CS254954B2 - Method of peptides production - Google Patents
Method of peptides production Download PDFInfo
- Publication number
- CS254954B2 CS254954B2 CS802399A CS239980A CS254954B2 CS 254954 B2 CS254954 B2 CS 254954B2 CS 802399 A CS802399 A CS 802399A CS 239980 A CS239980 A CS 239980A CS 254954 B2 CS254954 B2 CS 254954B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- ala
- amino acid
- carboxypeptidase
- gly
- phe
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 64
- -1 amino acid esters Chemical class 0.000 claims abstract description 55
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 47
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108010002156 Depsipeptides Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 claims description 53
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 claims description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 44
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 13
- YIZXAGDEZSXOPR-JQWIXIFHSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-benzamidopropanoyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YIZXAGDEZSXOPR-JQWIXIFHSA-N 0.000 claims description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 6
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 claims description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 2
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical group 0.000 claims 11
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 claims 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 claims 1
- 241000228129 Penicillium janthinellum Species 0.000 claims 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 65
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 40
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 61
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 43
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 33
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 32
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N L-leucinamide Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(N)=O FORGMRSGVSYZQR-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 21
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 14
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 13
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 12
- XDEHMKQLKPZERH-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanamide Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(N)=O XDEHMKQLKPZERH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- OBSIQMZKFXFYLV-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OBSIQMZKFXFYLV-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 5
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 4
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N N-benzoyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- YIVZYFDBEPMPNL-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-acetamido-3-phenylpropanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CC1=CC=CC=C1 YIVZYFDBEPMPNL-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- YFGBQHOOROIVKG-BHDDXSALSA-N (2R)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-BHDDXSALSA-N 0.000 description 3
- UMMQVDUMUMBTAV-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 UMMQVDUMUMBTAV-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 3
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 3
- HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N L-alaninamide Chemical compound C[C@H](N)C(N)=O HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDLDXNCMJBOYJV-YFKPBYRVSA-N L-arginine, methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ZDLDXNCMJBOYJV-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- PQFMNVGMJJMLAE-QMMMGPOBSA-N L-tyrosinamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PQFMNVGMJJMLAE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102400000988 Met-enkephalin Human genes 0.000 description 3
- 108010042237 Methionine Enkephalin Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 3
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 3
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 3
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 3
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 3
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940068886 polyethylene glycol 300 Drugs 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- FDSPJMDEWGLXKT-JQWIXIFHSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-benzamidopropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C1=CC=CC=C1 FDSPJMDEWGLXKT-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 2
- MGOGKPMIZGEGOZ-REOHCLBHSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanamide Chemical compound OC[C@H](N)C(N)=O MGOGKPMIZGEGOZ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- VCYBSQKYFOVMPG-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminopropanehydrazide Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NN VCYBSQKYFOVMPG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- BXRMEWOQUXOLDH-LURJTMIESA-N L-Histidine methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 BXRMEWOQUXOLDH-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229920002556 Polyethylene Glycol 300 Polymers 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 101000655609 Streptomyces azureus Thiostrepton Proteins 0.000 description 2
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRLROPAFMUDDRC-INIZCTEOSA-N ethyl N-benzoyl-L-tyrosinate Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 SRLROPAFMUDDRC-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- XNOLRFVMWOSFSK-UHFFFAOYSA-N propyl 2-aminoacetate Chemical compound CCCOC(=O)CN XNOLRFVMWOSFSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000010518 undesired secondary reaction Methods 0.000 description 2
- CFBPGADIXTVKBS-VKHMYHEASA-N (2S)-2-amino-3-sulfanylpropan-1-ol Chemical compound OC[C@H](N)CS CFBPGADIXTVKBS-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LEJTXQOVOPDGHS-YOEHRIQHSA-N (2s)-2-[[(2s)-3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 LEJTXQOVOPDGHS-YOEHRIQHSA-N 0.000 description 1
- ZRZROXNBKJAOKB-GFVHOAGBSA-N (2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 ZRZROXNBKJAOKB-GFVHOAGBSA-N 0.000 description 1
- UHYBQLHLHAROJR-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanehydrazide Chemical compound NNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 UHYBQLHLHAROJR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DGTOSJBLQULTIR-QRPNPIFTSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;hydrazine Chemical compound NN.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DGTOSJBLQULTIR-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- LPJXPACOXRZCCP-VIFPVBQESA-N (2s)-2-benzamidopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 LPJXPACOXRZCCP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- PZUOEYPTQJILHP-GBXIJSLDSA-N (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanamide Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(N)=O PZUOEYPTQJILHP-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUMOJENFFHZAFP-UHFFFAOYSA-N 2-Ethoxynaphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC(OCC)=CC=C21 GUMOJENFFHZAFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWYPSSZPXQVFRB-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-benzamidoacetyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 FWYPSSZPXQVFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RNBMQRYMCAVZPN-VIFPVBQESA-N 2-[[(2s)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 RNBMQRYMCAVZPN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- UUYDPHCMCYSNAY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-n-methylacetamide Chemical compound CNC(=O)CN UUYDPHCMCYSNAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- OVSKGTONMLKNPZ-UHFFFAOYSA-N 3-(1-methylindol-3-yl)-4-(1-methyl-6-nitroindol-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C1=C(C=2C3=CC=C(C=C3N(C)C=2)[N+]([O-])=O)C(=O)NC1=O OVSKGTONMLKNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000234673 Bromelia Species 0.000 description 1
- 241001640117 Callaeum Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 241001561395 Citrus natsudaidai Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- QIGLJVBIRIXQRN-UHFFFAOYSA-N DL-leucine ethyl ester Natural products CCOC(=O)C(N)CC(C)C QIGLJVBIRIXQRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051088 Delta Sleep-Inducing Peptide Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SEWIYICDCVPBEW-BYPYZUCNSA-N L-glutamate methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SEWIYICDCVPBEW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GSYTVXOARWSQSV-BYPYZUCNSA-N L-methioninamide Chemical compound CSCC[C@H](N)C(N)=O GSYTVXOARWSQSV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- VLJNHYLEOZPXFW-BYPYZUCNSA-N L-prolinamide Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1 VLJNHYLEOZPXFW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101150044367 MKC1 gene Proteins 0.000 description 1
- YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N Met-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBQJSKKFNMDLON-JTQLQIEISA-N N-acetyl-L-phenylalanine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CBQJSKKFNMDLON-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 108010051054 N-benzyloxycarbonylphenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940051881 anilide analgesics and antipyretics Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000012431 aqueous reaction media Substances 0.000 description 1
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- ONDMKQWGMAVUNZ-UHFFFAOYSA-N butyl 2-aminoacetate Chemical compound CCCCOC(=O)CN ONDMKQWGMAVUNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFFDSQBEGQFJJU-UHFFFAOYSA-N butyl hydrogen carbonate Chemical compound CCCCOC(O)=O DFFDSQBEGQFJJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000006244 carboxylic acid protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- CCAFPWNGIUBUSD-UHFFFAOYSA-N diethyl sulfoxide Chemical compound CCS(=O)CC CCAFPWNGIUBUSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 1
- CJGXMNONHNZEQQ-JTQLQIEISA-N ethyl (2s)-2-amino-3-phenylpropanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CJGXMNONHNZEQQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- QIGLJVBIRIXQRN-ZETCQYMHSA-N ethyl (2s)-2-amino-4-methylpentanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](N)CC(C)C QIGLJVBIRIXQRN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- NTNZTEQNFHNYBC-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-aminoacetate Chemical compound CCOC(=O)CN NTNZTEQNFHNYBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARJXIGOIOGJAKR-LURJTMIESA-N ethyl L-methioninate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](N)CCSC ARJXIGOIOGJAKR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010049589 leucyl-leucyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- CEMZBWPSKYISTN-YFKPBYRVSA-N methyl (2s)-2-amino-3-methylbutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)C(C)C CEMZBWPSKYISTN-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UIHPNZDZCOEZEN-YFKPBYRVSA-N methyl (2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CCSC UIHPNZDZCOEZEN-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- IDVXGMLTOPUJTE-JQWIXIFHSA-N methyl (2s)-3-hydroxy-2-[[(2s)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoyl]amino]propanoate Chemical compound COC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 IDVXGMLTOPUJTE-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- QVDXUKJJGUSGLS-LURJTMIESA-N methyl L-leucinate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC(C)C QVDXUKJJGUSGLS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N methyl L-phenylalaninate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- MWZPENIJLUWBSY-VIFPVBQESA-N methyl L-tyrosinate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MWZPENIJLUWBSY-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;phosphoric acid Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N sec-butyl acetate Chemical compound CCC(C)OC(C)=O DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 125000005147 toluenesulfonyl group Chemical group C=1(C(=CC=CC1)S(=O)(=O)*)C 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010012567 tyrosyl-glycyl-glycyl-phenylalanyl Proteins 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- BZPCSFNCKORLQG-NSHDSACASA-N z-arg(no2)-oh Chemical compound [O-][N+](=O)NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 BZPCSFNCKORLQG-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
- C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
- C07K5/06095—Arg-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu enzymatické výroby peptidů. Zejména se vynález týká způsobu výroby peptidů za použití určité skupiny enzymů jako katalyzátorů.
Je známé provádění syntézy peptidů více či méně důmyslnými vazebnými reakcemi a to jak homogenní syntézou, tak i heterogenní syntézou na pevných nosičích. Avšak všechny tyto chemické postupy zahrnují nebezpečí nežádoucích sekundárních reakcí a racemizací, a proto je nutné pečlivé řízení chemických reakcí, aby se tyto komplikace odstranily nebo co nejvíce omezily. Mimo to aminokyselinové postranní řetězce musí být často chráněny, což vyžaduje deblokaci jako poslední chemický krok při výrobě žádaných peptidů. V závislosti na velikosti syntetizovaného peptidů mohou být výtěžky nízké a v důsledku sekundárních reakcí je к získání čistého produktu třeba použít těžkopádných purifikačních postupů. Všechny tyto problémy spojené s chemickou syntézou peptidů, vysoká cena některých vazebných činidel a blokujících derivátů aminokyselin jsou příčinou toho, že i výroba malých syntetických peptidů, například pentapeptidů je dosti drahá.
Protože enzymy jsou vysoce specifické kakalyzátory a proteolytické enzymy jsou schopné hydrolyzovat peptidické vazby v proteinech, byly již dříve studovány možnosti převrácení této hydrolyzační reakce, neboli využití enzymů jako katalyzátorů při syntéze peptidických vazeb. Bergmanri a Fraenkel-Conrat, J. Biol. Chem. 119, 707— —720, (1937) a Bergmann a Fruton, J. Biol. Chem. 124, 321—329, (1938) studovali toto podrobně a,v roce 1937 prokázali, že papain a chymotrypsin mohou katalyzovat spojování některých acylaminokyselin a anilidů aminokyselin. V tomto studiu se pokračovalo na základě dvou fundamentálně odlišných přístupů, termodynamického a kinetického.
Základními rysy termodynamických metod je použití vhodné proteázy ke katalýze ustavení termodynamické rovnováhy mezi reagujícími látkami a odstranění reakčního produktu z reakční směsi. Isowa et al, Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2762—2765 (1977),
Bull. Chem. Soc. Japan 50 2766—2772 (1977), Bull. Chem. Soc. Japan 51, 271—276 (1978) a americký patent č. 4 119 493 a Britské patenty 1 523 546 a 1 533 129, Luisi et al., J. Mol. Catalysis 2, 133—138 (1977), Saltman et al., Biopolymers 16, 631—638 (1977) a Morihara, J. Biochem 84, 1277—1283 (1978) zjistili, že některé serinové thiolové a metaloendoprotézy katalyzují syntézu peptidů z chráněných, ale velmi snadno rozpustných di-, tri-, a tetrapeptidů, přičemž konečné produkty precipitují z reakční směsi, neboť jejich rozpustnost je nižší, než rovnovážná koncentrace. Příklady takovýchto syntéz jsou uvedeny v těchto reakčních schématech:
1) papain Z—Leu—Phe—OH + Phe—ODPM----->
------ z—Leu—Phe—Phe—ODPM ODPM = difenylmetylester
2)
Z—Arg(NOž)—OH + Phe—Val— termolysin —OBu1---------Z—Arg.(NO2)— Phe—Val—OBu'
3)
BOC—Val—Tyr(Bz)OH + Val—His(Bz) — nagarza —Pro—Phe—OEt-------BOC—Val—Туг (Bz)—Val—His (Bz) — —Pro—Phe—OH (Z = karbobenzoxy,
Bz = benzoyl, BOC = tert. butoxykarboxyl).
Avšak tento reakční princip může být použit jako obecný postup syntézy pouze tehdy, jestliže jako při obvyklém postupu chemické syntézy, všechny aminokyselinové postranní řetězce s potenciálně jonizovatelnými skupinami jsou blokovány před reakcí a odblokovány po reakci. Metoda je také nedokonalá v tom, že vzhledem к vysoké specifitě různých enzymů, je třeba použít různých enzymů, v závislosti na typu peptidické vazby jež má být syntetizována, či spíše na aminokyselinách tvořících peptidickou vazbu. I když tyto další těžkosti mohou být překonány, metoda skrývá některé další problémy, neboť vyžaduje velmi vysokou koncentraci enzymu, 100 mg/mmol peptidu; dlouhé doby reakce, 1 až 3 dny a dává velmi odlišné výtěžky 20 až 80 %, jak je uvedeno ve výše zmíněných americkém a britských patentových spisech.
