HU186734B - Process for the enzymatic preparation of peptides - Google Patents

Process for the enzymatic preparation of peptides Download PDF

Info

Publication number
HU186734B
HU186734B HU80832A HU83280A HU186734B HU 186734 B HU186734 B HU 186734B HU 80832 A HU80832 A HU 80832A HU 83280 A HU83280 A HU 83280A HU 186734 B HU186734 B HU 186734B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ala
mol
amino acid
peptide
amide
Prior art date
Application number
HU80832A
Other languages
English (en)
Inventor
Jack T Johansen
Fred Widmer
Original Assignee
Forenede Bryggerier As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forenede Bryggerier As filed Critical Forenede Bryggerier As
Publication of HU186734B publication Critical patent/HU186734B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

A találmány tárgya eljárás peptidek enzimatikus előállítására. Részletesebben, a találmány tárgya egy eljárás peptidek előállítására, mely során katalizátorként az enzimek specifikus csoportjait alkalmazzuk.
Ismeretes, hogy a peptidek szintéziseinél többé vagy kevésbe bonyolult kapcsolási reakciókat végeznek, mind a heterogén, mind a homogén fázisban végzett szintézisek esetében. Azonban mindezek a kémiai módszerek nemkívánt másodlagos reakciók vagy racemizációk bekövetkezésének kockázatával járnak és ezért szükséges a kémiai reakciók gondos ellenőrzése, hogy a fellépő problémákat csökkentsük vagy kiküszöböljük. Továbbá, az aminosav oldaíláncait gyakran védeni kell, amely szükségessé teszi a védőcsoportok eltávolítását is utolsó lépésként, hogy a kívánt pep’idet előállítsuk. Λ szintetizált pepiidtől függően, a kitermelés alacsony lehet és a másodlagos reakciók gyakran szükségessé teszik a nehézkes tisztítási művelet elvégzését, hogy a pepiidet tiszta formában kinyerjük. A kémiai úton történő peptidszintezis mindezen velejáró problémái, valamint a kapcsoló reagensek és blokkoló aminosav-származékok legtöbbjének magas ára azt jelenti, hogy még egy kisebb szintetikus pepiid, például pentapepíid előállítása is viszonylag költséges.
Mivel az enzimek igen specifikus katalizátorok és a proteolitikus enzimek hidrolizálni képesek proteinekben a peptidkötcseket, korábban kísérleteket végeztek a hidrolízis reakciójának visszafordítására, vagy más szavakkal, az enzimek katalizátorként történő alkalmazására a peptidkötések szintézisénél.
Bergmann és Fraenkel-Conrad (The role of spccificity in the enzymatic synthetis of protein: J. Bioi. Chem. 119, 707-720, 1937), valamint Bergmann és Fruton (Somé synthetic and hydrolytic experiments with chymotrypsin; J. Bioi. Chem. 124, 321-329, 1938) részletes vizsgálatokat folytattak ezen a téren és 1937-ben kimutatták, hogy a papain és kimotripszin bizonyos acilaminosavak és aminosav-anilidek kapcsolási reakcióját katalizálhatják. Ezeket a vizsgálatokat később tovább folytatták cs két alapvetően eltérő közelítési mód (a termodinamika és kinetika) alapján intenzifíkálták.
A termodinamikai módszerek alapvető jellemzője, hogy a reagensek közötti termodinamikai egyensúly beállását megfelelő proteáz alkalmazásával katalizálják és a reakciótermékeket a reakcióelegyből eltávolítják, ily módon Isowa és társai (The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes; Buli. Chem. Soc. Japan 50, 2762-2765, 1977, The enzymatic synthesis (4 protected valine-5 angiotensin II amide-1; Bull. Chem. Japan 50, 2766-2772, 1977., Peptide synthesis with proíeinases, Fragment condensation of ZLeuGInGlyOH or ZGInGiyOH with HLcuVaINH2 using metalloprolcinascs; Bull. Chem. Soc. Japan 51, 271-276, 1978). továbbá 4 119 493 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és 1 523 546, valamint I 533 129. sz. Nagy-Brifannia-i szabadalmi leírások, Luisi és társai (Cő-oligopeptídes of glycinc and aromatic amint) aciiis with variable disíanee between the aromatic residues; J. Mól. Catalysis 2, 133-138, 1977. Co-oligopeptidcs of aromatic amino acids and glycine with variable disíanee between ihc aromatic residues; Biopolymcrs 16, 631638. 1977) és Morihara (Peptide borid synthesis catalyzed by alpha-ebymolrypsin; J. Biochem 84, 1277-1283, 1978) leírják, hogy sz-ámos szerin-, tiol- és metalo-endoproteáz katalizálja a peptidszintézist a védett, de könnyen oldódó dí-, Sri- és tetrapeptidekbői, feltéve, ha a végtermék kicsapódik a reakciőközegből, amikor is annak oldhatósága kisebb, mint az egyensúlyi koncentráció. Fenti szintézisek példáit az alábbi reakcióvázlaton szemléltetjük;
!. Z-l cu-Phe-OH rPhe-ODPM £2£2jg.Z-Leu-Phc-Phe-ODPM
ODPM — difenil-metíl-észter
2. Z Arg(NO2)-OI 1 + Phe-Val-OBut Z-Arg(NO2)Phc-Va!-OBut
3. BOC-Val-Tyr(Bz)OH+Val-Hís(Bz)-Pro-Phe-OEt BOC-Val Tyr(Bz)-Val-His(Bz)-Pro-Phe-OH
Z — benziloxikarboml
Bz = benzoil
BOC = íercier-buti'oxi-karboxil
Azonban ez a reakcióelmélet csak akkor használható a szintézis általános módszereként, ha a hagyományos kémiai kapcsolási módszerekhez hasonlóan valamennyi aminosav oldalláncot a reakció előtt ionizálható csoportokkal védenek és a reakció végén azokat eltávolítják. A módszer hiányossága, hogy a különböző nagy specifikussággal rendelkező enzimek kiválasztása a szintetizálandó peptidkötések típusainak megfelelő nehézkes. Bár ezek a hiányosságok áthidalhatóak, de a módszernek számos egyéb hátránya is van, mivel igen magas enzimkoncentráció (100 mg/mmol pepiid), hosszú reakcióidő (1-3 nap) szükséges cs a kitermelés is ingadozó (fenti amerikai egyesült államokbeli és Nagy-Britannia-i szabadalmakban 20 és 80 % között).
Klibanov és társai (A new' approach to preparative' enzymatic synthesis; Bioíech. Bioeng. 19, Í35i—1361, 1977) javasolták a vízből és vízzel nem elegyedő szerves oldószerből álló rendszer alkalmazását. Ez a módszer hasonlóan magas cnzimkoncentrációt és több napig is elhúzódó reakcióidőt igényel.
Az enzimatikus szintézisek másik típusa a reakciókinetika felhasználására támaszkodik, A legtöbb szerinés tiol-proteáz esetében egy acil-enzim intermediert képeznek a katalitikus lépések egyikében a peptid és peptidészterek hidrolízise folyamán, amelyet ezután a következő lépésben vagy lépésekben hidrolizáinak. Ha vízen kívül más nitkleofil-rész is jelen van a hidrolízisnél, akkor azok szintén átveszik az acil-enzimről az acilcsoportot, amely az amidkötés kialakulásához vezet. Fastrez és Fersht (Demonstráljon of the acyl-enzyme mechanism fór the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrvpsin: Biochcmistry 12, 2025-2034,-1973) leírják az N-acetil-L-fcnil-alanin (Ac-Phe-OEí) kimotripszin által katalizált hidrolízisét különböző aminosav-amidok jelenlétében. A reakciót az 1. reakcióvázlaton mutatjuk be.
IS6 734
7. reakcióvázlai _ Ks __ k2 _
Ac-Phe-Oe + C! .....~t> (Ac-Phe-OEt)CT < *' Ac-Phe i k-s + EtOH
CT = kimotripszin.
Először egy enzim-szubsztrát-komplexet képzünk, amelyet az Ac-Phe-CT acil-enzim intermedier képzése követ. Ez utóbbit vízzel hidrolizáljuk, amikor Ac-Phe-OH keletkezik, ha azonban a nukleofil R-NH2 is jelen van, akkor az acil-enzim intermedieren a hidrolízisen kívül aminolízis is bekövetkezik. Feltételezve, hogy k3 » k-3 és k4 » k-4, az aminolízis és hidrolízis aránya csak k4/k3-tól, valamint a nukleofil részek koncentrációjától függ, amely 55 mól jq vízzel egyenrangú. Fastrez és Fersht kimutatták, hogy például 1 mól alaninamid pH 10-nél 44-szer erősebben nukleofil, mint 55 mól víz, amely az N-acildipeptid-amid nagy részének (több mint 95 %) képződése során keletkezett. Morihara és Oka (Alpha-chymotrypsin as thc catalyst fór peptide synthesis; Biochem. J. 163, 531—542,
1977., Peptide bond synthesis catalyzed by alpha-chymotrypsin; J. Biochem. 84, 1277-1283, 1978., Trypsin as a catalyst fór peptide synthesis; J. Biochem. 82, 10551062, 1977., Protease as a catalyst fór peptide synthesis,
Symp. on Peptide Chemistry in Japan, Osaka, pp. 79—84,
1977.) ezt az elvet alkalmazták az enzimatikus peptidszintézishez. Kimotripszint és tripszint használva, a peptidek sokaságát szintetizálták N-acilaminosav észterekből és aminosavak nukleofil származékaiból és kimutatták, , hogy a reakció tisztán kinetikai, mivel magas kitermelések érhetők el, függetlenül a termék oldékonyságától.
Az előzőekben említett tanulmányok azt mutatják, hogy a kinetikai módszereknek számos előnye van a termodinamikai módszerekkel szemben;
1. Gyorsabb a reakció (bizonyos esetekben néhány perc alatt lejátszódik).
2. Lehetséges alacsony enzim-koncentrációkat alkalmazni.
3. Az aminosav oldalláncait nem szükséges védőcsoportokkal ellátni.
4. Immobilizált és nem oldható enzimek is használhatók, mivel a peptidek oldatban vannak, és ezzel az automatizálás feltétele is adott.
Tekintettel arra, hogy a reakciótermékek oldhatóak is lehetnek, a szintézisnek gyorsabbnak kell lennie, mint a termék másodlagos hidrolízisének, hogy az elkülönítést időben elvégezhessük.
Továbbá, az ismert kinetikai módszerek csak korláto- ^5 zott mértékben alkalmazhatóak, mivel a vizsgált enzimek specifikus tulajdonságai a különböző peptidkötcsek szintéziséhez különböző enzimek használatát teszik szükségessé. Ráadásul, a nagyobb peptidmolekulák szintézise a bidrolizáiandó molekulán belül belső peptidkötések ki- θθ alakulásához vezet az alkalmazott enzimek endopeptidáz aktivitása következtében, függetlenül az enzimek észterbontó aktivitásától.
A találmány tárgya egy eljárás peptidek enzimatikus szintézisére, mellyel áthidalhatóak a technika állásának
K,
előzőekben említett hiánosságai és jellegéből adódóan nem korlátozódik specifikus aminosav komponensek használatára, továbbá elkerülhető a belső peptidkötések későbbi hidrolízise.
