CS254954B2 - Method of peptides production - Google Patents

Method of peptides production Download PDF

Info

Publication number
CS254954B2
CS254954B2 CS802399A CS239980A CS254954B2 CS 254954 B2 CS254954 B2 CS 254954B2 CS 802399 A CS802399 A CS 802399A CS 239980 A CS239980 A CS 239980A CS 254954 B2 CS254954 B2 CS 254954B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
ala
amino acid
carboxypeptidase
gly
phe
Prior art date
Application number
CS802399A
Other languages
English (en)
Other versions
CS239980A2 (en
Inventor
Jack T Johansen
Fred Widmer
Klaus Breddam
Original Assignee
Carlsberg Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carlsberg Biotechnology Ltd filed Critical Carlsberg Biotechnology Ltd
Publication of CS239980A2 publication Critical patent/CS239980A2/cs
Publication of CS254954B2 publication Critical patent/CS254954B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

Vynález se týká způsobu enzymatické výroby peptidů. Zejména se vynález týká způsobu výroby peptidů za použití určité skupiny enzymů jako katalyzátorů.
Je známé provádění syntézy peptidů více či méně důmyslnými vazebnými reakcemi a to jak homogenní syntézou, tak i heterogenní syntézou na pevných nosičích. Avšak všechny tyto chemické postupy zahrnují nebezpečí nežádoucích sekundárních reakcí a racemizací, a proto je nutné pečlivé řízení chemických reakcí, aby se tyto komplikace odstranily nebo co nejvíce omezily. Mimo to aminokyselinové postranní řetězce musí být často chráněny, což vyžaduje deblokaci jako poslední chemický krok při výrobě žádaných peptidů. V závislosti na velikosti syntetizovaného peptidů mohou být výtěžky nízké a v důsledku sekundárních reakcí je к získání čistého produktu třeba použít těžkopádných purifikačních postupů. Všechny tyto problémy spojené s chemickou syntézou peptidů, vysoká cena některých vazebných činidel a blokujících derivátů aminokyselin jsou příčinou toho, že i výroba malých syntetických peptidů, například pentapeptidů je dosti drahá.
Protože enzymy jsou vysoce specifické kakalyzátory a proteolytické enzymy jsou schopné hydrolyzovat peptidické vazby v proteinech, byly již dříve studovány možnosti převrácení této hydrolyzační reakce, neboli využití enzymů jako katalyzátorů při syntéze peptidických vazeb. Bergmanri a Fraenkel-Conrat, J. Biol. Chem. 119, 707— —720, (1937) a Bergmann a Fruton, J. Biol. Chem. 124, 321—329, (1938) studovali toto podrobně a,v roce 1937 prokázali, že papain a chymotrypsin mohou katalyzovat spojování některých acylaminokyselin a anilidů aminokyselin. V tomto studiu se pokračovalo na základě dvou fundamentálně odlišných přístupů, termodynamického a kinetického.
Základními rysy termodynamických metod je použití vhodné proteázy ke katalýze ustavení termodynamické rovnováhy mezi reagujícími látkami a odstranění reakčního produktu z reakční směsi. Isowa et al, Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2762—2765 (1977),
Bull. Chem. Soc. Japan 50 2766—2772 (1977), Bull. Chem. Soc. Japan 51, 271—276 (1978) a americký patent č. 4 119 493 a Britské patenty 1 523 546 a 1 533 129, Luisi et al., J. Mol. Catalysis 2, 133—138 (1977), Saltman et al., Biopolymers 16, 631—638 (1977) a Morihara, J. Biochem 84, 1277—1283 (1978) zjistili, že některé serinové thiolové a metaloendoprotézy katalyzují syntézu peptidů z chráněných, ale velmi snadno rozpustných di-, tri-, a tetrapeptidů, přičemž konečné produkty precipitují z reakční směsi, neboť jejich rozpustnost je nižší, než rovnovážná koncentrace. Příklady takovýchto syntéz jsou uvedeny v těchto reakčních schématech:
1) papain Z—Leu—Phe—OH + Phe—ODPM----->
------ z—Leu—Phe—Phe—ODPM ODPM = difenylmetylester
2)
Z—Arg(NOž)—OH + Phe—Val— termolysin —OBu1---------Z—Arg.(NO2)— Phe—Val—OBu'
3)
BOC—Val—Tyr(Bz)OH + Val—His(Bz) — nagarza —Pro—Phe—OEt-------BOC—Val—Туг (Bz)—Val—His (Bz) — —Pro—Phe—OH (Z = karbobenzoxy,
Bz = benzoyl, BOC = tert. butoxykarboxyl).
Avšak tento reakční princip může být použit jako obecný postup syntézy pouze tehdy, jestliže jako při obvyklém postupu chemické syntézy, všechny aminokyselinové postranní řetězce s potenciálně jonizovatelnými skupinami jsou blokovány před reakcí a odblokovány po reakci. Metoda je také nedokonalá v tom, že vzhledem к vysoké specifitě různých enzymů, je třeba použít různých enzymů, v závislosti na typu peptidické vazby jež má být syntetizována, či spíše na aminokyselinách tvořících peptidickou vazbu. I když tyto další těžkosti mohou být překonány, metoda skrývá některé další problémy, neboť vyžaduje velmi vysokou koncentraci enzymu, 100 mg/mmol peptidu; dlouhé doby reakce, 1 až 3 dny a dává velmi odlišné výtěžky 20 až 80 %, jak je uvedeno ve výše zmíněných americkém a britských patentových spisech.
Klibanov et al, Blatech. Bioeng. 19, 1351— —1361 (1977) navrhli práci v systému složeném z vody a organického rozpouštědla nemísitelného s vodou. Tento postup také výžaduje vysokou koncentraci enzymu a dlouhou reakční dobu až několik dnů.
Jiný typ enzymatických syntéz je založen na kinetickém přístupu. Bylo prokázáno pro většinu serinových a thiolových proteáz, že meziprodukt acylenzym se tvoří během jednoho z katalytických kroků při hydrolýze peptidů nebo esterů peptidů, a pak je hydrolyzován vodou v následujících krocích. Jsou-li během hydrolýzy přítomny jiné nukleofilní látky než voda, budou také přijímat acyl skupinu z acylenzymu, přičemž se vytvoří amidová vazba. Toto studovali napři254 954 klad Fastrez a Fersht, Biochemistry 12, 2025—2034 (1973), kteří popsali chymotrypsinem katalyzovanou hydrolýzu N-acetyl-L(4)
-ptenyl-alaniuetylesteru (Ac—Phe—OEt) v přítomnosti různých amidů aminokyselin. Reakce je. uvedena v schématu 4).
Д c- -- Pha- — OEt -v ОТ
(Ao-Pha,-OEír CT __- г ч Ac-Pha.к_д +· EtOH
OHťСТ
Aq - NH 'R ^СТ (CT ·~ chymotrypsin)
Nejdříve se utvoří komplex enzym-substrát a pak se vytvoří meziprodukt acylenzym (Ac—Phe—CT). Tento je hydrclyzován vodou na Ac—Phe—OH, ale je-li. přítomna nukleofilní látka (R—NH2), acylenzymový meziprodukt bude kromě hydrolýzy také předmětem aminolýzy. Předpokládáme-li, že кз > к..з a lei > k_4, poměr aminolýzy к hydrolýze zřejmě závisí na kd/кз a také na koncentraci nukleofilu, jenž je v kompetici s 55 M vodou. Fastrez -a F-orsht zjistili, že například 1 M alaninamid při pH 10 je 44 X silnější nukleofil než 55 M voda, což mělo za následek přednostní tvorbu, více než 95% výše uvedeného N-acyldipeptidamidu. Morihara a Oka, Biochemistry J. 163, 531-542 (1977), J. Biochem. 84, .1.277—1283 (1978), J. Biochem. 82, 1055— — 1062 (1977), Symp. on Peptide Chemistry in Japan, Osaka, pp 79—84 (1977) dále využil tohoto principu pro enzymatickou syntézu peptidů. Pomocí chymotrypsinu a trypsinu syntetizovali množství peptidů z esterů N-acylaminokyselm a z od aminokyselin odvozených nukleofilu a prokázali, že reakce byla výhradně kinetická, neboť je možno získat vysoké výtěžky, bez ohledu na rozpustnost produktu.
Výše zmíněné studie naznačují, že kinetické přístupy mají oproti termodynamickým několik výhod.
1. Rychlejší reakce; v některých případech ukončená během několika minut.
2. Možnost použití nízkých koncentrací enzymu.
3. Aminokyselinové postranní řetězce nemusí být nezbytně blokovány.
4. Mohou být použity imobilizované a nerozpustné enzymy, což umožňuje jsou li peptidy rozpuštěny, použití automatizace.
I když reakční produkty mohou být rozpustné, syntéza musí být rychlejší než sekundární hydrolýza produktu, aby tento mohl, být oddělen včas.
Použití známých kinetických přístupů je omezeno, neboť vzhledem ke specifitě zkoušených enzymů je třeba použít různých enzymů pro syntézu různých peptidických vazeb. Při syntéze velkých peptidových mole• kul dochází к hydrolýze vnitřních peptidových vazeb v molekule, což je způsobeno endopeptidázovou aktivitou enzymů v dnešní době používaných, jež Je nezávislá na esterolytické aktivitě enzymu.
Úkolem tohoto vynálezu je vytvořit enzymatickou syntézu peptidů bez výše zmíněných nedostatků a zejména syntézu, která není omezena pouze na určité aminokyseliny a která nezahrnuje nebezpečí následné hydrolýzy vnitřních peptidových vazeb.
Úkolem vynálezu tedy je, vytvořit způsob výroby peptidů obecného vzorce
А—В kde
A je N-koncový chráněný aminokyselinový zbytek nebo případně N-konoový chráněný peptidový zbytek a
В je případně C-koncový chráněný aminokyselinový zbytek, reakcí substrátové složky s aminovou složkou v přítomnosti enzymu.
Vynález řeší úkol tím, že vytváří způsob při němž se nechá reagovat substrátová složka vybraná ze skupiny zahrnující
a) estery aminokyselin, estery peptidů a depsipeptidy vzorce
A—ORt,
A—SR4 nebo
A—SeR1 kde
A je stejné jak je definováno výše a
R1 představuje alkyl, aryl, heteroalkyl nebo a des-amino fragment aminokyselinového zbytku, (b) případně N-substituované amidy aminokyselin a amidy peptidů vzorce
A—NR2R2* kde
A je stejné, jak bylo definováno výše a
R2 a R2‘ představuje vodík, alkyl, heteroalkyl, aryl nebo aralkyl a případně (c) N-koncové chráněné peptidy vzorce
A—X kde
A je stejné, jak bylo definováno výše a
X představuje aminokyselinu s aminovou složkou vybranou ze skupiny zahrnující (a ] aminokyseliny vzorce
H—B—OH, (b) případně N-substituované amidy aminokyselin vzorce
Η—B—NR5R3‘ kde
В je aminokyselinový zbytek a
R3 a R3‘ představuje vodík, hydroxy, amino nebo alkyl, aryl, heteroaryl nebo aralkyl a (c) estery aminokyselin vzorce
Η—B—OR4,
Η—B—SR4 nebo
Η—B—SeR4 kde
В je aminokyselinový zbytek a
R4 představuje alkyl, aryl, heteroaryl a aralkyl v přítomnosti enzymu karboxypeptldázy ve vodném roztoku nebo disperzi o pH od 5 do 10,5, s výhodou při teplotě od 20 do 50 °C, aby se vytvořil peptid a poté se odštěpí skupina R3 nebo R4 nebo N-koncová ochranná skupina, je-li třeba.