Klibanov et al, Blatech. Bioeng. 19, 1351— —1361 (1977) navrhli práci v systému složeném z vody a organického rozpouštědla nemísitelného s vodou. Tento postup také výžaduje vysokou koncentraci enzymu a dlouhou reakční dobu až několik dnů.
Jiný typ enzymatických syntéz je založen na kinetickém přístupu. Bylo prokázáno pro většinu serinových a thiolových proteáz, že meziprodukt acylenzym se tvoří během jednoho z katalytických kroků při hydrolýze peptidů nebo esterů peptidů, a pak je hydrolyzován vodou v následujících krocích. Jsou-li během hydrolýzy přítomny jiné nukleofilní látky než voda, budou také přijímat acyl skupinu z acylenzymu, přičemž se vytvoří amidová vazba. Toto studovali napři254 954 klad Fastrez a Fersht, Biochemistry 12, 2025—2034 (1973), kteří popsali chymotrypsinem katalyzovanou hydrolýzu N-acetyl-L(4)
-ptenyl-alaniuetylesteru (Ac—Phe—OEt) v přítomnosti různých amidů aminokyselin. Reakce je. uvedena v schématu 4).
Д c- -- Pha- — OEt -v ОТ
(Ao-Pha,-OEír CT __- г ч Ac-Pha.к_д +· EtOH
OHťСТ
Aq - NH 'R ^СТ (CT ·~ chymotrypsin)
Nejdříve se utvoří komplex enzym-substrát a pak se vytvoří meziprodukt acylenzym (Ac—Phe—CT). Tento je hydrclyzován vodou na Ac—Phe—OH, ale je-li. přítomna nukleofilní látka (R—NH2), acylenzymový meziprodukt bude kromě hydrolýzy také předmětem aminolýzy. Předpokládáme-li, že кз > к..з a lei > k_4, poměr aminolýzy к hydrolýze zřejmě závisí na kd/кз a také na koncentraci nukleofilu, jenž je v kompetici s 55 M vodou. Fastrez -a F-orsht zjistili, že například 1 M alaninamid při pH 10 je 44 X silnější nukleofil než 55 M voda, což mělo za následek přednostní tvorbu, více než 95% výše uvedeného N-acyldipeptidamidu. Morihara a Oka, Biochemistry J. 163, 531-542 (1977), J. Biochem. 84, .1.277—1283 (1978), J. Biochem. 82, 1055— — 1062 (1977), Symp. on Peptide Chemistry in Japan, Osaka, pp 79—84 (1977) dále využil tohoto principu pro enzymatickou syntézu peptidů. Pomocí chymotrypsinu a trypsinu syntetizovali množství peptidů z esterů N-acylaminokyselm a z od aminokyselin odvozených nukleofilu a prokázali, že reakce byla výhradně kinetická, neboť je možno získat vysoké výtěžky, bez ohledu na rozpustnost produktu.
Výše zmíněné studie naznačují, že kinetické přístupy mají oproti termodynamickým několik výhod.
1. Rychlejší reakce; v některých případech ukončená během několika minut.
2. Možnost použití nízkých koncentrací enzymu.
3. Aminokyselinové postranní řetězce nemusí být nezbytně blokovány.
4. Mohou být použity imobilizované a nerozpustné enzymy, což umožňuje jsou li peptidy rozpuštěny, použití automatizace.
I když reakční produkty mohou být rozpustné, syntéza musí být rychlejší než sekundární hydrolýza produktu, aby tento mohl, být oddělen včas.
Použití známých kinetických přístupů je omezeno, neboť vzhledem ke specifitě zkoušených enzymů je třeba použít různých enzymů pro syntézu různých peptidických vazeb. Při syntéze velkých peptidových mole• kul dochází к hydrolýze vnitřních peptidových vazeb v molekule, což je způsobeno endopeptidázovou aktivitou enzymů v dnešní době používaných, jež Je nezávislá na esterolytické aktivitě enzymu.
Úkolem tohoto vynálezu je vytvořit enzymatickou syntézu peptidů bez výše zmíněných nedostatků a zejména syntézu, která není omezena pouze na určité aminokyseliny a která nezahrnuje nebezpečí následné hydrolýzy vnitřních peptidových vazeb.
Úkolem vynálezu tedy je, vytvořit způsob výroby peptidů obecného vzorce
А—В kde
A je N-koncový chráněný aminokyselinový zbytek nebo případně N-konoový chráněný peptidový zbytek a
В je případně C-koncový chráněný aminokyselinový zbytek, reakcí substrátové složky s aminovou složkou v přítomnosti enzymu.
Vynález řeší úkol tím, že vytváří způsob při němž se nechá reagovat substrátová složka vybraná ze skupiny zahrnující
a) estery aminokyselin, estery peptidů a depsipeptidy vzorce
A—ORt,
A—SR4 nebo
A—SeR1 kde
A je stejné jak je definováno výše a
R1 představuje alkyl, aryl, heteroalkyl nebo a des-amino fragment aminokyselinového zbytku, (b) případně N-substituované amidy aminokyselin a amidy peptidů vzorce
A—NR2R2* kde
A je stejné, jak bylo definováno výše a
R2 a R2‘ představuje vodík, alkyl, heteroalkyl, aryl nebo aralkyl a případně (c) N-koncové chráněné peptidy vzorce
A—X kde
A je stejné, jak bylo definováno výše a
X představuje aminokyselinu s aminovou složkou vybranou ze skupiny zahrnující (a ] aminokyseliny vzorce
H—B—OH, (b) případně N-substituované amidy aminokyselin vzorce
Η—B—NR5R3‘ kde
В je aminokyselinový zbytek a
R3 a R3‘ představuje vodík, hydroxy, amino nebo alkyl, aryl, heteroaryl nebo aralkyl a (c) estery aminokyselin vzorce
Η—B—OR4,
Η—B—SR4 nebo
Η—B—SeR4 kde
В je aminokyselinový zbytek a
R4 představuje alkyl, aryl, heteroaryl a aralkyl v přítomnosti enzymu karboxypeptldázy ve vodném roztoku nebo disperzi o pH od 5 do 10,5, s výhodou při teplotě od 20 do 50 °C, aby se vytvořil peptid a poté se odštěpí skupina R3 nebo R4 nebo N-koncová ochranná skupina, je-li třeba.
Vynález je založen na základní změně oproti doposud užívaným postupům, jež představuje použití exopeptldáz namísto enzymů používaných dosud, jež všechny vykazovaly převládající nebo alespoň značnou endopeptidázovou aktivitu.
Bylo zjištěno, že použitelné enzymy kromě toho, že musí být exopeptidázami, musí mít peptidázovou aktivitu široké speclfity, aby měly syntetickou aktivitu odpovídající široké specifity, neomezenou na jeden nebo, několik málo typů peptidických vazeb. Enzymy musí být schopné utvořit acylenzymové meziprodukty stejného typu, jak byly popsány výše pro kinetický přístup a musí mít zejména takové vlastnosti, které dovolují aminolýzu meziproduktu za podmínek, kdy k_4 « k4, viz schéma 4) výše, aby se zabránilo bezprostřední hydrolýze vyrobených peptidů. Schopnost tvořit acylenzymové meziprodukty může být také vyjádřena jako schopnost štěpit C-koncovou ochrannou skupinu v substrátové použité složce, tj. v tomto případě esterázová nebo amidázová aktivita. Aby došlo к syntéze musí tato aktivita převládat nad peptidázovou aktivitou enzymu za daných reakčních podmínek.
Tyto četné vlastnosti má skupina exopeptidáz zvaná karboxypeptidázy, jež jsou schopné hydrolyzovat peptidy s volnými karboxylovými skupinami. Bylo zjištěno, že většina těchto karboxypeptidáz má různé enzymatické aktivity, jež jsou velmi závislé na pH, tak, že například v bazickém prostředí při pH od 8 do 10,5 mají převážně esterázovou nebo amidázovou aktivitu a při pH od 9 do 10,5 žádnou nebo jen nevýznamnou peptidázovou aktivitu. Tyto vlastnosti mohou být výhodně využity při postupu podle vynálezu, neboť přispívají к dosažení dobrých výsledků.
Dále bylo zjištěno, že schopnost tvořit acylenzymové meziprodukty je zvláště výrazná u serinových a thlolových proteáz. Výhodnou skupinou karboxypeptidáz jsou proto serinové nebo thtolové karboxypeptidázy.
Tyto enzymy mohou být produkovány kvasinkami plísněmi, nebo mohou být živočlš254954
n-élioi, rostlhTn-étoo nebo mikrobiálního původu.
Zvláště výhodným enzymem je karboxypeptidáza Y z kvasinek —CPD—Y. Tento enzym je popsán v práci Hayashi et :al. j. Biochem. 77, 69—79 (1975) a Johansen ot al. Carlsberg Res. Commun. 41, 1—14 (1976), kteří vyvinuli zvláště výhodnou purifikační metodu pomocí afin-itní chromatognafie na afinitmí pryskyřici skládající se -z polymerní pryskyřičné matrice s navázanými benzylsukctoylovýmii skupinami. CPD—Y jež je seri-novým enzymem se vyznačuje tím, -že výše uvedený vztah mezi různými enzymatickými aktivitami platí při pH >9 a že nemá endopeptidázovou aktivitu. Kromě specifity pro C-koncové aminokyseliny nebo estery s volnými a-kaťhoxylovými skupinami, CPD— —Y může také hydro lyžovat peptidy ve kterých je C-koncová -karboxylová skupina blokována ve formě esterové skupiny, například alkyl nebo aryl ester nebo jako amidoskupina nebo· N-substituovaný amid, například anilid. Je důležité, že enzym hydrolyzuje většinu substrátů, bez ohledu na typ C-koncového aminokyselinového zbytku. Další výhodou CPD—Y je, že je dostupná ve velkých množstvích a je poměrně dosti stabilní.
Kromě CPD—Y, která je v současné době nejvýhodnějším enzymem, postup podle vynálezu je proveditelný s jinými karboxypeptidázami jako ty, jež jsou uvedeny v tomto přehledu:
| Enzym | Původ Houby |
| Penicillokarbo-xy- | Penicillium jantlii- |
| peptidáza S.....-1 | nellum |
| Pěnici] lokarboxy- | Pcnicillium janthi- |
| peptidáza S—2 > | nell-um |
| Karboxypeptidáza z | AspergHIus sai-boi |
| •Karboxypeptidáza z | Aspergillus aryzae |
| Rostliny | |
| Karboxypeptidáza C | Listy pomerančovníku |
| Slupky pomerančů | |
| Karboxypeptidáza C-, | Citrus natsudaidai I-Iayata |
| Pbaseolain | Listy ledvinkového hrachu |
| Karboxypeptidáza z | Klíčící ječmen Klíčící bavlník Rajčata Vodní melouny Prášek z bromélií — |
| — ananas |
né též kyselá složka nebo donor, obsahující podíl A s tzv. aminovou složkou, -zvanou též nukleofilní složka nebo akceptor, a obsahující podíl B, přičemž se vytvoří peptid A—B.
Pcdíl A, což je aminokyselinový nebo pepticlový zbytek, může mít, je-li třeba, chráněnou N-koncovou aminoskupinu, aby se zabránil© nežádoucím sekundármm reakcím.
Potřebnost ochrany aminoskupiny se snižuje se vzrůstající délkou řetězce péptidu a >není téměř nutná, skládá-li se peptidový zbytek ze tří aminokyselin, avšak závisí to i na jejich typu a pořadí.
Příkladem vhodných aminokyselin jsou alifatické aminokyseliny, jako monoaminomonokarboxylové kyseliny, například glycin (Gly), alantn (Ala), valin (Val), norvalin (Nva), leucin (Leu!), izoleucin (iso-Leu) a norleucin (Nle), hydroxyminokyseliny, jako je serin (Ser), threorim (Thr) a homoserin (homo-Ser ), aminokyseliny Obsahující síru, jako je metionin (Met) nebo cystin (CysSJ a cystein (CysH), monoaminodikarboxylové kyseliny, jako je kyselina asparagová (Aspj, kyselina glutamová (Giuj, asparagin (Asn) a glutamin (Gin), diamtoomonokarboxylové kyseliny, jako je ornithin (Orn), lysin (Lys) a arginin (Arg), aromatické aminokyseliny, jako fenýlaíanin (Phe) a tyrosin (Tyr), a heterocykllcké aminokyseliny, jakojje histidin (His) a tryptofan (Trp).
Jako ochranné skupiny mohou být použity ochranné skupiny aminokyselin obvyklé v chemii peptidů, jako je benzoyl (Bz) acetýl (Ac) nebo terciární alkoxykarbonylové skupiny, například t-butyloxykarbonýl (BOC—), t-amyloxykarbonyl (t-AOC—), benzyloxykarhonyl (Z—), p-metoxybenzylorxykarbonyl (PMZ— í), 3,5-dimetoxybenzytoxykarbonyl [ Z (OMe )?;— ], 2,4,6-trimetylbenzyloxykarbonyl (TMZ—), p-fenýlazobenzýloxykarbonyl (PZ—), p toluensulfonyl (Tos—), o-nitrofenylsuifenyl (Nps—.) apod.
Výhodnými ochrannými skupinami jsou benzyloxykarbonyl a t-butyloixykarbonyl, neboť tyto deriváty lze lehko vyrobit, jsou ekonomicky výhodné a snadno odštěpitelné.