Főleg az említett, de más előnyök is elérhetők az A-B általános képletű - mely képletben
A jelentése N-terminálisan védett L-aminosav-gyök vagy C-terminális L-aminosavval rendelkező, adott esetben N-terminálisan védett peptidgyök és
B jelentése adott esetben C-terminálisan védett L-aminosav-gvök vegyületek előállításával oly módon, hogy az alábbiak közül egy
a) A-OR1 általános képletű - mely képletben A jelentése azonos a fentiekben megadottakkal, R’ jelentése 1-4 szénatomos alkil- vagy fenil-(l— 4 szénatomos alkil)-csoport vagy egy aminosav alfa-dezamino Iragmense - aminosav-észtert. peptid-észtert, depszipeptidet,
b) ANH2 képletű - mely képletben A jelentése a már megadott - aminosav-amidot vagy peptid-amidot,
c) A-X általános képletű - mely képletben A jelentése azonos a fentiekben megadottakkal és X jelentése egy aminosav adott esetben N-terminálisan védett pepiidet, az alábbi vegyületek valamelyikével mint amin-komponensscl
a) H-B-OH általános képletű L-aminosav, amelyben B jelentése a fentiekben megadott b) adott esetben N-szubsztituált, H-B-NR3R3' általános képletű - mely képletben B jelentése aminosavmaradek és R3 és R3' jelentése hidrogénatom, hidroxi-, aminocsoport - L-aminosavamid.
c) H-B-OR4 általános képletű - mely képletben B jelentése aminosai maradék és R4 jelentése 1-4 szénatomos alkilesoport - -aminosav-észter,
I -specifikus szerin- vagy tiol-karboxipcptidáz enzim jelenlétében, 5 és 10,5 pH-jú vizes oldatban vagy diszperzióban, előnyösen 20 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten reagáltatunk cs kívánt esetben a keletkezett peptidről az R4 vagy N-terminális védőcsoportot lehasítjuk.
találmánv alapvető változást jelent a technika állásában. mivel exopeptidázokat alkalmazunk az eddig hasonló célra használt enzimek helyett, amelyek túlnyomórészt vagy bizonyos mértékben endopeptidáz aktivitással rendelkeztek.
Azt találtuk, hogy az exopcpiidázoknak egy széles specifikus peptidáz aktivitást kell mutatniuk, miáltal a szélesebb specifikus hatás következtében a szintézis teljesebb és nem korlátozódik a peptidkötések egyszerűbb és
186 734 csak néhány típusának kialakítására. Az enzimeknek megfelelőknek kell lenniük az előzőekben - a kinetikai módszernél - leírt típusú acil-enzim intermedier előállítására, és főleg olyan tulajdonságokkal kel! rendelkezniük, amelyek lehetővé teszik az intermedier aminolízisét abban az esetben, amikor k.4 « k4 (lásd 1. reakcióvázlat), hogy ily módon az előállított pepiid gyors hidrolízise elkerülhető legyen. Az acil-enzim intermedierek képződéséhez az alkalmazott, szubsztrát komponensben levő C-terminális védőcsoport lehasítása szükséges, azaz jelen esetben az észteráz vagy amidáz aktivitás érvényesülése. Szintézis során az említett aktivitásnak meg kell haladnia az enzim peptidáz aktivitását az alkalmazott reakciófeltételek mellett.
Ezeket a tulajdonságokat találtuk a karboxipeptidázok nak nevezett exopeptidáz csoportban, mely enzimek képesek a peptidek olyan hidrolízisére, mely során szabad karboxil-csoportok keletkeznek. Azt találtuk, hogy ezeknek az enzimeknek sokasága eltérő enzimaktivitást mutat, amely elsősorban a pH-tól függ, így például 8 és 10,5 közötti pH-éríéken túlnyomórészt az észteráz és amidáz aktivitás kerül előtérbe, és pH 9 és 10,5 közötti értéken nincs vagy csak csekély mértékben van peptidáz aktivitásuk. Mindezek a tulajdonságok előnyösen használhatók fel a találmány szerinti eljárásban, mivel ezek révén jó kitermelés biztosítható.
Vizsgálataink azt mutatták, hogy a szerin- vagy tiol-proteázok különösen megfelelőek az acil-enzim intermedierek előállítására. A karboxipeptidázok előnyös csoportja ezért a szerin- és tiol-karboxipeptidázok. Ezeket az enzimeket előállíthatjuk élesztőgombákkal vagy lehetnek állati, illetve mikrobiológiai eredetűek.
Különösen jól alkalmazható az élesztőgombából (CPD-Y) nyerhető karboxipeptidáz-Y, Ezt az enzimet Hayashi (Kinetic studies of earboxypepÍidase-Y; J. Biochem. 77, 69-79, 1957) és johansen (Isolation of carboxypeptidase-Y by affínity chromatOgraphy; Carlsberg Rés. Commun. 41, 1-14, 1976) ismerteti, akik egy különösen jól alkalmazható tisztítási eljárást dolgoztak ki. A tisztítást affinitás kromatográfiai módszerrel végzik oly módon, hogy a polimer-gyanta mátrixhoz benzil-szukcinil csoportot kapcsolnak. A CPD-Y - amely egy szerin enzim - pH >9 értéknél a már korábban említett aktivitást mutatja és ugyanakkor endopeptidáz aktivitása nincs. Szabad alfa-karboxil-csoportokkal rendelkező C-terminá!is aminosavak vagy észterek vonatkozásában mutatott specifikussága miatt, a CPD-Y azokat a peptideket is bidrolizálhatja, amelyekben a C-terminális alfa-karboxil-csoport egy észter- (alkil- vagy arií-cszter) formában, illetve amid, N-szubsztiíuáit-amid (például aniíid) formájában van jelen. Fontos még, hogy ezek az enzimek a legtöbb szubsztrátot hidroüzálni tudják, függetlenül a C-terminális aminosav-gyökök típusától. A CPD-Y további előnye, hogy nagy mennyiségekben gyártható cs viszonylag nagy stabilitású. A CPD-Y ugyan a legmegfelelőbb enzim a találmány megvalósítására, de a találmány szerinti eljárás az alábbi felsorolásban szereplő enzimekkel is végezhető,
Enzim
Eredete
Pe n ici I le-k a rbox ipept időz S-2
Karboxipcplidáz(ok)
Karboxipeptidáz(ok)
K a t boxípc p! i dáz( ok)
Karboxipcptidáz C N
Phazeolain
Karboxipeptidázfok)
Penicillium janthinelium
Aspergillus saitoi Aspergillus oryzae
Növények:
narancsfa levelei narancs-gyümölcshéj citrus natsudaidai Hayata zöldbablevelek csírázó árpa, csírázó gyapot, paradicsom, dinnye, ananász-bromelain
A bovin típusú karboxipeptidáz A és B (CPD-A és CPD-B) már nem megfelelőek, mivel azok metallokarboxipeptidázok.
Mint korábban már részleteztük, a szintézis egyrészt az úgynevezett szubsztrátkomponens, amelyet savkompoG nensnek vagy donornak is neveznek (amely az A részt tartalmazza), másrészt az úgynevezett amin komponens, amelyet nukleofil komponensnek vagy akceptomak neveznek (amely a B részt tartalmazza) reakcióján alapszik, ily módon kialakítva az A-B pepiidet.
Az A rész, amely egv aminosav-gyök vagy egy peptidgyök. kívánt esetben védett N-íermináJis amino-vegyület is lehet, hogy a nemkívánt másodlagos reakciókat elkerüljük. Az amino-csoport védelmének szükségessége a peptid-gyök szénláncának a növekedésével csökken és már nincs jelentősége, ha a peptid-gyök három aminosavból áll, természetesen annak a típusától és szekvenciájától függően.
Előnyös aminosavak például az alifás aminosavak, mint a monoamino-monokarbonsavak, például giiein ((ily), alanin (Alá), valin (Vai), norvalin (Nva), leucin (í cn), izoleucin (iso-Lcu) és nor'eucín (Nle), továbbá hidroxi-aminosa.vak, mint a szerin (Ser), treonin (Thr) és homoszerin (homo-Ser). kéntartalmú aminosavak, mint a metionin (Met) vagy cisztin (CysS) és cisztcin
46' (Cysh), monoamino-diknrbonsavak, mint az aszparaginsav (Asn), glutaminsav (Giu), aszparagin (Asn), glutamin (Gin), diamino-tnonokarbonsavak, mint azomitin (Ont), lisin (Lys) és arginin (Arg), aromás aminosavak, mint a ícnílalanin (Phe) és tirozin (Tyr), továbbá a heterociklikus aminosavak. mint a hisztidin (His) és triptofán (Trp).
Védőcsopnrtként használhatunk peptidkémiában ismert védocsoportokat. így benzoil- (Bz). aeeíil- (Ac) vagy tercier alkoxikarbonil-csoportot, például t-buíiloxikarhonil-(BOC-), t-amiloxikarbonil-(t-AOC-), benzil5C oxikarboníl-(Z-), p-mel0xibcnzil-oxikarboniI-(PMZ-), 3.5-dimt'íoxi-benziloxikarbonil-[Z(OMe)2-], 2,4,6-trimetilbenzil-oxikarbonil-(TMZ-), p-fenilazobenzil-oxikarbonil-(PZ-), p-toluolszuIfonil-(Tos-), o-nitrofenilszull'enil-csoport (Nps-) és hasonlóak.
l lönvös védöcsoporlok lehetnek például a benzíloxikarbonil- cs t-butiloxikarbonil-csoportok, mivel ezek könnyen előállithaióak, felhasználásuk gazdaságos és könnyen lehasíthatóak.
A fenti s/ubsztrát-komponens az alábbi vegyületek bármelyike lehet;
Gombák:
Penicillo-karboxipeptidáz Penicillium janthinelium S-l a ) aminosav-észter. peptid-észter vagy A-OR1 általános képletű depszipeptid. ahol A jelentése azonos a korábban megadottakkal és R1 jelentése 1—4 szénatomos alkil- vagy fenil-{ 1-4 szénatomos alkil)65
1<S6 734 csoport vagy egy aminosavgyök aifa-dezamino fragmense,
b) kívánt esetben egy A-NH2 képletű aminosav-amid vagy peptid-amid, ahol A jelentése azonos a korábban megadottakkal, vagy
c) kívánt esetben A-X általános képletű N-terminális védeti peptid, ahol A jelentése azonos a korábban megadottakkal és X jelentése egy aminosav.
Fentiekben ,,alkil”-csoport alatt egy egyenes vagy elágazó szénláncú alkil-csoportot értünk, amelynek szénatomszáma 1 és 6 között van, például lehet meti!-, etil-, propíl-, izopropil-, butil-, izobutil-, terc.-butil-, amil-, hexil-csopcrt és más hasonló csoport.
így az észterek esetében az OR1-csoport előnyösen alkoxi-csoport, így metoxi-, etoxi- vagy t-butoxi- és benziloxi-csoport. Más csoportok is előnyösen használhatók, ha az aminosav-gyök vagy peptid-származék a karboxipeptidáznak megfelelő szubsztrát. Erre példa az úgynevezett depszipeptidek, amelyben a C-terminális aminosav-észter kötésen át kapcsolódik a peptidkötés helyett, például a benzoilglicin-fenillaktát (Bz-Gly-OPhe) esetében.
Előnyösen használható karbonsav-védőcsoportok például az alkoxi-csoportok, különösen a metoxi-csoport vagy más szavakkal a szubsztrát komponens előnyösen egy aminosavmetilésztert tartalmaz, mive! ezeket könnyű előállítani és ugyanakkor jó szubsztrátok. Azonban például etil-észter, propil-észter, izopropil-észter, butil-észter, t-butil-észter, benzil-észter vagy terc.-butiloxi-észter ugyanolyan jól alkalmazható.