Vynález je založen na základní změně oproti doposud užívaným postupům, jež představuje použití exopeptldáz namísto enzymů používaných dosud, jež všechny vykazovaly převládající nebo alespoň značnou endopeptidázovou aktivitu.
Bylo zjištěno, že použitelné enzymy kromě toho, že musí být exopeptidázami, musí mít peptidázovou aktivitu široké speclfity, aby měly syntetickou aktivitu odpovídající široké specifity, neomezenou na jeden nebo, několik málo typů peptidických vazeb. Enzymy musí být schopné utvořit acylenzymové meziprodukty stejného typu, jak byly popsány výše pro kinetický přístup a musí mít zejména takové vlastnosti, které dovolují aminolýzu meziproduktu za podmínek, kdy k_4 « k4, viz schéma 4) výše, aby se zabránilo bezprostřední hydrolýze vyrobených peptidů. Schopnost tvořit acylenzymové meziprodukty může být také vyjádřena jako schopnost štěpit C-koncovou ochrannou skupinu v substrátové použité složce, tj. v tomto případě esterázová nebo amidázová aktivita. Aby došlo к syntéze musí tato aktivita převládat nad peptidázovou aktivitou enzymu za daných reakčních podmínek.
Tyto četné vlastnosti má skupina exopeptidáz zvaná karboxypeptidázy, jež jsou schopné hydrolyzovat peptidy s volnými karboxylovými skupinami. Bylo zjištěno, že většina těchto karboxypeptidáz má různé enzymatické aktivity, jež jsou velmi závislé na pH, tak, že například v bazickém prostředí při pH od 8 do 10,5 mají převážně esterázovou nebo amidázovou aktivitu a při pH od 9 do 10,5 žádnou nebo jen nevýznamnou peptidázovou aktivitu. Tyto vlastnosti mohou být výhodně využity při postupu podle vynálezu, neboť přispívají к dosažení dobrých výsledků.
Dále bylo zjištěno, že schopnost tvořit acylenzymové meziprodukty je zvláště výrazná u serinových a thlolových proteáz. Výhodnou skupinou karboxypeptidáz jsou proto serinové nebo thtolové karboxypeptidázy.
Tyto enzymy mohou být produkovány kvasinkami plísněmi, nebo mohou být živočlš254954
n-élioi, rostlhTn-étoo nebo mikrobiálního původu.
Zvláště výhodným enzymem je karboxypeptidáza Y z kvasinek —CPD—Y. Tento enzym je popsán v práci Hayashi et :al. j. Biochem. 77, 69—79 (1975) a Johansen ot al. Carlsberg Res. Commun. 41, 1—14 (1976), kteří vyvinuli zvláště výhodnou purifikační metodu pomocí afin-itní chromatognafie na afinitmí pryskyřici skládající se -z polymerní pryskyřičné matrice s navázanými benzylsukctoylovýmii skupinami. CPD—Y jež je seri-novým enzymem se vyznačuje tím, -že výše uvedený vztah mezi různými enzymatickými aktivitami platí při pH >9 a že nemá endopeptidázovou aktivitu. Kromě specifity pro C-koncové aminokyseliny nebo estery s volnými a-kaťhoxylovými skupinami, CPD— —Y může také hydro lyžovat peptidy ve kterých je C-koncová -karboxylová skupina blokována ve formě esterové skupiny, například alkyl nebo aryl ester nebo jako amidoskupina nebo· N-substituovaný amid, například anilid. Je důležité, že enzym hydrolyzuje většinu substrátů, bez ohledu na typ C-koncového aminokyselinového zbytku. Další výhodou CPD—Y je, že je dostupná ve velkých množstvích a je poměrně dosti stabilní.
Kromě CPD—Y, která je v současné době nejvýhodnějším enzymem, postup podle vynálezu je proveditelný s jinými karboxypeptidázami jako ty, jež jsou uvedeny v tomto přehledu:
Enzym Původ Houby
Penicillokarbo-xy- Penicillium jantlii-
peptidáza S.....-1 nellum
Pěnici] lokarboxy- Pcnicillium janthi-
peptidáza S—2 > nell-um
Karboxypeptidáza z AspergHIus sai-boi
•Karboxypeptidáza z Aspergillus aryzae
Rostliny
Karboxypeptidáza C Listy pomerančovníku
Slupky pomerančů
Karboxypeptidáza C-, Citrus natsudaidai I-Iayata
Pbaseolain Listy ledvinkového hrachu
Karboxypeptidáza z Klíčící ječmen Klíčící bavlník Rajčata Vodní melouny Prášek z bromélií —
— ananas
né též kyselá složka nebo donor, obsahující podíl A s tzv. aminovou složkou, -zvanou též nukleofilní složka nebo akceptor, a obsahující podíl B, přičemž se vytvoří peptid A—B.
Pcdíl A, což je aminokyselinový nebo pepticlový zbytek, může mít, je-li třeba, chráněnou N-koncovou aminoskupinu, aby se zabránil© nežádoucím sekundármm reakcím.
Potřebnost ochrany aminoskupiny se snižuje se vzrůstající délkou řetězce péptidu a >není téměř nutná, skládá-li se peptidový zbytek ze tří aminokyselin, avšak závisí to i na jejich typu a pořadí.
Příkladem vhodných aminokyselin jsou alifatické aminokyseliny, jako monoaminomonokarboxylové kyseliny, například glycin (Gly), alantn (Ala), valin (Val), norvalin (Nva), leucin (Leu!), izoleucin (iso-Leu) a norleucin (Nle), hydroxyminokyseliny, jako je serin (Ser), threorim (Thr) a homoserin (homo-Ser ), aminokyseliny Obsahující síru, jako je metionin (Met) nebo cystin (CysSJ a cystein (CysH), monoaminodikarboxylové kyseliny, jako je kyselina asparagová (Aspj, kyselina glutamová (Giuj, asparagin (Asn) a glutamin (Gin), diamtoomonokarboxylové kyseliny, jako je ornithin (Orn), lysin (Lys) a arginin (Arg), aromatické aminokyseliny, jako fenýlaíanin (Phe) a tyrosin (Tyr), a heterocykllcké aminokyseliny, jakojje histidin (His) a tryptofan (Trp).
Jako ochranné skupiny mohou být použity ochranné skupiny aminokyselin obvyklé v chemii peptidů, jako je benzoyl (Bz) acetýl (Ac) nebo terciární alkoxykarbonylové skupiny, například t-butyloxykarbonýl (BOC—), t-amyloxykarbonyl (t-AOC—), benzyloxykarhonyl (Z—), p-metoxybenzylorxykarbonyl (PMZ— í), 3,5-dimetoxybenzytoxykarbonyl [ Z (OMe )?;— ], 2,4,6-trimetylbenzyloxykarbonyl (TMZ—), p-fenýlazobenzýloxykarbonyl (PZ—), p toluensulfonyl (Tos—), o-nitrofenylsuifenyl (Nps—.) apod.
Výhodnými ochrannými skupinami jsou benzyloxykarbonyl a t-butyloixykarbonyl, neboť tyto deriváty lze lehko vyrobit, jsou ekonomicky výhodné a snadno odštěpitelné.
Jak bylo uvedeno výše, substrátová složka může být vybrána ze skupiny zahrnující
a) aminokyselinové estery, peptidové estery a depsipeptidy vzorce ,A—OR1,
A—SR1 nebo
A—SeR1 kde
A je stejné jak bylo definováno výše a
R1 představuje alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl nebo α-desaamino fragment aminokyselinového zbytku,
Hovězí karboxypeptidázy А а В CPD—A
a.rCPD—В však nejsou vhodné, neboť to jsou те1а1окагЬохурер,Мё7у.
Jak bylo vysvětleno výše, syntéza je založena η-a reakci tzv. substrátové složky zva254954
b) případně Nsubstitované amidy aminokyselin a amidy peptidů vzorce
A—NR2R2‘ kde
A je stejné jak bylo definováno výše a R2 a R2‘ představují vodík, alkyl, aryl, heteroaryl nebo ar alkyl a
c] případně N-koncové chráněné peptidy vz-orce
А—X kde
A je stejné jak bylo definováno výše a
X představuje aminokyselinu.
V tomto významu „alkyl“ znamená přímý řetězec nebo· rozvětvený alkyl, výhodně s 1 až 6 atomy uhlíku, například metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, terč, butyl, amyl, hexyl apod.
„Aryl“ znamená fenyl, heterocyklický aryl apod.
„Aralkyl“ znamená benzyl, fenetyl apod. Skupiny R2 a R2‘ a R3 a R3‘ mohou být shodné nebo rozdílné.
Všechny tyto skupiny mohou být substituovány substituenty inertními, vzhledem к enzymu, například halo (fluoro, chloro, bromo, jodo), nitro, alkoxy (metoxy, etoxy, atd.), nebo alkyl (metyl, etyl atd.), přičemž aminokyselinový zbytek nebo peptidový derivát musí být substrátem pro karboxypeptidázu.
V případě esterů skupina OR1 je výhodně vybrána ze skupiny alkoxyskupin, jako jsou metoxy, etoxy nebo t butoxy, fenyloxy a benzyloxy. Skupiny mohou být případně substituovány inertními substituenty, jako jsou nitroskupiny, například p-nitrobenzyloxy. Mohou být použity i jiné skupiny, je-li aminokyselinový zbytek nebo peptidový derivát substrátem pro karboxypeptidázu. Příkladem jsou tzv. depsipeptidy, kde C-koncová aminoskupina připojená esterovou vazbou místo peptidické vazby, například benzoyl-glycin-fenyllaktát (Bz—Gly—OPhe).
Výhodnými ochrannými skupinami karboxylové kyseliny jsou alkoxy skupiny, zvláště metoxyskupiny nebo jinými slovy: Substrátová složka s výhodou obsahuje nebo se skládá z metylesteru aminokyseliny, neboť tyto deriváty jsou dobrými substráty a dají se snadno vyrobit. Avšak například etylestery, propylestery, izopropylestery, butylestery, t-butylestery, benzylestery nebo terč, butoxyestery je možné použít stejně dobře.
Je třeba uvést, že jonizovatelné skupiny, které mohou být v jednotlivých aminokyselinách, jež tvoří peptidový zbytek A, mohou, je-li třeba být blokovány způsobem známým jako per se, v závislosti na typu skupiny. To však není vždy třeba, což je jedna z předností způsobu podle vynálezu. Je-li třeba
I chránit funkční skupiny, vhodnými ochrannými skupinami pro ω-aminoskupinu (Νω) jsou například NQ)-benzyloxykarbonyl (Νω— —Z), t-butoxykarbonyl (Νω—BOC) nebo tosyl (Νω—ToS). Vhodnými ochrannými skupinami pro N-guanidinoskupinu (№) v Arg jsou nitro (№—N02), №benzyloxykarbonyl (№—Z) a №, NG-dibenzyloxykarbonyl (NG—Z—Z). Vhodnými ochrannými skupinami pro imidazolový kruh (Nim) v His jsou Nim-benzyl (Νίπι—Bzl) a Tosyl (Nim—Tos). Vhodnými ochrannými skupinami pro ω-karboxylskupinu jsou α-benzyloxy (—OBzl). Vhodnými ochrannými skupinami pro hydroxylskupinu v alifatických nebo aromatických hydroxy aminokyselinách jsou aralkylskupiny, jako je benzyl (Bzl). Vhodnými S-ochrannými skupinami pro merkaptoskupinu v CysH jsou například benzylskupina (Bzl). Ochranné skupiny musí být stabilní během primární reakce a musí být snadno odštěpitelné od konečného produktu aniž by způsobily sekundární reakce.
Způsob podle vynálezu může být v podstatě prováděn s jakoukoliv aminokyselinou jako substrátovou složkou.