Jak bylo uvedeno výše, substrátová složka může být vybrána ze skupiny zahrnující
a) aminokyselinové estery, peptidové estery a depsipeptidy vzorce ,A—OR1,
A—SR1 nebo
A—SeR1 kde
A je stejné jak bylo definováno výše a
R1 představuje alkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl nebo α-desaamino fragment aminokyselinového zbytku,
Hovězí karboxypeptidázy А а В CPD—A
a.rCPD—В však nejsou vhodné, neboť to jsou те1а1окагЬохурер,Мё7у.
Jak bylo vysvětleno výše, syntéza je založena η-a reakci tzv. substrátové složky zva254954
b) případně Nsubstitované amidy aminokyselin a amidy peptidů vzorce
A—NR2R2‘ kde
A je stejné jak bylo definováno výše a R2 a R2‘ představují vodík, alkyl, aryl, heteroaryl nebo ar alkyl a
c] případně N-koncové chráněné peptidy vz-orce
А—X kde
A je stejné jak bylo definováno výše a
X představuje aminokyselinu.
V tomto významu „alkyl“ znamená přímý řetězec nebo· rozvětvený alkyl, výhodně s 1 až 6 atomy uhlíku, například metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, terč, butyl, amyl, hexyl apod.
„Aryl“ znamená fenyl, heterocyklický aryl apod.
„Aralkyl“ znamená benzyl, fenetyl apod. Skupiny R2 a R2‘ a R3 a R3‘ mohou být shodné nebo rozdílné.
Všechny tyto skupiny mohou být substituovány substituenty inertními, vzhledem к enzymu, například halo (fluoro, chloro, bromo, jodo), nitro, alkoxy (metoxy, etoxy, atd.), nebo alkyl (metyl, etyl atd.), přičemž aminokyselinový zbytek nebo peptidový derivát musí být substrátem pro karboxypeptidázu.
V případě esterů skupina OR1 je výhodně vybrána ze skupiny alkoxyskupin, jako jsou metoxy, etoxy nebo t butoxy, fenyloxy a benzyloxy. Skupiny mohou být případně substituovány inertními substituenty, jako jsou nitroskupiny, například p-nitrobenzyloxy. Mohou být použity i jiné skupiny, je-li aminokyselinový zbytek nebo peptidový derivát substrátem pro karboxypeptidázu. Příkladem jsou tzv. depsipeptidy, kde C-koncová aminoskupina připojená esterovou vazbou místo peptidické vazby, například benzoyl-glycin-fenyllaktát (Bz—Gly—OPhe).
Výhodnými ochrannými skupinami karboxylové kyseliny jsou alkoxy skupiny, zvláště metoxyskupiny nebo jinými slovy: Substrátová složka s výhodou obsahuje nebo se skládá z metylesteru aminokyseliny, neboť tyto deriváty jsou dobrými substráty a dají se snadno vyrobit. Avšak například etylestery, propylestery, izopropylestery, butylestery, t-butylestery, benzylestery nebo terč, butoxyestery je možné použít stejně dobře.
Je třeba uvést, že jonizovatelné skupiny, které mohou být v jednotlivých aminokyselinách, jež tvoří peptidový zbytek A, mohou, je-li třeba být blokovány způsobem známým jako per se, v závislosti na typu skupiny. To však není vždy třeba, což je jedna z předností způsobu podle vynálezu. Je-li třeba
I chránit funkční skupiny, vhodnými ochrannými skupinami pro ω-aminoskupinu (Νω) jsou například NQ)-benzyloxykarbonyl (Νω— —Z), t-butoxykarbonyl (Νω—BOC) nebo tosyl (Νω—ToS). Vhodnými ochrannými skupinami pro N-guanidinoskupinu (№) v Arg jsou nitro (№—N02), №benzyloxykarbonyl (№—Z) a №, NG-dibenzyloxykarbonyl (NG—Z—Z). Vhodnými ochrannými skupinami pro imidazolový kruh (Nim) v His jsou Nim-benzyl (Νίπι—Bzl) a Tosyl (Nim—Tos). Vhodnými ochrannými skupinami pro ω-karboxylskupinu jsou α-benzyloxy (—OBzl). Vhodnými ochrannými skupinami pro hydroxylskupinu v alifatických nebo aromatických hydroxy aminokyselinách jsou aralkylskupiny, jako je benzyl (Bzl). Vhodnými S-ochrannými skupinami pro merkaptoskupinu v CysH jsou například benzylskupina (Bzl). Ochranné skupiny musí být stabilní během primární reakce a musí být snadno odštěpitelné od konečného produktu aniž by způsobily sekundární reakce.
Způsob podle vynálezu může být v podstatě prováděn s jakoukoliv aminokyselinou jako substrátovou složkou.
Druhým účastníkem reakce je tzv. aminová složka, jež je vybrána ze skupiny zahrnující
a) ,aminokyseliny vzorce
Η—B—OH,
b) případně N substituované amidy aminokyselin vzorce
Ή—B—NR3R3< kde
В je aminokyselinový zbytek a
R3 a R3< představují vodík,,hydroxy, amino nebo alkyl, aryl, heteroaryl nebo aralkyl a
c) estery aminokyselin, thioestery nebo selenoestery vzorce
Η—B—OR4,
Η—B—SR4 ;nebo
Η—B—SeR4 kde
В je aminokyselinový zbytek a
R4 představuje alkyl, aryl, heteroaryl a aralkyl.
Alkyl-, aryl- a aralkylskupiny mohou být substituovány a jsou definovány stejně, jak bylo uvedeno ve spojení s substrátovou složkou.
Je zřejmé, že R3 = vodík představuje volný amid, zatímco R3 = 0H je hydroxamová ky2 5 4’9 5 4
Π selina, R3=-amlno je hydruzid a R7 — fenyl představuje anilíd.
Způsob podle vynálezu má takto hlavní výhodu oproti způsobu podle například Isowy a Morihary ( viz .výše ] -v lom, že muže být prováděn jak s volnými, na £--konci nechráněnými, aminokyselinami, tak s aminokyselinami jež jsou na C-konci chráněny například přeměnou na odpovídající amidy, anilicly, hydr-azidy, estery nebo jiné karboxylderiváty aminokyselin.
Co- se týká aminové složky, reakční pořadí, výtěžky atd. závisí velmi na tom, zda složky vstupují do reakce jako volné kyseliny nebo jako C-chráněné deriváty, například amidy. To bude podrobněji doloženo níže ve spojení s příklady;
Používá-li se volných kyselin, potom hydroifobní aminokyseliny, jako je slanin, leucin, valln a fenylalanin, právě tak jako kyseliny s kladně nabitými postranními řetězci jako- je lysin a arg.imn, se poměrně snadno inkorporují do řetězce substrátové složky, zatímco aminokyseliny, jejichž postranní řetězce obsahují buďto karboxylové skupiny jako jsou kyselina asparagová nebo glutamová, hydroxylové skupiny jako je serin a thrconin nebo am-ido skupiny jako· je asparagin a glutamin, se inkorporují mnohem obtížněji.
I-Iet-erocykHcké aminokyseliny jako je prolili -a histidin se jako volné kyseliny inkorporují velmi obtížně.
Používají-li se jako .aminová složka C-kon•cově chráněné aminokyseliny, například amidy aminokyselin nebo N-substituované amidy, je tornu jinak, je možné říci zcela obecně a bude to dále rozvedeno, že v tomto případě je reakce značně nezávislá na struktuře a je možné získat velmi vysoké výtěžky až ‘90 %; avšak i zde se heterocyklické aminokyseliny inkorporují mnohem obtížněji než alifatické.
Jak byl? uvedeno výše, způsob podle vynálezu se provádí při pH až 10,5, výhodně při pH. 8,0 až 10,5. Nejvýhodnější pH hodnota, jež je často ve velmi úzkém rozmezí, závisí na pH optimu a pH-minimu rozdílných enzymatických, aktivit použitého enzymu, přičemž pil hodnota by měla být vybrána tak, aby aktivity byly vyváženy lak, jak by lo vysvětleno· v předchozím.
poplidázová aktivita se zvyšuje s klesajícími hodnotami pH pod pH okolo 9,0, přičemž se postup z hlediska výtěžku stává méně výhodný. Avšak v některých případech, například u Bz·—Ala—Gly .nebo Bz—Ala— - •Gly --NH· vytvořené peptidy nebo amidy peptidů jsou velmi špatnými substráty pro karboxypeptidázu, takže esterázová aktivita vůči esteru aminokyseliny nebo vůči esteru peptidu, výhodně použitým jako substrátová složka, ještě převládá, což umožňuje syntézu až při pH-hodnotách okolo nebo pod 5,0. Optimální pH závisí na konkrétním výchozím materiálu, vytvořených peptidech a enzymu.
tfo užívá-41 se fako ^enzymu GPD—Y, pH-ho jnota je ;s výhodou 8,0 <až 1*0,5, nejlépe 9;0 až 10.;o jak tede >dále vysvětleno.
Tato· hodnota pH by měla být udržována během vazebně -reakce a pak může být změněna kvůli precipiítaci reakčního produktu, štěpení ochranných skupin atd. Toho může být dosaženo použitím vhodného pufru pro vybranou pH-oblast v reakčním médiu, jako je bikarbonátový pufr.
Výběr pufru však není pro reakci kritický, je-li zajištěno' udržování správného pH.
Hodnota pH může být rovněž udržována přidáváním kyseliny jako je HC1 nebo· zásady, jako je NaOH během reakce.
Jak bylo uvedeno, reakce se provádí ve vodném reakčním prostředí, které, je-li třeba, může Obsahovat až 50 °/o organického· rozpouštědla. Výhodnými organickými rozpouštědly jsou alkanoly, například metanol •a etanol, iglykoly, například etylenglykol nebo polyetylénglýkoly, dimetylformamid, dinietylsulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan a dimetoxyetan.
Výběr složení reakčního prostředí závisí zvláště na rozpustnosti, teplotě a p‘H reakčních složek a peptidového produktu a na stabilitě enzymu.
Reakční prostředí může také obsahovat složku, která činí zenzym nerozpustný, ale zachovává značný podíl enzymatické aktivity, jako je jentoměničová pryskyřice. Enzym může být imobilizován známým způsobem, viz Methods of Enzymology, Sv. 44, 1976, například navázáním na matrici, jako je zesilovaný dextran nebo .agaróza, nebo na kysličník křemičitý, polyamid nebo celulózu nebo zapouzdřením do polyakrylamiidu, alginátfi nebo vláken. Kromě toho může být enzym modifikován chemicky, -aby se zlepšila jeho stabilita nebo enzymatické vlastnosti.
Koncentrace dvou účastníků reakce se může měnit uvnitř širokého rozmezí, jak bude dáte vysvětleno. Výhodná počáteční 'koncentrace .substrátové složky je 0,01 až 1 molární a pro aminovou složku je O.,05 až 3 molární.
Aktivita enzymu se může také měnit, ale je s výhodou 10~6 až 10'4 inolární.
•Podle vynálezu je reakční teplota s výhodou 20 až 50 °C. Nejvhodnější reakční teplota pro danou syntézu může být určena pokusy, a závisí zvláště na použité aminové složce a na enzymu. Vhodná teplota bude zpravidla kolem 35 až 45 °C, nejlépe asi 35 stupňů Celsia. Při teplotách nižších než 20 CC bude reakční doba obvykle příliš dlouhá, zatímco teploty nad 50 °C jsou spojeny s problémy stability enzymu a/nebo reakčních složek nebo reakčních produktů.
Podobně se mění i reakční doba, která závisí velmi na dalších reakčních parametrech, jak bude -dále 'vysvětleno. Standardní reakční doba při postupu podře vynálezu je asi minut, avšak může činit až několik (hodin.
Je třeba dodat, že používáni se jako aminové složky amidu nebo substituovaného amidu, je často výhodné nebo i nezbytné rozštěpit amidoskupinu zvláště od utvořeného amidu peptidu, aby bylo možné pokračovat v syntéze. V tomto ohledu je obzvláště vhodná karboxypeptidáza, zvláště CDD—Y je velmi výhodná, neboť jak bylo popsáno výše, CPD—Y vykazuje amidázovou aktivitu při pH > 9, přičemž karboxypeplidázová aktivita je zanedbatelná.
Karboxypeptidáza může být obecně použita к odštěpení skupin R3 nebo R4, jak byly definovány, od utvořeného peptidu ať je třeba pokračovat v syntéze nebo pouze získat konečný peptíd, který není C-koncově chráněn.
Jak bude dále vysvětleno, způsob podle vynálezu je použitelný pro vytvoření neohraničeného počtu dipeptidů, oligopeptidů a polypeptidů, podle stejného principu, tj. reakcí substrátové složky s aminovou složkou ve formě aminokyseliny nebo derivátu aminokyseliny za přítomnosti karboxypeptidázy.
Příkladem dobře známých oligopeptidů nebo polypeptidů jež mohou být takto vyrobeny jsou enkefaliny, somatostatin, analogy somatostatinu a peptidy s podobnými biologickými aktivitami a tzv. „spánkový pepticl“ (Trp—Ala—Gly—Gly—Asp—Ala—Ser— —Gly—Glu).
V některých případech, například, jde-li o peptidy skládající se z více než pěti aminokyselin, může být výhodné syntetizovat části žádaného peptidu ve formě fragmentů oligopeptidů, například pentapeptidů s vhodnými pořadími aminokyselin a potom podrobit oligopeptidy kondenzaci fragmentů kterýmkoliv způsobem známým jako per se.