Meg kell említeni, hogy az ionizálható csoportok, amelyek az egyes aminosavakban jelen lehetnek és amelyek az A peptid-gyök komponensei, kívánt esetben ismert módon védhetők, a csoport típusának megfelelően. Azonban ez nem mindig szükséges, amely éppen a jelen eljárás egyik előnyét jelenti. Ha a funkcionális csoportokat kívánjuk védeni, akkor az CO-amino-csoport (NfO) esetében megfelelő védőcsoportok lehetnek például az Nbf-benziloxikarbonil-csoport (N°2-Z), t-butoxikarbonilcsoport (N^-BOC) vagy tozil-csoport (N^-Tos). Az argininben levő N-guanidino-csoport NG esetében megfelelő védőcsoport a nitro-csoport (NG-NO2), NG-benziloxikarbonil (NG-Z) és NG, NG-dibenziloxikarbonil-csoport (Ng-Z-Z). A hisztidinben levő imidazol-gyűrű (N'm) védőcsoportjaként N'm-benzil-csoportot (N,ni-Bzi) és tozil-csoportot (Nim-Tos) alkalmazhatjuk. AzCO-karboxil-csoportokhoz megfelelő védőcsoportok például az <ü-benziloxi-csoportok (-OBzl). Az alifás vagy aromás hidroxi-aminosavak hidroxi-csoportjainak megfelelő védőcsoportok az aralkil-csoportok, mint például a benzil-csoport (Bzl). A Cysfí-ban levő merkapto-csoporlhoz megfelelő S-védőcsoport például a benzil-csoport (Bzl). A védőcsoportoknak a primer reakciók során stabilnak kell lenniük, és a végtermékről könnyen lehasíthatóknak, oly módon, hogy az szekunder reakciókat ne okozzon.
A találmány szerinti eljárás elvileg bármely aminosavval, mint szubsztrát-komponenssel megvalósítható.
A reakció másik komponense az úgynevezett aminkomponens, amely az alábbi csoportok bármelyike lehet:
a) H-B-OH általános képletű L-aminosavak, amelyben B jelentése a már megadott,
b) H-B-NR3R3 általános képletű, mely képletben !! jelentése aminosav-gyök és
R3 és R3' jelentése hidrogénatom, hidroxi- vagy ; mino-csoport — adott esetben N-szubsztítuált aminosav-amidok,
c) H-B-OR4 általános képletű - mely képletben B jelentése aminosav-gyök és
R4 jelentése l—4 szénatomos alkil-csoport — ííminosav-csztcrck.
Látható, hogy R3 = hidrogénatom szabad amidot, míg Ft3 = OH egy hidroxámsavat, R3 = amino-csoport hidrazidot jelöl.
Λ találmány szerinti eljárás így például előnyösebb, mint a már idézett Isowa- és Morihara-eljárás, mivel mind szabad aminosavakkal (C-terminálisan nem védett), mind C-terminálisan védett aminosavakkal (például az aminosavak megfelelő amidokká, anilidekké, hidrazidokká. észterekké vagy más karboxil-származékokká történő alakításával) megvalósítható.
A? amin-komponens vonatkozásában a reakció-szekvencia. kitermelés stb. nagymértékben függ attól, hogy szabad amínosavat vagy C-védett származékát, pl. amidját : Ikalmaztuk-e kiindulási komponensként. Mindezt a példák kapcsán részletesen bemutatjuk, mindenesetre azonban az alábbi általános kép bontakozik ki.
H:> olyan szabad aminosavakat alkalmazunk, amelyek hidrofob aminosavak, mint az alanin, leucin, valin és feni! alanin. valamint pozitív töltésű oldalláncú aminosavak. mint a Iizin vagy arginin, akkor a szubsztrátkomnonens láncához történő kapcsolás könnyen elvégezhető míg bizonyos aminosavak, amelyek oldallánca akár karboxil-csoportot (glutaminsav), akár hidroxil-csoportot (szerin cs (rconin). akár amid-csoportot (aszparaginsav és glutaminsav) tartalmaz, reakciója már lényegesen nehezebben megy.
A heterociklikus aminosavak - mint a prolin és hisztidin - szabad aminosavként történő alkalmazása rendkívü’ nehéz.
Különbség van abban is, ha amin-komponensként C-terminálisan védett aminosavakat, például aminosav-amidokat vagv N-szubsztituált-amidokat, például hidrazidot vagy anilidct alkalmazunk. Ezt a későbbiekben még részletezzük, de általánosságban elmondható, hogy ebben az esetben a reakció nagymértékben független a szerkezettől és igen magas kitermelést (90 %-ig) eredményez: azonban itt is a heterociklikus aminosavak nehezebben alkalmazhatók, mint az alifás aminosavak.
Mint korábban leírtuk, a találmány szerinti eljárás pH 5,0 és I0.5, előnyösen 8,0 és 10,5 közötti értéken végezhető. Az előnyös pH-érték, amely gyakran igen szűk tartomány, a pH-optimum!ól cs pH-minimumtól függ. tekintettel arra, hogy az alkalmazott enzimek különböző enzim-aktivitásúak, következésképpen a pHértéket úgy kell megválasztani, hogy az enzimaktivitások a korábban említettek szerint optimális egyensúlyban legyenek.
Általánosságban elmondható, hogy a peptidáz aktivitás pH 9 alatt a pH csökkenésével növekszik, mely az eljárás kitermelése vonatkozásában nem előnyös. Azonban néhány esetben. így Bz.-Ala-Gly vagy Bz-Ala-Gly-NH2 esetében a keletkezett peptidek vagy peptid-aminok
386 734 nem megfelelő szubsztrátjai a karboxipeptidázoknak, a szubsztrál-komponensként előnyösen alkalmazott aminosavésztcrre vagy peptid-észtcrre vonatkozó csztcrázaktivitás tehát jelentősen meghaladja ezt, így még a pH 5 körüli vagy alatti szintézis lefolyása is lehetővé válik. Általában elmondható, hogy a pH-optimum a kiindulási anyagoktól, a képződött pcpiidcktől cs az alkalmazott enzimtől függ.
Ha enzimként CPD-Y-t alkalmazunk, a pH-értéke előnyösen 8,0 és 10,5 között, még előnyösebben 9,0 és 10,5 között van, mint ezt később részletezzük.
Ezt a pH-értéket a kapcsolási reakció folyamán tartani kell és ezt követően szabad állítani a reakciótermék kicsapásához, a védőcsoport lehasításához stb. Ennek biztosítása céljából alkalmazható a reakcióközeg kiválasztott pH-tartományának megfelelő puffer, mini a bikarbonátpuffer.
Mindemellett, a választott puffer nem lényeges a reakció szempontjából, csak ha az sajátos pH-tartományt igényel.
A megfelelő pH-érték fenntartható megfelelő sav, mint sósav vagy bázis, mint nátrium-hidroxíd reakció során történő hozzáadásával.
A reakciót, mint már említettük, vizes közegben vagy kívánt esetben maximum 50 % szerves oldószert tartalmazó közegben végezzük. Szerves oldószerként előnyösen alkanolokat, például metanolt, etanolt; glikolokat, így etiléngiikoit vagy políetiléngükolokat, dimctilformamidot, dimetil-szulfoxidot, tetrahidrofuránt, dioxánt és dimetoxi-etánt alkalmazhatunk.
A reakcióközeg összetételének megválasztása elsősorban az oldckonyságtól, hőmérséklettől, a reakciókomponensek és a peptid-termék pH-játóI, valamint az enzim stabilitásától függ.
A reakcióközeg olyan komponenst is tartalmazhat, amely biztosítja az enzim oldékonyságát, de az enzimaktivitás jelentős részét megőrzi (ioncserélő-gyanták). Másképpen, az enzim immobílizáit formában is használható (lásd Methods of Enzymology, Vol. 44, 1976), amikor mátrixhoz, így dextránhoz, agarózhoz, kovaföldhöz, poliamidhoz vagy cellulózhoz kapcsolják, vagy poliakrilamidba, alginátba vagy szálakba kapszulázzák. Mindemellett, az enzim kémiai úton befolyásolható, hogy a stabilitása vagy enzimaíikus tulajdonságai javuljanak.
A reakció két komponensének a koncentrációja szeles határok között változhat, mint azt az alábbiakban kifejtjük. A szubsztrát-komponens kiindulási koncentrációja előnyösen 0,01 és 1 mól, míg az amin-komponensé 0,05 és 3 mól között van.
Az enzimaktivitás is sokféle lehet, előnyösen azonban 10e és 10~4 mól között alkalmazható.
A találmány szerint a hőmérséklet előnyösen 20-50 °C. Adott szintézishez a legmegfelelőbb reakció-hőmérséklet kísérletekkel határozható meg, de nagymértékben függ az alkalmazott amin-komponenstől és enzimtől is. A megfelelő hőmérséklet rendszerint 35-45 °C. előnyösen 35 °C körit! van. 20 °C alatti hőmérsékleten végzett reakció ideje aránytalanul megnő, míg az. 50 °C felett végzett reakcióknál problémát jelenthet az enzim és/vagy a reakciópartnerek vagy a reakciótermék stabilitása.
Hasonló eltérések tapasztalhatók a reakcióidőkben is, amelyek nagymértékben függnek egyéb reakció-paraméterektől. A találmány szerinti eljárás standard reakcióideje kb. 10 perc, de elhúzódhat néhány órára is.
Meg kell jegyeznünk, ha egy amidot vagy szubsztiluált amidot használunk amin-komponensként, akkor előnyös vagy éppen szükséges lehasítani az amid-csoportot a képződött peptid-amidrói, hogy a szintézis tovább folyhasson. Ebben a íekintetben a karboxipeptidázok, különösen a CPD-Y rendkívül megfelelőek, mivel a korábban leírt CPD-Y pH > 9 értékeken amidáz-aktivitást nuitat, ugyanakkor a karboxipeptidáz aktivitása elhanyagolható.
A karboxipeptidázok általában a keletkezett peptidek
R3 vagy R4 ( jelentésük azonos a korábban megadottakkal) csoportjának hasítására használhatók, amikor kívánatos a reakció folytatása vagy éppen egy C-termináüsar, nem védett pepiid előállítása.
Mini majd a későbbi példák is mutatják, a találmány szerinti eljárás alkalmazható korlátlan számú dipeptid, oligopeptid és polipeptid előállítására, azonos találmányi elv alapján, amikor is a szubsztrát-komponenst egy aminosav vagy aminosav-származék formájában levő amin-komponensse!, karboxipeptidáz jelenlétében reagál20 tatjuk.
Ily módon jól ismert oligopepíideke! vagy pohpepti.deket állíthatunk elő. például enkefalinokat, szomastatint, szomastatin analógokat vagy hasonló tulajdonságú peptidekeí, mint az. úgynevezett „álom-peptidet” (Trp-Ala25 -CUy-Gly-Asp-Ala-Ser-Giy-Glu).
Bizonyos esetekben, amikor több mint öt aminosavból álló) peptideket átütünk elő, előnyös a kívánt pepiid részeit oligopeptidek íragmenseiből, például egy megfelelő aminosav-szckvenciájú pentapeptidből szintetizálni és az oligopeptidet a fragmensek ismert módon történő kondenzációjával előállítani,
A keletkező peptidek oldékonysági tulajdonságainak javítása céljából előnyös, ha a reakciólépések során N-lerminális aminosavkent argínint vagy más ionizálható aminosavat használunk és ezután az arginint a peptidről cs specifikus enzim, például tripszin segítségével lehasítjuk, amikor a kívánt aminosav szekvenciája egyébként megfelelő.
Ezek és az egyéb módosítások szintén a találmány tárgyát képezik.
Mielőtt a találmány szerinti eljárást példákkal bemutatnánk, ismertetjük a kiindulási anyagokat, mérési módszereket stb.