Druhým účastníkem reakce je tzv. aminová složka, jež je vybrána ze skupiny zahrnující
a) ,aminokyseliny vzorce
Η—B—OH,
b) případně N substituované amidy aminokyselin vzorce
Ή—B—NR3R3< kde
В je aminokyselinový zbytek a
R3 a R3< představují vodík,,hydroxy, amino nebo alkyl, aryl, heteroaryl nebo aralkyl a
c) estery aminokyselin, thioestery nebo selenoestery vzorce
Η—B—OR4,
Η—B—SR4 ;nebo
Η—B—SeR4 kde
В je aminokyselinový zbytek a
R4 představuje alkyl, aryl, heteroaryl a aralkyl.
Alkyl-, aryl- a aralkylskupiny mohou být substituovány a jsou definovány stejně, jak bylo uvedeno ve spojení s substrátovou složkou.
Je zřejmé, že R3 = vodík představuje volný amid, zatímco R3 = 0H je hydroxamová ky2 5 4’9 5 4
Π selina, R3=-amlno je hydruzid a R7 — fenyl představuje anilíd.
Způsob podle vynálezu má takto hlavní výhodu oproti způsobu podle například Isowy a Morihary ( viz .výše ] -v lom, že muže být prováděn jak s volnými, na £--konci nechráněnými, aminokyselinami, tak s aminokyselinami jež jsou na C-konci chráněny například přeměnou na odpovídající amidy, anilicly, hydr-azidy, estery nebo jiné karboxylderiváty aminokyselin.
Co- se týká aminové složky, reakční pořadí, výtěžky atd. závisí velmi na tom, zda složky vstupují do reakce jako volné kyseliny nebo jako C-chráněné deriváty, například amidy. To bude podrobněji doloženo níže ve spojení s příklady;
Používá-li se volných kyselin, potom hydroifobní aminokyseliny, jako je slanin, leucin, valln a fenylalanin, právě tak jako kyseliny s kladně nabitými postranními řetězci jako- je lysin a arg.imn, se poměrně snadno inkorporují do řetězce substrátové složky, zatímco aminokyseliny, jejichž postranní řetězce obsahují buďto karboxylové skupiny jako jsou kyselina asparagová nebo glutamová, hydroxylové skupiny jako je serin a thrconin nebo am-ido skupiny jako· je asparagin a glutamin, se inkorporují mnohem obtížněji.
I-Iet-erocykHcké aminokyseliny jako je prolili -a histidin se jako volné kyseliny inkorporují velmi obtížně.
Používají-li se jako .aminová složka C-kon•cově chráněné aminokyseliny, například amidy aminokyselin nebo N-substituované amidy, je tornu jinak, je možné říci zcela obecně a bude to dále rozvedeno, že v tomto případě je reakce značně nezávislá na struktuře a je možné získat velmi vysoké výtěžky až ‘90 %; avšak i zde se heterocyklické aminokyseliny inkorporují mnohem obtížněji než alifatické.
Jak byl? uvedeno výše, způsob podle vynálezu se provádí při pH až 10,5, výhodně při pH. 8,0 až 10,5. Nejvýhodnější pH hodnota, jež je často ve velmi úzkém rozmezí, závisí na pH optimu a pH-minimu rozdílných enzymatických, aktivit použitého enzymu, přičemž pil hodnota by měla být vybrána tak, aby aktivity byly vyváženy lak, jak by lo vysvětleno· v předchozím.
poplidázová aktivita se zvyšuje s klesajícími hodnotami pH pod pH okolo 9,0, přičemž se postup z hlediska výtěžku stává méně výhodný. Avšak v některých případech, například u Bz·—Ala—Gly .nebo Bz—Ala— - •Gly --NH· vytvořené peptidy nebo amidy peptidů jsou velmi špatnými substráty pro karboxypeptidázu, takže esterázová aktivita vůči esteru aminokyseliny nebo vůči esteru peptidu, výhodně použitým jako substrátová složka, ještě převládá, což umožňuje syntézu až při pH-hodnotách okolo nebo pod 5,0. Optimální pH závisí na konkrétním výchozím materiálu, vytvořených peptidech a enzymu.
tfo užívá-41 se fako ^enzymu GPD—Y, pH-ho jnota je ;s výhodou 8,0 <až 1*0,5, nejlépe 9;0 až 10.;o jak tede >dále vysvětleno.
Tato· hodnota pH by měla být udržována během vazebně -reakce a pak může být změněna kvůli precipiítaci reakčního produktu, štěpení ochranných skupin atd. Toho může být dosaženo použitím vhodného pufru pro vybranou pH-oblast v reakčním médiu, jako je bikarbonátový pufr.
Výběr pufru však není pro reakci kritický, je-li zajištěno' udržování správného pH.
Hodnota pH může být rovněž udržována přidáváním kyseliny jako je HC1 nebo· zásady, jako je NaOH během reakce.
Jak bylo uvedeno, reakce se provádí ve vodném reakčním prostředí, které, je-li třeba, může Obsahovat až 50 °/o organického· rozpouštědla. Výhodnými organickými rozpouštědly jsou alkanoly, například metanol •a etanol, iglykoly, například etylenglykol nebo polyetylénglýkoly, dimetylformamid, dinietylsulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan a dimetoxyetan.
Výběr složení reakčního prostředí závisí zvláště na rozpustnosti, teplotě a p‘H reakčních složek a peptidového produktu a na stabilitě enzymu.
Reakční prostředí může také obsahovat složku, která činí zenzym nerozpustný, ale zachovává značný podíl enzymatické aktivity, jako je jentoměničová pryskyřice. Enzym může být imobilizován známým způsobem, viz Methods of Enzymology, Sv. 44, 1976, například navázáním na matrici, jako je zesilovaný dextran nebo .agaróza, nebo na kysličník křemičitý, polyamid nebo celulózu nebo zapouzdřením do polyakrylamiidu, alginátfi nebo vláken. Kromě toho může být enzym modifikován chemicky, -aby se zlepšila jeho stabilita nebo enzymatické vlastnosti.
Koncentrace dvou účastníků reakce se může měnit uvnitř širokého rozmezí, jak bude dáte vysvětleno. Výhodná počáteční 'koncentrace .substrátové složky je 0,01 až 1 molární a pro aminovou složku je O.,05 až 3 molární.
Aktivita enzymu se může také měnit, ale je s výhodou 10~6 až 10'4 inolární.
•Podle vynálezu je reakční teplota s výhodou 20 až 50 °C. Nejvhodnější reakční teplota pro danou syntézu může být určena pokusy, a závisí zvláště na použité aminové složce a na enzymu. Vhodná teplota bude zpravidla kolem 35 až 45 °C, nejlépe asi 35 stupňů Celsia. Při teplotách nižších než 20 CC bude reakční doba obvykle příliš dlouhá, zatímco teploty nad 50 °C jsou spojeny s problémy stability enzymu a/nebo reakčních složek nebo reakčních produktů.
Podobně se mění i reakční doba, která závisí velmi na dalších reakčních parametrech, jak bude -dále 'vysvětleno. Standardní reakční doba při postupu podře vynálezu je asi minut, avšak může činit až několik (hodin.
Je třeba dodat, že používáni se jako aminové složky amidu nebo substituovaného amidu, je často výhodné nebo i nezbytné rozštěpit amidoskupinu zvláště od utvořeného amidu peptidu, aby bylo možné pokračovat v syntéze. V tomto ohledu je obzvláště vhodná karboxypeptidáza, zvláště CDD—Y je velmi výhodná, neboť jak bylo popsáno výše, CPD—Y vykazuje amidázovou aktivitu při pH > 9, přičemž karboxypeplidázová aktivita je zanedbatelná.
Karboxypeptidáza může být obecně použita к odštěpení skupin R3 nebo R4, jak byly definovány, od utvořeného peptidu ať je třeba pokračovat v syntéze nebo pouze získat konečný peptíd, který není C-koncově chráněn.
Jak bude dále vysvětleno, způsob podle vynálezu je použitelný pro vytvoření neohraničeného počtu dipeptidů, oligopeptidů a polypeptidů, podle stejného principu, tj. reakcí substrátové složky s aminovou složkou ve formě aminokyseliny nebo derivátu aminokyseliny za přítomnosti karboxypeptidázy.
Příkladem dobře známých oligopeptidů nebo polypeptidů jež mohou být takto vyrobeny jsou enkefaliny, somatostatin, analogy somatostatinu a peptidy s podobnými biologickými aktivitami a tzv. „spánkový pepticl“ (Trp—Ala—Gly—Gly—Asp—Ala—Ser— —Gly—Glu).
V některých případech, například, jde-li o peptidy skládající se z více než pěti aminokyselin, může být výhodné syntetizovat části žádaného peptidu ve formě fragmentů oligopeptidů, například pentapeptidů s vhodnými pořadími aminokyselin a potom podrobit oligopeptidy kondenzaci fragmentů kterýmkoliv způsobem známým jako per se.
Aby se zlepšila například rozpustnost vytvořených peptidů, může být výhodné použít jako N-koncovou aminokyselinu arginin nebo jinou jonizovanou aminokyselinu během syntetických kroků a pak odštěpit arginin od peptidu specifickým enzymem, například trypsinem, je-li žádaná sekvence aminokyselin jinak v pořádku.
Tyto a jiné modifikace také tvoří část vynálezu.
Dříve než bude způsob podle vynálezu vysvětlen pomocí příkladů, budou popsány výchozí materiály, metody měření atd.
Karboxypeptidáza Y z pekařského droždí byla izolována postupem afinitní chromatografie podle Johansen te al. Carlberg Res. Commun. 41, 1—14 (1976} a získána jako lyofilizovaný prášek 10% enzymu v citronanu sodném. Před použitím byl enzym odsolen na gelu ze zesítěného dextranu (1,5 X X 25 cm) vyváženém vodou a byl eluován destilovanou vodou. Koncentrace enzymu byla stanovena spektrofotometricky při E = 14,8. Zásobní roztok 7 mg/ml, tj.
110 μΜ byl připraven a skladován v alikvotech po 250—500 μΐ při —21 °C. Karbobenzyloxy-f enylalaninmethylester (Z—Phe— —OMe) byl připraven postupem podle Ya18 mada et. al. Bull. Chem. Soc. Japan 51, 1897—1898 (1978), a byl použit jako sirup. Fenylalaninhydrazin a alaninhydrazid hydrochlorid byly připraveny z esterů tak jak bylo popsáno v Lossex et. al. J. Prak. Chemie 4, Reihe, Band 8, 345—350 (1959). Nekorigované body tání byly 86—88 °C, (literatura: 82—83 °C, Losse et al. J. Prak. Chemie 4. Reihe Band 8, 355—350 (1959) a 182—185 CC. (literatura: 184—185 °C, Zeller et al. Helv. Chim. Acta. 40, 257—260 (1957). Asparaginamid dihydrochlorid byl získán z kyseliny asparagové přes dietylester podle Fischer, Chem. Ber. 34, 433—454 (1901) klasickou a minolýzou (t. t.: 210—214 °C, literatura:
2.15—215 °C) Smith, Spack, J. Biol. Chem. 212, 271—299 (1955). Jiné výchozí látky byly dodány výše jmenovanými firmami nebo byly připraveny analogickým způsobem.
Čistota byla určena kvantitativně chromatografií na tenké vrstvě gelu kyseliny křemičité. Použitý systém rozpouštědel byl СНС1з/СН3/СН2/3ОН/СН3СООН/Н2О (11:5:2:1) a skvrny byly vizualizovány zhášením fluorescence pro určení složení reagencií.