Aby se zlepšila například rozpustnost vytvořených peptidů, může být výhodné použít jako N-koncovou aminokyselinu arginin nebo jinou jonizovanou aminokyselinu během syntetických kroků a pak odštěpit arginin od peptidu specifickým enzymem, například trypsinem, je-li žádaná sekvence aminokyselin jinak v pořádku.
Tyto a jiné modifikace také tvoří část vynálezu.
Dříve než bude způsob podle vynálezu vysvětlen pomocí příkladů, budou popsány výchozí materiály, metody měření atd.
Karboxypeptidáza Y z pekařského droždí byla izolována postupem afinitní chromatografie podle Johansen te al. Carlberg Res. Commun. 41, 1—14 (1976} a získána jako lyofilizovaný prášek 10% enzymu v citronanu sodném. Před použitím byl enzym odsolen na gelu ze zesítěného dextranu (1,5 X X 25 cm) vyváženém vodou a byl eluován destilovanou vodou. Koncentrace enzymu byla stanovena spektrofotometricky při E = 14,8. Zásobní roztok 7 mg/ml, tj.
110 μΜ byl připraven a skladován v alikvotech po 250—500 μΐ při —21 °C. Karbobenzyloxy-f enylalaninmethylester (Z—Phe— —OMe) byl připraven postupem podle Ya18 mada et. al. Bull. Chem. Soc. Japan 51, 1897—1898 (1978), a byl použit jako sirup. Fenylalaninhydrazin a alaninhydrazid hydrochlorid byly připraveny z esterů tak jak bylo popsáno v Lossex et. al. J. Prak. Chemie 4, Reihe, Band 8, 345—350 (1959). Nekorigované body tání byly 86—88 °C, (literatura: 82—83 °C, Losse et al. J. Prak. Chemie 4. Reihe Band 8, 355—350 (1959) a 182—185 CC. (literatura: 184—185 °C, Zeller et al. Helv. Chim. Acta. 40, 257—260 (1957). Asparaginamid dihydrochlorid byl získán z kyseliny asparagové přes dietylester podle Fischer, Chem. Ber. 34, 433—454 (1901) klasickou a minolýzou (t. t.: 210—214 °C, literatura:
2.15—215 °C) Smith, Spack, J. Biol. Chem. 212, 271—299 (1955). Jiné výchozí látky byly dodány výše jmenovanými firmami nebo byly připraveny analogickým způsobem.
Čistota byla určena kvantitativně chromatografií na tenké vrstvě gelu kyseliny křemičité. Použitý systém rozpouštědel byl СНС1з/СН3/СН2/3ОН/СН3СООН/Н2О (11:5:2:1) a skvrny byly vizualizovány zhášením fluorescence pro určení složení reagencií.
Složení reakčních složek bylo určeno kvantitativně reverzní-fázovou vysokotlakou kapalnou chromatografií. Oddělení bylo dosaženo použitím vhodných specifických gradientů elučních systémů od 10 % CH3CN v 10 mM N-aAc, pH 4 do 100 % CH3CN nebo od 10 mM-NaAc, pH 4 do 100 % CH3CN. Druhý systém byl použit pro sloučeniny jako je Bz—Ala—Gly—OH, Bz—Ala—Ala—OH, Bz— —Ala—Ser—OH a jejich amidy viz níže. Průtoková rychlost byla 3 ml/min, teplota kolony 47 °C a vlnová délka 260 nm. Výtěžky byly určeny na základě molárního poměru reakčních složek, jenž byl získán z integrovaných poloh pod vrcholy v elučním profilu.
Skvrny byly identifikovány chromatografií na tenké vrstvě s vhodnými standardními sloučeninami. Některé produkty byly identifikovány kombinací vysokotlaké kapalné chromatografie a analýzy aminokyselin. К tomuto účelu byly odebírány z reakční směsi po 10 minutách 1 ml elikvoty a reakce byla přerušena přidáním 250 μΐ 6 M-HC1. pH bylo pak upraveno na 4 pomocí NaOH a směs byla rozdělena vysokotlakou kapalnou chromatografií. Byl zaznamenáván průběh eluce při vhodné vlnové délce mezi 255—280 nm. Chromatografie byla reverzní fázová s elučním systémem TEAP — 20 % (obj./obj.) TEAP (trietylamonlumfosfátový pufr) v metanolu, pří vhodných gradientech a průtokových rychlostech 1,5-2,0 ml/min. TEAP-pufr byl připraven podle Rivier, J. Liq. Chrom. 1, 343—366 (1978). V mnoha případech dával systém 0,1 M HAc, pH 3 — 20 % obj./obj. 0,1 M HAc, pH 3 v methanolu, také dostatečné rozlišení.
Vytékající kapalina obsahující N acyldipeptidy byla shromažďována a vysušena lyofilizací nebo odpařením rozpouštědla při
35—45 °C. Malé vzorky zbytků byly hydroly254954 zovány v 6 M HC1 při 110 °C ve vakuu po 36 hod. Odpařené hydrolyzáty byly pak analy zovány na analyzátoru aminokyselin.
Sentéza s volnými aminokyselinami jako aminovou složkou
Přikladl
Roztok 2 ml 0,6 M valinu 0.1 MKC1 — — 1 mM EDTA, pH 9,8 byl smíchán s 100 μΐ, tj. 0.1 mmolu, 1M roztoku Bz—Ala—OMe rozpuštěného v 96% etanolu. Reakce byla prováděna, v pH-statu při 35 °C a pH 9.8, přičemž byla hodnota pl-I udržována konstatní automatickým přidáváním 0,5 M NaOH. Reakce byla započata přidáním 0,7 mg karboxypaptidázy Y, 150 jedn./mg. Po reakční době 30 minut, byla reakce přerušena úpravou pH na asi pH 1 pomocí 6M HC1. Reakční produkt byl vyčištěn a oddělen pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Bz— -Ala—Val—OH byl 40 °/o. Kvantitativní aminokyselinová analýza produktu po hydrolýze v 6 M HC1 po 24 hodin, udávala poměrně 1,0 molu alaninu a 1,0 molu valinu.
Vliv pH, teploty a koncentrace substrátové složky, aminové složky a CPD—Y na výtěžek v reakci:
CPD—Y Bz—Ala—OMe II- Val-OH----------------------->
--------> Bz.....Ala.....Val.....ОН -I- CH.sOH.
(5) byl studován v pěti rozdílných sériích pokusů analogicky výše uvedenému postupu. Jedou z pnuimetrů uvedených výše byl v každém pokusu měněn, zatímco čtyři, ostatní byly udržovány konstantní: 0,6 M valin, 55 mM Bz—Ala -OMe, 4,5 (uM CPD—Y, pH 9.7, 35 °C. Výsledky jsou uvedeny v obr. 1. Z obr. 1A je vidět, že rozsah pH pro optimální výtěžek je dosti úzký, pouze 0,5 jednotky pH. Z obr. 1B je patrno, že zvýšení reakční teploty způsobí téměř lineární zvýšení syntézy na účet relativně nižší, hydrolýzy. Při teplotách nad 45 °C se inaktivuje enzym a dochází к ne-enzymatické hydrolýze esteru. Při nižších teplotách a. hodnotách pH do 10,0 byla hydrolýza esteru během prvních deseti minut reakce zanedbatelná. Stala se však význam nou, byla-li rychlost enzymatické reakce inhibována při reakčních dobách až 2 — 5 hodin.
Zatímco výtěžky Bz—Ala—Val—OH se zvyšovaly s vyšší koncentrací aminové složky obr. ID, u vztahu mezi výtěžkem a koncentrací substrátové složky Bz—Ala—OMe tomu bylo právě opačně, obr. IC. Tato pozorování spolu se závislostí výtěžku na vysoké koncentraci enzymu, obr. 1E, ukazují optimální poměr koncentrace substrátu a koncentrace enzymu.
Časový průběh typické reakce ukázaný na příkladu výše uvedené reakce za téměř optimálních podmínek je na obr. 2.
V přítomnosti 0,5 M valinu byl substrát Bz—Ala—OMe rychle převeden během 20 minut na 38% Bz—Ala—Val—OH a 62% Bz—Ala—OH. Na obr. je také vidět, že dipeptid nebyl hydrolyzován při pH 9,7 v přítomnosti nadbytku valinu. Bylo-li však pH upraveno na 5 až 8, byl všechen Bz—Ala— —Val—OH hydrolyzován během několika sekund. Toto selektivní chování CPD—Y při vysokých pH je důležitou vlastností pro její použitelnost při syntéze peptidů.
Příklad 2
Roztok 2 ml 3M lysinu, 0,1 M KC1, 1 mM EDTA o pH 9,8 byl smíchán s 400 μΐη 100 % metanolu a 100 /Д tj. 0,1 mmolu 1M Z— -—Phe—OMe, rozpuštěného v 100 % metanolu. Reakce se prováděla tak, jak je popsáno v příkladu 1 a byla započata přidáním 0,7 mg krboxypeptidázy Y. Po 30 minutách reakční doby bylo pH upraveno 6M HC1 na hodnotu 1. Reakční produkt byl čištěn a izolován pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Z—Phe—Lys—OH byl 60 %. Kvantitativní analýza aminokyselin, jak je popsána v příkladu 1, ukázala že produkt obsahuje relativně 1,0 molu lysinu a 1,0 molu fenylalaninu.
Analogicky s příklady 1 a 2 byly připraveny z určených výchozích látek peptidy uvedené v tabulce I. Pokusy byly prováděny v pH-statu Radiometer a výtěžky byly určeny vysokotlakou chromatografií viz výše. Podmínky byly 4,5 uM CPD—Y; pH 9,7 a 35 °C.
Tabulka I
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s volnými aminokyselinami jako aminovou složkou.
| Substrát (konc.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % |
| Bz—Ala—OMe | Glycin (3,0 M) | Bz—Ala—Gly—OH | 62 |
| (55 mM) | Alanin (1,9 M) | Bz—Ala—Ala—OH | 65 |
| Valin (0,6 M) | Bz—Ala—Val—OH . (příklad 1) | 40 | |
| Leucin (0,17 M) | Bz—Ala—Leu—OH | 24 | |
| Fenylalanin (0,16 M) | Bz—Ala—Phe—OH | 27 | |
| Serin (3,2 M) | Zz—Ala—Ser—OH | 50 | |
| Threonin (0,7 M) | Bz—Ala—Thr—OH | 24 | |
| Methionin (0,6 M) | Bz—Ala—Met—OH | 46 | |
| Lysin (1,5 M) | Bz—Ala—Lys—OH | 56 | |
| Arginin (0,8 M) | Bz—Ala—Arg—OH | 26 | |
| Kyselina aspartová (1,0 M) | Bz—Ala—Asp—OH | 0 | |
| Asparagin (0,6 M) | Bz—Ala—Asn—OH | 5 | |
| Kyselina glutamová (1,2 M) χ-metylester kyseliny | Bz/Ala—Glu—OH Bz—Ala— | 0 | |
| glutamové (1,0 M) | Glu(OMe)—OH | 30 | |
| Bz—Ala—OMe | Isoleucin (0,15 M) | Bz—Ala—Ile—OH | 40 |
| (50 mM) | Glutamin (0,5 M) O-terc.butylester kyseliny | Bz—Ala—Glu—OH Bz—Ala—Asp— | 20 |
| aspartové (0,5 M) | — (O‘Bu)—OH | 30 | |
| Tryptofan (0,05 M) | Bz—Ala—Trp—OH | 10 | |
| Histidin (1,0 M) | Bz—Ala—His—OH | 15 | |
| Z—Phe—OMe | Valin (0,6 M) | Z—Phe—Val—OH | 6 |
| (55 mM) | Lysin (3,0 M ) | Z—Phe—Lys—OH (příklad 2) | 60 |
| Bz—Phe— —Gly—OMe (30 mM) | Valin (0,6 M) | Bz—Phe—Gly—Val—OH | 40 |
| Z—Ala—OMe | Glycin (2,0 M) | Z—Ala—Gly—OH | 30 |
| (10 mM) | Alanin (0,7 M) | Z—Ala—Ala—OH | 60 |
| Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Leu—OH | 21 | |
| Lysin (1,5 M) | Z—Ala—Lys—OH | 60 | |
| Bz—Gly—OMe | Glycin (2,0 M) | Bz—Gly—Gly—OH | 63 |
| (20 mM) | Leucin (0,15 M) | Bz—Gly—Leu—OH | 21 |
| Bz—Tyr—OEt | Valin (0,6 M) | Bz—Tyr—Val—OH | 30 |
| (25 mM) | Alanin (1,9 M) | Bz—Tyr—Ala—OH | 46 |
| Arginin (0,8 M) | Bz—Tyr—Arg—OH | 35 | |
| Ac—Phe—OEt (50 mM) | Alanin (0,8 M) | Ac—Phe—Ala—OH | 85 |
| Z—Ala— | Glycin (2,0 M) | Z—Ala—Ala—Gly—OH | 40 |
| —Ala—OMe | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Ala—Leu—OH | 0 |
| (10 mM) | Fenylalanin (0,15 M) | Z—Ala—Ala—Phe—OH | 0 |
| Z—Ala— | Glycin (2,0 M) | Z—Ala—Phe—Gly—OH | 35 |
| —Phe—OMe (10 mM) | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Phe—Leu—OH | 0 |
| Z—Ala— —Ser—OMe (10 mM) | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Ser—Leu—OH | 40 |
| Z—Ala— | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Val—Leu—OH | 25 |
| —Val—OMe | Lysin (1,5 M) | Z—Ala—Val—Lys—OH | 60 |
| (10 mM) | |||
| Z—Ala— | Glycin (2,0 M) | Z—Ala—NLeu—Gly—OH | 60 |
| —NLeu—OMe (10 mM) | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—NLeu—Leu—OH | 16 |
| Z—Ala— —Met—OMe (10 mM) | Glycin (2,0 M) | Z—Ala—Met—Gly—OH | 50 |
2549S4
20
| Substrát | Aminoví! složka | Produkt | Výtěžek |
| (konc.) | (koncentrace) | % | |
| Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Met—Leu—OH | 15 | |
| Z -Ala— | Glycin (2,0 M) | Z—Ala—Trp—Gly—OH | 23 |
| —Trp—OMe | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Trp—Leu—OH | 3 |
| (10 mM] | Fenylalanin (0,15 M] | Z—Ala—Trp—Phe—OH | 0 |
| Lysin (1,5 M) | Z—Ala — Trp—Lys—OH | 36 | |
| Z—Ala—Ala— | Leucin (0,15 M) | Z—Ala—Ala—Tyr—Leu—OH | 0 |
| —Tyr—OMe | Lysin (1,5 M) | Z—Ala—Ala—Tyr—Lys—OH | 23 |
| (10 mM) | Alenin (1,7 M) | Z—Ala—Ala—Tyr—Ala—OH | 31 |
Syntéza s amidy aminokyselin jako aminovou složkou
Příklad 3
Roztok 2 ml 0,6 M amidu methioninu (Met—NHz), 0,1 M KC1 1 mH EDTA, pH 9,8 bylo smícháno s 100 ult.j. 0,1 mmolu 1M Bz—Ala—OMe roztoku v 96 % metanolu. Reakce se prováděla jak je popsáno v příkladu 1 a započata byla přidáním 0,7 mg karboxypeptidázy Y. Po 30 minutách reakčního času bylo upraveno pH 6 M HC1 na hodnotu 1. Reakční produkt byl čištěn a izolován pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Bz—Ala—Met—NHz byl 95 °/o. Kvantitativní analýza aminokyselin, jak je popsána v příkladu 1, ukázala, že produkt relativně obsahoval 1,0 molu Ala, 1,0 molu Met a 1,0 molu NH3.
