oli 95 %. Esimerkissä 1 kuvatun kvantitatiivisen aminohappoanalyysin perusteella tuote sisälsi suhteellisesti 1,0 moolia Ala, 1,0 moolia Met sekä 1,0 moolia nh3.

Reaktion kulku on esitetty kuvassa 3, josta käy ilmi, että 20 minuutin kuluessa substraatti on muuttunut lähes täydellisesti noin 95 prosentiksi dipeptidiä, 5 %:a on tällöin hydrolysoitunut Bz-Ala-0H:ksi.

Esimerkki H

2 ml liuosta, jossa on 0,4 M valiiniamidia (Val-NH2)-0,1 M KCl:a - 1 mM EDTA:a, pH 9,5, sekoitettiin 100 ^ulin (0,1 mmoolia) kanssa 1 M Bz-Ala-OMe-liuosta 96 %:isessa etanolissa.

Reaktio suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Reaktion tuote Bz-Ala-Val-NH^ saostui reaktion kuluessa. 20 minuutin kuluttua reaktion pH säädettiin yhdeksi ja saostuma eristettiin sentrifugoiden. Tuote liuotettiin 1 ml:aan 96 %:ista etanolia ja puhdistettiin ja eristettiin korkeapainekromatografiän avulla. Bz-Ala-Val-NH2:n saanto oli 95 %, kun taas, kuten on esitetty esimerkissä 1, se oli vain 40 %, kun vapaata happoa käytettiin amiini-komponenttina. Kvantitatiivinen aminohappoanalyysi, kuten on kuvattu esimerkissä 1, ilmaisi tuotteen suhteellisesti sisältävän 1,0 moolia Ala, 1,0 moolia Vai ja 1,0 moolia NH3> 2,4 70597

Kuvassa 4 on esitetty reaktiosekvenssin riippuvuus pH:sta sekä valiiniamidin konsentraatiosta. Reaktio suoritettiin yhdenmukaisesti ylläesitetyn synteesin kanssa, jolloin vakio parametrit olivat: valiiniamidi 0,6 M, Bz-Ala-OMe 55 mM, CPD-Y 4,5 ^uM, pH 9,7 , 35°C.

Kuvasta 4B on nähtävissä, että saanto on oleellisesti epä-herkkä valiiniamidin konsentraation vaihtelulle vastakohtana kuvalle ID, mikä ilmaisee saannon valiinikonsentraation vaihdellessa, vähintään ekvimolaariseen tai korkeampaan kuin substraatti-konsentraatio (55 mM).

Kuvasta 4A on nähtävissä, että valiiniamidin tehokas pH-alue yltää pH 9,Oraan, jossa on terävä yläraja pH 9,8:ssa, jonka yläpuolella saanto vähenee voimakkaasti.

Yhdenmukaisesti esimerkkien 3 ja 4 kanssa valmistettiin mainituista lähtöaineista peptidit, jotka on lueteltu taulukossa II. Kokeet suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 4,5 ^uM CPD-Y; pH 9,5 ja 35°C, kun taas substraatti-konsentraatio on mainittu taulukossa.

li 25 70597

Taulukko II

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi aminohappoamidit amiini-komponenttina.

Substraatti Amiini-kanponentti ^ o a. a.

(kone.) (konsentraSio)__^uote__Saant° 4

Bz-Ala-OMe Glysiiniamidi (0,3 M) Bz-Ala-Gly-NH2 90 (55 mM) Seriiniamidi (0,3 M) Bz-Ala-Ser-NH2 90

Valiiniamidi (0,4 H) Bz-Ala-Val-NH2 95 (esim. 4)

Leusiiniamidi (0,3 M) Bz-Ala-Leu-NH2 85

Metioniiniamidi (0,6 M) Bz-Ala-Met-NH2 95 (esim. 3)

Fenyylialaniiniamidi Bz-Ala-Phe-NHp 90^ (0,3 M) '

Tyrosiiniamidi (0,6 M) Bz-Ala-Tyr-NH2 90

Asparagiiniamidi (0,3 M) Bz-Ala-Asn-NH2 8Ö

Proliiniamidi (0,3 M) Bz-Ala-Pro-NH2 0

Glutamiinihappoamidi Bz-Ala-Glu-NH0 0 (0,25 H) ^

Histidiiniamidi (0,2 M) Bz-Ala-His-NH2 89

Treoniiniamidi (0,2 M) Bz-Ala-Thr-NH2 88 Z-Phe-OMe Valiiniamidi (0,5 M) Z-Phe-Val-NH2 97b' (55 niM) Seriiniamidi (0,4 M) Z-Phe-Ser-NH2 60

Tyrosiiniamidi (0,4 M) Z-Phe-Tyr-NH2 64

Bz-Phe- Valiiniamidi (0,4 M) Bz-Phe-Gly-Val- 90

Gly-OMe NH? (30 mM)_____ Z-Phe-Ala- Valiiniamidi (0,4 M) Z-Phe-Ala-Val- qob) OMe NH2 * (20 mM) Glysiiniamidi (0,4 M) Z-Phe-Ala-Gly- 95 nh2

Histidiiniamidi (0,4 M) . Z-Phe-Ala-His- 50 __1NH2__ b) Tuote saostunut

Taulukko II (j atkoa) 26 70597

Substraatti Amiini-komponentti „ 0 . α (tons.) Ctonsentraatio) ^ote Sasnt° 1 Z-Lcu-Gly- Valiiniamidi ¢0-.4- M) . Z-Leu-Gly-Gly- 80