Složení reakčních složek bylo určeno kvantitativně reverzní-fázovou vysokotlakou kapalnou chromatografií. Oddělení bylo dosaženo použitím vhodných specifických gradientů elučních systémů od 10 % CH3CN v 10 mM N-aAc, pH 4 do 100 % CH3CN nebo od 10 mM-NaAc, pH 4 do 100 % CH3CN. Druhý systém byl použit pro sloučeniny jako je Bz—Ala—Gly—OH, Bz—Ala—Ala—OH, Bz— —Ala—Ser—OH a jejich amidy viz níže. Průtoková rychlost byla 3 ml/min, teplota kolony 47 °C a vlnová délka 260 nm. Výtěžky byly určeny na základě molárního poměru reakčních složek, jenž byl získán z integrovaných poloh pod vrcholy v elučním profilu.
Skvrny byly identifikovány chromatografií na tenké vrstvě s vhodnými standardními sloučeninami. Některé produkty byly identifikovány kombinací vysokotlaké kapalné chromatografie a analýzy aminokyselin. К tomuto účelu byly odebírány z reakční směsi po 10 minutách 1 ml elikvoty a reakce byla přerušena přidáním 250 μΐ 6 M-HC1. pH bylo pak upraveno na 4 pomocí NaOH a směs byla rozdělena vysokotlakou kapalnou chromatografií. Byl zaznamenáván průběh eluce při vhodné vlnové délce mezi 255—280 nm. Chromatografie byla reverzní fázová s elučním systémem TEAP — 20 % (obj./obj.) TEAP (trietylamonlumfosfátový pufr) v metanolu, pří vhodných gradientech a průtokových rychlostech 1,5-2,0 ml/min. TEAP-pufr byl připraven podle Rivier, J. Liq. Chrom. 1, 343—366 (1978). V mnoha případech dával systém 0,1 M HAc, pH 3 — 20 % obj./obj. 0,1 M HAc, pH 3 v methanolu, také dostatečné rozlišení.
Vytékající kapalina obsahující N acyldipeptidy byla shromažďována a vysušena lyofilizací nebo odpařením rozpouštědla při
35—45 °C. Malé vzorky zbytků byly hydroly254954 zovány v 6 M HC1 při 110 °C ve vakuu po 36 hod. Odpařené hydrolyzáty byly pak analy zovány na analyzátoru aminokyselin.
Sentéza s volnými aminokyselinami jako aminovou složkou
Přikladl
Roztok 2 ml 0,6 M valinu 0.1 MKC1 — — 1 mM EDTA, pH 9,8 byl smíchán s 100 μΐ, tj. 0.1 mmolu, 1M roztoku Bz—Ala—OMe rozpuštěného v 96% etanolu. Reakce byla prováděna, v pH-statu při 35 °C a pH 9.8, přičemž byla hodnota pl-I udržována konstatní automatickým přidáváním 0,5 M NaOH. Reakce byla započata přidáním 0,7 mg karboxypaptidázy Y, 150 jedn./mg. Po reakční době 30 minut, byla reakce přerušena úpravou pH na asi pH 1 pomocí 6M HC1. Reakční produkt byl vyčištěn a oddělen pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Bz— -Ala—Val—OH byl 40 °/o. Kvantitativní aminokyselinová analýza produktu po hydrolýze v 6 M HC1 po 24 hodin, udávala poměrně 1,0 molu alaninu a 1,0 molu valinu.
Vliv pH, teploty a koncentrace substrátové složky, aminové složky a CPD—Y na výtěžek v reakci:
CPD—Y Bz—Ala—OMe II- Val-OH----------------------->
--------> Bz.....Ala.....Val.....ОН -I- CH.sOH.
(5) byl studován v pěti rozdílných sériích pokusů analogicky výše uvedenému postupu. Jedou z pnuimetrů uvedených výše byl v každém pokusu měněn, zatímco čtyři, ostatní byly udržovány konstantní: 0,6 M valin, 55 mM Bz—Ala -OMe, 4,5 (uM CPD—Y, pH 9.7, 35 °C. Výsledky jsou uvedeny v obr. 1. Z obr. 1A je vidět, že rozsah pH pro optimální výtěžek je dosti úzký, pouze 0,5 jednotky pH. Z obr. 1B je patrno, že zvýšení reakční teploty způsobí téměř lineární zvýšení syntézy na účet relativně nižší, hydrolýzy. Při teplotách nad 45 °C se inaktivuje enzym a dochází к ne-enzymatické hydrolýze esteru. Při nižších teplotách a. hodnotách pH do 10,0 byla hydrolýza esteru během prvních deseti minut reakce zanedbatelná. Stala se však význam nou, byla-li rychlost enzymatické reakce inhibována při reakčních dobách až 2 — 5 hodin.
Zatímco výtěžky Bz—Ala—Val—OH se zvyšovaly s vyšší koncentrací aminové složky obr. ID, u vztahu mezi výtěžkem a koncentrací substrátové složky Bz—Ala—OMe tomu bylo právě opačně, obr. IC. Tato pozorování spolu se závislostí výtěžku na vysoké koncentraci enzymu, obr. 1E, ukazují optimální poměr koncentrace substrátu a koncentrace enzymu.
Časový průběh typické reakce ukázaný na příkladu výše uvedené reakce za téměř optimálních podmínek je na obr. 2.
V přítomnosti 0,5 M valinu byl substrát Bz—Ala—OMe rychle převeden během 20 minut na 38% Bz—Ala—Val—OH a 62% Bz—Ala—OH. Na obr. je také vidět, že dipeptid nebyl hydrolyzován při pH 9,7 v přítomnosti nadbytku valinu. Bylo-li však pH upraveno na 5 až 8, byl všechen Bz—Ala— —Val—OH hydrolyzován během několika sekund. Toto selektivní chování CPD—Y při vysokých pH je důležitou vlastností pro její použitelnost při syntéze peptidů.
Příklad 2
Roztok 2 ml 3M lysinu, 0,1 M KC1, 1 mM EDTA o pH 9,8 byl smíchán s 400 μΐη 100 % metanolu a 100 /Д tj. 0,1 mmolu 1M Z— -—Phe—OMe, rozpuštěného v 100 % metanolu. Reakce se prováděla tak, jak je popsáno v příkladu 1 a byla započata přidáním 0,7 mg krboxypeptidázy Y. Po 30 minutách reakční doby bylo pH upraveno 6M HC1 na hodnotu 1. Reakční produkt byl čištěn a izolován pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Z—Phe—Lys—OH byl 60 %. Kvantitativní analýza aminokyselin, jak je popsána v příkladu 1, ukázala že produkt obsahuje relativně 1,0 molu lysinu a 1,0 molu fenylalaninu.
Analogicky s příklady 1 a 2 byly připraveny z určených výchozích látek peptidy uvedené v tabulce I. Pokusy byly prováděny v pH-statu Radiometer a výtěžky byly určeny vysokotlakou chromatografií viz výše. Podmínky byly 4,5 uM CPD—Y; pH 9,7 a 35 °C.
Tabulka I
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s volnými aminokyselinami jako aminovou složkou.
Substrát (konc.) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek %
Bz—Ala—OMe Glycin (3,0 M) Bz—Ala—Gly—OH 62
(55 mM) Alanin (1,9 M) Bz—Ala—Ala—OH 65
Valin (0,6 M) Bz—Ala—Val—OH . (příklad 1) 40
Leucin (0,17 M) Bz—Ala—Leu—OH 24
Fenylalanin (0,16 M) Bz—Ala—Phe—OH 27
Serin (3,2 M) Zz—Ala—Ser—OH 50
Threonin (0,7 M) Bz—Ala—Thr—OH 24
Methionin (0,6 M) Bz—Ala—Met—OH 46
Lysin (1,5 M) Bz—Ala—Lys—OH 56
Arginin (0,8 M) Bz—Ala—Arg—OH 26
Kyselina aspartová (1,0 M) Bz—Ala—Asp—OH 0
Asparagin (0,6 M) Bz—Ala—Asn—OH 5
Kyselina glutamová (1,2 M) χ-metylester kyseliny Bz/Ala—Glu—OH Bz—Ala— 0
glutamové (1,0 M) Glu(OMe)—OH 30
Bz—Ala—OMe Isoleucin (0,15 M) Bz—Ala—Ile—OH 40
(50 mM) Glutamin (0,5 M) O-terc.butylester kyseliny Bz—Ala—Glu—OH Bz—Ala—Asp— 20
aspartové (0,5 M) — (O‘Bu)—OH 30
Tryptofan (0,05 M) Bz—Ala—Trp—OH 10
Histidin (1,0 M) Bz—Ala—His—OH 15
Z—Phe—OMe Valin (0,6 M) Z—Phe—Val—OH 6
(55 mM) Lysin (3,0 M ) Z—Phe—Lys—OH (příklad 2) 60
Bz—Phe— —Gly—OMe (30 mM) Valin (0,6 M) Bz—Phe—Gly—Val—OH 40
Z—Ala—OMe Glycin (2,0 M) Z—Ala—Gly—OH 30
(10 mM) Alanin (0,7 M) Z—Ala—Ala—OH 60
Leucin (0,15 M) Z—Ala—Leu—OH 21
Lysin (1,5 M) Z—Ala—Lys—OH 60
Bz—Gly—OMe Glycin (2,0 M) Bz—Gly—Gly—OH 63
(20 mM) Leucin (0,15 M) Bz—Gly—Leu—OH 21
Bz—Tyr—OEt Valin (0,6 M) Bz—Tyr—Val—OH 30
(25 mM) Alanin (1,9 M) Bz—Tyr—Ala—OH 46
Arginin (0,8 M) Bz—Tyr—Arg—OH 35
Ac—Phe—OEt (50 mM) Alanin (0,8 M) Ac—Phe—Ala—OH 85
Z—Ala— Glycin (2,0 M) Z—Ala—Ala—Gly—OH 40
—Ala—OMe Leucin (0,15 M) Z—Ala—Ala—Leu—OH 0
(10 mM) Fenylalanin (0,15 M) Z—Ala—Ala—Phe—OH 0
Z—Ala— Glycin (2,0 M) Z—Ala—Phe—Gly—OH 35
—Phe—OMe (10 mM) Leucin (0,15 M) Z—Ala—Phe—Leu—OH 0
Z—Ala— —Ser—OMe (10 mM) Leucin (0,15 M) Z—Ala—Ser—Leu—OH 40
Z—Ala— Leucin (0,15 M) Z—Ala—Val—Leu—OH 25
—Val—OMe Lysin (1,5 M) Z—Ala—Val—Lys—OH 60
(10 mM)
Z—Ala— Glycin (2,0 M) Z—Ala—NLeu—Gly—OH 60
—NLeu—OMe (10 mM) Leucin (0,15 M) Z—Ala—NLeu—Leu—OH 16
Z—Ala— —Met—OMe (10 mM) Glycin (2,0 M) Z—Ala—Met—Gly—OH 50
2549S4
20
Substrát Aminoví! složka Produkt Výtěžek
(konc.) (koncentrace) %
Leucin (0,15 M) Z—Ala—Met—Leu—OH 15
Z -Ala— Glycin (2,0 M) Z—Ala—Trp—Gly—OH 23
—Trp—OMe Leucin (0,15 M) Z—Ala—Trp—Leu—OH 3
(10 mM] Fenylalanin (0,15 M] Z—Ala—Trp—Phe—OH 0
Lysin (1,5 M) Z—Ala — Trp—Lys—OH 36
Z—Ala—Ala— Leucin (0,15 M) Z—Ala—Ala—Tyr—Leu—OH 0
—Tyr—OMe Lysin (1,5 M) Z—Ala—Ala—Tyr—Lys—OH 23
(10 mM) Alenin (1,7 M) Z—Ala—Ala—Tyr—Ala—OH 31
Syntéza s amidy aminokyselin jako aminovou složkou
Příklad 3
Roztok 2 ml 0,6 M amidu methioninu (Met—NHz), 0,1 M KC1 1 mH EDTA, pH 9,8 bylo smícháno s 100 ult.j. 0,1 mmolu 1M Bz—Ala—OMe roztoku v 96 % metanolu. Reakce se prováděla jak je popsáno v příkladu 1 a započata byla přidáním 0,7 mg karboxypeptidázy Y. Po 30 minutách reakčního času bylo upraveno pH 6 M HC1 na hodnotu 1. Reakční produkt byl čištěn a izolován pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Bz—Ala—Met—NHz byl 95 °/o. Kvantitativní analýza aminokyselin, jak je popsána v příkladu 1, ukázala, že produkt relativně obsahoval 1,0 molu Ala, 1,0 molu Met a 1,0 molu NH3.