Průběh reakce je ukázán na obr. 3, z něhož je zřejmé, že po 20 minutách je substrát přeměněn téměř zcela z 95 % na dipeptid, 5 °/o je hydrolyzováno na Bz—Ala—OH.
P ř i к lad 4
Roztok 2 ml 0,4 M amidu valinu (Val— —N№), 0,1 M KC1, 1 mM EDTA, pH 9,5 byl smíchán s 100 ul, tj. 0,1 mmolu 1 MBz— —Ala—OMe roztoku v 96 % etanolu. Reakce probíhala, jak je popsáno v příkladu 1. Reakční produkt Bz—Ala—Val—NH? precipitoval během reakce. Po 20 minutách reakce bylo pH upraveno na hodnotu 1 a precipitát byl izolován centrifugací. Produkt byl rozpuštěn v 1 ml 96 % etanolu a čištěn a izolován pomocí vysokotlaké chromatografie. Výtěžek Bz—Ala—Val—NH? byl 95 procent, zatímco, jak je ukázáno v příkladu 1, při použití volné kyseliny jako aminové složky byl pouze 40 %. Kvantitativní analýza aminokyselin, jak je popsána v příkladu 1, ukázala, že produkt relativně obsahoval 1,0 molu. Ala, 1,0 molu Val a 1,0 molu NHs
Závislost poradí reakcí na pH a koncentraci amidu valinu je ukázána na obr. 4. Reakce byla prováděna obdobně jako syntéza uvedená výše, při konstantních parametrech: 0,6 M amid valinu, 55 mM Bz—Ala—OMe,
4.5 uM CPD—Y, pH 9,7, 35 °C.
Bude zřejmé z obr. 4B, že výtěžek je v podstatě necitlivý к proměnlivé koncentraci amidu valinu na rozdíl od obrázku ID, který ukazuje při proměnlivé koncentraci, a to alespoň při koncentraci ekvimolární nebo vyšší než je koncentrace substrátu, tj. 55 mM.
Z obr. 4A bude zřejmé, že účinné rozmezí pH pro amid valinu sahá к 9,0, přičemž existuje ostrá horní hranice při pH 9,8 nad kterou výtěžek významně klesá.
Obdobně s příklady 3 a 4 z uvedených výchozích materiálů byly připraveny peptidy zaznamenané v tabulce II. Pokusy byly prováděny za následujících podmínek: 4,5 jam CPD—Y; pH 9,6 a 35 °C, koncentrace substrátu je uvedena v tabulce.
I
Tabulka И
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s amidy aminokyselin jako aminovou složkou.
| Substrát (koně.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek o/o |
| Bz—Ala—OMe | Glycinamld (0,3 M) | Bz—Ala—Gly—NHž | 90 |
| (55 mM) | Serinamid (0,3 M) | Bz—Ala—Ser—NHž | 90 |
| Vallnamid (0,4 M) | Bz—Ala—Val—NH2 | 95 + > | |
| (Příklad 4) Leucinamid (0,3 M) | Bz—Ala—Leu—NHž | 85 | |
| Methioniamid (0,6 M) | Bz—Ala—Met—NHz | 95 . | |
| (Příklad 3) Fenylalaninamid (0,3 M) | Bz— Ala—Phe—NHž | 90 | |
| Tyrosinamid (0,6 M) | Bz—Ala—Tyr—NHž | 90 | |
| Asparaginamid (0,3 M) | Bz—Ala—Asn—NHž | 80 | |
| Prolinamid (0,3 M) | Bz—Ala—Pro—NHž | 0 | |
| Amid kyseliny | Bz—Ala—Glu—NHž | 0 | |
| glutamové (0,25 M) Histidinamid (0,2 M) | Bz—Ala—His—NHž | 89 | |
| Threoninamid (0,2 M) | Bz—Ala—Thr—NHž | 88 | |
| Z—Phe—OMe | Valinamid (0,5 M) | Z—Phe-Val—NH2 | !97 + ) |
| (55 mM) | Serinamid (0,4 M) | Z—Phe—Ser—NH2 | 60 |
| Tyrosinamid (0,4 M) | Z—Phe—Tyr—NHž | 64 | |
| Bz—Phe—Gly- | -Vallnamid (0,4 M) | Bz—Phe—Gly —Val—NHž | 90 |
| —OMe (30 mM) | |||
| Z—Phe— | Valinamid (0,4 M) | Z—Phe—Ala—Val—NHž | 90+l |
| —Ala—OMe | Glycinamid (0,4 M) | Z—Phe—Ala-Gly—NH2 | 95 |
| (20 mM) | Histidinamid (0,4 M) | Z—Phe—Ala—His—NHž | 50 |
| Z—Leu—Gly— | Valinamid (0,4 M) | Z—Leu—Gly—Gly—Val—NHž | 80 |
| —Gly—OEt (10 mM) Bz—Tyr—OEt | Valinamid (0,25 M) | Bz—Tyr—Val—NH? | 94 |
| (50 mM) | Glycinamid (0,55 M) | Bz—Tyr—Gly—NHž | 82 |
| Z—Ala—OMe | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Leu—NHž | 90 |
| (10 mM) | Glycinamid (0,15 M) | Z—Ala—Gly—NH2 | 20 |
| Bz—Arg—OEt | Tyrosinamid (0,2 M) | Bz—Arg—Tyr—NHž | 52 |
| (75 mM) Bz—Tyr—OEt | Valinamid (0,25 M) | Bz—Tyr—Val—NHž | 94 |
| (50 mM) | Glycinamid (0,55 M) | Bz—Tyr—Gly—NHž | 82 |
| Z—Pro—OMe | Leucinamid (0,25 M) | Z—Pro—Leu—NHž | 0 |
| (50 mM) Bz—Gly—OMe | Histidinamid (0,2 M) | Bz—Gly—His—NHž | 20 |
| (100 mM) | Glycinamid (0,55 M) | Bz—Gly—Gly—NH2 | 95 |
| Leucinamid (0,25 M) | Bz—Gly—Leu—NHž | 95 | |
| Z—Ala— | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Phe—Leu—NHž | 95 |
| —Phe—OMe | Glycinamid (0,15 M) | Z—Ala—Phe—Gly—NHž | 84 |
| (10 mM) Z—Ala— | Glycinamid (0,15 M) | Z—Ala—Ala—Gly—NHž | 100 |
| —Ala—OMe | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Ala—Leu—NHž | 100 |
| (10 mM) Z—Ala— | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Ser—Leu—NHž | 95 |
| —Ser—OMe | Glycinamid (0,15 M) | Z—Ala—Ser—Gly—NHž | 70 |
| (10 mM) Z—Ala— | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Val—Leu—NHž | 84 |
| —Val—OMe | Glycinamid (0,15 M) | Z—Ala—Val—Gly—NHž | 100 |
(10 mM)
+) Produkt vysrážen
2S4934
| Substrát (konc.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % |
| Z—Ala— | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—NLeu—Leu—NH? | 100 |
| —NLeu—OMe | Glycinamid (0,15 M) | Z — Ala—NLeu—Gly—N№ | 100 |
| (10 mM) Z—Ala— | Glycinamid *(0,15 M) | Z—Ala—Met—NH2 | 95 |
| —Met—OMe (10 mM) Z—Ala— | Glycinamid [0,15 M) | Z—Ala—Trp—Gly—NH2 | 84 |
| —Trp—OMe | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Trp—Leu—NHz | 89 |
| (10 mM) Z—Thr— | Valinamid (0,2 M) | Z—Thr—Pro—Val—NHz | 95 |
| —Pro—OMe | |||
| (25 mM) Z—Ala—Ala— | Glycinamid (0,15 M) | Z—Ala— Ala—Tyr—Gly—NH? | 100 |
| —Tyr—OMe | Leucinamid (0,15 M) | Z—Ala—Ala—Tyr—Leu—NHz | 100 |
| (10 mM) Z—Tyr—Gly— —Gly—OMe (20 mM) | Fenylalaninamid (0,2 M) | Z—Tyr—Gly—Gly—Phe—NHz | 40 |
+) Produkt vysrážen
P ří к lad 5
Syntéza s hydrazidy aminokyselin jako a minovou složkou praveny peptidy podle tabulky III z výchozích látek, jež jsou uvedeny. Pokusy byly prováděny za těchto podmínek: 4,5 μΜ CPD—Y, pH 9,6 a 35 °C.
Obdobně jako v příkladech 3 a 4 byly přiTabulka III
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s hydrazidy aminokyselin jako aminovou složkou
Substrát (konc.)
Aminová, složka [koncentrace)
Produkt
Výtěžek %
Bz—Ala—Ome Alanln-hydrazld (0,6 M) (55 mM) Fenylalaninhydrazid (0,3 M)
Bz—Ala—Ala—NH—NHž
Bz—Ala—Phe—NH—NH2
Příklad 6
Syntéza s estery aminokyselin jako aminovou složkou
Pokusy s estery aminokyselin byly prováděny obdobně jako v příkladech 1, 2, 3 a 4 v pH-statu při pH 9,0-9,7 a 23—35 °C. Produkty a výtěžky byly stanoveny vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Koncentrace CPD—Y byla od 4,5 do 11 μΜ.
V tabulce IV jsou peptidy vyrobené z uvedených výchozích látek.
Je zřejmé, že v některých případech dochází к oligomerizaci. Protože obvykle jsou výtěžky velmi vysoké, zdá se že estery aminokyselin by byly velice výhodné, kdyby mohla oligomerizace být dále omezena.
Tabulka IV
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptldů s estery aminokyselin jako aminovou složkou.