Kiindulási anyagok
A karboxipeptidáz Y-t pckclesztőből izolálták afíinitáskromatogrália alkalmazásával (Johansen, J. T., K. Bred50 dam. M. Ottesen; Isolaíion of carboxypeptidase Y by affinitv chromatographv.. Carlsbcrg Rés. Commun. 41, 1 — 14. 1976). és amelyet liotilizálí por formájában alkalmaztunk (10 % enzim nátrium-citrátban). Felhasználás előtt az enzimet Sephadcx® G-25 fine (1,5x25 cm) oszlopon sólalanítofluk és desztillált vízzel eluáituk. Az enzimkonccntrációt spektrofotometriásán határoztuk meg E*^' nm = 14.8 érieknél (Johansen, j. T., K. Bredtlam. Ki. Ottesen; Isolaíion of carboxypeptidase Y by aüinity chromatographv, Carlsbcrg Rés. Commun. 41,
1-14. 1976) 7 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot (110 gmál) készítettünk, cs 250—500 μΐ-es mennyiségekben -21 cC-on tároltuk. A bcnzoilalamin-metilésztert (Bz-Ata-OMc) a Bachcm cégtől (Lieastal, Svájc) vásároltuk. A bórtrifluorid-éterát-komplexet (a szintézishez), oldószereket és reagenseket (valamennyit analitikai minő-618(. 734 ségben) a Merck cégtől (Darmstadt, Néniét Szövetségi Köztársaság) szereztük be. Valamennyi, aminosavat, aminosav-amidot és származékait a Sigma Chemical Company (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) gyártotta. A karbobenziloxi-fenilalanin-metilészlert (Z-Phe-OMe) Yamada eljárása szerint [Esterification of N-(benzoyloxycarbonil)-amino acids and amino acids using BF3-etherate as catalyst, Bull. Chem. Soc. Japan 51, 1897-1898, 1978] állítottuk elő és szirupként alkalmaztuk. A fenilalanin-hidrazidot és alanin-hidrazid-hidrokloridot észterből Losse és társai módszere szerint (Racematspaltung von Aminosáureamiden und hidraziden, J. Prak. Chemide, 4, Reihe, Bánd 8, 345-350, 1959) készítettük. A nemkorrigált olvadáspontok 8688 °C (irodalmi: 82—83 °C, lásd utóbbi irodalmi utalást) és 182-185 °C (irodalmi: 184-185 °C, Zeller, E. A., L. A. Blanksma, J. A. Carbon, Ueber die Wirkungvon optisch aktiven Hydraziden auf die Diaminoxydasc, Hclv. Chim. Acta. 40, 257-260, 1957). Az aszparagin-amid-dihidrokioridot aszparaginsavból dietil-észteren át — hagyományos aminolízissel - Fischer módszere alapján (Ueber die Ester dér Aminosauren. Chem. Bér. 34, 433-454, 1901) állítottuk elő. Az olvadáspont 210214 °C, irodalmi: 214-215 °C (Smith E L„ D. J. Spackman; Leucine aminopeptidase V. Activation specificity and mechanism of action, J. Bioi. Chem. 212, 271-299, 1955). A többi kiindulási anyagot a fenti cégektől vásároltuk vagy analóg módszerekkel állítottuk elő.
A kitermelés meghatározása
A termék tisztaságát szilikagél 60 F254-en (Merck) vékonyréteg-kromatográfiával határoztuk meg. Az alkalmazott oldószerrendszer
CHC13/CH3(CH2)OH/CH3COOH/H2O(11:5:2:1) és a foltokat fluoriméterrel határoztuk meg. A reagensek kvantitatív meghatározására nagynyomású folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmaztunk és a Hewlett Packard 1084 kromatográfot egy változtatható hullámhosszúságú UV detektorral láttuk el (Modcl 79 875 A). Az elkülönítéshez 10 mmólos nátriumacetátban levő, 10-100 % CH3CN eluáló rendszer (pH 4) megfelelő specifikus gradiensét alkalmaztuk. Ezt a rendszert alkalmaztuk például a Bz-AIa-Gly-OH, Bz-Ala-Ala-OH, Bz-Ala-Ser-OH vegyülctekhez és amidjaikhoz. Az áramlási sebesség 3 ml/perc volt, az oszlop hőmérséklete 47 °C és a hullámhossz 260 n:n. A kitermeléseket a reagensek — amelyeket az eluációs profil csúcsai alatti részekből gyűjtöttünk — moláris aránya alapján határoztuk meg.
A termék meghatározása
A foltokat vékonyréteg-kromatográfia módszerével, megfelelő standard vegyületek alkalmazásával azonosítottuk. Több terméket a nagynyomású folyadék-kromatográfia (HPLC) és aminosav-analízis módszerének kombinálásával határoztuk meg. E célból 10 perc után a rcakcióclegyből 1 ml mennyiséget vettünk ki és a reakciót 250 μλ 6 mólos HC1 hozzáadásával leállítottuk. A pH-t NaOH-val 4-re állítottuk és az elegyet HPLC-vel elkülönítettük. (Waters-készülék két pumpával, Modcl 660 Solvent Programmer, Model U6K Injector, Modcl 450
VariaMc Wavclcngth Detector és Radiomerer REC 61 vagy Hewlett Packard Recorder/lntcgrator Model 3380. Az eluációt 255 és 280 nm közötti, megfelelő hullámhosszon követtük. A fordított fázisú kromatográfiánál Waíers C-18 μ-Bondapak oszlopot használtunk, metanolban 20 tf% TEAP (trimetil-ammónium-foszfát-puffer) eluáló rendszer alkalmazása mellett és az áramlási sebesség 1,5-2,0 ml/perc volt. A TEAP-puffert Rivier módszere [Use of trialkyl ammonium phosphate (TAAP) buflers in reverse phase HPLC fór high resolution and liigl rccorvcry of peptídes and prolcins. J. Liq. C'hrom.
1. 343—366, 1978] alapján állítottuk elő. Sok esetben a 0.1 mólos ecetsav (pH = 3), 20 °/o 0,1 mólos ecetsav (pH = 3) metanolban rendszer kielégítő elválasztást adóit.
Az elfolyó részt - amely N-acildipeptidet tartalmaz manuálisan gyűjtöttük és Iiofileztiik vagy Büchi Rotovap készüléken 35-45 °C között szárazra pároltuk. A maradékból kis mintát 6 mólos HCI-bcn, 110 °C-on vákuumban, 36 órán át hidrolizállunk. Az cvaporált hidrolizátumot ezután Durrum D-500-as aminosav-analizátorral meghatároztuk.
Szintézis szabad aminosavakkal, mint amin-komponenssel
l. példa
Valinra 0.6 mólos, KCI-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos oldatból 2 ml-t (pH = 9,8) 100 μΐ (0,1 mmól) mólos Bz-Aia-OMe (melyet 96 % etanolban oldottunk) oldattal elegyítettük. A reakciót Radiometer pH-stat készülékben 35 °C-on és pH — 9,8-nél végeztük, mialatt a konstans pH-értékeí 0,5 mólos NaOH automatikus hozzáadásával biztosítottuk. A reakciót 0,7 mg karboxipeptidáz Y (150 cgység/mg és De Forende Bryggericr módszere alapján készült) hozzáadásával indítottuk. 30 perc reakcióidő után a reakciót a pH-érték 6 mólos sósavval történő 1-rc állításával megállítottuk.,A reakcióterméket tisztítottuk és nagynyomású kromatográfiával elválasztottuk. A Bz-Ala-Val-OH kitermelése 40 % volt. A termék 24 órán át és 6 mólos HC!-ben végzet! hidrolízise után nyert mennyiségi aminosav-analízis eredménye 1,(1 mól alanin és 1,0 mól valin.
A pH hálását, hőmérsékletet, szubsztrát-komponens, anii t-komponens és C'PD-Y koncentrációját kitermelésre Bz-Ala-OMe + H-Val-OH SZILI Bz-A)a-Val-OH + + C H3OH reakció függvényében, a fentiekben leírt módszer szerint végzett 5 kísérletben megvizsgáltuk. Valamennyi kísérletben a paraméterek egyikét az alábbiakban változtattuk, míg az összes többit konstans értéken tartottuk: 0.6 mólos valin, 55 mmólos Bz-AIa-OMe, 4.5 mmólos CPD-Y. pH 9,7. 35 °C. Az eredményeket az 1. ábra szemlélteti. Az la ábrából látható, hogy a kitermeléshez optimális pH-tártomány igen szűk és mindössze 0.5 pH egységre tcr)cd. Az Ab ábra mutatja, hogy a reakcióhőmérséklet növekedése viszonylag kisebb hidiolízis mialt a szintézis lineáris növekedését okozza. Azonban a 45 °C feletti .hőmérsékleten megfigyelhető cnzlm-inakliválódás és ncin-cnzimatikus észter-hidrolízis mái gátolja a kívánt reakciót. Alacsonyabb hőmérsékleti értékeken, egészen pH 10-ig az észter hidrolízise elhanyagolható a 10 perces standard reakcióidőn belül. Ez akkor válik fontossá, ha az enzimatikus reakció gátolva van és
ISO 73» a reakcióidő 2-5 óra. Míg a Bz-Aia-Val-OH kitermelések a magasabb amin-komponerts koncentrációval nőttek (Id ábra), addig a kitermelés és Bz-Ala-OMe szubsztrátkomponens koncentrációja közötti összefüggés fordított (1c ábra). Ez utóbbi megfigyelés szerint, valamint a kitermelés enzimkoncentrációtól való függősége miatt (le ábra) kívánatos egy optimális szubsztrát-enzim koncentrációarány.
A korábban ismertetett reakcióegyenlet alapján végzett reakció időfüggésének optimumát a 2. ábra szemlélteti. 0,5 mólos valin jelenlétében a Bz-Ala-OMe szubsztrátot viszonylag gyorsan (20 percen belül) 38 %bán Bz-Ala-Val-OH-vá és 62 %-ban Bz-Ala-OH-vá alakítottuk. Az ábrából az is kiderül, hogy a dipeptid pH 9,7-néI vaiinfelesleg jelenlétében nem hidrolizált. Azonban ha a pH-értéket 5 és 8 közé állítottuk, akkor az összes Bz-Ala-Val-OH-t másodperceken belül sikerült hidrolizálnunk. A CPD-Y ezen szelektív viselkedése magas pH-nál nagy jelentőségű a peptidszintézisben.
2. példa
Lizinre 3 mólos, KCl-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos (pH = 9,8) oldat 2 ml-éí 100 %-os metanol 400 μΐvel és I mólos Z-Phe-OMe (100 %-os metanolban oldva) 100 μΙ-ν.Ί (0.01 mmól) kevertük. A reakciót az 1. példában leírt módszer alapján végeztük cs 0,7 mg karboxípeptidáz-Y hozzáadásával indítottuk. 30 perc reakcióidő letelte után a pH-t 6 mólos sósavval 1-re állítottuk. A reakcióterméket tisztítottuk és nagynyomású kromatográfiával elkülönítettük. A Z-Phe-Lys-OH kitermelése 60 % volt. Az 1. példában leírtak szerint végzett kvantitatív aminosav-analízis eredménye azt mutatta, hogy a termék 1,0 mól lizint és 1,0 mól fcnilalanint tartalmazott.
Az 1. és 2. példákban leírtakhoz hasonlóan készítettük az J. táblázatban szereplő peptideket a korábban említett kiindulási anyagokból. Valamennyi kísérletet Radiometer pH-staí készülékben végeztük és a kitermeléseket az előzőekben említett HPLC-módszerre! határoztuk meg. Kísérleti paraméterek: 4.5 mmólos CPD-Y, pH 9,7 és 35 °C.
/. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-na! katalizált peptidszintézis szabad aminosavakkal, mint amin-komponcnsekkcl
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Bz-Ala-OMc Glicin (3,0 mól) Bz-AIa-Gly-OH 62
(55 mmól) Alanin (1,9 mól) Bz-Ala-Ala-OH 65
Valin (0,6 mól) Bz-Ala-Val-OH (1. példa) 40
Leucin (0,17 mól) Bz-Ala-Leu-OH 24
Fcnilalanin (0,16 mól) Bz-Ála-Phe-OH 27
Szerin (3.2 mól) Bz-Ala-Ser-OH 50
Treoniri (0,7 mól) Bz-Ala-Thr-OH 24
Metionin (0,6 mól) Bz-Ala-Met-OH 46
Lizin (1,5 mól) Bz-AIa-Lys-OH 56
Arginin (0.8 mól) Bz-Aía-Arg-OH 26
Asparaginsav (1,0 mól) Bz-Ala-/\sp-OH 0
Asparagin (0,6 mól) Bz-Ala-Asn-OH 5
Glutaminsav (1,2 mól) Bz-Ala-Glu-OH 0
Glutaminsav-V-metil-ész.ter (1,0 mól) Bz-AIa-Glu(OMe)-OH 30
Z-Plic-OMe Valin (0,6 mól) Z-Phe-Val-OH 6
(55 mmól) Lizin (3,0 mól) Z-Phe-Lys-OH (2. példa) 60
Bz-Phe-Gly-OMe (30 mmól) Valin (0,6 mól) Bz-Phe-Gly-V al-OH 40
Z-Ala-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-Gly-OH W
(10 mmól) Alanin (0,7 mól) Z-Ala-Ala-OH 60
Lenéin (0.15 mól) Z-Ala-Leu-OH 21
Lizin (1,5 mól) Z-Ala-Lys-OH 60
Bz-Gly-OMe Glicin (2,0 mól) Bz-Gly-Gly-OH 63
(20 mmól) Leucin (0.15 mól) Bz-Gly-Lcu-OH 21
Bz-Tyr-OEt Valin (0,6 mól) Bz-Tyr-Val-OH 30
(25 mmól) Alanin (1,9 mól) Bz-Tyr-AIa-OH 46
Arginin (0,8 mól) Bz-Tyr-Arg-OH 35
186 734
/. táblázat folytatása
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Ac-Phe-OEt (50 mmól) Alanin (0,8 mól) Ac-Phe-Ala-OH 85
Z-AIa-Ala-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-AIa-Gly-OH 40
(10 mmól) Leucin (0,15 mól) Fenilalanin (0,15 mól) Z-Ala-A!a-Leu-ÖH Z-Ala-Ala-Phe-OH 0 0
Z-Ala-Phe-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-Phc-Gly-OH 35
(10 mmól) Leucin (0,15 mól) Z-Ala-Phe-Leu-OH 0
Z-Ala-Ser-OMe (10 mmól) Leucin (0,15 mól) Z-Ala-Ser-Leu-OH 40
Z-Ala-Val-OMe Leucin (0,15 mól) Z-Ala-Val-Leu-OH 25
(10 mmól) Lizin (1,5 mól) Z-Ala-Val-Lys-OH 60
Z-Ala-NLeu-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-NLcu-Gly-OH 60
(10 mmól) Leucin (0,15 mól) Z-Ala-NLeu-Lcu-OH 16
Z-A|a-Met-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-Met-Gly-OH 50
(10 mmól) Leucin (0,15 mól) Z-Ala-Met-Leu-Oll 15
Z-Ala-Trp-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-Trp-Gly-OH 23
(10 mmól) Leucin (0,15 mól) Z-Ala-Trp-Leu-OH 3
Z-Ala-Trp-OMe Fenilalanin (0,15 mól) Z-Ala-Trp-Phc-OH 0
(10 mmól) Lizin (1,5 mól) Z-Ala-Trp-Lys-OH 36
Z-Ala-Ala-Tyr-OMe Leucin (0,15 mól) Z-Ala-Ala-Tvr-Lcu-OH 0
(10 mmól) Lizin (1,5 mól) Alanin (1,7 mól) Z-Ala-Ala-Tyr-Lys-OH Z-Ala-Ala-Tyr-Ala-OH 23 31
Szintézis aminosav-amidokkal, . mint amin-komponenssel
3. példa 45
Metionin-amid (Met-NH2-ra 0,6 mólos KCl-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos (pH 9,8) oldatból 2 ml-t 1 mólos Bz-Ala-OMc 96 % metanolban lcvfí oldatának 100 /zL-vel (0,1 mmól) elegyítettük. A reakciót az 59 1. példában leírtak szerint végeztük és 0,7 mg karboxi-peptidáz-Y hozzáadásával indítottuk. 30 perc reakcióidő letelte után a pH-t 6 mólos HCI hozzáadásával I -re állítottuk. A reakcióterméket tisztítottuk és a nagynyomású kromatográfia módszerével elkülönítettük. 55 A Bz-Ala-Met-NH2 kitermelése 95 % volt. Az 1. példában említett kvantitatív aminosav-analízís szerint a termék 1,0 mól Ala-t, 1,0 mól Met-t és 1,0 mól NH3-at tartalmazott.
A reakció lefolyását a 3. ábra szemlélteti, amelyből θθ kiderül, hogy 20 percen belül a szubsztrát majdnem teljes mértékben, kb. 95 %-ban dipeptiddé alakul, 5 %-a Bz-Ala-OH-vá hidrolizálódík.
4. példa
Valin-amidra (Val-NH2) 0,4 mólos, KCl-re 0,1 mólos és F.DTA-ra 1 mmólos (pH 9,5) oldatnak 2 ml-ét 96 %-os etanolban levő 1 mólos Bz-Ala-OMe oldatnak ΙΟΟμΙ-vel (0.1 mmól) elegyítettük. A reakciót az i. példában leírtak szerint végeztük. A Bz-Ala-Val-NH2 reakciótermék a reakció során kicsapódott. 20 perccel ezután a pH-t 1 -re állítottuk és a csapadékot centrifugálással elkülönítettük. A terméket 96 %-os etanol 1 ml-ében feloldottuk, majd tisztítottuk, végül nagynyomású kromatográfiával elkülönítettük. A Bz-Ala-Val-NH2 kitermelése 95 % volt, míg az I. példában - amikor amin-komponensként szabad aminosavat használtunk - csak 40 %-ot kaptunk. Az I. példában leírtak szerinti kvantitatív aminosavanalízís eredménye 1,0 mól alanin, 1,0 mól valin és l.OmólNHj.
A reakciószekvencia pH-tól és valin-amid-koncentrációtól való függését a 4. ábra mulatja. A reakciót a fenti szintézishez hasonlóan végeztük a következő paraméterek mellett: 0,6 mólos valin-amtd. 55 mmólos Bz-Ala-OMe. 4.5 mólos CPD-Y. pH 9,7, 35 °C.
186 731
A 4. ábrából megállapítható, hogy a kitermelés nagymértékben független a valin-amid-koncentrációtól, ellentétben az 1D ábrával, ahol a kitermelés a valin-koncentrációtól (már az ekvimoláris vagy a szubsztrát koncentrációnál magasabb koncentrációknál) függött.
A 4A ábrából látható, hogy a valin-amidnak megfelelő pH-tartomány 9-ig terjed cs 9,8-nél van egy éles felső határ, ahol a kitermelés erősen esik.
A 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a 51. táblázatban szereplő peptideket a már említett kiindulási anyagokból. A kísérleteket az alábbi paraméterek mellett végeztük: 4,5 mólos CPD-Y, pH 9,6 5 és 35 °C, valamint a szubsztrát-koneentrációí a táblázatban leírtuk.
//. táblázni
Karboxípeptidáz-Y-nal katalizált pepódszintézis aminosav amidokkal, mint amin-koniponensekkel
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Bz-Ala-OMe Gücin-amid 0.3 mól) Bz-Ala Gly-NHZ 90
(55 mmól) Szcrin-amid (0,3 mól) Bz-Ala-Ser-NHj 90
Valin-amid (0,4 mól) (4. példa) Bz-AIa-Val-NHj 95 b)
Leucin-amid (0,3 mól) Bz-Ala-Leu-NH2 85
Metionin-amid (0,6 mól) Bz-Ala-Met-NH2 95
Fenilalanin-amid (0,3 mól) Bz-Ala-Phe-NHj 90 b)
Tirozin-amid (0,6 mó!) Bz-Ala-Tyr-NH2 90
Aszparagin-amid (0,3 mól) Bz-Ala-Asn-NH2 80
Prolin-amid (0,3 mól) Bz-Ala-Pro-NH2 0
Glutaminsav-amid (0.25 mól) Bz-Ala-G!u-NH2 0
Hisztidin-amid (0,2 mó!) Bz-Ala-His-NH2 89
Treonin-amid (0,2 mó!) Bz-AIa-Thr-NHí 88
Z-Phe-OMe Valtn-aniid (0,5 mól) Z-Phe-Va!-NH2 97 b)
(55 mmól) Szerin-amid (0,4 mól) Z-Phe-Ser-NHü 60
Tirozin-amid (0,4 mól) Z-Phe-Tyr-NHz 64
Bz-Plie-Gly-OMe (30 mmól) Valin-amid (0.4 mól) Bz-Phe-Gly-Val-NH2 90
Z-Phe-Ala-OMe (20 mmól) Valin-amid (0,4 mól) Z-Phe-Ala-Val-NH2 90 b)
Z-Phe-Ala-OMe Glicin-amid (0.4 mó!) Z-Phe-Ala-Gly-NHj, 95
(20 mmól) Hisztidin-amid (0,4 mól) Z-Phc-Ala-His-NH2 50
Z-Leu-Gly-Gly-OEt (10 mmól) Valin-amid (0,4 mól) Z-Lcu-Gly-GIy-Val-NH2 80
Bz-Tyr-OEt Valin-amid (0,25 mól) Bz-Tvr-VaI-NH2 94
(50 mmól) Glicin-amid (0,55 mó!) Bz-Tyr-Gly-NHZ 82
Z-Ala-OMe Leucin-amid (0,15 mól) Z-Ala-Lcu-NH2 90
(10 mmól) Glicin-amid (0.15 mól) Z-Ala-Gly-NHz 20
Bz-Arg-OEt (75 mmól) Tirozin-amid (0.2 mól) B7-Arg-Tyr-NH2 52
Bz-Tyr-OEt Valin-amid (0.25 mól; Bz-Tyr-Val-NHZ 94
(50 mmól) Glicid-amid (0.55 mól) Bz-Tyr-Gly-NH2 82
Z-Pro-OMe Leucin-amid (0,25 mól) Z-Pro-Leu-NHz 0
(50 mmól)
-101
186 734
H. táblázat folytatása
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) 3 érmék Kitermelés %-ban
Bz-Gly-OMe Hisztidin-amid (0,2 mól) Bz-GIy-His-NHj 20
(100 ni mól) Glicin-amin (0,55 mól) Leucin-amid (0,25 mól) Bz-Gly-Gly-NH2 Bz-Gly-Lcú-NHz 95 95
Z-Ala-Phc-OMe Leucin-amid (0,15 mói) Z-Ala-Phc-Leu-NH2 95
(10 mniól) Glicin-amid (0,15 mól) Z-Ala-Phe-Gly-NH2 84
Z-AIa-Ala-OMe Glicin-amid (0,15 mól) Z-AIa-Ala-G!v-NH2 100
(10 mmól) Leucin-amid (0,15 mól) Z-AIa-Ala-Leu-NHz 100
Z-Ala Ser-OMe Leucin-amid (0,15 mól) Z-A la-Ser- Leu-N H2 95
(10 mmól) Glicin-amid (0,15 mól) Z-Ala-Ser-Gly-NH2 70
Z-AIa-Vai-OMe Laucin-amid (0.15 mól) Z-Ala-Val-Leu-NHj 84
(10 mmól) Glicin-amid (0,15 mól) Z-AIa-Val-Gly-NH2 100
Z-Ala-NLeu~OMe Leucin-amid (0,15 mól) Z-Ala-NLeu-Lcu-N H2 100
(10 mmól) Glicin-amid (0,15) Z-Ala-NLeu-Gly-NH2 100
Z-Ala-Met-OMe (10 mmól) Glicin-amid (0,15 mól) Z-Ala-Met-Gly-NH2 95
Z-Ala-Trp-OMe Glicin-amid (0,15 mól) Z-Ala-Trp-C.ly-NH2 84
(10 mmól) Leucin-amid (0,15 mól) Z-Ála-Trp-Lcu-NH2 89
Z-Thr-Pro-OMe (25 mmól) Vaiin-amid (0,2 mól) Z-Thr-Pro-Val-NH2 95
Z-A!a-Ala-Tyr-OMe Glicin-amid (0,15 mó!) Z-Ala-Ala-Tyr-Gly-NH2 100
(10 mmól) Leucin-amid (0,15 mól) Z-AIa-Ala-Tyr-Leu-NH2 100
Z-Tyr-Gly-Giy-OMc (20 mmól) Fcnilalanin-amid (0,2 mói) Z-Tyr-Clly-Gly-Phe-NH2 40
b) A termék kicsapódott.