Průběh reakce je ukázán na obr. 3, z něhož je zřejmé, že po 20 minutách je substrát přeměněn téměř zcela z 95 % na dipeptid, 5 °/o je hydrolyzováno na Bz—Ala—OH.
P ř i к lad 4
Roztok 2 ml 0,4 M amidu valinu (Val— —N№), 0,1 M KC1, 1 mM EDTA, pH 9,5 byl smíchán s 100 ul, tj. 0,1 mmolu 1 MBz— —Ala—OMe roztoku v 96 % etanolu. Reakce probíhala, jak je popsáno v příkladu 1. Reakční produkt Bz—Ala—Val—NH? precipitoval během reakce. Po 20 minutách reakce bylo pH upraveno na hodnotu 1 a precipitát byl izolován centrifugací. Produkt byl rozpuštěn v 1 ml 96 % etanolu a čištěn a izolován pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Bz—Ala—Val—NH? byl 95 procent, zatímco, jak je ukázáno v příkladu 1, při použití volné kyseliny jako aminové složky byl pouze 40 %. Kvantitativní analýza aminokyselin, jak je popsána v příkladu 1, ukázala, že produkt relativně obsahoval 1,0 molu. Ala, 1,0 molu Val a 1,0 molu NHs
Závislost poradí reakcí na pH a koncentraci amidu valinu je ukázána na obr. 4. Reakce byla prováděna obdobně jako syntéza uvedená výše, při konstantních parametrech: 0,6 M amid valinu, 55 mM Bz—Ala—OMe,
4.5 uM CPD—Y, pH 9,7, 35 °C.
Bude zřejmé z obr. 4B, že výtěžek je v podstatě necitlivý к proměnlivé koncentraci amidu valinu na rozdíl od obrázku ID, který ukazuje při proměnlivé koncentraci, a to alespoň při koncentraci ekvimolární nebo vyšší než je koncentrace substrátu, tj. 55 mM.
Z obr. 4A bude zřejmé, že účinné rozmezí pH pro amid valinu sahá к 9,0, přičemž existuje ostrá horní hranice při pH 9,8 nad kterou výtěžek významně klesá.
Obdobně s příklady 3 a 4 z uvedených výchozích materiálů byly připraveny peptidy zaznamenané v tabulce II. Pokusy byly prováděny za následujících podmínek: 4,5 jam CPD—Y; pH 9,6 a 35 °C, koncentrace substrátu je uvedena v tabulce.
I
Tabulka И
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s amidy aminokyselin jako aminovou složkou.
Substrát (koně.) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek o/o
Bz—Ala—OMe Glycinamld (0,3 M) Bz—Ala—Gly—NHž 90
(55 mM) Serinamid (0,3 M) Bz—Ala—Ser—NHž 90
Vallnamid (0,4 M) Bz—Ala—Val—NH2 95 + >
(Příklad 4) Leucinamid (0,3 M) Bz—Ala—Leu—NHž 85
Methioniamid (0,6 M) Bz—Ala—Met—NHz 95 .
(Příklad 3) Fenylalaninamid (0,3 M) Bz— Ala—Phe—NHž 90
Tyrosinamid (0,6 M) Bz—Ala—Tyr—NHž 90
Asparaginamid (0,3 M) Bz—Ala—Asn—NHž 80
Prolinamid (0,3 M) Bz—Ala—Pro—NHž 0
Amid kyseliny Bz—Ala—Glu—NHž 0
glutamové (0,25 M) Histidinamid (0,2 M) Bz—Ala—His—NHž 89
Threoninamid (0,2 M) Bz—Ala—Thr—NHž 88
Z—Phe—OMe Valinamid (0,5 M) Z—Phe-Val—NH2 !97 + )
(55 mM) Serinamid (0,4 M) Z—Phe—Ser—NH2 60
Tyrosinamid (0,4 M) Z—Phe—Tyr—NHž 64
Bz—Phe—Gly- -Vallnamid (0,4 M) Bz—Phe—Gly —Val—NHž 90
—OMe (30 mM)
Z—Phe— Valinamid (0,4 M) Z—Phe—Ala—Val—NHž 90+l
—Ala—OMe Glycinamid (0,4 M) Z—Phe—Ala-Gly—NH2 95
(20 mM) Histidinamid (0,4 M) Z—Phe—Ala—His—NHž 50
Z—Leu—Gly— Valinamid (0,4 M) Z—Leu—Gly—Gly—Val—NHž 80
—Gly—OEt (10 mM) Bz—Tyr—OEt Valinamid (0,25 M) Bz—Tyr—Val—NH? 94
(50 mM) Glycinamid (0,55 M) Bz—Tyr—Gly—NHž 82
Z—Ala—OMe Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Leu—NHž 90
(10 mM) Glycinamid (0,15 M) Z—Ala—Gly—NH2 20
Bz—Arg—OEt Tyrosinamid (0,2 M) Bz—Arg—Tyr—NHž 52
(75 mM) Bz—Tyr—OEt Valinamid (0,25 M) Bz—Tyr—Val—NHž 94
(50 mM) Glycinamid (0,55 M) Bz—Tyr—Gly—NHž 82
Z—Pro—OMe Leucinamid (0,25 M) Z—Pro—Leu—NHž 0
(50 mM) Bz—Gly—OMe Histidinamid (0,2 M) Bz—Gly—His—NHž 20
(100 mM) Glycinamid (0,55 M) Bz—Gly—Gly—NH2 95
Leucinamid (0,25 M) Bz—Gly—Leu—NHž 95
Z—Ala— Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Phe—Leu—NHž 95
—Phe—OMe Glycinamid (0,15 M) Z—Ala—Phe—Gly—NHž 84
(10 mM) Z—Ala— Glycinamid (0,15 M) Z—Ala—Ala—Gly—NHž 100
—Ala—OMe Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Ala—Leu—NHž 100
(10 mM) Z—Ala— Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Ser—Leu—NHž 95
—Ser—OMe Glycinamid (0,15 M) Z—Ala—Ser—Gly—NHž 70
(10 mM) Z—Ala— Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Val—Leu—NHž 84
—Val—OMe Glycinamid (0,15 M) Z—Ala—Val—Gly—NHž 100
(10 mM)
+) Produkt vysrážen
2S4934
Substrát (konc.) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek %
Z—Ala— Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—NLeu—Leu—NH? 100
—NLeu—OMe Glycinamid (0,15 M) Z — Ala—NLeu—Gly—N№ 100
(10 mM) Z—Ala— Glycinamid *(0,15 M) Z—Ala—Met—NH2 95
—Met—OMe (10 mM) Z—Ala— Glycinamid [0,15 M) Z—Ala—Trp—Gly—NH2 84
—Trp—OMe Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Trp—Leu—NHz 89
(10 mM) Z—Thr— Valinamid (0,2 M) Z—Thr—Pro—Val—NHz 95
—Pro—OMe
(25 mM) Z—Ala—Ala— Glycinamid (0,15 M) Z—Ala— Ala—Tyr—Gly—NH? 100
—Tyr—OMe Leucinamid (0,15 M) Z—Ala—Ala—Tyr—Leu—NHz 100
(10 mM) Z—Tyr—Gly— —Gly—OMe (20 mM) Fenylalaninamid (0,2 M) Z—Tyr—Gly—Gly—Phe—NHz 40
+) Produkt vysrážen
P ří к lad 5
Syntéza s hydrazidy aminokyselin jako a minovou složkou praveny peptidy podle tabulky III z výchozích látek, jež jsou uvedeny. Pokusy byly prováděny za těchto podmínek: 4,5 μΜ CPD—Y, pH 9,6 a 35 °C.
Obdobně jako v příkladech 3 a 4 byly přiTabulka III
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s hydrazidy aminokyselin jako aminovou složkou
Substrát (konc.)
Aminová, složka [koncentrace)
Produkt
Výtěžek %
Bz—Ala—Ome Alanln-hydrazld (0,6 M) (55 mM) Fenylalaninhydrazid (0,3 M)
Bz—Ala—Ala—NH—NHž
Bz—Ala—Phe—NH—NH2
Příklad 6
Syntéza s estery aminokyselin jako aminovou složkou
Pokusy s estery aminokyselin byly prováděny obdobně jako v příkladech 1, 2, 3 a 4 v pH-statu při pH 9,0-9,7 a 23—35 °C. Produkty a výtěžky byly stanoveny vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Koncentrace CPD—Y byla od 4,5 do 11 μΜ.
V tabulce IV jsou peptidy vyrobené z uvedených výchozích látek.
Je zřejmé, že v některých případech dochází к oligomerizaci. Protože obvykle jsou výtěžky velmi vysoké, zdá se že estery aminokyselin by byly velice výhodné, kdyby mohla oligomerizace být dále omezena.
Tabulka IV
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptldů s estery aminokyselin jako aminovou složkou.
Substrát Aminová složka (konc.) (koncentrace)
Produkt
Výtěžek %
Bz—Ala—OMe Ethylester glycinu (0,5 M) (50 mM)
Propylester glycinu (0,5 M) Isopropylester glycinu (0,5 M)
Butylester glycinu (0,5 M)
Methylester leucinu (0,025 M)
Bz—Ala—OMe Ethylester leucinu (50 mM) (0,25 M)
Terč, butylester leucinu (0,25 M)
Methylester fenylalaninu
ÍBz—Ala—Gly—OH ]Bz—Ala—Gly—Gly—OH Bz—Alu—Gly—OH
Bz—Ala—Gly—OH
Bz—Ala—Gly—OH
Bz—Ala—Leu—OH
Bz—Ala—Leu—Leu--OH
Bz—Ala—Leu—Leu—Leu—OL
Bz—Ala—Leu—Leu—Leu— .—Leu—OH ÍBz—Ala—Leu—OH iBz—Ala—Leu—Leu—OH Bz—Ala—Leu—OH
Bz—Ala—Phe—OH
Bz—Ala—Phe—Phe—OH
Bz—Ala—Phe—Phe—Phe—Ol
100 } 50
Ethylester fenylalaninu (0,15 M)
Methylester kyseliny glutamové (y-terc.-Bu) (0,5 M) terč.butylester kyseliny glutamové (y-terc.-Bu) (0,25 M)
Bz—Ala—OMe (50 mM)
Methylester methioninu (0,2 M)
Bz—Ala—OMe (50 mM)
Ethylester methioninu (0,2 M)
Isopropylester methioninu (0,2 M)
Methylester valinu (0,7 M)
Methylester šeřinu (0,5 M)
Methylester tyroslnu (0,5 M)
Methylester argininu (0,5 M)
Methylester argininu (NO2) (0,5 M)
Methylester histldinu (0,5 M)
Methylester threoninu (0,5 M )
ÍBz—Ala—Phe—OH 1 (Bz—Ala—Phe—Phe—OH j Bz—Ala—Glu (χ-terc.-Bu)—OH [ 70 35
Bz—Ala—Glu (y-terc.-Bu)—OH 0
/Bz—Ala—Met—OH > Bz—Ala—Met—Met—OH Bz—Ala—Met—Met—Met— —OH Bz—Ala—Met—Met—Met— —Met—OH Bz—Ala—Met—Met—Met— —Met—Met—OH 1 86
Bz—Ala—Met—OH 40
Bz—Ala—Met—OH 8
ÍBz—Ala—Val—OH 1 (Bz—Ala—Val—Val—OH j ) 85
Bz—Ala—Ser—OH 50
Bz—Ala—Tyr—OH 25
Bz—Ala—Arg—OH 0
Bz—Ala—Arg (NOž) —OH 40
Bz—Ala—His—OH 26
Bz—Ala—Thr—OH 47
Substrát (коле.) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek %
Ac—Phe—OEt Alaninmetylester Ac—Phe—Ala—OH Ac—Phe—Ala—Ala—OH 60
Bz—Gly—OMe (50 mM) Histidinmetylester (0,5 M) Bz—Gly—His—OH 40
Příklad 7
Příklad 8
L- a Dstereolzomery aminových složek
Rozdílnost substrátové esterové skupiny
Obdobně jako v příkladech 1, 2, 3, 4 a 6 byly vyrobeny peptidy podle tabulky V z uvedených výchozích materiálů.
Je patrné, že jsou inkorporovány pouze L-izomery. Toto je velmi zajímavá vlastnost z hlediska ekonomie postupu, neboť není třeba důsledně čistit výchozí aminokyseliny, aby se získal čistý L-izomer.
Obdobně s příklady 1, 2, 3 a 4 byly vyrobeny peptidy podle tabulky VI z uvedených výchozích látek.
Výsledky potvrzují pružnost postupu podle vynálezu s ohledem na použitelné substráty.
Tabulka V
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s L- a D-izomery aminové složky.
Substrát (koncentrace) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek % L-izomer D-izomer
Bz—Ala—OMe Valin (0,6 M) Bz—Ala—Val—OH 42 0
(50 mM) Alanin (1,8 M) Bz—Ala—Val—OH 65 0
Bz—Tyr—OEt Valin (0,6 M) Bz—Tyr—Val—OH 30 0
(30 mM) Alanin (1,8 M) Bz—Tyr—Ala—OH 46 0
Bz—Ala—OMe Val—NH2 (0,25 M) Bz—Ala—Val—NHz 78 0
(50 mM)
Bz—Tyr—OEt Val—NHz (0,25 M) Bz—Tyr—Val—NHz 95 0
(30 mM)
Ac—Phe—OEt (50 mM) Ala—OMe (0,5 M) ÍAc—Phe—Ala—OH (Ac—Phe— (Ala )2—OH | 60 0
Tabulka VI
Výtěžek (%) karboxydázou Y katalyzované syntézy peptidů s různými esterovými skupinami v substrátové složce.
Substrát Bz—Gly—OMe (20 mM) Bz—Gly—OEt (20 mM) Bz—Gly—OiPr (20 mM) Bz—Gly—OBzl (20 mM)
Aminová složka
Glycin (2,0 M) 63 ;56 45 47
Glycinamid (0,15 M) 59 95 88 91
Leucin (0,15 M) 21 59 74 80
Leucinamid (0,15 M) 95 100 95 95
Příklad 9 robeny peptidy podle tabulek VII z uvedených výchozích látek. Podmínky byly 4,5 μΜ
Depsipeptidy jako substráty CPD—Y, pH 7,8 a 25 °C.
Je zřejmé, že bylo dosaženo velmi vysoObdobně jako v příkladech 3 a 4 byly vy- kých výtěžků.
Tabulka VII
Karboxypeptidázcu Y katalyzovaná syntéza peptidů s depsipeptidy jako substrátovými složkami.
Substrát Aminová komponenta Produkt (konc.) (konc.) í
Výtěžek %
Bz—Gly—OGly Glycinamid (0,25 M) (20 mM) Leucinamid (0,25M)
Fenylalaninamid (0,25 Mj Bz—Gly—OPhe Glycinamid [0,25 Mj (20 mM) Leucinamid (0,25M)
Fenylalaninamid [0,25 M) Bz—Phe—OGly Glycinamid (0,25 M) (20 mM) Leucinamid (0,25M)
Fenylalaninamid (0,25 M) Bz—Gly—OAla Glycinamid (0,25 M) [20 mM) Leucinamid (0,25M)
Bz—Gly—Gly—NH2 90
Bz—Gly—Leu—NH2 95
Bz—Gly—Phe—NH2 95
Bz—Gly—Gly—NH?; 95
Bz—Gly—Leu—NHž 95
Bz—Gly—Phe—NH2 95
Bz—Phe —Gly—NH2 Í90
Bz—Phe—Leu—NH2 80
Bz—Phe—Phe—NH2 80
Bz—Gly—Gly—NH2 95
Bz—Gly—Leu—NH2 95
Příklad 10
Peptidy jako substrátové složky
Obdobně jako v příkladech 1, 2, 3 a 4 byly vyrobeny peptidy uvedené v tabulce VIII. Pokusy byly prováděny v pH-statu a výtěžky byly určeny vysokotlakou kapalnou chromatografií. Podmínky byly 4 až 25 μΜ CPD—Y, pH = 7,6 a 25 °C.
Tabulka VII
Karboxypeptidázou-Y katalyzovattá syntéza peptidů s peptidy jako substráty.
Substrát (konc.) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek %
Bz—Phe—Gly- —Leucinamid (0,25 M) Bz—Phe—Leu—NH2 90
(20 mM) Bz—Gly—Phe —Leucinamid (0,25 M) Bz—Gly—Leu—NH2 10
(20 mM) Z—Ala—Ala Leucinamid (0,25 M) Z—Ala—Leu—NH? 74
(20 mM) Z—Phe—Ala Leucinamid (0,25 M) Z—Phe—Leu—NH? 60
(20 mM) Z—Phe—Ser Leucinamid (0,25 M) Z—Phe—Leu—NH? 70.
(20 mM) Z—Ala—Gly Leucinamid (0,25 M) Z—Ala—Leu—ΝΉ2 80
(10 mM) Ас—(А1а)з Leucinamid (0,25 M) Ac—(Ala )z—Leu—NH2 70
(10 mM) Ac(Ala)4 Leucinamid (0,25 M) Ас—(А1а)з—Leu—NH2 70
(10 mM) Z—Ala—Val Leucinamid (0,25 M) Z—Ala—Leu—NH2 10
(10 mM) Z—Phe—Phe Leucinamid (0,25 M) Z—Phe—Leu—NH? A 10
Syntéza peptidů jako funkce pH
V případech kdy je syntetizovaný peptid špatným substrátem pro CPD-Y, může být syntéza prováděna při hodnotách pH nižším než výhodných 9—10,5.
Příklad 11
Obdobně jako v příkladech 1 a 3 byly vyrobeny peptidy v tabulce IX v pH-statu při uvedených hodnotách pH.
Podmínky byly 15 μΜ CPD-Y a 25 °C.
Tabulka IX
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů jako funkce pH.
Substrát (konc.) Aminová složka (koncentrace) Produkt pH Výtěžek i%
Bz—Ala—OMe Glycin (1,3 M) Bz—Ala—Gly 9,5 40
(50 mM) 9,0 57
8,0 60
7,0 61
6,0 60
5,0 51
Bz—Ala—OMe Glycinamid (1,3 M) Bz—Ala—-Gly—MHz 9,5 77
(50 mM) 9,0 .95
8,0 100
7,0 97
6,0 44
Různé jiné aminové složky
Příklad 12
Obdobně jako v příkladech 3 a 4 byly vyrobeny peptidy uvedené v tabulce X. Pokusy byly prováděny v pH státu a výtěžky stanoveny vysokotlakou chromatografií. Podmínky byly 4,5 μΜ CPD-Y, pH 9,7 a 25 °C.
Tabulka X
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s různými deriváty aminokyselin jako aminovými složkami.
Substrát Aminová složka (konc.) (koncentrace)
Bz—Ala—OMe /3-alaninamid (50 mM) (0,2 M)
Glycln hydroxamová kyselina (0,2 M)
D.L.-Alanin hydroxamová kyselina (0,2 M) Glycin-N-methylamid (0,5 M)
Přiklad 13
Syntéza peptidů s karboxypeptidázami z ječmene
Klíčící ječmen, například ve formě sladu, obsahuje dvě rozdílné peptidázy označené
Produkt Výtěžek _______ M
Bz—Ala—0AIa—N№80
Bz-Ala—Gly—NH—OH45
Bz—Ala—Ala—NH —OH40
Bz-Ala—Gly—NH—СНз20
СР—1—1 а СР—-2—1 viz Lee E. Ray, Carlsberg Res. Comm. 41, 169—182 (1976).
СР—1—1 a CP—2—1 byly izolovány jako popsal L. E. Ray a peptidy v tabulce XI byly vyrobeny obdobně jako v příkladech 1, 2, 3 a 4 z uvedených látek. Podmínky byly 6 μΜ СР—1—1 nebo CP—2—1, pH 8,0 a 25 °C.
Tabulka XI
Syntéza peptidů za použití karboxypeptidáz z klíčícího ječmene CP—1—1 a CP—2—1.
Substrát (konc.) Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek % Enzym
Bz—Ala—OMe Valinamid (0,25 M) Bz—Ala—Val—NH2 43 CP—1—1
(50 mM) Alanin amid (0,25 MjBz—Ala—Ala—NH2 58 CP—1—1
Lysin (1,7 M) Bz—Ala—Lys 11 CP—1—1
Valinamid (0,25 M) Bz—Ala—Val—NH2 57 CP—2—1
Alaninamid (0,25 M) Bz—Ala—Ala—NH2 64 CP—2—1
Lysin (1,7 M) Bz—Ala—Lys 11 CP—2—1
Příklad 14
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná deaminace amidů peptidů
К roztoku 2 ml 15 mM Bz—Ala—Leu—NHž v 0,1 M KC1 — 1 mM EDTA, pH 9,7, 25 °C a 10 % dimetylformamidu bylo přidáno 2 mg CPD—Y. Průběh reakce je ukázán na obr. 5 a byl sledován vysokotlakou kapalinovou chromatografii, jak bylo popsáno v příkladu
1. Je patrno, že Bz—Ala—Leu—NH2 byl po 20 minutách úplně převeden na asi 68 % Bz—Ala—Leu—OH a 32 % Bz—Ala—OH. A- minokyselinová analýza reakční směsi ukázala, že Bz—Ala—OH byl vytvořen hlavně odštěpením Leu—NHz od Bz—Ala—Leu— —NH2.
Příklad 15
Srovnání esteru peptidů s a bez ochranných N-koncových skupin jako substrátů
Obdobně jako v příkladech 3 a 4 byly vyrobeny peptidy uvedené v tabulce XII za těchto podmínek: 50 mM substrát, 5 μΜ CPD—Y, pH 9,5 a 25 ’C.
Tabulka XII
Srovnání pomocí karboxypeptitíázy-Y katalyzované syntézy peptidů za použití esterů peptidu s a bez N-koncové ochranné skupiny jako substrátu.
Substrát (konc.) Aminová složka (koncentrace] Produkt Výtěžek %
Ac—Ala—Ala— -Leucinamid (0,15 M) Ac—Ala—Ala—Ala— 90
—Ala—OMe —Leu—NH?
(50 mM) Ala—Ala— Leucinamid (0,15 M) Ala -Ala—Ala--Leu-NH2 75
—Ala—OMe (50 mM)
Příklad 16
Syntéza v přítomnosti organických rozpouštědel
Obdobně jako v příkladech 1, 2, 3, 4 a 6 byly vyrobeny peptidy v následujících tabulkách XIII, XIV а XV z uvedených výchozích látek a při uvedených koncentracích organických rozpouštědel.
Podmínky byly tyto: 50 mM substrát, 5 μΜ CPD—Y, pH 9,6 a 30 °C.
.......... ::' Tabulka XIII
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s 50 mM Bz -Ala—OMe jako substrátem a volnými aminokyselinami, jako aminovou složkou a s anebo bez 20% metanolu (MeOH) v 0,1 M KC1, 1 mM EDTA.
Aminová složka (koncentrace) Produkt Výtěžek %
s MeOH bez MeOH
Valin (0,5 M) Bz—Ala—Val—OH 42 53
Threonin (1,2 M) Bz—Ala—Thr—OH 52 61
Fénylalanin (0,16 M) Bz—Ala—Phe—OH 16 18
Leucin (0,16 M) Bz—Ala—Leu—OH 33 39
Metionin (0,6 M) Bz—Ala—Met—OH 42 64
Glycin (3,0 M) Bz—Ala—Gly—OH 55 50
Serin (3,2 M) Bz—Ala—Ser—OH 50 52
Lysin (1,5 M) Bz—Ala—Lys—OH 53 41
χ-t-butylester kyseliny Bz Ala- Gin--OBu1/- OH 54 55
glutamové (1,0 M)
Asparagin (0,6 M) Bz—Ala—Asn—OH 18 14
Tabulka XIV
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza Bz—Ala-Thr—OH z Bz—Ala—OMe (50 mM) a threonlnu s různými koncentracemi polyetylénglykolu 300 (PEG-300). Podmínky: CPD-Y 4 μΜ, pH 9,6 a 25 °C.
% PEG-300 v 0,1 M KC1 koncentrace threoninu % výtěžek Bz—Ala—Thr—OH
0 0,7 M 36
10 0,7 M 34
20 0,7 M 31
30 0,7 M 29
40 , '..........., ..... 0,35 M : í'·, _ ' 28
................ Tabulka XV
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů z 50 mM Bz—Ala—OMe a uvedených esterů aminokyselin, jako aminové složky v 30 % polyetylénglykolu — 0,1 M KC1, 1 mM EDTA, Podmínky: CPD—Y = 8 uM, pH 9,6 a 25 °C.
Substrát Aminová složka Produkt . Výtěžek (konc.) (koncentrace) o/o
Bz—Ala—OMe Valin—OMe /Bz—Ala—Val—OH , 'Bz—Ala—Val—Val—OH / 88
(50 mM) (0,5 M)
Serin—OMe Bz—Ala—Ser—OH 30
(0,5 M)
Bz—Ala—OMe Valin—OMe [Bz—Ala—Val—OH 1
(50 mM) (0,5 M) 1 Bz—Ala-Val—Val—OH ’ 88
Serin—OMe Bz—Ala—Ser—OH 30
(0,5 M)
Kyselina glutamová Bz—Ala—Glu -(/OBu1)—OH 38
(Г-OBu1)—OMe (0,5 M)
Fénylalanin—OMe [Bz—Ala—Phe—OH
(0,5 M) Bz—Ala—Phe—Phe—OH j 82
Bz—Ala—OMe L-mettonln—OMe [Bz—Ala—Met—OH 1
(50 mM) (0,5 M) Bz—Ala—Met—Met—OH J
Bz—Ala—Met—Met—Met— I 85
—OH ’
D-metlonin—OMe Bz—Ala—D—Met—OH 0
(0,5 M)
254354
Příklad 17
Nerozpustná (imobilizovaná) karboxypeptidáza-Y
CPD—Y byla navázána na ConcanavallnA-Sepharosu 4B od a tento komplex byl zesíťován pomocí glutaraldehydu jak popisuje Hsiao a Royer, Archives of Biochemistry and Biophysics, 198, 379—385, (1979). Koncen trace CPD—Y byla 3 mg na ml suspenze Sepharosy.
Obdobně jako v příkladech 1 a 3 byly peptidy uvedené v tabulce XVI vyrobeny za těchto podmínek: 50 mM substrát, 0,25 ml CPD— —Y gelu, tj. 5 uM CPD—Y, pH 9,7 a 35. °C. Po odstranění enzymu filtrací byly produkty a výtěžky stanoveny vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
Tabulka XVI
Syntéza peptidů katalyzovaná nerozpustnou karboxypeptidázou.
Substrát Aminová složka Produkt (konc.) (koncentrace)
Výtěžek %
Bz—Ala—OMe Fenylalamin (0,15 M) (50 mM) Leucinamid (0,2 M)
Bz—Ale—Phe
Bz—Ala—Leu—NH2
Příklad 18
Peptidické amidy jako substráty
Roztok 5 mmolu Bz—Ala—Leu—NH2 v 0,1 M chloridu draselném — 1 mmol EDTA a 10% dimetylformamld pH 10,0 byl smíchán při teplotě 25 °C s 0,25 M valínamldem.
Reakce byla iniciována přidáním 40 pm CPD—Y a prováděna analogicky jako v příkladech 3 a 4. Bz—Ala—Leu—Val—NH2 byl izolován pomocí HPCL s výtěžkem 65 %.
Reakce byla opakována za použití 5 mmol
Bz—Ala—Phe—NH2 jako složky substrátu. Bz—Ala—Phe—Val—NHž byl izolován pomocí HPLC s výtěžkem 44 %.
Příklad 19
Syntéza met-enkefalinu
Stupňová syntéza met-enkefalinu vycházející z 5 g Bz—Arg—CEt a používající CPD—Y jako katalyzátor se provádí podle následujícího schématu
Bz—Arg—OEt pH 9,6
CPD—Y
H—Tyr—NH2
Bz—Arg—Tyr—NH2 pH 9,6 CPD—Y Bz—Arg—Tyr—OH
EtOH/HCl
Bz—Arg—Tyr—OEt pH 9,0
CPD—Y H—Gly—OEt
H—Tyr—Gly—Gly—Phe—Met—OH (95 %)
pH 8,0 Trypsin
(85 %) Bz—Arg—' 1 Гуг—Gly—Phe—Met—OH (75%)
pH 9,5 1 CPD—Y M—Met—OH
(90 %) - Bz—Arg— 1 Гуг—Gly—Gly—Phe—OEt (80%)
EtOH/HCI
(80%) Bz—Arg—í Гуг—Gly—Phe—OH (95 %)
pH 9,6 CPD—Y
(60 %) Bz—Arg—’ Гуг—Gly—Gly—Phe—NH2 (65 %)
CPD—Y, pH 8,0 /
H—Phe—NH2
Schéma:
Syntéza met-enkefalinu za použití karboxypeptidázy-Y (CPD—Y) jako katalyzátoru. V závorkách jsou uvedeny procenta výtěžků.
CPD—Y katalyzovaná kondenzace a stupně deaminace byly prováděny v čistě vodné fázi a Bz—Arg byla vybrána jako solubilizační chránící skupina, která by mohla být odstraněna v posledním stupni trypsinem, jak je vysvětleno vpředu. Po rozšíření peptídu aminokyselinou, následovanou deaminací byl syntetizován následující peptid-esterový substrát pomocí absolutního ethanolu a bezvodého chlorovodíku. Sloučeniny z jednotlivých reakčních stupňů byly izolovány pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Takto lze rovněž regenerovat nadbytečnou aminovou složku i „vedlejší produkt“ hydrolýzy.
5'49 5 4

Claims (10)

  1. PŘEDMĚT
    1. Způsob výroby peptidů obecného vzorce
    А—В kde
    A znamená N-koncově chráněný zbytek L-aminokyseliny nebo případně N-koncově chráněný peptidový zbytek mající C-koncovou L-aminokyselinu a
    В je případně C-koncově chráněný zbytek L-aminokyseliny, reakcí substrátové složky s aminovou složkou v přítomnosti enzymu, vyznačený tím, že substrátová složka ze skupiny zahrnující
    a) estery aminokyselin, estery peptidů a depsipeptidy obecného vz-orce
    A -OR1 kde
    A má význam udaný výše a
    OR1 znamená enzymaticky odštěpltelnou skupinu, v níž R1 je vybráno z Cl—-Сб-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu, benzylu a fenethylu, nebo α-des-aminový fragment zbytku L-aminokyseliny,
    b) případně N-substituované amidy aminokyselin a amidy peptidů obecného vzorce
    A—NR2R2< kde
    A má význam udaný výše a
    NR2R2‘ znamená enzymaticky štěpitelnou skupinu, v níž R2 a R2‘ jsou vybrány z vodí ku, Ci—Сб-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu, benzylu a fenethylu, a
    c) případně N-koncově chráněné peptidy obecného vzorce
    А—X kde
    A má význam udaný výše a
    X znamená L-aminokyselinu, se uvádí do reakce s aminovou složkou ze skupiny zahrnující
    a) L-aminokyseliny obecného vzorce
    Η—B—OH, kde
    В znamená zbytek L-aminokyseliny,
    b) případně N-substituované amidy L-aminokyselin vzorce
    H--B—NR3R3‘ kde
    В je L-aminokyselinový zbytek a
    VYNALEZU
    R3 a R3‘ znamenají vodík, nebo snadno odštěpiteinou skupinu vybranou z hydroxylu, aminoskupiny nebo Ci—Ce-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu, benzylu a fenethylu, a
    c]estery aminokyselin obecného vzorce
    Η—B—OR4 kde
    В je L-aminokyselinový zbytek a
    R4‘ znamená snadno odštěpitelnou skupinu vybranou z Ci—Co-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu a fenethylu, v přítomnosti L-speclfické serin- nebo thiolkarboxypeptidázy živočišného, rostlinného a mikrobiálního původu, ve vodném roztoku nebo disperzi o· výchozí koncentraci substrátové složky 0,01 až 1 M a aminové složky 0,05 až 3 M a o pH 5 až 10.5, výhodně 8 až 10,5 a s výhodou při teplotě 20 až 50 °C, za vzniku peptidů, a poté se popřípadě odštěpí kterákoli ze skupin R3, R3‘ nebo R4 nebo N koncová ochranná skupina, výhodně pomocí L-specifické serin- nebo thiolkarboxypeptidázy, které bylo použito při předchozí reakci.
  2. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že jako karboxypeptidázy se použije karboxypeptidázy Y z kvasnic.
  3. 3. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se používá karboxypeptidázy ze skupiny zahrnující penícilokarboxypeptidázu S—1 a S—
    2 z Penicillium janthinellum, karboxypeptidázy z Aspergillus saitoi nebo Aspergillus eryzae, karboxypeptidázy C z pomerančovníkových listů neboi slupek, k-arboxypeptidázu CN z Citrus natsudsidai Hayata, phaseolain z fazolových listů, karboxypeptidázy z klíčícího ječmene, klíčících bavlníkových rostlin, rajčat, vodních melounů a bromeleinového nebo ananasového prášku.
  4. 4. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se používá zmobilizovaného karboxypeptidázového enzymu.
  5. 5. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se používá vodného reakčního roztoku obsahujícího s výhodou organické rozpouštědlo v koncentraci od stop do 50 %.
  6. 6. Způsob podle bodu 5 vyznačený tím, že se používá organického rozpouštědla ze skupiny zahrnující alkanoly, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, dioxan, tetrahydrofuran, dimethoxyethan, eíhylenglykol a polyethylenglykoly.
  7. 7. Způsob podle bodu 5, vyznačený tím, že reakce se provádí při koncentraci karboxypeptidázy 10~6 až 10-4 M.
  8. 8. Způsob podle kteréhokoli z předchozích bodů vyznačený tím, že jako substrátové složky se používá esteru aminokyseliny nebo esteru peptidů ze skupiny zahrnující benzylestery a Ci—Cd-alkylesterů, případně substituovaných inertními substituenty.
    2Í4Я5<
    35 ЗВ
  9. 9. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že jako aminové složky se používá amidu obecného vzorce
    Η—Β—NH R3 kde
    R3 znamená Ci—Сз-alkyl a
    В znamená Zbytek L-arriindkyseliny.
  10. 10. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že jako aminové složky se používá esteru obecného vzorce
    Η—B—OR4 kde
    R4 znamená Ci—Сз-alkyl a
    В znamená Zbytek L-aminokyseliny.
    5 listů výkresů
    Bz-Ala-Val-OH
    254854
CS802399A 1979-04-06 1980-04-08 Method of peptides production CS254954B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK144379 1979-04-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS239980A2 CS239980A2 (en) 1987-07-16
CS254954B2 true CS254954B2 (en) 1988-02-15

Family

ID=8104890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS802399A CS254954B2 (en) 1979-04-06 1980-04-08 Method of peptides production

Country Status (18)

Country Link
US (2) US4339534A (cs)
EP (1) EP0017485B1 (cs)
JP (1) JPS6339237B2 (cs)
AT (1) ATE9595T1 (cs)
AU (1) AU545416B2 (cs)
BR (1) BR8008024A (cs)
CA (1) CA1160973A (cs)
CS (1) CS254954B2 (cs)
DE (1) DE3069259D1 (cs)
FI (1) FI70597C (cs)
HU (1) HU186734B (cs)
IE (1) IE50256B1 (cs)
IL (1) IL59776A (cs)
NZ (1) NZ193375A (cs)
RO (1) RO80806A (cs)
SU (1) SU1378785A3 (cs)
WO (1) WO1980002157A1 (cs)
ZA (1) ZA801929B (cs)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
WO1982004069A1 (en) * 1981-05-20 1982-11-25 Andresen Finn Hede A process for the preparation of insulin derivatives
WO1983001074A1 (en) * 1981-09-15 1983-03-31 Andresen, Finn, Hede Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof
DK149824C (da) * 1982-01-22 1987-03-16 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner
WO1983002772A1 (en) * 1982-02-08 1983-08-18 Robin Ewart Offord An improved method for preparing human insulin from non-human insulin
JPS59112952A (ja) * 1982-12-21 1984-06-29 Taisho Pharmaceut Co Ltd ペプチド誘導体
GB8430255D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Erba Farmitalia Biologically active oligopeptides
FR2584077B1 (fr) * 1985-06-28 1988-07-08 Irceba L-di ou tripeptides possedant une activite biologique utilisable en medecine humaine et veterinaire, procede pour leur obtention et medicament en contenant
JPH01501995A (ja) * 1986-04-10 1989-07-13 コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション 酵素合成方法
US4935355A (en) * 1986-04-15 1990-06-19 Synthetech, Inc. Preparation of dipeptides
US5350681A (en) * 1986-08-18 1994-09-27 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides
US5202235A (en) * 1986-08-18 1993-04-13 The Coca-Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
US5336601A (en) * 1986-08-18 1994-08-09 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the snythesis and separation of peptides
US5002871A (en) * 1986-08-18 1991-03-26 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides
US5037741A (en) * 1986-08-18 1991-08-06 The Coca Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
DK72587D0 (da) * 1987-02-13 1987-02-13 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider
US4892820A (en) * 1987-06-10 1990-01-09 The Nutrasweet Company Solvent system for enzymatic coupling process
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
DE3733198A1 (de) * 1987-10-01 1989-04-13 Kernforschungsanlage Juelich Enzymatisches verfahren zur herstellung von dipeptiden
DE3741515A1 (de) * 1987-12-08 1989-06-22 Degussa Verfahren zur herstellung von dipeptiden
DK15888D0 (da) * 1988-01-14 1988-01-14 Carlsberg Biotechnology Ltd Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af immunmodulerende pentapeptider samt mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden
DE3803124A1 (de) * 1988-02-03 1989-08-10 Degussa Verfahren zur enzymatischen peptidsynthese
DE68924196T2 (de) * 1988-06-03 1996-05-09 Sharp Kk Elektronische Anordnung mit einer Kalenderfunktion.
DK163435C (da) * 1988-08-12 1992-07-20 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf
US5002872A (en) * 1989-05-10 1991-03-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Enzyme mediated coupling reactions
US5300437A (en) * 1989-06-22 1994-04-05 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US4950606A (en) * 1989-06-22 1990-08-21 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US5169780A (en) * 1989-06-22 1992-12-08 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US5279954A (en) * 1989-06-30 1994-01-18 Board Of Regents Of The University Of Nebraska And Bionebraska Exopeptidase catalyzed site-specific bonding of supports, labels and bioactive agents to proteins
US5366862A (en) * 1990-02-14 1994-11-22 Receptor Laboratories, Inc. Method for generating and screening useful peptides
DE4014564C1 (cs) * 1990-05-07 1991-07-18 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
DK133990D0 (da) * 1990-05-30 1990-05-30 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af growth hormone releasing factor (grf) og peptider anvendelige som mellemprodukter ved fremgangsmaaden
DK220890D0 (da) * 1990-09-14 1990-09-14 Ole Buchardt Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider
US5580751A (en) * 1990-09-14 1996-12-03 Carlsberg A/S Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
KR930002966B1 (ko) * 1990-11-24 1993-04-16 주식회사 미 원 디펩티드의 제조방법
CA2115159A1 (en) * 1991-08-08 1993-02-09 Jeffrey A. Bibbs Production of peptide amides
DE59205565D1 (de) * 1991-10-07 1996-04-11 Hoechst Ag Carbonsäureester-Schutzgruppen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Kopplung an eine funktionelle Gruppe sowie ihre Verwendung
EP0566824A1 (en) * 1992-01-28 1993-10-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic peptide synthesis
US5356805A (en) * 1992-03-03 1994-10-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Gamma-polyglutamate hydrolase
FR2721030B1 (fr) * 1994-06-09 1996-08-30 Pasteur Institut Composés modifiant la transmission sérotoninergique; applications diagnostiques et thérapeutiques.
ATE211483T1 (de) 1993-10-04 2002-01-15 Pasteur Institut Verbindungen, die die serotoninerge übertragung beeinflussen; ihre diagnostischen und therapeutischen anwendungen
US6187579B1 (en) * 1993-10-28 2001-02-13 Carlsberg A/S Customized proteases
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
US5585359A (en) * 1994-09-29 1996-12-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU4415796A (en) * 1994-12-07 1996-06-26 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
JPH11505522A (ja) * 1995-04-21 1999-05-21 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト エンドセリン阻害剤としてのｎ−アロイルアミノ酸アミド
US5985627A (en) * 1997-02-28 1999-11-16 Carlsberg Laboratory Modified carboxypeptidase
NL1006069C2 (nl) * 1997-05-16 1998-11-17 Dsm Nv Werkwijze voor de bereiding van peptiden.
WO2000027800A1 (en) * 1998-11-09 2000-05-18 Smithkline Beecham Corporation Ccr-3 receptor antagonists
US20030060413A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-27 Zimmer Robert H. Derivatives of pseudo-peptides, their preparation and their biological uses
US7671029B2 (en) 1999-08-06 2010-03-02 Immupharma Sa Compositions and methods for enhanced pharmacological activity of compositions comprising peptide drug substances
US6908900B2 (en) * 2001-01-17 2005-06-21 Zimmer & Associates Ag Compositions and methods for enhanced pharmacological activity through oral and parenteral administration of compositions comprising polypeptide drug substances and other poorly absorbed active ingredients
US6624147B1 (en) * 1999-09-28 2003-09-23 Rijksuniversiteit Leiden Inhibitors of prenylated pyrophosphate consuming enzymes
US6939693B2 (en) * 1999-10-29 2005-09-06 Novus International, Inc. Enantioselective oligomerization of α-hydroxy carboxylic acids and α-amino acids
US6605590B1 (en) 1999-10-29 2003-08-12 Novus International, Inc. Oligomers and oligomeric segments of alpha-hydroxy carboxylic acids and alpha-amino acids
PT2308874E (pt) 2005-12-07 2013-04-26 Basilea Pharmaceutica Ag Monobactamas ligadas por pontes, úteis como inibidores de beta-lactamase
CN103073618A (zh) * 2013-01-15 2013-05-01 吉尔生化（上海）有限公司 一种苄氧羰基丙氨酰丙氨酸的制备方法
AU2017246706B2 (en) 2016-04-04 2020-09-17 Research Triangle Institute Neuropeptide s receptor (NPSR) agonists
CN107936089B (zh) * 2017-11-07 2021-01-29 重庆大学 一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3276961A (en) * 1963-04-08 1966-10-04 Squibb & Sons Inc Process for preparing human insulin
US3972773A (en) * 1975-04-29 1976-08-03 Sagami Chemical Research Center Process for producing peptide
US4119493A (en) * 1975-10-23 1978-10-10 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4116768A (en) * 1975-04-29 1978-09-26 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4086136A (en) * 1975-10-23 1978-04-25 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase
JPS5411294A (en) * 1977-05-23 1979-01-27 Toyo Soda Mfg Co Ltd Recovery of protease
JPS5411293A (en) * 1977-05-23 1979-01-27 Toyo Soda Mfg Co Ltd Recovery of protease

Also Published As

Publication number Publication date
US4806473A (en) 1989-02-21
ZA801929B (en) 1981-11-25
IL59776A (en) 1985-01-31
JPS56500519A (cs) 1981-04-23
FI70597C (fi) 1986-09-24
NZ193375A (en) 1983-06-14
SU1378785A3 (ru) 1988-02-28
EP0017485B1 (en) 1984-09-26
IE800694L (en) 1980-10-06
RO80806A (ro) 1983-02-01
US4339534A (en) 1982-07-13
AU545416B2 (en) 1985-07-11
FI70597B (fi) 1986-06-06
WO1980002157A1 (en) 1980-10-16
FI801035A (fi) 1980-10-07
IE50256B1 (en) 1986-03-19
DE3069259D1 (en) 1984-10-31
HU186734B (en) 1985-09-30
CS239980A2 (en) 1987-07-16
AU5981580A (en) 1980-10-22
IL59776A0 (en) 1980-06-30
ATE9595T1 (de) 1984-10-15
EP0017485A1 (en) 1980-10-15
CA1160973A (en) 1984-01-24
BR8008024A (pt) 1981-03-31
JPS6339237B2 (cs) 1988-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS254954B2 (en) Method of peptides production
EP0278787B1 (en) A process for enzymatic production of dipeptides
US4645740A (en) Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins
EP0359399B1 (en) Process for the enzymatic production of dipeptides
AU660944B2 (en) Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
US5580751A (en) Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
Nakamura et al. Synthesis of peptide thioesters via an N–S acyl shift reaction under mild acidic conditions on an N‐4, 5‐dimethoxy‐2‐mercaptobenzyl auxiliary group
DK2634193T3 (en) Condensation of the side-chain protected oligopeptidfragmenter using subtilisins in organic solvents
EP0324659B1 (en) Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process
Hwang et al. Enzyme-catalyzed peptide segment condensation using 5 (4H)-oxazolones as acyl donors
Konopińska et al. Proteolytic enzymes in peptide synthesis
Groeger et al. Papain‐catalyzed synthesis of dipeptides
NO157706B (no) Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider.
CA1177429A (en) Process for enzymatic production of peptides
DK155613B (da) Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af peptider
WO2009047354A1 (en) Chemo-enzymatic synthesis of a c-terminal thioester of an amino acid or a peptide
DK163365B (da) Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptidderivater
EP0303602A1 (en) Enzymatic synthesis
CALLSTROM CHARLES A. WARTCHOW¹ MATTHEW R. CALLSTROM² MARK D. BEDNARSKI³
Yuen Carboxypeptidase Y catalysed oligomerisation of methionine