Substrát Aminová složka (konc.) (koncentrace)
Produkt
Výtěžek %
Bz—Ala—OMe Ethylester glycinu (0,5 M) (50 mM)
Propylester glycinu (0,5 M) Isopropylester glycinu (0,5 M)
Butylester glycinu (0,5 M)
Methylester leucinu (0,025 M)
Bz—Ala—OMe Ethylester leucinu (50 mM) (0,25 M)
Terč, butylester leucinu (0,25 M)
Methylester fenylalaninu
ÍBz—Ala—Gly—OH ]Bz—Ala—Gly—Gly—OH Bz—Alu—Gly—OH
Bz—Ala—Gly—OH
Bz—Ala—Gly—OH
Bz—Ala—Leu—OH
Bz—Ala—Leu—Leu--OH
Bz—Ala—Leu—Leu—Leu—OL
Bz—Ala—Leu—Leu—Leu— .—Leu—OH ÍBz—Ala—Leu—OH iBz—Ala—Leu—Leu—OH Bz—Ala—Leu—OH
Bz—Ala—Phe—OH
Bz—Ala—Phe—Phe—OH
Bz—Ala—Phe—Phe—Phe—Ol
100 } 50
Ethylester fenylalaninu (0,15 M)
Methylester kyseliny glutamové (y-terc.-Bu) (0,5 M) terč.butylester kyseliny glutamové (y-terc.-Bu) (0,25 M)
Bz—Ala—OMe (50 mM)
Methylester methioninu (0,2 M)
Bz—Ala—OMe (50 mM)
Ethylester methioninu (0,2 M)
Isopropylester methioninu (0,2 M)
Methylester valinu (0,7 M)
Methylester šeřinu (0,5 M)
Methylester tyroslnu (0,5 M)
Methylester argininu (0,5 M)
Methylester argininu (NO2) (0,5 M)
Methylester histldinu (0,5 M)
Methylester threoninu (0,5 M )
| ÍBz—Ala—Phe—OH 1 (Bz—Ala—Phe—Phe—OH j Bz—Ala—Glu (χ-terc.-Bu)—OH | [ 70 35 |
| Bz—Ala—Glu (y-terc.-Bu)—OH | 0 |
| /Bz—Ala—Met—OH > Bz—Ala—Met—Met—OH Bz—Ala—Met—Met—Met— —OH Bz—Ala—Met—Met—Met— —Met—OH Bz—Ala—Met—Met—Met— —Met—Met—OH 1 | 86 |
| Bz—Ala—Met—OH | 40 |
| Bz—Ala—Met—OH | 8 |
| ÍBz—Ala—Val—OH 1 (Bz—Ala—Val—Val—OH j | ) 85 |
| Bz—Ala—Ser—OH | 50 |
| Bz—Ala—Tyr—OH | 25 |
| Bz—Ala—Arg—OH | 0 |
| Bz—Ala—Arg (NOž) —OH | 40 |
| Bz—Ala—His—OH | 26 |
| Bz—Ala—Thr—OH | 47 |
| Substrát (коле.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % |
| Ac—Phe—OEt | Alaninmetylester | Ac—Phe—Ala—OH Ac—Phe—Ala—Ala—OH | 60 |
| Bz—Gly—OMe (50 mM) | Histidinmetylester (0,5 M) | Bz—Gly—His—OH | 40 |
Příklad 7
Příklad 8
L- a Dstereolzomery aminových složek
Rozdílnost substrátové esterové skupiny
Obdobně jako v příkladech 1, 2, 3, 4 a 6 byly vyrobeny peptidy podle tabulky V z uvedených výchozích materiálů.
Je patrné, že jsou inkorporovány pouze L-izomery. Toto je velmi zajímavá vlastnost z hlediska ekonomie postupu, neboť není třeba důsledně čistit výchozí aminokyseliny, aby se získal čistý L-izomer.
Obdobně s příklady 1, 2, 3 a 4 byly vyrobeny peptidy podle tabulky VI z uvedených výchozích látek.
Výsledky potvrzují pružnost postupu podle vynálezu s ohledem na použitelné substráty.
Tabulka V
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s L- a D-izomery aminové složky.
| Substrát (koncentrace) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % L-izomer D-izomer | |
| Bz—Ala—OMe | Valin (0,6 M) | Bz—Ala—Val—OH | 42 | 0 |
| (50 mM) | Alanin (1,8 M) | Bz—Ala—Val—OH | 65 | 0 |
| Bz—Tyr—OEt | Valin (0,6 M) | Bz—Tyr—Val—OH | 30 | 0 |
| (30 mM) | Alanin (1,8 M) | Bz—Tyr—Ala—OH | 46 | 0 |
| Bz—Ala—OMe | Val—NH2 (0,25 M) | Bz—Ala—Val—NHz | 78 | 0 |
| (50 mM) | ||||
| Bz—Tyr—OEt | Val—NHz (0,25 M) | Bz—Tyr—Val—NHz | 95 | 0 |
| (30 mM) | ||||
| Ac—Phe—OEt (50 mM) | Ala—OMe (0,5 M) | ÍAc—Phe—Ala—OH (Ac—Phe— (Ala )2—OH | | 60 | 0 |
Tabulka VI
Výtěžek (%) karboxydázou Y katalyzované syntézy peptidů s různými esterovými skupinami v substrátové složce.
| Substrát | Bz—Gly—OMe (20 mM) | Bz—Gly—OEt (20 mM) | Bz—Gly—OiPr (20 mM) | Bz—Gly—OBzl (20 mM) |
| Aminová složka | ||||
| Glycin (2,0 M) | 63 | ;56 | 45 | 47 |
| Glycinamid (0,15 M) | 59 | 95 | 88 | 91 |
| Leucin (0,15 M) | 21 | 59 | 74 | 80 |
| Leucinamid (0,15 M) | 95 | 100 | 95 | 95 |
Příklad 9 robeny peptidy podle tabulek VII z uvedených výchozích látek. Podmínky byly 4,5 μΜ
Depsipeptidy jako substráty CPD—Y, pH 7,8 a 25 °C.
Je zřejmé, že bylo dosaženo velmi vysoObdobně jako v příkladech 3 a 4 byly vy- kých výtěžků.
Tabulka VII
Karboxypeptidázcu Y katalyzovaná syntéza peptidů s depsipeptidy jako substrátovými složkami.
Substrát Aminová komponenta Produkt (konc.) (konc.) í
Výtěžek %
Bz—Gly—OGly Glycinamid (0,25 M) (20 mM) Leucinamid (0,25M)
Fenylalaninamid (0,25 Mj Bz—Gly—OPhe Glycinamid [0,25 Mj (20 mM) Leucinamid (0,25M)
Fenylalaninamid [0,25 M) Bz—Phe—OGly Glycinamid (0,25 M) (20 mM) Leucinamid (0,25M)
Fenylalaninamid (0,25 M) Bz—Gly—OAla Glycinamid (0,25 M) [20 mM) Leucinamid (0,25M)
| Bz—Gly—Gly—NH2 | 90 |
| Bz—Gly—Leu—NH2 | 95 |
| Bz—Gly—Phe—NH2 | 95 |
| Bz—Gly—Gly—NH?; | 95 |
| Bz—Gly—Leu—NHž | 95 |
| Bz—Gly—Phe—NH2 | 95 |
| Bz—Phe —Gly—NH2 | Í90 |
| Bz—Phe—Leu—NH2 | 80 |
| Bz—Phe—Phe—NH2 | 80 |
| Bz—Gly—Gly—NH2 | 95 |
| Bz—Gly—Leu—NH2 | 95 |
Příklad 10
Peptidy jako substrátové složky
Obdobně jako v příkladech 1, 2, 3 a 4 byly vyrobeny peptidy uvedené v tabulce VIII. Pokusy byly prováděny v pH-statu a výtěžky byly určeny vysokotlakou kapalnou chromatografií. Podmínky byly 4 až 25 μΜ CPD—Y, pH = 7,6 a 25 °C.
Tabulka VII
Karboxypeptidázou-Y katalyzovattá syntéza peptidů s peptidy jako substráty.
| Substrát (konc.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % |
| Bz—Phe—Gly- | —Leucinamid (0,25 M) | Bz—Phe—Leu—NH2 | 90 |
| (20 mM) Bz—Gly—Phe | —Leucinamid (0,25 M) | Bz—Gly—Leu—NH2 | 10 |
| (20 mM) Z—Ala—Ala | Leucinamid (0,25 M) | Z—Ala—Leu—NH? | 74 |
| (20 mM) Z—Phe—Ala | Leucinamid (0,25 M) | Z—Phe—Leu—NH? | 60 |
| (20 mM) Z—Phe—Ser | Leucinamid (0,25 M) | Z—Phe—Leu—NH? | 70. |
| (20 mM) Z—Ala—Gly | Leucinamid (0,25 M) | Z—Ala—Leu—ΝΉ2 | 80 |
| (10 mM) Ас—(А1а)з | Leucinamid (0,25 M) | Ac—(Ala )z—Leu—NH2 | 70 |
| (10 mM) Ac(Ala)4 | Leucinamid (0,25 M) | Ас—(А1а)з—Leu—NH2 | 70 |
| (10 mM) Z—Ala—Val | Leucinamid (0,25 M) | Z—Ala—Leu—NH2 | 10 |
| (10 mM) Z—Phe—Phe | Leucinamid (0,25 M) | Z—Phe—Leu—NH? A | 10 |
Syntéza peptidů jako funkce pH
V případech kdy je syntetizovaný peptid špatným substrátem pro CPD-Y, může být syntéza prováděna při hodnotách pH nižším než výhodných 9—10,5.
Příklad 11
Obdobně jako v příkladech 1 a 3 byly vyrobeny peptidy v tabulce IX v pH-statu při uvedených hodnotách pH.
Podmínky byly 15 μΜ CPD-Y a 25 °C.
Tabulka IX
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů jako funkce pH.
| Substrát (konc.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | pH | Výtěžek i% |
| Bz—Ala—OMe | Glycin (1,3 M) | Bz—Ala—Gly | 9,5 | 40 |
| (50 mM) | 9,0 | 57 | ||
| 8,0 | 60 | |||
| 7,0 | 61 | |||
| 6,0 | 60 | |||
| 5,0 | 51 | |||
| Bz—Ala—OMe | Glycinamid (1,3 M) | Bz—Ala—-Gly—MHz | 9,5 | 77 |
| (50 mM) | 9,0 | .95 | ||
| 8,0 | 100 | |||
| 7,0 | 97 | |||
| 6,0 | 44 |
Různé jiné aminové složky
Příklad 12
Obdobně jako v příkladech 3 a 4 byly vyrobeny peptidy uvedené v tabulce X. Pokusy byly prováděny v pH státu a výtěžky stanoveny vysokotlakou chromatografií. Podmínky byly 4,5 μΜ CPD-Y, pH 9,7 a 25 °C.
Tabulka X
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s různými deriváty aminokyselin jako aminovými složkami.
Substrát Aminová složka (konc.) (koncentrace)
Bz—Ala—OMe /3-alaninamid (50 mM) (0,2 M)
Glycln hydroxamová kyselina (0,2 M)
D.L.-Alanin hydroxamová kyselina (0,2 M) Glycin-N-methylamid (0,5 M)
Přiklad 13
Syntéza peptidů s karboxypeptidázami z ječmene
Klíčící ječmen, například ve formě sladu, obsahuje dvě rozdílné peptidázy označené
Produkt Výtěžek _______ M
Bz—Ala—0AIa—N№80
Bz-Ala—Gly—NH—OH45
Bz—Ala—Ala—NH —OH40
Bz-Ala—Gly—NH—СНз20
СР—1—1 а СР—-2—1 viz Lee E. Ray, Carlsberg Res. Comm. 41, 169—182 (1976).
СР—1—1 a CP—2—1 byly izolovány jako popsal L. E. Ray a peptidy v tabulce XI byly vyrobeny obdobně jako v příkladech 1, 2, 3 a 4 z uvedených látek. Podmínky byly 6 μΜ СР—1—1 nebo CP—2—1, pH 8,0 a 25 °C.
Tabulka XI
Syntéza peptidů za použití karboxypeptidáz z klíčícího ječmene CP—1—1 a CP—2—1.
| Substrát (konc.) | Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % | Enzym |
| Bz—Ala—OMe | Valinamid (0,25 M) | Bz—Ala—Val—NH2 | 43 | CP—1—1 |
| (50 mM) | Alanin amid (0,25 MjBz—Ala—Ala—NH2 | 58 | CP—1—1 | |
| Lysin (1,7 M) | Bz—Ala—Lys | 11 | CP—1—1 | |
| Valinamid (0,25 M) | Bz—Ala—Val—NH2 | 57 | CP—2—1 | |
| Alaninamid (0,25 M) Bz—Ala—Ala—NH2 | 64 | CP—2—1 | ||
| Lysin (1,7 M) | Bz—Ala—Lys | 11 | CP—2—1 |
Příklad 14
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná deaminace amidů peptidů
К roztoku 2 ml 15 mM Bz—Ala—Leu—NHž v 0,1 M KC1 — 1 mM EDTA, pH 9,7, 25 °C a 10 % dimetylformamidu bylo přidáno 2 mg CPD—Y. Průběh reakce je ukázán na obr. 5 a byl sledován vysokotlakou kapalinovou chromatografii, jak bylo popsáno v příkladu
1. Je patrno, že Bz—Ala—Leu—NH2 byl po 20 minutách úplně převeden na asi 68 % Bz—Ala—Leu—OH a 32 % Bz—Ala—OH. A- minokyselinová analýza reakční směsi ukázala, že Bz—Ala—OH byl vytvořen hlavně odštěpením Leu—NHz od Bz—Ala—Leu— —NH2.
Příklad 15
Srovnání esteru peptidů s a bez ochranných N-koncových skupin jako substrátů
Obdobně jako v příkladech 3 a 4 byly vyrobeny peptidy uvedené v tabulce XII za těchto podmínek: 50 mM substrát, 5 μΜ CPD—Y, pH 9,5 a 25 ’C.
Tabulka XII
Srovnání pomocí karboxypeptitíázy-Y katalyzované syntézy peptidů za použití esterů peptidu s a bez N-koncové ochranné skupiny jako substrátu.
| Substrát (konc.) | Aminová složka (koncentrace] | Produkt | Výtěžek % |
| Ac—Ala—Ala— | -Leucinamid (0,15 M) | Ac—Ala—Ala—Ala— | 90 |
| —Ala—OMe | —Leu—NH? | ||
| (50 mM) Ala—Ala— | Leucinamid (0,15 M) | Ala -Ala—Ala--Leu-NH2 | 75 |
—Ala—OMe (50 mM)
Příklad 16
Syntéza v přítomnosti organických rozpouštědel
Obdobně jako v příkladech 1, 2, 3, 4 a 6 byly vyrobeny peptidy v následujících tabulkách XIII, XIV а XV z uvedených výchozích látek a při uvedených koncentracích organických rozpouštědel.