5. példa
Szintézis aminosav-hidrazidokkal mint amin-komponensekkel
A 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a 111. táblázatban szereplő peptideket a korábban említett kiindulási anyagokból. Á kísérleteket a következő paraméterek mellett végeztük: 4,5 mólos CPD-Y, pH 9,6 és 35 rC.
Hl. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis aminosav-hidrazidokkal mint amin-komponensekkc!
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termek Kitermelés %-ban
Bz-Ala-OMe Alanin-bidrazid (0,6 mól) Bz-Ala-A1a-NH-NH2 37
(55 mmól) Fenilalanin -hidrazid (0,3 mói) Bz-Ala-Phe-NH-NHj 80
-111
Ι86 734
6. példa
Szintézis aniinosav-észterekkel, mint amin-komponensekkel
Az 1., 2., 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon végeztük a kísérleteket az aminosav-csztcrekkel, Radiometer pH-stat készülékben 9,0-9,7 pH-náf és 23—35 °C-on. A terméket és kitermelést HPLC-módszcrrcl határoztuk meg. A CPD-Y koncentrációja 4,5 és 1 I mól volt.
Λ IV. táblázatban szereplő peptideket is az említett kiindulási anyagokból nyertük.
Látható, hogy bizonyos esetekben oligomerizáció történt. Tekintettel arra, hogy a kitermelések igen magasak, az aminosav-észterek különösen jól alkalmazhatók, ha az oligomerizáció korlátozható.
IV. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis aminosav-észterekkel mint amin-komponensekkcl
Szubsztrát (konc.)
Bz-Ala-OMe (50 mmól)
Bz-Ala-OMe (50 mmól)
Amin-komponens Termék (konc.)
Kitermelés %-ban
Glicinetil-észter 1 Bz-Ala-Gly-OH ) 1
(0,5 mól) Bz-Ala-Gly-Gly-OH 100
Glicin propil észter l Bz-Ala-Gly-OH ) 85
(0,5 mól) Glicin izopropil észter Bz-Ala-Gly-OH 90
(0,5 mól) Glicin butil észter Bz-Ala-Gly-OH 80
(0,5 mól) Leucin metil észter Bz-A!a-Leu-OH
(0,25 mól) Bz-AIa-Leu-Leu-OH 85
Bz-Ala-Leu-Leu-Leu-OH *
Leucin etil észter Bz-Aía-Lcu-Leu-Leu-Leu- -OH f Bz-Ala-Leu-OH | 50
(0,25 mól) , Bz-AIa-Leu-Leu-OH (
Leucin-t-butil észter [ Bz-Ala-Lcu-OÍI J 0
(0,25 mól) Fenilalanin metil észter f Bz-AIa-Phe-OH 1 Bz-Ala-Phe-Phe-OH 1 80
(0,25 mól) l Bz-Ala-Phe-Phe-Phe-OH J
Fenilalanin etil észter | Bz-Ala-Phe-OH 1 70
(0.15 mól) | Bz-AIa-Phe-Phe-OH J
Glutaminsav (y-t-Bu) Bz-AIa-Glu
metil észter (0,5 mól) (y-t-Bu)-OH 35
Glutaminsav (γ-t-Bu) Bz-AIa-Glu
t-butil észter (0,25 mól) (y-t-Bu)-OH 0
( Metíonín metil észter s Bz-Ala-Met-OH Bz-Ala-Met Met-OH Bz-Ala-Mct-Mct-Met-OH l 86
(0,2 mól) < Bz-AIa-Mct-Met-Met- >
! Metionin etil észter Met-OH | Bz-Ala-Met-Met-Met- - Met-Mct-OH Bz-Ala-Mct-OH 40
(0,2 mól) Methionin izopropil észter Bz-Ala-Mct-OH 8
(0,2 mól) Valin metil észter / Bz-Ala-Val-OH | 85
(0,7 mól) | Bz-AIa-Val-Val-OH j
Szerin metil észter Bz-Ala-Ser-OH 50
(0,5 mól) Tirozin metil észter Bz-Aia-Tyr-OH 25
(0,5 mól) Arginin metil észter Bz-Ala-Arg-OH 0
(0,5 mól)
-121 ί 86 ?3· / V. táblázás folysasása
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Arginin (NO2) metil < (0,5 mól) észter Bz-AIa-Arg(NO2)OH 40
Hisztidin metil észter Bz-Ala-His-OH 26
(0,5 mól) Treonin metil észíer Bz-Ala-Tbr-OH 47
Ac-Phe-OEt Alanin metil észter Ac-Phe-Ala-OH 60
(50 mmól) 5,0 mól) Ac-Phe-Ala-Ala-OH
Bz-Gly-OMe Hisztidin metil észter Bz-Gly-His-OH 40
(50 mmól) (0,5 mól)
7. példa
Az amino-kortiponens L- cs D-sztereoizomcijei
Az 1., 2., 3., 4. és 6. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő az V. táblázatban szereplő peplidcket a már említett kiindulási anyagokból.
Látható, hogy az csak L-izomereket tartalmaz. Ez az eljárás gazdaságossági szempontjából egy igen lényeges adat, mert következésképpen nem szükséges a kiindulási aminosavakat külön tisztítással elkülöníteni, hogy tiszla L-izomert nyerjünk.
V. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis az amin-komponens L- és D-izomerjcivel
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kite L- izot rmelés D- ner
Bz-Ala-OMe Valin (0,6 mól) Bz-Ala-Val-OH 42 0
(50 mmól) Alanin (1,8 mól) Bz-Ala-Ala-OH 65 0
Bz-Tyr-OEt Valin (0,6 mól) Bz-Tyr-Val-OH 30 0
(30 mmól) Alanin (1,8 mól) Bz-Tyr-Ala-OH 46 0
Bz-Ala-OMe . (50 mmól) VaI-NH2 (0,25 mól) I:z-Ala-Val-NH2 78 0
Bz-Tyr-OEt (30 mmól) Val-NH2 (0,25 mól) Bz-Tyr-Val-NHZ 95 0
Ac-Phe-OEt (50 mmól) Ala-OMe (0,5 mól) ( Ac-Phe-Ala-OH | 1 Ac-Phe-(Ala)2-OH j 60 0
-131
186 734
S. pe’ida
A szubsztrát észter-csoportjainak változtatása
Az 1., 2., 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a VI. táblázatban felsorolt peptideket, korábban ismertetett kiindulási anyagokból.
Az eredmények bizonyítják a találmány szerinti eljárás jó alkalmazhatóságát különböző szubsztrátok vonatkozásában.
Szubsztrát Bz-Gly-OMe Bz-Gly-OEt Bz-Gly-OiPr Bz-Gly-OBzl
Amin-komponens (20 mmó!) (20 mmól) (20 mmól) (20 mmól)
Glicin (2,0 mól) 63 56 45 47
Glicin-amid (0,15 mól) 59 95 88 91
Leucin (0,15 mól) 21 59 74 80
Leucin-amid (0,15 mól) 95 100 95 95
9. példa
A depszipeptidek mint szubsztrátok
A 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a VII. táblázatban szereplő peptideket, a korábban leírt kiindulási anyagckból.
A főbb paraméterek a következők voltak: 4,5 /zmól CPD-Y, pH = 7,6 és 25 °C.
A táblázatból látható, hogy igen magas kitermeléseket' kaptunk.
VII. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis depszipeptidekkel, mint szubsztrát-komponensekkel
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Bz-Gly-OGIy Glicin-amid (0,25 mó!) Bz-Gly-Gly-ΝΗϊ 90
(20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Fenilalanin-amid (0,25 mól) Bz-Gly-Leu-NH2 Bz-Gly-Phe-NHg 95 95 f
Bz-Gly-OPhe Glicin-amid (0,25 mól) Bz-Gly-Gly-NHs 95
(20 mmól) Leucín-atnid (0.25 mól) Fenilalanin-amid 1 (0.25 mól) Bz-Gly-Leu-NHj Bz-Gly-Phe-NH2 95 95
Bz-Phe-OGlv Glicin-amid (0,25 mól) Bz-Phe-Gly-NH2 90
(20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Fenilalanin-amid (0,25 mól) Bz-Phe-Leu-NH2 Bz-Phc-Phc-NHj, 80 80
-14I SO 734
10. példa
Peptidek mint szuhsztrát-komponensek
Az L, 2., 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a Vili. táblázatban szereplő peptideket. A kísérleteket Radiomeícr ρΗ-stat készülékben végeztük és a kitermeléseket HPLC-módszer alapján határoztuk meg. A reakció jellemzői: 5 pmól CPD-Y, pH = 7,6 és 25 °C.
Vili. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis peptidekkel, mint szubszlrátokkal
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Bz-Phe-Gly (20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Bz-Phe-Leu-NH2 90
Bz-Gly-Phe (20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Bz-Gly-Leu-NH2 10
Z-Ala-Ala (20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Z-Ala-Leu-NH2 74
Z-Phe-Ala (20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Z-Phe-Leu-NH2 60
Z-Phe-Ser (20 mmól) Leucin-amid (0,25 mól) Z-Phe-Leu-NH2 70
Peptidszintézis a pH változtatásával
Azokban az esetekben, amikor a szintetizált peptid a CPD-Y számára nem megfelelő, a szintézist az egyébként előnyös 9-10,5 pH-tartomány alatti értékeken végezzük.
17. példa
Az 1. és 3. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a IX. táblázatban felsorolt peptideket, pH-stat készülékben cs a megadott pH-értékck mellett.
A reakció jellemzői: 15 μιηόΐ CPD-Y és 25 °C.
IX. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis a pH függvényében
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék PH Kitermelés %-ban
Bz-Ala-OMe Glicin Bz-Ala-Gly 9,5 40
(50 mmól) (1,3 mól) 9.0 57
8,0 60
7.0 61
6.0 60
5,0 51
Glicin-amid Bz-Ala-GIy-NH2 9.5 77
(1,3 mól) 9,0 . 95
8,0 100
7.0 97
6,0 44
12. példa
Különböző más amin-komponcnsek
A 3. és 4, példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk ció a X. táblázatban szereplő peptideket. A kísérleteket pH-stat készülékben végeztük és a kitermeléseket HPLC alapján meghatároztuk. A reakció jellemzői: 4,5 μηιόΐ CPD-Y, pH = 9,7 cs 25 °C.
-151
186 734
A', táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nai aktivált pepiídszintézis különböző aminosav-származékokkai, mint amín-komponensekkel
Szubsztrát (konc.) Amin-komponcns (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Bz-Ala-OMe (8-alanin-amid (0,2 mól) Bz-Ala-/3-Ala-NH2 80
(50 mmól) Glicin hidroxámsav (0,2 mól) Bz-AIa-Gly-NH-OH 45
D, L-alanin hidroxámsav (0,2 mól) Bz-Ala-Ala-NH-OH 40
13. példa
Peptidszintézis árpa-karboxipeptidázzal
A csírázó árpa, például maláta formájában két különböző peptidázt tartalmaz, melyek elnevezése CP-1-1 és CP-2-1 (Lee E. Ray, Carlsberg Rés. Comm. 41, 169182, 1976).