Gly-OEt Val-NH2 (10 mM)___:__

Bz-Tyr-OEt Valiiniamidi (0,25 M) Bz-Tyr-Val-NH2 94 (50 mM) Glysiiniamidi (0,55 M) Bz-Tyr-Gly-NH2 82 Z-Ala-OMe Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Leu-NH2 90 (10 mM) Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Gly-NH2 20

Bz-Arg-0Et Lysiiniamidi (0,2 M) Bz-Arg-Tyr-NHp 52 (75 mM)___f__

Bz-Tyr-OEt Valiiniamidi (0,25 M) Bz-Tyr-Val-NH2 94 (50mM) Glvsiimamidi (0.55 M) Bz-Tyr-Gly-NH2 82

Z(50°mM)le Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Pro~Leu-NH2 O

Β?ΐηηΥ"Μ^θ Histidiiniamidi (0,2 M) Bz-Gly-His-NH2 20

Glysiiniamidi (0,55 M) Bz-Gly-Gly-NH2 95

Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH2 95 Z-Ala-Phe- Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Phe—Leu— 95 OMe NH2 ^ ^ ^ Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Phe-Gly- 84 nh2 Z-Ala-Ala- Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Ala-Gly- 100 OMe NH2 (10 mM) Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Ala-Leu- 100 nh2 Z-Ala-Ser- Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Ser-Leu- 95 OMe NH2 (10 mM) Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Ser-Gly- 70 nh2 nMAla“Val" Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Val-Leu- 84 OMe NH2

Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Val-Gly- 100 __ I NH2__ 2’ 70597

Taulukko II (jatkoa)

Subsraatti AnrLini-komponentti (kons.) (konsentraatio) Tuote Saanto % Z-Ala-NLeu- Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-NLeu- 100 OMe Leu-NH2 (10 mM) Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-NLeu- 100

Gly-NH2 Z-Ala-Met- Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Met-Gly- 95 OMe NHp (.10 mM)___f__ Z-Ala-Trp- Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Trp-Gly- 84 OMe NH2 (10 mM) Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Trp-Leu- 89 nh2 oZ-r-pr°- Vaiiiniamidi (0,2 M) Z-Thr-Pro-Val- 95 (25 mM)___f__ Z-Ala-Ala- Glysiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Ala-Tyr- 100

Tyr-OMe Gly-NH2 (10 mM) Leusiiniamidi (0,15 M) Z-Ala-Ala-Tyr- 100

Leu-NH2 Z-Tyr-Gly- Fenyylialaniiniamidi Z-Tyr-Gly-Gly- 40

Gly-OMe (0,2 M) Phe-NH? (20 mM) _f__ 28 7 0 5 9 7

Esimerkki 5

Synteesi aminohappohydratsidit amiini-komponenttina

Yhdenmukaisesti esimerkkien 3 ja 4 kanssa valmistettiin taulukossa III esitetyt peptidit mainituista lähtöaineista. Kokeet suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 4,5 ^.uM CPD-Y, pH 9,6 ja 35°C.

Taulukko III

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi aminohappohydratsidit amiini-komponenttina

Substraatti Amiini-komponentti _ . _ ^ „ (kons.) (konsentr^tio)__^__Saanto %

Bz-Ala-OMe Alaniinihydratsidi Bz-Ala-Ala-NH- 37 (55 mM) (0 6 M) NH2 .. . Bz-Ala-Phe-NH- 80

Fenyylialaniim-hydratsidi mu __(0,3 M)_ 2_;_

Esimerkki 6

Synteesi aminohappoesterit amiini-komponenttina

Aminohappoestereiden avulla kokeet suoritettiin yhdenmukaisesti esimerkkien 1, 2, 3 ja 4 kanssa Radiometer pH-lait-teessa pH 9,0-9,7:ssä sekä 23-35°C:ssa. Tuotteet ja saannot määritettiin HPLC:n avulla. CPD-Y:n konsentraatio oli 4,5 - 11 ^uM.

Taulukko IV esittää mainituista lähtöaineista tuotetut peptidit.

On nähtävissä, että joissakin tapauksissa on saatu tiettyä oligomerisoitumista. Koska saannot ovat yleensä hyvin korkeat, aminohappoesterit näyttävät erittäin käyttökelpoisilta, jos oligomerisoitumista voidaan edelleen rajoittaa.

29 7 0 5 9 7

Taulukko IV

Karboksipeptidaasi-Y:n. katalysoima peptidien synteesi aminohappoesterit amiini-komponenttina.

Substraatti I AmiM-kc^jonentti ^ Saarto j C kons.) (konsentraatio) ...... r \

Bz-Ala-OMe Glysiimetyyliestem ( Bz-Ala-Gly-OH j (50 mM) (0.5 M) J Bz„Ala_Gly_ l 100

l^Gly-OH J

Glysiinipropyyliesteri Bz-Alu-Gly-OH 85 (0,5 M)

Glysiini-isopropyylieste- Bz-Ala-Gly-OH 90 ri (0,5 M)

Glysiinibutyyliesteri Bz-Ala-Gly-OH 80 (0,5 M) fBz-Ala-Leu-OH Λ Bz-Ala-Leu-Leu-

Leusiinimetyyliesteri J OH I 85 (0,25 M) | Bz-Ala-Leu-Leu-

Leu-OH

Bz-Ala-Leu-Leu-

(^Leu-Leu-OH

Leusiinietyyliesteri - f Bz-Ala-Leu-OH Λ C0,2S M) ! Bz-Alo-Leu-Leu-i 50

L0il J

Leusiini-t-butyyliesteri Bz-Ala-Leu-OH 0 (0,25 M) | Bz-Ala-Phe-OH '"l

Fenyylialaniinimetyyli- ) Bz-Ala-Phe-Phe- esteri (0,25 M) Λ OH ” 80 / Bz-Ala-Phe-Phe-