Podmínky byly tyto: 50 mM substrát, 5 μΜ CPD—Y, pH 9,6 a 30 °C.
.......... ::' Tabulka XIII
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů s 50 mM Bz -Ala—OMe jako substrátem a volnými aminokyselinami, jako aminovou složkou a s anebo bez 20% metanolu (MeOH) v 0,1 M KC1, 1 mM EDTA.
| Aminová složka (koncentrace) | Produkt | Výtěžek % | |
| s MeOH | bez MeOH | ||
| Valin (0,5 M) | Bz—Ala—Val—OH | 42 | 53 |
| Threonin (1,2 M) | Bz—Ala—Thr—OH | 52 | 61 |
| Fénylalanin (0,16 M) | Bz—Ala—Phe—OH | 16 | 18 |
| Leucin (0,16 M) | Bz—Ala—Leu—OH | 33 | 39 |
| Metionin (0,6 M) | Bz—Ala—Met—OH | 42 | 64 |
| Glycin (3,0 M) | Bz—Ala—Gly—OH | 55 | 50 |
| Serin (3,2 M) | Bz—Ala—Ser—OH | 50 | 52 |
| Lysin (1,5 M) | Bz—Ala—Lys—OH | 53 | 41 |
| χ-t-butylester kyseliny | Bz Ala- Gin--OBu1/- OH | 54 | 55 |
| glutamové (1,0 M) | |||
| Asparagin (0,6 M) | Bz—Ala—Asn—OH | 18 | 14 |
Tabulka XIV
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza Bz—Ala-Thr—OH z Bz—Ala—OMe (50 mM) a threonlnu s různými koncentracemi polyetylénglykolu 300 (PEG-300). Podmínky: CPD-Y 4 μΜ, pH 9,6 a 25 °C.
| % PEG-300 v 0,1 M KC1 | koncentrace threoninu | % výtěžek Bz—Ala—Thr—OH |
| 0 | 0,7 M | 36 |
| 10 | 0,7 M | 34 |
| 20 | 0,7 M | 31 |
| 30 | 0,7 M | 29 |
| 40 | , '..........., ..... 0,35 M : í'·, _ ' | 28 |
| ................ Tabulka XV |
Karboxypeptidázou-Y katalyzovaná syntéza peptidů z 50 mM Bz—Ala—OMe a uvedených esterů aminokyselin, jako aminové složky v 30 % polyetylénglykolu — 0,1 M KC1, 1 mM EDTA, Podmínky: CPD—Y = 8 uM, pH 9,6 a 25 °C.
Substrát Aminová složka Produkt . Výtěžek (konc.) (koncentrace) o/o
| Bz—Ala—OMe Valin—OMe | /Bz—Ala—Val—OH , 'Bz—Ala—Val—Val—OH / | 88 | |
| (50 mM) | (0,5 M) | ||
| Serin—OMe | Bz—Ala—Ser—OH | 30 | |
| (0,5 M) | |||
| Bz—Ala—OMe | Valin—OMe | [Bz—Ala—Val—OH 1 | |
| (50 mM) | (0,5 M) | 1 Bz—Ala-Val—Val—OH ’ | 88 |
| Serin—OMe | Bz—Ala—Ser—OH | 30 | |
| (0,5 M) | |||
| Kyselina glutamová | Bz—Ala—Glu -(/OBu1)—OH | 38 | |
| (Г-OBu1)—OMe (0,5 M) | |||
| Fénylalanin—OMe | [Bz—Ala—Phe—OH | ||
| (0,5 M) | Bz—Ala—Phe—Phe—OH j | 82 | |
| Bz—Ala—OMe | L-mettonln—OMe | [Bz—Ala—Met—OH 1 | |
| (50 mM) | (0,5 M) | Bz—Ala—Met—Met—OH J | |
| Bz—Ala—Met—Met—Met— I | 85 | ||
| —OH ’ | |||
| D-metlonin—OMe | Bz—Ala—D—Met—OH | 0 | |
| (0,5 M) |
254354
Příklad 17
Nerozpustná (imobilizovaná) karboxypeptidáza-Y
CPD—Y byla navázána na ConcanavallnA-Sepharosu 4B od a tento komplex byl zesíťován pomocí glutaraldehydu jak popisuje Hsiao a Royer, Archives of Biochemistry and Biophysics, 198, 379—385, (1979). Koncen trace CPD—Y byla 3 mg na ml suspenze Sepharosy.
Obdobně jako v příkladech 1 a 3 byly peptidy uvedené v tabulce XVI vyrobeny za těchto podmínek: 50 mM substrát, 0,25 ml CPD— —Y gelu, tj. 5 uM CPD—Y, pH 9,7 a 35. °C. Po odstranění enzymu filtrací byly produkty a výtěžky stanoveny vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
Tabulka XVI
Syntéza peptidů katalyzovaná nerozpustnou karboxypeptidázou.
Substrát Aminová složka Produkt (konc.) (koncentrace)
Výtěžek %
Bz—Ala—OMe Fenylalamin (0,15 M) (50 mM) Leucinamid (0,2 M)
Bz—Ale—Phe
Bz—Ala—Leu—NH2
Příklad 18
Peptidické amidy jako substráty
Roztok 5 mmolu Bz—Ala—Leu—NH2 v 0,1 M chloridu draselném — 1 mmol EDTA a 10% dimetylformamld pH 10,0 byl smíchán při teplotě 25 °C s 0,25 M valínamldem.
Reakce byla iniciována přidáním 40 pm CPD—Y a prováděna analogicky jako v příkladech 3 a 4. Bz—Ala—Leu—Val—NH2 byl izolován pomocí HPCL s výtěžkem 65 %.
Reakce byla opakována za použití 5 mmol
Bz—Ala—Phe—NH2 jako složky substrátu. Bz—Ala—Phe—Val—NHž byl izolován pomocí HPLC s výtěžkem 44 %.
Příklad 19
Syntéza met-enkefalinu
Stupňová syntéza met-enkefalinu vycházející z 5 g Bz—Arg—CEt a používající CPD—Y jako katalyzátor se provádí podle následujícího schématu
Bz—Arg—OEt pH 9,6
CPD—Y
H—Tyr—NH2
Bz—Arg—Tyr—NH2 pH 9,6 CPD—Y Bz—Arg—Tyr—OH
EtOH/HCl
Bz—Arg—Tyr—OEt pH 9,0
CPD—Y H—Gly—OEt
| H—Tyr—Gly—Gly—Phe—Met—OH | (95 %) | ||
| pH 8,0 | Trypsin | ||
| (85 %) | Bz—Arg—' 1 | Гуг—Gly—Phe—Met—OH | (75%) |
| pH 9,5 | 1 CPD—Y M—Met—OH | ||
| (90 %) | - Bz—Arg— | 1 Гуг—Gly—Gly—Phe—OEt | (80%) |
| EtOH/HCI | |||
| (80%) | Bz—Arg—í | Гуг—Gly—Phe—OH | (95 %) |
| pH 9,6 | CPD—Y | ||
| (60 %) | Bz—Arg—’ | Гуг—Gly—Gly—Phe—NH2 | (65 %) |
CPD—Y, pH 8,0 /
H—Phe—NH2
Schéma:
Syntéza met-enkefalinu za použití karboxypeptidázy-Y (CPD—Y) jako katalyzátoru. V závorkách jsou uvedeny procenta výtěžků.
CPD—Y katalyzovaná kondenzace a stupně deaminace byly prováděny v čistě vodné fázi a Bz—Arg byla vybrána jako solubilizační chránící skupina, která by mohla být odstraněna v posledním stupni trypsinem, jak je vysvětleno vpředu. Po rozšíření peptídu aminokyselinou, následovanou deaminací byl syntetizován následující peptid-esterový substrát pomocí absolutního ethanolu a bezvodého chlorovodíku. Sloučeniny z jednotlivých reakčních stupňů byly izolovány pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Takto lze rovněž regenerovat nadbytečnou aminovou složku i „vedlejší produkt“ hydrolýzy.
5'49 5 4
Claims (10)
- PŘEDMĚT1. Způsob výroby peptidů obecného vzorceА—В kdeA znamená N-koncově chráněný zbytek L-aminokyseliny nebo případně N-koncově chráněný peptidový zbytek mající C-koncovou L-aminokyselinu aВ je případně C-koncově chráněný zbytek L-aminokyseliny, reakcí substrátové složky s aminovou složkou v přítomnosti enzymu, vyznačený tím, že substrátová složka ze skupiny zahrnujícía) estery aminokyselin, estery peptidů a depsipeptidy obecného vz-orceA -OR1 kdeA má význam udaný výše aOR1 znamená enzymaticky odštěpltelnou skupinu, v níž R1 je vybráno z Cl—-Сб-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu, benzylu a fenethylu, nebo α-des-aminový fragment zbytku L-aminokyseliny,b) případně N-substituované amidy aminokyselin a amidy peptidů obecného vzorceA—NR2R2< kdeA má význam udaný výše aNR2R2‘ znamená enzymaticky štěpitelnou skupinu, v níž R2 a R2‘ jsou vybrány z vodí ku, Ci—Сб-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu, benzylu a fenethylu, ac) případně N-koncově chráněné peptidy obecného vzorceА—X kdeA má význam udaný výše aX znamená L-aminokyselinu, se uvádí do reakce s aminovou složkou ze skupiny zahrnujícía) L-aminokyseliny obecného vzorceΗ—B—OH, kdeВ znamená zbytek L-aminokyseliny,b) případně N-substituované amidy L-aminokyselin vzorceH--B—NR3R3‘ kdeВ je L-aminokyselinový zbytek aVYNALEZUR3 a R3‘ znamenají vodík, nebo snadno odštěpiteinou skupinu vybranou z hydroxylu, aminoskupiny nebo Ci—Ce-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu, benzylu a fenethylu, ac]estery aminokyselin obecného vzorceΗ—B—OR4 kdeВ je L-aminokyselinový zbytek aR4‘ znamená snadno odštěpitelnou skupinu vybranou z Ci—Co-alkylu, fenylu, p-nitrofenylu a fenethylu, v přítomnosti L-speclfické serin- nebo thiolkarboxypeptidázy živočišného, rostlinného a mikrobiálního původu, ve vodném roztoku nebo disperzi o· výchozí koncentraci substrátové složky 0,01 až 1 M a aminové složky 0,05 až 3 M a o pH 5 až 10.5, výhodně 8 až 10,5 a s výhodou při teplotě 20 až 50 °C, za vzniku peptidů, a poté se popřípadě odštěpí kterákoli ze skupin R3, R3‘ nebo R4 nebo N koncová ochranná skupina, výhodně pomocí L-specifické serin- nebo thiolkarboxypeptidázy, které bylo použito při předchozí reakci.
- 2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že jako karboxypeptidázy se použije karboxypeptidázy Y z kvasnic.
- 3. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se používá karboxypeptidázy ze skupiny zahrnující penícilokarboxypeptidázu S—1 a S—2 z Penicillium janthinellum, karboxypeptidázy z Aspergillus saitoi nebo Aspergillus eryzae, karboxypeptidázy C z pomerančovníkových listů neboi slupek, k-arboxypeptidázu CN z Citrus natsudsidai Hayata, phaseolain z fazolových listů, karboxypeptidázy z klíčícího ječmene, klíčících bavlníkových rostlin, rajčat, vodních melounů a bromeleinového nebo ananasového prášku.
- 4. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se používá zmobilizovaného karboxypeptidázového enzymu.
- 5. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že se používá vodného reakčního roztoku obsahujícího s výhodou organické rozpouštědlo v koncentraci od stop do 50 %.
- 6. Způsob podle bodu 5 vyznačený tím, že se používá organického rozpouštědla ze skupiny zahrnující alkanoly, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, dioxan, tetrahydrofuran, dimethoxyethan, eíhylenglykol a polyethylenglykoly.
- 7. Způsob podle bodu 5, vyznačený tím, že reakce se provádí při koncentraci karboxypeptidázy 10~6 až 10-4 M.
- 8. Způsob podle kteréhokoli z předchozích bodů vyznačený tím, že jako substrátové složky se používá esteru aminokyseliny nebo esteru peptidů ze skupiny zahrnující benzylestery a Ci—Cd-alkylesterů, případně substituovaných inertními substituenty.2Í4Я5<35 ЗВ
- 9. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že jako aminové složky se používá amidu obecného vzorceΗ—Β—NH R3 kdeR3 znamená Ci—Сз-alkyl aВ znamená Zbytek L-arriindkyseliny.
- 10. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že jako aminové složky se používá esteru obecného vzorceΗ—B—OR4 kdeR4 znamená Ci—Сз-alkyl aВ znamená Zbytek L-aminokyseliny.5 listů výkresůBz-Ala-Val-OH254854
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK144379 | 1979-04-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS239980A2 CS239980A2 (en) | 1987-07-16 |
| CS254954B2 true CS254954B2 (en) | 1988-02-15 |
Family
ID=8104890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS802399A CS254954B2 (en) | 1979-04-06 | 1980-04-08 | Method of peptides production |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4339534A (cs) |
| EP (1) | EP0017485B1 (cs) |
| JP (1) | JPS6339237B2 (cs) |
| AT (1) | ATE9595T1 (cs) |
| AU (1) | AU545416B2 (cs) |
| BR (1) | BR8008024A (cs) |
| CA (1) | CA1160973A (cs) |
| CS (1) | CS254954B2 (cs) |
| DE (1) | DE3069259D1 (cs) |
| FI (1) | FI70597C (cs) |
| HU (1) | HU186734B (cs) |
| IE (1) | IE50256B1 (cs) |
| IL (1) | IL59776A (cs) |
| NZ (1) | NZ193375A (cs) |
| RO (1) | RO80806A (cs) |
| SU (1) | SU1378785A3 (cs) |
| WO (1) | WO1980002157A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA801929B (cs) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| AU8457482A (en) * | 1981-05-20 | 1982-12-07 | Nordisk Insulinlaboratorium | A process for the preparation of insulin derivatives |
| AU551174B2 (en) * | 1981-09-15 | 1986-04-17 | Nordisk Insulinlaboratorium | Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| JPS59112952A (ja) * | 1982-12-21 | 1984-06-29 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | ペプチド誘導体 |
| GB8430255D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Erba Farmitalia | Biologically active oligopeptides |
| FR2584077B1 (fr) * | 1985-06-28 | 1988-07-08 | Irceba | L-di ou tripeptides possedant une activite biologique utilisable en medecine humaine et veterinaire, procede pour leur obtention et medicament en contenant |
| WO1987006268A1 (en) * | 1986-04-10 | 1987-10-22 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Or | Enzymatic synthesis |
| US4935355A (en) * | 1986-04-15 | 1990-06-19 | Synthetech, Inc. | Preparation of dipeptides |
| US5037741A (en) * | 1986-08-18 | 1991-08-06 | The Coca Cola Company | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides |
| US5350681A (en) * | 1986-08-18 | 1994-09-27 | The Coca-Cola Company | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides |
| US5202235A (en) * | 1986-08-18 | 1993-04-13 | The Coca-Cola Company | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides |
| US5002871A (en) * | 1986-08-18 | 1991-03-26 | The Coca-Cola Company | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides |
| US5336601A (en) * | 1986-08-18 | 1994-08-09 | The Coca-Cola Company | Enzymatic membrane method for the snythesis and separation of peptides |
| DK72587D0 (da) * | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider |
| US4892820A (en) * | 1987-06-10 | 1990-01-09 | The Nutrasweet Company | Solvent system for enzymatic coupling process |
| US5268267A (en) * | 1987-08-21 | 1993-12-07 | The General Hospital Corporation | Method for diagnosing small cell carcinoma |
| DE3733198A1 (de) * | 1987-10-01 | 1989-04-13 | Kernforschungsanlage Juelich | Enzymatisches verfahren zur herstellung von dipeptiden |
| DE3741515A1 (de) * | 1987-12-08 | 1989-06-22 | Degussa | Verfahren zur herstellung von dipeptiden |
| DK15888D0 (da) * | 1988-01-14 | 1988-01-14 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af immunmodulerende pentapeptider samt mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden |
| DE3803124A1 (de) * | 1988-02-03 | 1989-08-10 | Degussa | Verfahren zur enzymatischen peptidsynthese |
| EP0344803B1 (en) * | 1988-06-03 | 1995-09-13 | Sharp Kabushiki Kaisha | Electronic device with calendar function |
| DK163435C (da) * | 1988-08-12 | 1992-07-20 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf |
| US5002872A (en) * | 1989-05-10 | 1991-03-26 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Enzyme mediated coupling reactions |
| US5169780A (en) * | 1989-06-22 | 1992-12-08 | Celgene Corporation | Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines |
| US4950606A (en) * | 1989-06-22 | 1990-08-21 | Celgene Corporation | Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines |
| US5300437A (en) * | 1989-06-22 | 1994-04-05 | Celgene Corporation | Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines |
| US5279954A (en) * | 1989-06-30 | 1994-01-18 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska And Bionebraska | Exopeptidase catalyzed site-specific bonding of supports, labels and bioactive agents to proteins |
| US5366862A (en) * | 1990-02-14 | 1994-11-22 | Receptor Laboratories, Inc. | Method for generating and screening useful peptides |
| DE4014564C1 (cs) * | 1990-05-07 | 1991-07-18 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | |
| DK133990D0 (da) * | 1990-05-30 | 1990-05-30 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af growth hormone releasing factor (grf) og peptider anvendelige som mellemprodukter ved fremgangsmaaden |
| US5580751A (en) * | 1990-09-14 | 1996-12-03 | Carlsberg A/S | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides |
| DK220890D0 (da) * | 1990-09-14 | 1990-09-14 | Ole Buchardt | Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider |
| KR930002966B1 (ko) * | 1990-11-24 | 1993-04-16 | 주식회사 미 원 | 디펩티드의 제조방법 |
| EP0598034B1 (en) * | 1991-08-08 | 1998-11-04 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Production of peptide amides |
| DE59205565D1 (de) * | 1991-10-07 | 1996-04-11 | Hoechst Ag | Carbonsäureester-Schutzgruppen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Kopplung an eine funktionelle Gruppe sowie ihre Verwendung |
| EP0566824A1 (en) * | 1992-01-28 | 1993-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Enzymatic peptide synthesis |
| US5356805A (en) * | 1992-03-03 | 1994-10-18 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Gamma-polyglutamate hydrolase |
| FR2721030B1 (fr) * | 1994-06-09 | 1996-08-30 | Pasteur Institut | Composés modifiant la transmission sérotoninergique; applications diagnostiques et thérapeutiques. |
| EP0722457B1 (fr) * | 1993-10-04 | 2002-01-02 | Institut Pasteur | Composes modifiant la transmission serotoninergique; applications diagnostiques et therapeutiques |
| US6187579B1 (en) | 1993-10-28 | 2001-02-13 | Carlsberg A/S | Customized proteases |
| US5369017A (en) * | 1994-02-04 | 1994-11-29 | The Scripps Research Institute | Process for solid phase glycopeptide synthesis |
| US5585359A (en) * | 1994-09-29 | 1996-12-17 | Merck & Co., Inc. | Inhibitors of farnesyl-protein transferase |
| WO1996017941A2 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Bionebraska, Inc. | Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs |
| EP0821670A1 (en) * | 1995-04-21 | 1998-02-04 | Novartis AG | N-aroylamino acid amides as endothelin inhibitors |
| US5985627A (en) * | 1997-02-28 | 1999-11-16 | Carlsberg Laboratory | Modified carboxypeptidase |
| NL1006069C2 (nl) * | 1997-05-16 | 1998-11-17 | Dsm Nv | Werkwijze voor de bereiding van peptiden. |
| WO2000027800A1 (en) * | 1998-11-09 | 2000-05-18 | Smithkline Beecham Corporation | Ccr-3 receptor antagonists |
| US20030060413A1 (en) * | 2001-09-06 | 2003-03-27 | Zimmer Robert H. | Derivatives of pseudo-peptides, their preparation and their biological uses |
| US6908900B2 (en) * | 2001-01-17 | 2005-06-21 | Zimmer & Associates Ag | Compositions and methods for enhanced pharmacological activity through oral and parenteral administration of compositions comprising polypeptide drug substances and other poorly absorbed active ingredients |
| US7671029B2 (en) | 1999-08-06 | 2010-03-02 | Immupharma Sa | Compositions and methods for enhanced pharmacological activity of compositions comprising peptide drug substances |
| US6624147B1 (en) * | 1999-09-28 | 2003-09-23 | Rijksuniversiteit Leiden | Inhibitors of prenylated pyrophosphate consuming enzymes |
| EP1224318A2 (en) * | 1999-10-29 | 2002-07-24 | Novus International, Inc. | Oligomers and oligomeric segments of alpha-hydroxy carboxylic acids and alpha-amino acids |
| US6939693B2 (en) * | 1999-10-29 | 2005-09-06 | Novus International, Inc. | Enantioselective oligomerization of α-hydroxy carboxylic acids and α-amino acids |
| CN102988362B (zh) | 2005-12-07 | 2014-11-05 | 巴斯利尔药物股份公司 | 单环-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂的有效的联合应用 |
| CN103073618A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-01 | 吉尔生化（上海）有限公司 | 一种苄氧羰基丙氨酰丙氨酸的制备方法 |
| EP3440051B1 (en) * | 2016-04-04 | 2024-03-20 | Research Triangle Institute | Neuropeptide s receptor (npsr) agonists |
| CN107936089B (zh) * | 2017-11-07 | 2021-01-29 | 重庆大学 | 一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| US4119493A (en) * | 1975-10-23 | 1978-10-10 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| US4116768A (en) * | 1975-04-29 | 1978-09-26 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| US3972773A (en) * | 1975-04-29 | 1976-08-03 | Sagami Chemical Research Center | Process for producing peptide |
| US4086136A (en) * | 1975-10-23 | 1978-04-25 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase |
| JPS5411294A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
| JPS5411293A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
-
1980
- 1980-04-01 FI FI801035A patent/FI70597C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-04-01 RO RO80102770A patent/RO80806A/ro unknown
- 1980-04-01 WO PCT/DK1980/000020 patent/WO1980002157A1/en unknown
- 1980-04-01 ZA ZA00801929A patent/ZA801929B/xx unknown
- 1980-04-01 BR BR8008024A patent/BR8008024A/pt not_active IP Right Cessation
- 1980-04-01 JP JP55500907A patent/JPS6339237B2/ja not_active Expired
- 1980-04-01 AU AU59815/80A patent/AU545416B2/en not_active Ceased
- 1980-04-02 DE DE8080301062T patent/DE3069259D1/de not_active Expired
- 1980-04-02 US US06/136,661 patent/US4339534A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-04-02 EP EP80301062A patent/EP0017485B1/en not_active Expired
- 1980-04-02 AT AT80301062T patent/ATE9595T1/de active
- 1980-04-03 IE IE694/79A patent/IE50256B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-04-03 CA CA000349271A patent/CA1160973A/en not_active Expired
- 1980-04-04 IL IL59776A patent/IL59776A/xx unknown
- 1980-04-08 HU HU80832A patent/HU186734B/hu not_active IP Right Cessation
- 1980-04-08 CS CS802399A patent/CS254954B2/cs unknown
- 1980-04-09 NZ NZ193375A patent/NZ193375A/xx unknown
- 1980-12-05 SU SU803217951A patent/SU1378785A3/ru active
-
1985
- 1985-06-13 US US06/744,308 patent/US4806473A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4806473A (en) | 1989-02-21 |
| US4339534A (en) | 1982-07-13 |
| BR8008024A (pt) | 1981-03-31 |
| IE800694L (en) | 1980-10-06 |
| IL59776A0 (en) | 1980-06-30 |
| ZA801929B (en) | 1981-11-25 |
| HU186734B (en) | 1985-09-30 |
| DE3069259D1 (en) | 1984-10-31 |
| FI70597C (fi) | 1986-09-24 |
| WO1980002157A1 (en) | 1980-10-16 |
| IL59776A (en) | 1985-01-31 |
| CA1160973A (en) | 1984-01-24 |
| FI801035A7 (fi) | 1980-10-07 |
| ATE9595T1 (de) | 1984-10-15 |
| EP0017485A1 (en) | 1980-10-15 |
| JPS6339237B2 (cs) | 1988-08-04 |
| CS239980A2 (en) | 1987-07-16 |
| EP0017485B1 (en) | 1984-09-26 |
| AU545416B2 (en) | 1985-07-11 |
| NZ193375A (en) | 1983-06-14 |
| FI70597B (fi) | 1986-06-06 |
| SU1378785A3 (ru) | 1988-02-28 |
| AU5981580A (en) | 1980-10-22 |
| JPS56500519A (cs) | 1981-04-23 |
| IE50256B1 (en) | 1986-03-19 |
| RO80806A (ro) | 1983-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS254954B2 (en) | Method of peptides production | |
| EP0278787B1 (en) | A process for enzymatic production of dipeptides | |
| US4645740A (en) | Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins | |
| EP0359399B1 (en) | Process for the enzymatic production of dipeptides | |
| AU660944B2 (en) | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides | |
| DK2634193T3 (en) | Condensation of the side-chain protected oligopeptidfragmenter using subtilisins in organic solvents | |
| Nakamura et al. | Synthesis of peptide thioesters via an N–S acyl shift reaction under mild acidic conditions on an N‐4, 5‐dimethoxy‐2‐mercaptobenzyl auxiliary group | |
| US5580751A (en) | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides | |
| EP0324659B1 (en) | Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process | |
| Hwang et al. | Enzyme-catalyzed peptide segment condensation using 5 (4H)-oxazolones as acyl donors | |
| Konopińska et al. | Proteolytic enzymes in peptide synthesis | |
| CN101821400B (zh) | 通过c-端酯交换的化学-酶促肽合成 | |
| Groeger et al. | Papain‐catalyzed synthesis of dipeptides | |
| NO157706B (no) | Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider. | |
| Pritz | Enzymes in protein ligation: The coupling of peptides, peptide nucleic acids and proteins by sortase A | |
| CA1177429A (en) | Process for enzymatic production of peptides | |
| DK155613B (da) | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af peptider | |
| WO2009047354A1 (en) | Chemo-enzymatic synthesis of a c-terminal thioester of an amino acid or a peptide | |
| DK163365B (da) | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptidderivater | |
| EP0303602A1 (en) | Enzymatic synthesis |