A CP-1-1 és CP-2-1 elkülönítését L. E. Ray eljárása alapján végeztük és az 1., 2., 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a XI. táblázatban felsorolt peptideket, a korábban ismertetett kiindulási anyagokból. A reakció jellemző’ ·. 6 gmól CP-1-1 vagy CP-2-1, pH = 8,0 és 25 °C.
XI. táblázat
Peptidszintézis csírázó árpából származó CP-1-1 és CP-2-1 karboxipeptidázokkal
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés % Enzim
Bz-A!a-OMe Valin-amid Bz-Ala-Val-NHZ 43 CP-1-1
(50. mmól) (0,25 mól) Alanin-amid Bz-Ala-Ala-NH2 58 CP-1-1
(0,25 mól)
Lizin Bz-Ala-Lys 11 CP-1-1
(1,7 mól) Valin-amid Bz-Ala-Va1-NH2 57 CP-2-1
(0,25 mól) Alanin-amid Bz-Ala-Ala-NHZ 64 CP-2-1
(0,25 mól) Lizin (1,7 mól) Bz-Ala-Lys 11 CP-2-1
14. példa
A peptid-amidok karboxipeptidáz-Y által katalizált dezamidálása mmói Bz-Ala-Leu-NH2-re 15 mmólos, KCI-rc 0,1 mólos, EDTA-ra és dimetil-formamidra 10 %-os oldatnak 2 ml-éhez 2 mg CPD-Y-t adtunk, A reakció lefutását GPLC módszerével vizsgáltuk és az 5. ábrán szemléltetjük. Látható, hogy a Bz-Ala-Leu-NII2 20 perc után teljesen áílakult és kb. 68 %-ban Bz-Ala-Leu-OH, továbbá 32 %-ban Bz-Ala-OH keletkezett. A reakcióelegyből végzett aminosavanalízis azt mutatta, hogy a
Bz-Ala-OH főleg a Leu-NH2 lehasadásával képződött 50 a Bz-Ala-Leu-NHz-ből.
15. példa
Az N-terminális védőcsoportokkal rendelkező és nem rendelkező peptid-észter szubsztrátok összehasonlítása
A 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állí60 tottuk elő a XII. táblázatban szereplő peptideket. A reakció jellemzői: 50 mmől szubsztrát, 5 /rmól CPD-Y, pH = 9,5 és 25 °C.
-161
ISO 734
Xll táblázat
Az N-terminális védőcsoportokka! rendelkező és nem rendelkező pcptid-ész.ter szubsztrátok összehasonlítása a karhoxipeptidáz-Y által katalizált peptidszintézis során
Szubsztrát (konc.) Amin-komponcns (konc.) Termék Kitermelés %-ban
Ac-Ala-Ála-AIa-OMe Leucin-amid (0,15 mól) Ac-Ala-Aía-A!a-Leu-NH2 90
(50 mmól)
Ala-Ala-Ala-OMe Leucin-amid (0,15 mól) Ala-Ala-Ala-Leu-NHí 75
(50 mmól)
példa
Szerves oldószerek jelenlétében végzett szintézis
Az 1., 2., 3. és 4. példákban leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a XIII., XIV. és XV. táblázatokban felsorolt peptideket, a már korábban ismertetett kiindulási anyagokból és a szerves oldószerek megadott koncentrációi mellett. A reakció főbb jellemzői: 50 mmól szubsztrát, 5 μ mól CPD-Y, pH = 96 és 30 °C.
XIII. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis 50 mmól Bz-Ala-OMe szubsztrát és szabad aminosav mint amin-komponens felhasználásával, % metanollal vagy anélkül, KCI-re 0,1 mólos, EDTA-ra 1 mmólos oldatban
Amifi-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban
McOH-val MeOH nélkül
Valin (0,6 mól) Bz-Ala-Val-OH 53 42
Threonin (1,2 mól) Bz-AIa-Thr-OH 61 52
Fenilalanin (0,16 mól) Bz-Ala-Phe-OH 18 16
Leucin (0,16 mól) Bz-AIa-Leu-GH 39 33
Metionin (0,6 mól) Bz-AIa-Met-OH 64 42
Glicin (3,0 mól) Bz-A!a-Gly-OH 50 55
Szerin (3,2 mól) Bz-Ala-Ser-OH 52 50
Lizin (1,5 mól) Bz-Ala-Lvs-OH 41 53
Glutaminsav-y-t-buti lészter Bz-Ala-Glu-(y-OBut)-OH 55 54
(1,0 mól)
Aszparagin (0,6 mól) Bz.-AIa-Asn-OH 14 18
XIV. táblázat
Bz-Ala-Thr-OH karboxipeptidáz-Y-nal katalizált szintézise 50 mmólos Bz-Ala-OMe-bő! és treoninból a polietilénglikoI-300 (PEG-300) különböző koncentrációi mellett Főbb reakciójellemzők: 4 pmól CPD-Y, pH = 9,6 és 25 °C
0,1 mól KCl-ben PEG-300 %-a Trconin koncentráció Bz-Ala-Thr-OH kitermelés %-ban
0 0,7 mól 36
10 0,7 mól 34
20 0,7 mól 31
30 0,7 mól 29
40 0,35 mól 28
-171 ! 8(> 734
XV. táblázat
Karboxipeptidáz-Y-na) katalizált peptidszintézis 50 mmólos Bz-Ala-OMe-ből és felsorolt aminosav-észterekből polietüénglikolra 30 %-os, KCl-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos oldatban A reakció jellemzői: CPD-Y — 8 μπιόΐ, pH = 9,6 és 25 °C
Szubsztrát (konc.)
Amin-komponens (konc.)
Termék
Kitermelés /o
Bz-Ala-OMe (50 mmó!)
Valin-OMe (0,5 mól) Bz-Ala-Val-OH 1 Bz-Ala-Val-Val-OH J 88
Szerin-OMc (0,5 mól) Bz-Ala-Ser-OH 30
Glutaminsav-(y-OBut)-OMe (0,5 mól) Bz-A!a-Glu- (y-OBut)-OH 38
Fenilalanin-OMe Bz-AIa-Phe-OH 82
(0,5 mól) Bz-Ala-Phe-Phe-OH
L-Metionin-OMe Bz-Ala-Met-OH 85
(0,5 mól) Bz-Ala-Met-Met-OH Bz-Ala-Met-Met-Met-OH
D-Metionin-OMe (0,5 mól) Bz-Ala-D-Met-OH 0
I7. példa
Nem oldható (immobilizált) karboxipeptidáz-Y 30
A CPD-Y-t Concanavalin A-Sepharose 4B-hez (Pharmacia Fine Chemicals) kapcsoltuk, majd a CPD-Y-t és Concanavalin A-t Hsiao és Royer módszere alapján (Archives of Biochemistry and Biophysics, 198, 379385, 1979) glutáraldchiddel térhálósítoituk. A CPD-Y koncentiációja 3 mg volt 1 mi csomagolt Sepharose-ra számolva.
Az 1. és 3. példában leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a XVI. táblázatban felsorolt peptideket, a következő paraméterek mellett: 50 mmól szubsztrát, 0,25 ml CPD-Y gél (5 Mmól CPD-Y). pH = 9,7 és 35 °C. Az enzim szűréssel történő eltávolítása után a terméket és 3S kitermelés! CPLC módszerrel határoztuk meg.
XVI. táblázat
Nem oldható karboxipcptidáz-Y által katalizált peptidszintézis
Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %
Bz-Ala-CMe Fenilaianin (0.15 mól) Bz-Ala-Phe 21
(50 mmól) Leucin-amid (0.2 mól) Bz-AIa-Leu-NHí 91
18. példa
Bz-Ala-Leu-NH2-re 5 mmólos, KCl-re 0,1 mólos, EDTA-ra 1 mmólos, dimetil-formamidra 10 %-os oklatot 10,0 pH-értéknél 25 °C hőmérsékleten összekeverünk 0,25 mól valin-amiddal. A reakciót 40 μπιόΐ CPD-Y adagolásával indítottuk be és a 3. cs 4. példában leírtak szerint folytattuk le. A Bz-A!a-Leu-Val-BH2-t nagynyomású folyadékkromatográfiásán izoláltuk 65 %-os kitermeléssel.
Az eljárás! megismételtük, azzal az eltéréssel, hogy szubsztrát komponensként 5 mmól Bz-Ala-Phe-NH2-t alkalmaztunk. így nagynyomású folyadékkromatográfiásán 44 %-os kitermeléssel izoláltuk a Bz-AIa-Phc-Val-NH2-t.

Claims (9)

  1. I. Eljárás A-B általános képletű — mely képletben
    55 Λ jelentése N-terminálisan védett L-aminosav-gyök \agv C-tei minális L-aminosavvai rendelkező, adott esetben N-tcrminálisan védett peptid-gyök és
    B jelentése adott esetben C-terminálisan védett L-aminosav-gyök —
  2. 2-6 tagú peptidek előállítására valamely szubsztrátkomponensnek egy amin-komponenssel enzim jelenlétében történő reakciójával, azzal jellemezve, hogy szubsztrát komponensként az alábbi vegyületek vala65 melyikéi
    -18ί «ίι 734
    a) A-OR1 általános kcpletű - mely képletben A jelentése azonos a fentiekben megadottakkal, R1 jelentése 1-4 szénatomos alkii- vagy fenil-(!-4 szénatomos a!kii)-csoport vagy egy aminosav alfa-dezamino fragmense — aminosav-észter peptíd-észter, depszipeptid,
    b) ANH2 képletű - mely képletben A jelentése a már megadott — aminosav-amid és peptid-amid,
    c) A-X általános képletű - mely képletben A jelentése azonos a fentiekben megadottakkal és X jelentése egy aminosav, adott esetben N-terminálisan védeti peptid, az alábbi vegyületek valamelyikével mint amin-komponenssel '5
    a) H-B-OH általános képletű L-aminosav- amelyben B jelentése a tárgyi körben megadott,
    b) adott esetben N-szubsztituált, H-B-NR3R3’ általános képletű - mely képletben B jelentése aminosav- 20 maradék és R3 és R3’ jelentése hidrogénatom, hidroxi-, amino-csoport - L-aminosavamid,
    c) H-B-OR4 általános képletű — mely képletben B jelentése aminosavmaradék és R4 jelentése 1-4 szénatomos alkil-csoport - aminosav-észter, 25
    L-specifikus szerin- vagy tiol-karboxipeptidáz enzim jelenlétében, 5 és 10,5 közötti pH-jú vizes oldatban vagy diszperzióban, előnyösen 20 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten reagáltatunk cs kívánt esetben a keletkezett 30 pepiidről az R4 vagy N-terminális védőcsoportot lehasítjuk.
    2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz enzimként élesztőből származó karboxipeptidáz-Y-t alkalmazunk. 35
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja.
    azzal jellemezve, hogy csírázó árpából származó karboxi-. peptidáz-Y-t alkalmazunk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, tízzel jellemezve, hogy karboxipeptidáz enzimként egy immobilizált karboxipeptidáz enzimet alkalmazunk.
  5. 5 Az I. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy az oldat pH-ját 8 és 10,5 között tartjuk.
    (\ Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 8,0 és 10,5 közötti pH-jú ptiífer-oídalban, kívánt esetben pH 8,0 és 10,5 közötti pH-tartományban végezzük, és a pH-értéket a reakcióeíegy pl 1-jának mérésével, sav vagy bázis hozzáadásával konstans értéken tartjuk.
  6. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy rcakcióközcgként 0-50 % szerves oldószert tartalmazó vizes oldatot használunk.
  7. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerként 1-4 szénáit mos alkanolokat vagy policíilén-glikolt alkalmazunk,
  8. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót a szubsztrátkomponens (),(1-1 mól és az amin-komponens 0,05-3 mól kezdeti koncentrációjával végezzük.