[_Phe-0H J

Taulukko IV (jatkoa) 70597 30

Substraatti Ani ini-komponentt i (kons.) (konsentraatio) Tuote Saanto s

Dz-Ala-OMe Fenyylialaniinietyyli- 4Bz-A1 a-Phc-OH (50 mM) esteri (0,15 M) ) Bz-Ma-Phe- 70

[Plic-OH J

Glutamiinihappo (jf-t- but)-metyyliesteri (V-t.--Bu)--0H 35 (0,5 M)

Glutamiinihappo (f-t-bu) Bz-Ala-Glu 0

t-butyyliesteri (0,25 M) w -t-Bu)-0H

fBz-Ala-Met-OH Λ Bz-Ala-Met-

w . .. . . ‘ Met-OH

Metionxinimetyyliesteri J

(0,2 M) \ Bz-A] a-Met- y 86

Met-Met-OH f

Bz-Ala-Met-.

Met-Met-Met-OH

Bz-Ala-Met-Mei-Met-Met-yMet-OH J

Metioniinietyyliesteri Bz-Ala-Met-OH 40 (0,2 M)

Metioniini-isopropyyli- Bz-Ala-Met-OH 8 esteri (0,2 M)

Valiinimetyyliesteri fBz-Ala-Val-OH ~) <0’7M) | Bz-Ala-Val- f 85

|^Val-0H J

Seriinimetyyliesteri Bz-Ala-Ser-OH 50 (0,5 M)

Tyrosiiriimetyyliesteri Bz-Ala-Tyr-OH 25 (0,5 M)

Arginiinimetyyliesteri Bz-Ala-Arg-OH O

(0,5 M)

Arginiini (N0„) metyyli- Bz-Ala-Arg(NOp)- 40

esteri (0,5 M) OH

Hist idiinimetyy lies teri Bz-Ala-His-0H 26 (0,5 M)

Treoniinimetyyliesteri Bz-Ala-Thr-OH 47 __(0,5 M)_____ 3i 70597

Taulukko IV (jatkoa)

Substraatti Amiini-komponentti . _ . „ (tons.) (tonsentraitio) Tuote Saanto ‘

Ac-Pbc-OEt Alaniinimetyyliesteri Ac-Phe-Ala-OH

(50 mM) (0,5 M) Ac-Phe-Ala- 60 _____Al.a-OH___

Bz-Gly-OMe Alaniinimetyyliesteri Bz-Gly-His-OH AO

(50 mM)_ (Q,5_M)_____ ___

Esimerkki 7

Aminokomponentin L- ja D-stereoisomeerit

Yhdenmukaisesti esimerkkien 1, 2,3, 4 ja 6 kanssa valmistettiin taulukossa V mainitut peptidit luetelluista lähtöaineista.

Havaitaan ainoastaan L-isomeerien liittyneen kokonaisuudeksi. Tämä on erittäin mielenkiintoinen seikka taloudelliselta kannalta, koska täten ei ole välttämätöntä puhdistaa lähtöaineena käytettyjä aminohappoja puhtaan L-isomeerin saamiseksi.

Taulukko V

32 7 0 5 9 7

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi, kun L- ja D-isomeerit ovat amiini-komponenttina.

Substraatti Amiini-komponentti _ Saanto % (tons.) (konsentraatio)__°te iL-isoneerJ D-iscmseri

Bz-Ala-OMe Väliini (0 6 M) Bz-Ala-Val- 42 0

(50 mM) ' OH

Alaniini (i*8 M) Bz—Ala-Ala— 65 0

OH

Bz-Tyr-OEt Väliini (0.6 M) Bz-Tyr-Val- 50 0

(30 mM) OH

Alaniini (1.8 M) Bz-Tyr-Ala- 46 0

OH

Bz-Ala-0Me Val-NH? (0.25 M) Bz-Ala-Val- 78 0 (50 mM) ^ NH2

Bz-Tyr-0Et Val-NH- (0.25 M) Bz-Tyr-Val- 95 0 (30 mM) ^ NH2

Ac-Phe-OEt Ala-OMe (0.5 M) ^Ac-Phe-Ala-) (50 mM) ΙΟΗ / 60 o .

lAc-Phe- [

((Ala)2-0H J

* 33 7 0 5 9 7

Esimerkki 8

Substraattiesteri-ryhmän vaihtelu

Yhdenmukaisesti esimerkkien 1, 2, 3 ja 4 kanssa tuotettiin taulukossa VI mainitut peptidit luetteloiduista lähtöaineista .

Tulokset osoittavat keksinnön mukaisen menetelmän joustavuuden käyttökelpoisten substraattien suhteen.

Taulukko VI

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoiman peptidien synteesin saanto erilaisten esteri-ryhmien liittyessä substraatti-komponenttiin.

Substraatti

Bz-Gly-OMe Bz-Gly-OEt Bz-Gly-OiPr Bz-Gly-OBz (20'"M) pao-H) <20mM>

Glysiini 63 56 45 47 (2,0 M)______

Glysiiniamidi 59 95 88 91 (0.15 M)_ ____

Leusiini 21 59 74 80 (0.15 M)____;__

Leusiiniamidi 95 100 95 95 (0.15 M)___L_ su 70597

Esimerkki 9

Depsipeptidit substraatteina

Yhdenmukaisesti esimerkkien 3 ja 4 kanssa valmistettiin luetelluista lähtöaineista taulukossa VII mainitut peptidit. Olosuhteet olivat 4,5 /jM CPD-Y, pH = 7,6 ja 25°C.

On odotettavissa, että saadaan erittäin suuret saannot.

Taulukko VII

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi depsipeptidit substraatti-komponentteina.

Substraatti Amiini-komponentti Tuote Saanto % (kons.) (konsentraatio)

Bz-Gly-OGly Glysiiniamidi (0,25 li) Bz-Gly-Gly-NH^ 90 (20 mM) Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH^ 95

Fenyylialaniiniamidi Bz-Gly-Phe-NH„ 95 __(0,25 M)_______

Bz-Gly-OPhe Glysiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Gly-NH^ 95 (20 mM) Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH^ 95

Fenyylialaniiniamidi Bz-Gly-Phe-NH0 95 __(0,25 M)_______

Bz-Phe-OGly Glysiiniamidi (0,25 M) Bz-Phe-Gly-NH2 90 (20 mM) Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Phe-Leu-NH^ 80

Fenyylialaniiniamidi Bz-Phe-Phe-NH9 80 ___(0,25 M)______

Bz-Gly-OAla Glysiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Gly-NH» 95 ( O | TT) M }

Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH2 95 35 70597

Esimerkki 10

Peptidit substraatti-komponentteina

Yhdenmukaisesti esimerkkien 1, 2, 3 ja 4 kanssa tuotettiin taulukossa VIII mainitut peptidit. Kokeet suoritettiin Radiometer pH-laitteessa ja saannot määritettiin HPLCrn avulla.

Olosuhteet olivat 4-25 ^jM CPD-Y, pH = 7,6 ja 25°C.

Taulukko VIII

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi peptidit substraatteina.

Substraatti Amiini-komponentti Tuote Saanto % (kons.) (konsentraatio)

Bz-Phe-Gly Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Phe-Leu-NH„ 90 (20 mM)______

Bz-Gly-Phe Leusiiniamidi (0,25 M) Bz-Gly-Leu-NH„ 10 (20 mM)___l__ Z-Ala-Ala Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Ala-Ala-NH„ 74 (20 mM)_ 1 Z-Phe-Ala Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Phe-Leu-NH9 60 (20 mM) 1 Z-Phe-Ser Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Phe-Leu-NH? "0 (20 mM)_

Z-Ala-Gly Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Ala-Leu-NH,. SO

(10 mM) Z

Ac-(Ala)Leusiiniamidi (0,25 M) Ac-(Ala)2-Leu- 70 (10 mM) " NH?_

Ac-(Ala)u Leusiiniamidi (0,25 M) Ac-(Ala)^-Leu- 70 (10 mM) 4 NH?_ Z-Ala-Val Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Ala-Leu-NH9 10 (10 mM) U. .......- ------ Z-Phe-Phe Leusiiniamidi (0,25 M) Z-Phe-Leu-NH2 10 36 70597

Peptidisynteesi pH:n funktiona

Niissä tapauksissa, jolloin syntetisoitu peptidi on huono CPD-Y:n substraatti, synteesi saatetaan suorittaa pH-arvoissa, jotka ovat alapuolella parempana pidettyjen pH-arvojen 9-10,5.

Esimerkki 11 ^

Yhdenmukaisesti esimerkkien 1 ja 3 kanssa taulukossa IX luetellut peptidit tuotettiin pH-laitteessa luetelluissa pH-ar-voissa.

Olosuhteet olivat 15 ^uM CPD-Y:a ja 25°C.

Taulukko IX

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi pH:n funktiona.

Substraatti Amiini-komponentti 1 -τ. , pH 0 ^ .

(kons.) (konsentraitio) Saanto»

Bz-Ala-OMe Glysiini (1,3 M) Bz-Ala-Gly 9,5 40 (50 mM) 57 8,0 60 7,0 61 6,0 60 ___5,0 51

Glysiiniamidi Bz-Ala-Gly- 9,5 77 (1,3 M) NH2 9,0 95 8,0 100 7,0 97 __;_6,0 44 37 70597

Muut erilaiset amiini-komponentit

Esimerkki 12 »

Yhdenmukaisesti esimerkkien 3 ja 4 kanssa valmistettiin taulukossa X luetellut peptidit. Kokeet suoritettiin pH-laittees-sa ja saannot määritettiin HPLC:lla. Olosuhteet olivat 4,5 ^uM CPD-Y, pH 9,5 ja 25°C.

Taulukko X

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi eri aminohappo-johdannaiset amiini-komponentteina.

Substraatti Amiini-komponentti (kons.) (konsentraatio) Tuote Saanto %

Bz-Ala-OMe ft -alaniiniamidi (0,2 M) Bz-Ala-pAla- 80 (30 rnM) NH2

Glysiinihydroksaamihappo Bz-Ala-Gly- 45

(0,2 M) NH-OH

D,L-alaniinihydroksaamihap- Bz-Ala-Ala- 40

po (0S2M) NH-OH

Glysiini-N-metyyliamidi Bz-Ala-Gly-NH-CH 20 (0,50 M) 3 38 7 0 5 9 7

Esimerkki 13

Peptidien synteesi ohran karboksipeptidaasien avulla

Itävä ohra, esim. maltaiden muodossa, sisältää kaksi eri peptidaasia, jotka on nimitetty CP-l-l:ksi ja CP-2-l:ksi (katso Lee E. Ray, Carlsberg Res. Comm. 41, 169-182 (1976)).

CP-1-1 ja CP-2-1 eristettiin L.E. Rayn kuvaamalla tavalla ja taulukossa XI luetellut peptidit tuotettiin mainituista lähtöaineista yhdenmukaisesti esimerkkien 1, 2, 3 ja H kanssa. Olosuhteet olivat 6 ^uM CP-1-1 tai CP-2-1, pH 8,0 ja 25°C.

Taulukko XI

Peptidien synteesi käyttäen itävästä ohrasta CP-1-1 ja CP-2-1 saatuja karboksipeptidaaseja.

Substraatti Amiini-komponentti (kons.) (konsentraatio) Tuote Saanto % Entsyymi

Bz-Ala-OMe Valiiniamidi Bz-Ala-Val- 43 CP-1-1 (30 inM) (0,25 M) NH2

Alaniiniamidi Bz-Ala-Ala- 58 CP-1-1 .(0,25 M). NH2

Lysiini (1,7 M) Bz-AI a-Ly s 11 CP-1-1

Valiiniamidi Bz-Ala-Val- - 57 CP-2-1 (0,25 M) NH2

Alaniiniamidi Bz-Ala-Ala- 64 CP-2-1 (0,25 M) NH2 __Lysiini (1,7 M)__Bz-Ala-Lys 11_CP-2-1 39 7 0 5 9 7

Esimerkki m

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidiamidien amidoryhmän lohkaisu

Liuokseen, jossa oli 2 ml 15 mM Bz-Ala-Leu-NH2 0,1 M KC1-1 mM EDTA:ssa, pH 9,7, 25°C sekä 10 % dimetyyliformamidia lisättiin 2 mg CPD-Y:a. Reaktion kulkua, kuten kuvassa 5 on esitetty, seurattiin HPLC:n avulla, esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. On nähtävissä, että Bz-Ala-Leu-NH^ muuttui 20 minuutin kuluttua täydellisesti noin 68 %:ksi Bz-Ala-Leu-OH:a ja 32 %:ksi Bz-Ala-0H:a. Reaktioseoksen aminohappoanalyysi osoitti, että Bz-Ala-OH muodostui pääasiassa lohkaisemalla Leu-NH2 Bz-Ala-Leu-NH2:sta.

Esimerkki 15

Vertailu N-terminaalisia suojaavia ryhmiä sisältävien peptidiesteri-substraattien sekä peptidiesteri-substraattien välillä, joissa ei ole N-terminaalisia suojaavia ryhmiä. Yhdenmukaisesti esimerkkien 3 ja 4 kanssa valmistettiin taulukossa XII lueteltuja peptidejä allamainituissa olosuhteissa: 50 mM substraattia, 5 ^uM CPD-Y:a, pH 9,5 ja 25°C.

Taulukko XII

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoiman peptidien synteesin vertailu, kun substtraattina käytetään peptidiestereitä, joissa on N-terminaalisia suojaavia ryhmiä ja peptidiestereitä, joista suojaavat ryhmät puuttuvat.

Substraatti Amiini-komponentti (kons.) (konsentraatio) ° tuote Saanto %

Ac-Ala-Ala- Leusiiniamidi (0,15 M) Ac-Ala-Ala- 90

Ala-OMe Ala-Leu-NH? (50 mM)

Ala-Ala-, Leusiiniamidi (0,15 M) Ala-Ala-Ala- 75

Ala-OMe Leu-NHp (50 mM)_____._____________‘__ 70597

Esimerkki 16

Synteesi orgaanisten liuottimien läsnäollessa

Yhdenmukaisesti esimerkkien 1, 2, 3, 4 ja 6 kanssa valmistettiin alla esitetyissä taulukoissa XIII, XIV sekä XV luetellut peptidit mainituista lähtöaineista käyttäen esitettyjä orgaanisten liuottimien konsentraatioita.

Olosuhteet olivat: 50 mM substraattia, 5 mM CPD-Y:a, pH 9,6 ja 30°C.

Taulukko XIII

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi 50 mM Bz-Ala-OMe substraattina ja vapaat aminohapot amiinikom-ponenttina, liuoksessa, jossa ei ole metanolia tai jossa on 20 % metanolia (MeOH), 0,1 M KCl:a, 1 mM EDTAra.

Amiini-komponentti _Saanto %. __ (konsentraatio) Tuote Ilman Me0H:n

MeOH:a kanssa Väliini (0,6 M) Bz-ΑΊ a-Val-OH 42 53

Treoniini (1,2 M) Bz-Ala-Thr-OH 52 61

Fenyylialaniini Bz-Ala-Phe-OH 16 18 (0,16 M)

Leusiini (0,16 M) Bz-A] a-Leu-OH 33 39

Metioniini (0,6 M) Bz-Ala-Met-OH 42 64

Glysiini (3,0 M) Bz-Ala-Gly-OH 55 50

Seriini (3,2 M) Bz-Ala-Ser-OH 50 52

Lysiini (1,5 M) Bz-Ala-Lys-OH 53 41

Glutamiinihappohapot f- Bz-Ala^Glu 54 55

t-butyyliesteri (1,0 M) ^ -OBu -)-OH

Asparagiini (0,6 M) Bz-Ala-Asn-OH 18 14

Taulukko XIV

hi 70597

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima Bz-Ala-THr-0H:n synteesi Bz-Ala-OMe:stä (50 mM) ja treoniinista käyttäen vaihtele-via polyetyleeniglykoli-300:n (PEG-300) konsentraatioita. Olosuhteet: CPD-Y 4 ^uM, pH 9,6 ja 25°C.

% PEG-300 Treoniinin % Saanto 0,1 M KCl:ssa Konsentraatio Bz-Ala-Thr-OH ___ 0 0.7 M 36 10 0.7 M 34 20 0.7 M 31 30 0.7 M 29 AO 0.35 M 2-8

Taulukko XV

Karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi 50 mM Bz-Ala-OMe:stä ja luetelluista aminohappoestereistä, jotka toimivat amiinikomponentteina, 30 % polyetyleeniglykoli-0,1 M KC1, 1 mM EDTA:ssa. Muut olosuhteet olivat: CPD-Y = 8 ^.uM, pH 9,6 ja 25°C.

Substraatti Amiini-komponentti (kons.) (konsentraatio) Tuote Saanto %

Bz-Ala-OMe Valiini-OMe (0,5 M) Bz-Ala-Val-OH Ί 88

(50 mM) Bz-Ala-Val- J

Val-OH J

Seriini-OMe (0,5 M) Bz-Ala-Ser OH 30

Glutamiinihappo (l^-OBu^) Bz-AlarGlu- 38

-OMe (0,5 M) b-OBur)-OH

Fenyylialaniini-OMe (Bz-Ala-Phc-OH Ί (0,5 M) )_ ... _i 82 \Bz-Ala-Phc- /Phe-OH ) -2 70597

Taulukko XV (jatkoa)

Subsraatti ^im-tomponentti . Saanto % (kons.) (konsentraatio) __________

Bz-Ala-OMe L-metioniini-OMe /Bz-Ala-Met-OH Ί (50 mM) (0,5 M) ) Bz-Ala-Met- ) 05

jMet-OH

f Bz-Ala-Mct-(^Mct-Mct-OH J

D-metioniini-OMe Bz-Ala-D-Met-OH 0 (0,5 M) ____J__

Esimerkki 17

Liukenematon (liikkumaton) karboksipeptidaasi-Y

CPD-Y sidotiin Concanavalin A-Sepharose 4B:hen (Pharmacia Fine Chemicals), jolloin tapahtui ristiliittyminen CPD-Y:n ja Concanavalin A:n välillä glutaraldehydin avulla kuten Hsiao ja Royer ovat kuvanneet (Archives of Biochemistry and Biophysics, osa 198, 379-385 (1979). CPD-Y:n konsentraatio oli 3 mg per ml pakattua Sepharosea,

Taulukossa XVI lueteltuja peptidejä tuotettiin yhdenmukaisesti esimerkkien 1 ja 3 kanssa seuraavissa olosuhteissa: 50 mM substraattia, 0,25 ml CPD-Y geeliä (5 ^uM CPD-Y:ä), pH 9,7 ja 35°C. Suodattamalla suoritetun entsyymin poistamisen jälkeen tuotteet ja saannot määritettiin HPLC:n avulla.

70597

Taulukko XVI

Liukenemattoman karboksipeptidaasi-Y:n katalysoima peptidien synteesi

Substraatti Amiini-komponentti Tuote Saanto % (kons.) (konsentraatio)

Bz-Ala-OKe Fenyylialaniini Bz-Ala-Phe 21 (50 mM) (0,15 M)

Leusiiniamidi Bz-Ala-Leu-NH~ 91 (0,2 M)

Esimerkki 18

Peptidiamidit substraatteina

Liuosta, jossa oli 5 mm Bz-Ala-Leu-NH2 ·’ta 0,1 H KC1 - 1 mm EDTA ja 10 % dimetyyliformamidia, pH 10,0, 25°C, sekoitettiin 0,25 H valiiniamidin kanssa.

Reaktio aloitetttiin lisäämällä 10 ^m CPD-Y:tä ja suoritettiin esimerkeissä 3 ja 4 kuvatulla tavalla. Bz-Ala-Leu-Val-NH„ eristet-tiin HPLC:llä ja saanto oli 65 %.

Reaktio toistettiin käyttämällä 5 mm Bz-Ala-Phe-NH2:ta subs-traattikomponenttina. Bz-Ala-Phe-Val-NH2 eristettiin HPLC:llä ja saanto oli 41 %.

Esimerkki 19

Met-enkefaliinin synteesi

Met-enkefaliinin vaiheittainen synteesi lähtien 5 g:sta Bz-Arg-OEt ja käyttäen CPD-Y:tä katalysaattorina on seuraavassa reaktiokaaviossa ,, 70597

Bz-Arg-OEt H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (95%) pH 9,6 CPD-Y pH 8,0 Trypsin H-Tyr-NH2

Bz-Arg-Tyr-NH2 (85%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (75%)

pH 9,6 CPD-Y pH 9,5 CPD-Y

H-Met-OH

Bz-Arg-Tyr-OH (90%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-OEt (80%)

EtOH/HCl EtOH/HCl

Bz-Arg-Tyr-OEt (80%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-OH (95%)

pH 9,0 CPD-Y pH 9,6 CPD-Y

H-Gly-OEt

Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-OEt (6C%) Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH2 (65%) CPD-Y, pH 8,0 H-Phe-NH2

Ment-enkefaliinin synteesi käyttäen karboksipeptidaasi-Y:tä (CPD-Y) katalysaattorina. Kunkin vaiheen saanto on ilmoitettu suluissa .

CPD-Y:llä katalyoistu kondensointi- ja deamidointivaiheet suoritettiin pelkässä vesifaasissa ja Bz-Arg- valittiin liukenevaksi suojaryhmäksi, joka voidaan poistaa viimeisessä vaiheessa trypsii-nillä kuten edellä on esitetty (s. 21, rivit 2-6, venäläinen teksti).

Sen jälkeen kun peptidiä on pidennetty aminohappoamidilla, jota seuraa deamidointi, seuraava peptidiesterisubstraatti syntetisoitiin abs. etanolilla ja vedettömällä HCl:llä.

Kunkin vaiheen jälkeen reagoivat aineet eristettiin prepara-tiivisella HPLC:llä. Tällä tavalla voitiin myös amiinikomponentti-ylimäärä ja hydrolyysin "sivutuotteet ottaa talteen.

“s 70597

Viitteet 1) Bergmann M. & H. Fraenkel-Conrat: spesifisyyden osuus proteiinien entsymaattisessa synteesissä. J. Biol. Chem. 119, 707-720 (1937) 2) Bergmann M. & J.S. Fruton: Joitakin kymotrypsiinillä suoritettuja synteesi- ja hydrolyysikokeita. J. Biol. Chem. 124, 321-329 (1938) 3) Fastrez, J. & A.R. Fersht: Todistus asyylientsyymi mekanismin puolesta kymotrypsiinillä tapahtuvassa peptidien ja anilidien hydrolyysissä. Biochemistry 12, 2025-2034 (1973) 4) Fischer E.: Aminohappojen estereistä. Chem.Ber. 34, 433-454 (1901) 5) Hayashi R., Y. Bai & T. Hata: Karboksipeptidaasi Y:n kineettisiä tutkimuksia I. Synteettisten substraattien hydrolyy-sin kineettiset parametrit. J. Biochem. 77, 69-79 (1975) 6) Johansen, J.T., K. Breddam & M. Ottesen: Karboksipepti-daasi Y:n eristäminen affiniteettikromatografiän avulla.

Carlsberg Res. Commun. 41, 1-14 (1976) 7) Isowa Y., M. Ohmori, T. Ichikawa, H. Kurita, H. Sato & K. Mori: Peptidien synteesi proteolyyttisten entsyymien avulla. Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2762-2765 (1977) 8) Isowa Y., H. Ohmori, M. Sato & K. Mori: Suojatun va-liini-5 angiotensiini II amidi-l:n entsymaattinen synteesi.

Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2766-2772 (1977) 9) Isowa Y., T. Ichikawa & M. Ohmori: Peptidisynteesi proteinaasien avulla. ZLeuGlnGlyOH tai ZGlnGly0H:n gragmentti kondensaatio HLeuValNHjin kanssa metalloproteinaaseja käyttäen. Bull. Chem. Soc. japan 51, 271-276 (1978) 10. Klibanov A.M., G.P. Samokhin, K. Martinek & J.V. Berezin: Proparatiivisen, entsymaattien synteesin uusi aloitustapa. Biotech. Bioeng. 19, 1351-1361 (1977) 11) Losse G., H.-J. Hebei & C. Kästner: Aminohappoamidien ja hydratsidien rasemaattilohkeaminen. J. Prak. Chemie, 4.

Reihe, Band 8, 345-350 (1959) 12) Luisi P.L., R. Saltman, D. Vlach & R. Guarnaccia: Glysiinin ja aromaattisten aminohappojen ko-oligopeptidit, joissa on vaihteleva etäisyys aromaattisten tähteiden välillä. VIII. N-suojattujen dipeptidiestereiden aromaattinen synteesi. J. Mol. Catalysis 2, 133-138 (1977) ,6 70597 13) Morihara K. & T. Oka: β^-kymotrypsiini peptidisynteesi katalysaattorina. Biochem. J. 163, 531-542 (1977) 14) Oka T. & K. Morihara: o£-kymotrypsiinin katalysoima peptidi-sidoksen synteesi. J. Biochem. 84, 1277-1283 (1978) 15) Oka T. & K. Morihara: Trypsiini peptidisynteesin katalysaattorina. J. Biochem. 82, 1055-1062 (1977) 16) Oka T. & K. Morihara: Proteaasi peptidisynteesin katalysaattorina: Synteesi tuotteen saostumisen poissaollessa. Symp. Peptide Chemistry in Japan, Osaka, ss. 79-84 (1977) 17) Rivier J.E.: Trialkyyliammoniumfosfaatti-(TAAP) puskureiden käyttö käänteisfaasi-HPLC:ssä peptidien proteiinin suuren resoluution sekä takaisinsaamisen saavuttamiseksi.

J.Liq. Chrom. 1, 343-366 (1978) 18) Saltman R., D. Vlach & P.L. Luisi: Aromaattisten aminohappojen sekä glysiinin ko-oligopeptidit, joissa on vaih-televa etäisyys aromaattisten tähteiden välillä. VII. N-suojat-tujen peptidiamidien entsymaattinen synteesi. Biopolymers 16, 631-638 (1977) 19) Smith E.L. & D.J. Spackman: Leusiiniaminopeptidaasi V. Aktivoiminen spesifisyys ja toiminnan mekanismi. J. Biol.

Chem. 212, 271-299 (1955) 20) Yamada T., N. Isono, A. Inui, T. Miyazama, S. Kuwata & H. Watanabe: N-( bentsyylioksikarbonyyli)-aminohappojen sekä aminohappojen esteröinti BF^-eteraatti katalyyttinä.

Bull.Chem. Soc. Japan 51, 1897-1898 (1978) 21) Zeller E.A., L.A. Blanksma & J.A. Carbon: Optisesti aktiivisten hydratsidien vaikutuksesta diamiinioksidaasiin.

Helv.Chim.Acta. 40, 257-260 (1957)

Claims (12)

1. Menetelmä peptidien entsymaattiseksi valmistamiseksi, joiden kaava on A-B-Z jossa A on N-terminaalisesti suojattu L-aminohappotähde tai mahdollisesti N-terminaalisesti suojattu peptiditähde, jossa on C-terminaa-linen L-aminohappo, B on L-aminohappotähde ja Z on OH tai C-termi-naalinen suojaryhmä, jolloin substraattikomponentti saatetaan reagoimaan amiinikomponentin kanssa entsyymin läsnäollessa, ja haluttaessa terminaalisuojaryhmä tai -ryhmät lohkaistaan niin, että muodostuu kaavan A-B-Z mukainen peptidi, tunnettu siitä, että substraattikomponentti, joka on aminohappo- tai peptidiesteri, dep-sipeptidi, mahdollisesti N-substituoitu aminohappoamidi tai peptidi-amidi tai mahdollisesti N-terminaalisesti suojattu peptidi ja jonka kaava on A-OR1 A-NR2R2' tai A-X-OH . . . 1 jossa A tarkoittaa samaa kuin edellä, R on entsymaattisesti lohkaistavissa oleva ryhmä, joka on alkyyli, aryyli, heteroaryyli, aralkyy- 2 2' li tai aminohappotähteen oC-des-ammo-fragmentti, R ja R tarkoittavat toisistaan riippumatta entsymaattisesti lohkaistavissa olevaa ryhmää, joka on vety, alkyyli, aryyli, heteroaryyli tai aral-kyyli, ja X on aminohappotähde, saatetaan reagoimaan amiinikomponentin kanssa, joka on mahdollisesti N-substituoitu L-aminohappoamidi, L-aminohappo tai L-aminohappoesteri ja jonka kaava on H-B-NR3R3f tai H-B-OR4 . . . 3 . 3 ' jolloin B tarkoittaa samaa kuin edellä, R ja R tarkoittavat toisistaan riippumatta entsymaattisesti lohkaistavissa olevaa ryhmää, joka on vety, hydroksi, amino, alkyyli, aryyli, heteroaryyli tai aralkyyli, ja R on vety tai entsymaattisesti lohkaistavissa olevaa ryhmää, joka on alkyyli, aryyli, heteroaryyli tai aralkyyli, jolloin reaktio suoritetaan hiivasta saadun tai eläin-, kasvi- tai mikro-bialkuperää olevan L-spesifisen seriini- tai tiolikarboksipeptidaa- *8 70597 sientsyymin läsnäollessa vesipitoisessa liuoksessa tai dispersiossa, jonka pH on 5-10,5, edullisesti lämpötilassa 20-50°C.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että karboksipeptidaasientsyymi on hiivasta saatu karboksi-peptidaasi Y.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että karboksipeptidaasi Y on puhdistettu affiniteettikroma-tografian avulla affiniteettihartsilla, joka käsittää polymeerisen hartsimatriisin, jossa on lukuisia sidottuja bentsyylisukkinyyli-ryhmiä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että karboksipeptidaasientsyymi on organismista Penicillium janthinellum saatu penisillokarboksipeptidaasi S-l tai S-2, organismista Aspergillus saitoi tai Aspergillus oryzae saatu karboksipeptidaasi, appelsiinin lehdistä tai kuorista saatu karboksipeptidaasi C, Citrus natsudaidai Hayatalta saatu karboksipeptidaasi pavun lehdistä saatu faseolaiini tai itävästä ohrasta, versovista puuvillakasveista, tomaateista, vesimeloneista tai Bromelein (ananas )-jauheesta saatu karboksipeptidaasi.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että karboksipeptidaasientsyymi on im-mobilisoitu.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen liuos tai dispersio sisältää enintään 50 tilav.-% orgaanista liuotinta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen liuos tai dispersio sisältää orgaanista liuotinta joka on alkanoli, dimetyylisulfoksidi, dimetyyliformarnidi, dioksaani, tetrahydrofuraani, dimetoksietaani, etyleeniglykoli tai polyetyleeniglykoli.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattikomponentti on L-amino-happo- tai peptidiesteri, joka on mahdollisesti inerteillä substi-tuenteilla substituoitu bentsyyli- tai C^^-alkyyli-esteri.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattikomponentti on p-nitroanilidi. 1,9 70597

10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amiinikomponentin kaava on H-B-NHR3 jossa R3 on vety tai C^g-alkyyli ja B on L-aminohappotähde.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amiinikomponentin kaava on H-B-OR*4 jossa R*4 on 3~alkyyli ja B on L-aminohappotähde.

12. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että läsnä on yksi tai useampi C-termi-naalia suojaava ryhmä ja että ryhmä tai ryhmät lohkaistaan entsymaattisesti edullisesti samalla karboksipeptidaasitsyymillä, jota käytetään edellisessä reaktiossa. 50 70597