    '0. A 9. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót ΙΟ6-10'4 mól karboxipeplidáz koncentrációval végezzük.
    '1. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy szubsztrát-komponensként olyan aminosav- vagy peptidésztert alkalmazunk, ahol az észter-képző metil- vagy etilcsoport.
  9. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy amin-komponensként H-B-OR4 általános képletű - mely képletben R4 jelentése metil-, etil-, propil- vagy izopropil-csoport - észtert alk almazunk.
HU80832A 1979-04-06 1980-04-08 Process for the enzymatic preparation of peptides HU186734B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK144379 1979-04-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU186734B true HU186734B (en) 1985-09-30

Family

ID=8104890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU80832A HU186734B (en) 1979-04-06 1980-04-08 Process for the enzymatic preparation of peptides

Country Status (18)

Country Link
US (2) US4339534A (hu)
EP (1) EP0017485B1 (hu)
JP (1) JPS6339237B2 (hu)
AT (1) ATE9595T1 (hu)
AU (1) AU545416B2 (hu)
BR (1) BR8008024A (hu)
CA (1) CA1160973A (hu)
CS (1) CS254954B2 (hu)
DE (1) DE3069259D1 (hu)
FI (1) FI70597C (hu)
HU (1) HU186734B (hu)
IE (1) IE50256B1 (hu)
IL (1) IL59776A (hu)
NZ (1) NZ193375A (hu)
RO (1) RO80806A (hu)
SU (1) SU1378785A3 (hu)
WO (1) WO1980002157A1 (hu)
ZA (1) ZA801929B (hu)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
WO1982004069A1 (en) * 1981-05-20 1982-11-25 Andresen Finn Hede A process for the preparation of insulin derivatives
WO1983001074A1 (en) * 1981-09-15 1983-03-31 Andresen, Finn, Hede Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof
DK149824C (da) * 1982-01-22 1987-03-16 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner
WO1983002772A1 (en) * 1982-02-08 1983-08-18 Robin Ewart Offord An improved method for preparing human insulin from non-human insulin
JPS59112952A (ja) * 1982-12-21 1984-06-29 Taisho Pharmaceut Co Ltd ペプチド誘導体
GB8430255D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Erba Farmitalia Biologically active oligopeptides
FR2584077B1 (fr) * 1985-06-28 1988-07-08 Irceba L-di ou tripeptides possedant une activite biologique utilisable en medecine humaine et veterinaire, procede pour leur obtention et medicament en contenant
JPH01501995A (ja) * 1986-04-10 1989-07-13 コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション 酵素合成方法
US4935355A (en) * 1986-04-15 1990-06-19 Synthetech, Inc. Preparation of dipeptides
US5350681A (en) * 1986-08-18 1994-09-27 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides
US5202235A (en) * 1986-08-18 1993-04-13 The Coca-Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
US5336601A (en) * 1986-08-18 1994-08-09 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the snythesis and separation of peptides
US5002871A (en) * 1986-08-18 1991-03-26 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides
US5037741A (en) * 1986-08-18 1991-08-06 The Coca Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
DK72587D0 (da) * 1987-02-13 1987-02-13 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider
US4892820A (en) * 1987-06-10 1990-01-09 The Nutrasweet Company Solvent system for enzymatic coupling process
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
DE3733198A1 (de) * 1987-10-01 1989-04-13 Kernforschungsanlage Juelich Enzymatisches verfahren zur herstellung von dipeptiden
DE3741515A1 (de) * 1987-12-08 1989-06-22 Degussa Verfahren zur herstellung von dipeptiden
DK15888D0 (da) * 1988-01-14 1988-01-14 Carlsberg Biotechnology Ltd Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af immunmodulerende pentapeptider samt mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden
DE3803124A1 (de) * 1988-02-03 1989-08-10 Degussa Verfahren zur enzymatischen peptidsynthese
DE68924196T2 (de) * 1988-06-03 1996-05-09 Sharp Kk Elektronische Anordnung mit einer Kalenderfunktion.
DK163435C (da) * 1988-08-12 1992-07-20 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf
US5002872A (en) * 1989-05-10 1991-03-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Enzyme mediated coupling reactions
US5300437A (en) * 1989-06-22 1994-04-05 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US4950606A (en) * 1989-06-22 1990-08-21 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US5169780A (en) * 1989-06-22 1992-12-08 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US5279954A (en) * 1989-06-30 1994-01-18 Board Of Regents Of The University Of Nebraska And Bionebraska Exopeptidase catalyzed site-specific bonding of supports, labels and bioactive agents to proteins
US5366862A (en) * 1990-02-14 1994-11-22 Receptor Laboratories, Inc. Method for generating and screening useful peptides
DE4014564C1 (hu) * 1990-05-07 1991-07-18 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
DK133990D0 (da) * 1990-05-30 1990-05-30 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af growth hormone releasing factor (grf) og peptider anvendelige som mellemprodukter ved fremgangsmaaden
DK220890D0 (da) * 1990-09-14 1990-09-14 Ole Buchardt Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider
US5580751A (en) * 1990-09-14 1996-12-03 Carlsberg A/S Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
KR930002966B1 (ko) * 1990-11-24 1993-04-16 주식회사 미 원 디펩티드의 제조방법
CA2115159A1 (en) * 1991-08-08 1993-02-09 Jeffrey A. Bibbs Production of peptide amides
DE59205565D1 (de) * 1991-10-07 1996-04-11 Hoechst Ag Carbonsäureester-Schutzgruppen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Kopplung an eine funktionelle Gruppe sowie ihre Verwendung
EP0566824A1 (en) * 1992-01-28 1993-10-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic peptide synthesis
US5356805A (en) * 1992-03-03 1994-10-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Gamma-polyglutamate hydrolase
FR2721030B1 (fr) * 1994-06-09 1996-08-30 Pasteur Institut Composés modifiant la transmission sérotoninergique; applications diagnostiques et thérapeutiques.
ATE211483T1 (de) 1993-10-04 2002-01-15 Pasteur Institut Verbindungen, die die serotoninerge übertragung beeinflussen; ihre diagnostischen und therapeutischen anwendungen
US6187579B1 (en) * 1993-10-28 2001-02-13 Carlsberg A/S Customized proteases
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
US5585359A (en) * 1994-09-29 1996-12-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU4415796A (en) * 1994-12-07 1996-06-26 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
JPH11505522A (ja) * 1995-04-21 1999-05-21 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト エンドセリン阻害剤としてのｎ−アロイルアミノ酸アミド
US5985627A (en) * 1997-02-28 1999-11-16 Carlsberg Laboratory Modified carboxypeptidase
NL1006069C2 (nl) * 1997-05-16 1998-11-17 Dsm Nv Werkwijze voor de bereiding van peptiden.
WO2000027800A1 (en) * 1998-11-09 2000-05-18 Smithkline Beecham Corporation Ccr-3 receptor antagonists
US20030060413A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-27 Zimmer Robert H. Derivatives of pseudo-peptides, their preparation and their biological uses
US7671029B2 (en) 1999-08-06 2010-03-02 Immupharma Sa Compositions and methods for enhanced pharmacological activity of compositions comprising peptide drug substances
US6908900B2 (en) * 2001-01-17 2005-06-21 Zimmer & Associates Ag Compositions and methods for enhanced pharmacological activity through oral and parenteral administration of compositions comprising polypeptide drug substances and other poorly absorbed active ingredients
US6624147B1 (en) * 1999-09-28 2003-09-23 Rijksuniversiteit Leiden Inhibitors of prenylated pyrophosphate consuming enzymes
US6939693B2 (en) * 1999-10-29 2005-09-06 Novus International, Inc. Enantioselective oligomerization of α-hydroxy carboxylic acids and α-amino acids
US6605590B1 (en) 1999-10-29 2003-08-12 Novus International, Inc. Oligomers and oligomeric segments of alpha-hydroxy carboxylic acids and alpha-amino acids
PT2308874E (pt) 2005-12-07 2013-04-26 Basilea Pharmaceutica Ag Monobactamas ligadas por pontes, úteis como inibidores de beta-lactamase
CN103073618A (zh) * 2013-01-15 2013-05-01 吉尔生化（上海）有限公司 一种苄氧羰基丙氨酰丙氨酸的制备方法
AU2017246706B2 (en) 2016-04-04 2020-09-17 Research Triangle Institute Neuropeptide s receptor (NPSR) agonists
CN107936089B (zh) * 2017-11-07 2021-01-29 重庆大学 一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3276961A (en) * 1963-04-08 1966-10-04 Squibb & Sons Inc Process for preparing human insulin
US3972773A (en) * 1975-04-29 1976-08-03 Sagami Chemical Research Center Process for producing peptide
US4119493A (en) * 1975-10-23 1978-10-10 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4116768A (en) * 1975-04-29 1978-09-26 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4086136A (en) * 1975-10-23 1978-04-25 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase
JPS5411294A (en) * 1977-05-23 1979-01-27 Toyo Soda Mfg Co Ltd Recovery of protease
JPS5411293A (en) * 1977-05-23 1979-01-27 Toyo Soda Mfg Co Ltd Recovery of protease

Also Published As

Publication number Publication date
US4806473A (en) 1989-02-21
ZA801929B (en) 1981-11-25
IL59776A (en) 1985-01-31
JPS56500519A (hu) 1981-04-23
FI70597C (fi) 1986-09-24
NZ193375A (en) 1983-06-14
SU1378785A3 (ru) 1988-02-28
EP0017485B1 (en) 1984-09-26
IE800694L (en) 1980-10-06
RO80806A (ro) 1983-02-01
US4339534A (en) 1982-07-13
AU545416B2 (en) 1985-07-11
FI70597B (fi) 1986-06-06
WO1980002157A1 (en) 1980-10-16
FI801035A (fi) 1980-10-07
IE50256B1 (en) 1986-03-19
DE3069259D1 (en) 1984-10-31
CS239980A2 (en) 1987-07-16
AU5981580A (en) 1980-10-22
IL59776A0 (en) 1980-06-30
ATE9595T1 (de) 1984-10-15
EP0017485A1 (en) 1980-10-15
CA1160973A (en) 1984-01-24
CS254954B2 (en) 1988-02-15
BR8008024A (pt) 1981-03-31
JPS6339237B2 (hu) 1988-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU186734B (en) Process for the enzymatic preparation of peptides
EP0278787B1 (en) A process for enzymatic production of dipeptides
JPH0698788A (ja) 水性溶液の形で保護された及び保護されていないジ− 及びオリゴペプチドの酵素による製造方法
EP0359399B1 (en) Process for the enzymatic production of dipeptides
HU185668B (en) Process for the enzymatic substitution of aminoacid in position b-30 of
DK2634193T3 (en) Condensation of the side-chain protected oligopeptidfragmenter using subtilisins in organic solvents
US8124372B2 (en) Selective enzymatic amidation of C-terminal esters or acids of peptides
Saltman et al. Co‐oligopeptides of aromatic amino acids and glycine with variable distance between the aromatic residues. VII. Enzymatic synthesis of N‐protected peptide amides
JP2012509089A (ja) 酵素的活性化およびカップリングを使用したペプチド合成
EP0324659B1 (en) Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process
EP2167673B1 (en) Process for the conversion of c-terminal peptide esters or acids to amides employing subtilisin in the presence of ammonium salts
CA1177429A (en) Process for enzymatic production of peptides
NO157706B (no) Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider.
EP0458475A2 (en) Transpeptidation reagent and method
AU591557B2 (en) Enzymatic synthesis
JPS5834120B2 (ja) ペプチドの製造方法
DK155613B (da) Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af peptider
JPS5813158B2 (ja) ペプチドの製造方法
Yuen Carboxypeptidase Y catalysed oligomerisation of methionine
Gazis et al. NEW METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS
JPS63254994A (ja) Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法
JPS6244920B2 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee