SU1378785A3 - Способ ферментативного получени пептидов - Google Patents

Способ ферментативного получени пептидов Download PDF

Info

Publication number
SU1378785A3
SU1378785A3 SU803217951A SU3217951A SU1378785A3 SU 1378785 A3 SU1378785 A3 SU 1378785A3 SU 803217951 A SU803217951 A SU 803217951A SU 3217951 A SU3217951 A SU 3217951A SU 1378785 A3 SU1378785 A3 SU 1378785A3
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
ala
phe
gly
leu
met
Prior art date
Application number
SU803217951A
Other languages
English (en)
Inventor
Таанинг Йохансен Джек
Видлер Фред
Original Assignee
Карлсберг Биотехнолоджи Лтд А/С (Фирма)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Карлсберг Биотехнолоджи Лтд А/С (Фирма) filed Critical Карлсберг Биотехнолоджи Лтд А/С (Фирма)
Application granted granted Critical
Publication of SU1378785A3 publication Critical patent/SU1378785A3/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

Изобретение относитс  к пептидам , в частности к способу ферментативного получени  пептидов общей формулы А-В, где А Н-концевой L-ами- нокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоту (АК) на его С-терминальном конце и необ зательно защитную группу на N-терми- нальном конце; В Ъ-аминокислотиый остаток , который может быть С-терми- напьно защищен, примен емых в син- . тезе биологически активных соединений . Цель изобретени  - упрощение процесса. Синтез пептидов ведут из аминокислотной (АКК) и субстратной компонент (СК) в растворе в присутствии фермента. В качестве АКК используют выбранные из группы соединени  Н-В-ОН (в указано вьше); амид с необ зательно N-замещенной АК формулы H-B-NHR ; сложный эфир АК формулы H-B-OR, где В указано выше; ОН; С -С4-алкил; ,-C4- алкил. В качестве СК используют выбранное из группы соединение: сложный эфир аминокислоты или пептида, или депсипептида формулы А - ОН,; амид АК или пептида формулы A-NHj или пептид формулы А.-Х, где А указано вьше; ,-С4-алкил, бензил или б г-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Phe; А,Ъ-Ж-ИЛИ ди-пентапептид; . Процесс целесообразно проводить в дисперсии или з водном растворе , содержащем до 20% органического растворител  (низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгли- кол ) при рН 7,6-10,5, 25-45 0 и исходной концентрации СК 0,01-0,15 моль и АКК 0,05-3 моль с последующим выделением необ зательного защищенного пептида, после чего при необходимости отщепл ют группы Rj и R( с помощью серинкарбоксипептидазного энзима ( карбоксипептидаза-У из дрожжей или карбоксипептидазы СР-1-1 или СР-2-1 из проростков  чмен ). Способ обеспечивает возможность проведени  процесса в широком интервале рН 7,6- 10,5 при меньшем расходе фермента (до 2-25 ммоль). 2 з.п. ф-лы, 16 табл. S Од ч1 00 00 СП о

Description

Изобретение относитс  к способам ферментативного получени  пептидов, который может быть использован в синтезе биологически активных соединений .
Цель изобретени  - упрощение процесса ферментативного синтеза пептидов .
Исходные материалы,
Карбопепсидаэу-Y, получаемую из хлебопекарных дрожжей, выдел ли с помощью хроматографии средства, предложенной Йохансеном, и производили в виде лиофшшзированного порошка (10% фермента в лимонно-кислом нат- рие),Перед использованием фермент обессоливали на установке Sephadex 025 fine (1,5-25 см), уравновешивали и вымывали дистиллированной водой . Концентрацию фермента определ ли спектрофотометрически при условии
2вонА% Приготавливали основной раствор с концентрацией 7 мг/мл (110 мкмоль)5 хранивишйс  при -21 С, аликвотными порци ми .по 250-500 мл. Использовали бензоилаланинметиловый эфир (Bz-Ala-OMe), выпускаемый фирмой Бахем, Лиштапь, Швейцари . Бо- ро-трифторидный эфировьш комплекс (дл  синтеза), растворители и реактивы (все аналитической чистоты) приобретали у фирмы Мерк, Дарм- штадт, ФРГ. Все аминокислоты, аминокислотные амиды и их производные закупали у фирмы Сигма Кемикал Ком- пани, Сан-Луис, С1ЧА. Карбобензил- оксифенилаланинметиловый эфир (Z-Phe ОМе) изготавливали в соответствии с процедурой Ямада и др. и использовали в виде сиропа. Фенилаланингид- разид, аланингидразид и аланингидра- зидгидрохлорид изготавливали из эфи- ров в соответствии с описанием Лос- се и др. Нескорректированные т,пл. составл ли 86-88 и 184-185 с (по известным данным 82-83 и 184-185°С соответственно). Аспарагинамиддигид- рохлорид получали из аспартановой кислоты и диэтилового эфира по Фишеру с помощью классического аминоли- за (т.пл. 210-214 С, по известршм данным 214-215 с). Другие исходные материалы приобретали у указанных фирм или производили аналогичным образом .
Определение выходных продуктов. Чистоту определ ли количественно с помощью TLC на силикагеле 60
0
Fg, (Мерк). Примен ли растворитель- ную систему CllClg (СК (СН,,), «OH(CHjCOOH) (11:5:2:1), П тна визуально провер ли на тушение флуоресценции дл  оценки состава реагентов .
Состав реагентов определ ли количественно на установке обращени  фазы HPLC с помощью столба RP-8,10 мкм (Мерк)-и хроматографа Хьюлетт Пакард 10845 снабженного регистратором переменной длины волны (модель 79875,А). Разделение обеспечивали при исполь5 зовании соответствующих удельных
градиентов в системах вымывани , составл ющих от 10% CHjCN в 10 ммоль НаАс (рН 4) до 100% или от 10 ммоль NaAc (рН 4) до 100% .
Q Последнюю систему использовали дл  таких соединений, как Bz Ala-Gly-OH, Bz-Ala-Ala-OH, Bz-Ala-Ser-OH, и соответствующих амидов о Скорость протекани  3 мл/мин, температура столба
5 , рабоча  длина волны 260 нм. Выходы определ ли из мол рного отношени  реагентов, которое находили по интегрированным площад м под пиками вымывани .
Идентификаци  продуктов. П тна идентифицировали методами кохроматографии тонких слоев с соответствующими стандартными соединени ми . Некоторые продукты идентифици- .ровали с помощью сочетани  метода
HPLC и аминокислотного анализа. Лп  этого из смеси реакции через 10 мин забирали аликвотные пробы объемом 1 мл и реакцию останавливали добавлением 250 мкл 6 М НС1, После это- го рН доводили до 4 с помощью КаОН и смесь раздел ли методом HPLC с помощью оборудовани  фирмы Уотерс, включающего два насоса, программное устройство составлени  растворителей
модели .660j инжектор модели Ь бК, регистратор переменной длины волны модели 450, совмещенный с самописцем (радиометр 61), или f Мописец- интегратор фирмы Хьюлетт-Пакард,
0 модель 3380А, Управление вымыванием осуществл ли с помощью сканировани  на подход щей длине волны от 255 до 280 им. Хроматографию осуществл ли методом обратной фазы с помогаю
5 столба Уотерс С-18м-Бондапак в
системе вымывани  20 об,% ТЕАР (три- метиламмониефосфатный буфер) в метаноле с соответствующими градиентами и скоростью потока 1,5-2,0 мл/мин.
Буферный раствор ТЕАР изготавливали по методике Ривьера. Во многих случа х удовлетворительные результаты обеспечивали в системе 0,1 М НАс, рН 3, 20 об.%, и 0,1 М НАс, рН 3 в метаноле.
Вытекающий поток, содержащий Ы- ацилдипептиды, собирали вручную и доводили до сухости путем лиофили- зации или на установке Бюхи Рото- вап при 35-45 С, Малые пробы остатков гидролизовали в 6 М НС1 при в вакууме з течение 36 ч, Испаренные гидролизаты анализировали на аминокислотном анализаторе типа Даррум Л-500.
Синтез со свободными аминокислотами в качестве аминовой компоненты
Пример 1.2мл 0,6 М раствор валина 0,1 М КС1, 1 м EDTA при рН 9,8 смешивают со 100 мкл (0,1 ммоль) 1 М раствора Bz-Ala-OMe (растворенны в 96%-ном этаноле). Реакцию прово-, д т в рН-стате при 35°С и рН 9,8, ) причем значение рН поддерживают посто нным путем автоматического добавлени  0,5 М ИаОН. Реакцию инциируют добавлением 0,7 мг карбокси- пептидазы-У (150и/мг, производство Де ФореНеде Брижерье). После про- текани  реакции в течение 30 мин, реакцию останавливают с помощью доведени  рН до 1 при посредстве 6 М НС1 Продукт реакцииочищают и выдел ют с помо1цью хроматографии при высоком давлении. Выход Bz-Ala-Val-OH составл ет 40%. Количественный анализ аминокислоты после гидролиза продукта в 6 М НС1 в течение 24 ч дает соответственно 1,0 моль аланина и 1,0 моль валина. .
Вли ние рН,,температуры и концентрации субстратной компоненты, ами- новой компоненты и CPD-Y на выход Bz-Ala-Val-OH+CHjOH изучали с до- мощью п ти серий экспериментов, проведенных аналогично описанной процедуре . В каждом из экспериментов измен ли один из указанных параметров при посто нстве остальных четы- рех: 0,6 М валин; 55 ммоль Bz-Ala-OM 4,5 мкмоль CPD-Y; рН 9,7; 35°С. Полученные результаты показали, что диапазон оптимальных значений рН довольно узок и составл ет всего 0,5 ед. рН, возрастание температуры, реакции приводит к почти линейному возрастанию синтеза из-за относительно слабого гидролиза. При температу
15
25
20 30 35 40
45 Q
5
pax выше 45 снижение активности фермента и неферментативный гидролиз эфиров станов тс  неприемлемы- ми. При более низких температурах при рН до 10,0 гидролиз эфиров был пренебрежимо мал в течение 10 мин реакции. Однако он становилс  существенным при снижении скорости ферментативной реакции, когда длительность реакции возрастала до 2-5 ч.
Выход Bz-Ala-Val-OH увеличивалс  при возрастании концентрации аминовой компоненты. Обратна  зависимость наблюдалась между выходом и концентрацией субстратной компоненты дл  Bz-Ala-OMe. Это обсто тельство с учетом зависимости выхода от высокой концентрации фермента позвол ет найти оптимальное отношение субстрата к концентрации фермента.
В присутствии 0,5 М валина субстрат Bz-Ala-OMe быстро преобразовывалс  (в течение 20 мин) в 38% Вг-/й.а -Val-OK и 62% Bz-Ala-OH. Эти цифры показывают также, что дипептид не. гидролизовалс  при рН 9,7 в присутствии избыточного валина. Если р11 доводили до 5-8, то весь Bz-Ala-Val- OH гидролизовалс  за несколько секунд . Такое избирательное поведение CPD-Y при высоких рН  вл етс  свойством , имеющим важное значение при синтезе пептидов.
Пример2. 2 мл раствора 3 М лизина, 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA при pFi 9,8 смещивают с 400 мкл 100%-ного метанола и 100 мкл {0,1 ммоль) 1 М Z-Phe-OMe (растворенного в 100%-ном метаноле). Реакцию провод т аналогично примеру 1, ионизиру  -добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У. Через 30 мин рН довод т до 1 с помощью 6 М НС1. Продукт реакции очищают и вьщел ют способом хроматографии высокого давлени  Выход Phc-Lys-OH достигает 60%. Количественный анализ аминокислот производившийс  аналогично примеру 1, показал, что в продукте содержалс  1 моль лизина и 1 моль фенилаланина.
Пептиды, представленные в табл.1, производили из указанных исходных материалов аналогично примерам 1 и 2. Эксперименты выполн ли в радиометрическом рН-стате, а выходы определ ли на установке HPLC. Поддерживали значени : 4,5 мкМ CPD-Y; рП 9,7.; .
Синтез с амидами аминокислот в качестве аминовой компоненты.
И р и м е р 3, 2 мл раствора 0,6 М метионинамида (Met-NH), 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA при рН 9,8 смешивают со 100 мкл (0,1 ммоль) раствора 1 М Bz--Ala-OMe в 96%-ном метаноле. Реакцию провод т аналогично примеру 1, иницииру  добавлением 0,7 мг карбок- сипептидазы-Y. Через 30 мин после начала реакции значение рН довод т до 1 с помощью 6 М НС1. Продукт реакции очищают и выдел ют способом хроматографии высокого давлени . Выход Bz-Ala-Met-NH 95%. Количественный аминокислотный анализ, проводившийс  так же, как в примере 1, показал , что продукт содержал 1,0 моль Ala, 1,0 моль Met и 1,0 моль NH.
В течение 20 мин субстрат почти полностью превращалс  в дипептид (95%), а 5% гидролизовалось. до Bz-Al ОН,
11ример4. 2мл раствора 0,4 валинамида (Val-NH), 0,1 М КС1, 1 Ml l EDTA при рН 9,5 смешивают со 100 мкл (0,1 ммолъ) раствора 1 М Bz- А1а-ОМе в 96%-ном метаноле. Реакцию провод т, как в примере 1, Продукт реакции Bz-Ala-Val-NHg осаждают во врем  реакции. Через 20 мин после начала реакции рН довод т до 1 и осадок выдел ют центрифугированием,Продукт раствор ют в 1 мл мета НОЛ а 5 очища1от и выдел ют способом хроматографии высокого давлени . Выход Bz-Ala-Val-NH составл ет 95%, в то врем  как в примере I при использовании свободной аминокислоты в качестве аминовой компоненты, он был равен.только 40%, Количественный анализ аминокислоты, проводивщий с  так же, как в примере 1, показал что продукт содержал 1,0 моль Ala, 1,0 моль Val и 1,0 моль NH.
Зависимость протекани  реакции от значени  рН и от концентрации валинамида .
Реакции) проводили аналогично описанному синтезу, причем посто нные параметры составл ли: 0,6 М валинами да; 55 мМ Bz-Ala-OMe; 4,5 мкМ CPD-Y рН 9,7; 35°С.
Полученные результаты показали, что выход практически не зависит от концентрации валинамида.
Эффективное значение рН вапинами да не превышает 9, значение рН 9,8
0
5
0
5 30 5
0
5
50
5
 вл етс  верхним пределом, после которого выход сразу уменьшаетс .
Аналогично примерам 3 и 4 пептиды , приведенные в табл. 2, приготавливают из указанных исходных материалов . Эксперименты выполн ют в следующих услови х: 4 мкМ CPD-Y; рН 9,6; 35 С. Концентраци  субстрата приведена в табл. 2.
П р. и м е р 5. Синтез с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты.
Аналогично примерам 3 и 4 пептиды , приведенные в табл.3 приготавли-. вали из указанных исходных материалов . Эксперименты проводили при 35°С, рН 9,6 в присутствии 4,5 мкМ CPD-Y. ..
П р и м е р 6. Синтез с аминокислотными зфирами в качестве аминовой компоненты.
Эксперименты с аминокислотными эфирами провод т так же, как в примерах 1-4: в радиометрическом рН- стате при рН от 9,0 до 9,7 и 23-35 С. Продукты и выход определ ют с помощью HPLC. Концентраци  CPD-Y составл ла от 4,5 до 11 мкМ.
В табл. 4 приведены пептиды, получаемые из указанньпс исходных материалов . Видно, что в отдельных случа х имела место некотора  олигомери- заци . Поскольку выходы обычно очень высоки, то аминокислотные зфиры можно считать пригодными дл  дальнейшего ограничени  олигомеризации.
Пример7.Ь-и D-стереоизо- меры в качестве аминовой компоненты .
Пептиды, приведенные в табл. 5. были получены из исходных продуктов так же, как в примерах 1-4 и 6.
Видно, что включаютс  только L- изомеры, В результате процесс становитс  экономичным,поскольку исключаетс  необходимость очистки исходных аминокислот дл  получени  чистого Ь иэомера.
П р и м е р 8. Изменени  субстратной эфирной группы.
Пептиды, приведенные в табл. 6, были получены из указанных исходных материалов так же, как в примерах 1-4.
Результаты доказывают гибкость предлагаемого способа по отношению к выбору субстратов.
П р и м е р 9. Депсипептиды в качестве субстратов.
Как в примерах 3 и 4, пептиды, приведенные в табл. 7, были получены из указанных исходных материалов Процесс проводили в присутствии 4,5 мкМ CFD-Y при рН 7,6 25°С.
Из табл. 7 видно, что обеспечиваютс  очень высокие выходы.
Пример 10. Пептиды в качестве субстратных компонент.
Пептиды, приведенные в .табл. 8, были получены так же, как в примерах 1-4. Эксперименты проводили в радиометрическом рН-стате; выходы определ ли с помощью HPLC. Посто нно поддеживали следующие параметры: 4-25 мкМ CPD-Y, рН 7,6 при .
Зависимость синтеза пептидов от рН.
В.тех случа х, когда синтезируемы пептиды  вл ютс  неподход гдими субстратами дл  CPD-Y, синтез может выполн тьс  при значени х рН предпоч- тительно 9-10,5.
Пример 11. Так же, как в примерах 1 и 3, пептиды, приведенные в табл. 9, были получены в рН-стате при указанных значени х рН.
Опыты проводили при 25 С в присутствии 15 мкмоль CPD-Y.
Другие аминовые компоненты.
Пример 12. Пептиды, приведенные в табл. 10, были получены так же, как в примерах 3 и 4. Эксперимен ты выполн ли в рН-стате, выходы определ ли с помощью KPLC. Опыты проводили рН 4,5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, .
Пример 13. Синтез пептидов с  чменными карбоксипептидазами.
Прорастающий  чмень, например, в виде солода содержит две различные карбоксипептидазы, обозначаемые СР-1-1 и СР-2-1.
СР-1-1 и СР-2-1 изолировали по методике Рэн; пептиды, приведенные в табл. 11, были получены так же, как в примерах 1-4, из .указ анных исходных материалов. Поддерживали следующие услови : 6 мкМ СР-1-1 или
СР-2-1, рН 8.0. 25°С.
Пример 14. Диамидаци  пептидных амидов при катализе карбоксипеп- тидазой.
К 2 мл раствора 15 мМ Bz-Ala-Leu- NHg в О, М КС1, 1 мМ EDTA (рН 9,7, в 10%-ном диметилформамиде добавл ли 2 мг CPD-Y. Результаты определ ли с помощью HPLC, как в при
10
5
20
5
5
0
0
5
0
5
мере 1. Видно, что Bz-Ala-Leu-NH через 20 мин полностью преобразовывалс  в 68% Bz-Ala-Leu-OH и 32% Bz-Ala-OH. Аминокислотный анализ среды реакции показал, что Bz-Ala-OH образуетс  главным образом в результате отщеплени  Leu-NH от Bz-Ala- Leu-lJH 2.
Пример 15. Сравнение пептидно-эфирных субстратов с И-концевыми защитными группами и без них.
Так же, как в примерах 3 и 4, пептиды , приведенные в табл. 12,были получены в следующих услови х: 50 мМ субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, 25°С.
Пример 16. Синтез в присутствии органических растворителей.
Так же, как в примерах 1-4 и 6, пептиды, приведенные в табл. 13-15. были получены из указанных исходных материалов при указанных концентраци х органических растворителей.
Поддерживали следую1и 1е услови : 50 М.М субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,6,
. .
П р и м е р 17. Нерастворима  (лишенна  подвижности) карбоксипеп- сидаза-Y.
CPD-Y присоедин ли к реактиву Конкавалин-А-Сефароза 4В, выпускаемому фирмой Фармацна Фаин Кеми- калз, после чего формировали перекрестные св зи между CPD-Y и Конка- валином А с глутаральдегидом, как описано Хсиас и Ройером. Концентраци  CPD-Y составила 3 мг на расфасованную Сефарозу.
Пептиды, приведенные в табл. 16, бьши получены так же, как в примерах 1 и 3, при следующих услови х: 50 мМ субстрата, 0,25 мл гел  CPD-Y {5 мкм CPD-Y); рН 9,7; . После удалени  фермента путем фильтрации продукты и выходы определ ли с помощью HPLC.,
Пример 1в. Амиды пептидов в качестве субстратов.
Раствор 5 мл Bz-Ala-Leu-NH в 0,10 М KCL, I мл Е)ТА в присутствии 10%-ного диметилформамида при рН 10,и, 25 С смешивали с 0,25 М вапин- амида.
Реакцию инициировали добавлением 40 мМ CPD-Y и проводили аналогично примерам 3 и 4. Bz-Ala-Leu-Yal-NH вьщел ли методом HPLC с выходом пор дка 65%.
Реакцию повтор ли с использованием Bz-Ala-Flifr-NHj в качестве субстратной компоненты. Bz-Ala-Phe-Yal-NH, выдел ли методом HPLC с выходом по- р дка 44%.
П р и м е р 19. Синтез мет-энке- фалина.
Ступенчатый синтез мет-энкефали- на при использовании в качестве исходного вещества 5 г Bz-Ai-g-Oet и в присутствии CPD-Y в качестве катализатора проводили по следующей схеме: синтез мет-энкефалина с использованием в качестве катализатора CPU-Y; выход дл  каждой стадии приведен в скобках.
Bz-Arg-Oet рН 9,6 ерл-у
I H-Tyr-NH2 BZ-Arg-Tyr-NH (85°/о) рН 9,6СРГНУ
BZ-Arg-Tyr-OH (90%) EtOH/HCl
H-Tyг-Gly-Gl /-Phe-Mel-OH (95%) рН8,0 f Trypsin
Bz-Arg-Tyt -Gly-Gl:y-Pbe-Met-OH(75o/oV. рН9,5 1CPD-Y
IH-Met-OH
Bz-Arg-Tyr-Gly-Gl -Phe-Oel (80Vo) IrtOH/HCl
Bz-Arg-Tyi: -Oei (80% Bz-Arg-T /r-Qiy-Gly-Phe-OH (95%)
pH9,0CPD-ypH9,5 ICPD-y
IH-Gly-OeiB7 .-Arg-Tyr-Gly-Gly-Oet (60%) Bz-Atg-Tyr-Gly-Gly-Phe-iqH2 (65%) CPD-y, pH-8,0
Стадии катализируемой CPD-Y конденсации и деамидировани  проводили в чистой водной фазе, а Bz-Arg был выбран в качестве солюбилизиругощей защитной 1 руппы, котора  может быть удалена на последней стадии с помощью трипсина. После расширени  пептида под воздействием амида амино- кислоты с последующим деамидировани- ем, следующий пептидно-сложноэфирный субстрат синтезировали с помощью аб- салютированного этанола и безводной НС1. Прсле каждой стадии реагенты выдел ли методом препаративной HPLC. Таким способом могут быть также регенерированы избыток ашшной компоненты и побочные продукты гидролиза .
Предлагаемый способ позвол ет уп- ростИть процесс ферментативного получени  пептидов за счет использовани  экзопептида  вместо примен вшихс  ранее ферментов, каждый из которых про вл л доминирующую или по мен шей мере значительную эндопептидазну активность, что позвол ет расширить набор аминньте и субстратных компонент , использовать ферментативный
процесс дл  синтеза многозвенных биологически активных пептидов, Например энкефалина, значительно сократит использование защитных групп, проводить стеноспецифический синтез, снизить расход фермента до концентрации 2-25 мкмоль, проводить процесс в более широком диапазоне рН (7,6-10,5 с получением стабильного высокого выхода целевого продукта.

Claims (3)

1. Способ ферментативного получени  пептидов общей формулы А-В, где A:N - концевой защищенный Ij-аминокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоту на его С-терминальном конце и необ зательно защитную группу на N-терминальном конце, В:Т.1 - аминокислотный остаток, который может быть С-терминально защищен, путем взаимодействи  аминокислотной и субстратной компонент в растворе в присутствии фермента, отличающийс  тем, что.
с целью упрощени  процесса,в качестве субстратной компоненты используют компоненту, выбранную из группы , содержащей сложные эфиры аминокислот , сложные эфиры пептидов и деп- сипептидов формулы A-OR, где значени  А указаны выше, R - С -С«-алкил бензил или альфа-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Phe-, амиды аминокислот или пептидов формулы A-NH, где значени  А указаны выше, пептиды формулы А,-Х, где L-аминокислота или ди-пентапептид, X - L-аминокислота, а в качестве аминной компоненты используют компоненту, выбранную из группы, содержащей аминокислоты общей формулы Н-В-ОН, где значени  Б указаны выше, амиды необ зательно N-замещенной аминокислоты формулы H-E-NHR, где значени  Б указаны вы- Dje, Rj - водород, оксигруппа, ами- но, С -С -алкил, сложные эфиры аминокислоты формулы Н-В-ОН., где значени  Б указаны выше.
Р- 4 - С, -С -ал- кил, и процесс ведут в присутствии L-специфического серин- или тиоалкил Т а б л и ц а 1
Синтез пептидов с катализацией карбоксипептидазой-Y при использовании свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты
Лейцин (0,17 М) Фенилаланин (0,16 М)
Серин (3,2 М) Треонил (0,7 М) Метионин (0,6 М) Лизин (1,5 М) Аргинин (и,8 М)
Аспарагинова  кислота (1,0 М)
0
5
0
5
карбоксипептидазного энзима, который ввод т в реакционную массу в концентрации от 2 до 25 мкмоль, процесс ведут в водном растворе или дисперсии при рН 7,6-10,5, 25-45 0 при исходной концентрации субстратной компоненты 0,01-0,15 моль, аминной компоненты, 0,05-3,000 моль с последующим выделением необ зательно защищенного пептида, после чего в случае необходимости отщепл ют группы R 2 или К с помощью серинкарбокси- пептидазного энзима.
2.Способ по п, I, отличающийс  тем, что в качестве карбоксипептидазного энзима используют карбоксипептидазу-У из дрожжей, карбоксипептидаз или СР-2-1 из проростков  чмен .
3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что используют водный раствор, содержащий 0-20% органического растворител , выбранного из группы, состо щей из низщего ал- ка.нола, диметилформамида или полиэтил енгликол .
24 27
50 24 46 56 26
0
131378785,4
Продолжение табл. 1
Глутаминова  кислота
(1,2М) Bz-ALa-Glu-OHО
Метиловый эфир глутами- . новой кислоты (1,ОМ) Bz-Ala-Glu(OMe)-OH 30
Bz-Ala-OMe Изолейцин (0,15М) Bz-Ala-He-OH40
(50 №М)
Глутамин (0,5 М) Bz-AJ.a-Cln-OH 20
0 трет-бутиловый эфир
аспаргиновой кислоты
(0,3 М)Bz-Ala-Asp/0 U/-OH 30
Триптофан (0,05 М) Bz-Ala-Trp-OH I O Гистидин (1,ОМ) Bz Ala-His-OH15
Z.-Phe-OMe Валин ( М)Z-Phe-Val-OH6
(55 мМ)
Лизин (3,0 М) . Z-Phe-Lys-OH60
(пример 2)
Bz-Phe-Gly-ОМе (30 мМ) Валин (0,6 М)Bz-Phe-Gly-rVal-OH 40
Z-Ala-OMe Глицин (2,0 М) Z-Ala-Gly-OH30
(10 мМ)
Алании (0,7 М) . Z-Ala-Ala-OH60
Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Leu-OH2
Лизин (1,5 М)Z-Ala-Lys-OH 60
Bz-Gly-OMe Глицин (2,0 М) Bz-Gly-Gly-OH63
(20 мМ )
Ac-Phe-OFt . .
(50 мМ) Алании ,(0,8 М) Bz-Phe-Ala-OH85
Z-Ala-Ala- Глицин (2,0 М) Z-Ala-Ala-Gly-OH 40 -ОМе (10 мМ)
Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Ala-Leu-OH О
Фенилаланин (0,15 М) Z-Ala-Ala-Pfte-OH О
Z-Ala-Phe- Глицин (2,0 М) Z-Ala-Phe-Gly-OH 35 -ОМе (10 мМ)
Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Phe-Leu-OH О
Z-Ala-Ser- .
-ОМе (Ю мМ) Лейцин (0,15 М) . Z-Ala-Ser-Leu-OH 40
15
Лейцин (0,15 М)
Лизин (1,5 М) Глицин (2,0 М)
Лейцин {о, 15 Mj Глицин (2,0 М) Лейцин (0,15 М) Глицин (2,0 М) Лейцин (0,15 М) Фенилаланин (0,15 Mj Лизин (1,5 М) Лейцин 0,15 М Лизин ( l ,5 М / Аланин (1,7 М j
Таблица 2
Синтез пептидов при использовании аминокислотных амидов в качестве аминовой компоненты; катализатор - карбоксипептидаза-Y
(пример 4)
Лейцинамид (0,3 М)Bz-Ala-Leu-NH
Метионинамид (0,6 М)
(пример 3), Bz-Ala-Met-NH
Фенилаланинамид (0,3 М) Bz-ALa-Phe-NH
Тирозинамид (0,6 М)Bz-Ala-Tyr-NH Аспарагинамид (0,3 М) Bz-Ala-Asn-NH.
1378785
16
Продолжение табл. I
3
Z-Ala-Val-Cu-OH
Z Ala-Val-Lys-OH
Z-Ala-NLe i-Gly-OH
Z-ALa-NLeu-I eu-OH
Z-ALa-Met-Gly-OH
Z-ALa-Met-Le i-OH
Z-Ala-Trp-Gly-OH
Z Ala-Trp-Leu-OH
Z-Ala-Trp-Phe-OH
Z-Ala-Trp-Lys-OH
Z Ala-Ala-Tj r-Leu-OH
Z-Ala-Ala-Tyr-Lys-OH
Z-Ala-Ala-Tyr-Ala-OH
85
95 90 90. 80
-ОМе (1 О мМ)
Z-Thr-Pro- -ОМе (25 мМ)
Z-Ala-Ala- -Туг-ОМе (10 мМ)
Z-Tyr-Gly- -Gly-OMe (20 мМ)
Валинамид (0,2.М) Глицинамид (О,15 М) Лейцииамид (0,15 М)
Z-Thr-Pro-Val-NHj 95 Z-Ala-Ala-Tyr-Gly-NH .J 100 Z-Ala-Ala-Tyr-Leu-NHj 100
Фенил ал анинамид (0,2 М) Z-l -r-Gly-Gly-Phe-NH 40
Продукт осаждалс .
ТаблицаЗ
Катализированный карбрксипептидазой-Y синтез пептидов с аминокислотными гидраэидами в качестве аминовой компоненты
Вг-А1а-ОМе Аланингидразид (0,6 М) Bz-Ala-Ala-NH-NHg
ФенилаланингиДразид ..
(0,3 М). Bz-Ala-Phe-NH-NH,
Z-Thr-Pro-Val-NHj 95 Z-Ala-Ala-Tyr-Gly-NH .J 100 Z-Ala-Ala-Tyr-Leu-NHj 100
37
80
Таблица 4
Катализированный карбоксипепсидазой-Y синтез пептидов с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты
Глицинпропиловый эфир (0,5 М)
Глицинизопропиловый эфир (0,5 М)
Глицинбутиловый эфир (0,5 М)
Лейцинметиловый эфир
(0,5 М)
Лейцинэтиловый эфир (0,25 М) .
Лейцин 1 бутиловьга эфир (0,25 М)
Фенил аланинметшювый эфир (0,25 М)
Фенилаланинэтиловый эфир (0,15 М)
Метиловый эфир (t-Bu) глутаминовой кислоты (0,5 М)
(if-t-Bu) t-бутиловый эфир глутаминовой кислоты (0,25 М)
Метионинметиловый эфи .( 0,2 М)
Метионинэтиловый эфир (0,2 М)
Bz-Ala-Gly-OH
Bz,-Ala-Gly-OH
Bz-Ala Gly-OH
Bz-Ala--Leu-OH Bz Ala Leu-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Leu-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu- -OH
Bz-Ala-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Iieu-OH 50
Bz-AJ-a-Leu-OHО
Bz-Ala-Phe-OH
Bz-Ala-Phe-Phe-OH 80 Bz-Ala-Phe-Phe-Phe-OH
Bz-Ala-Phe-OH Bz-Ala Phe-Phe-OH
70
Bz-Ala-Glu(-t-Bu)-OH 35
Bz-Ala-Glu(-t-Bu)-OH О
Bz-Ala-Met-OH Bz-Aba-Met-Met-ОН Bz-Ala Met-Met-Met-OH Bz-Ala-Met-Met-Met-Met OH
Bz-Ala-Met-OH40
c-Phe-OEt 50 мМ)
z-Gly-OMe 50 мМ)
Me тиониниз опропиловый эфир (0,2 М)
Валинметиловый эфир (0.7 М)
Серинметиловый эфир (0,5 М)
Тирозинметиловый эфир (0,5 М)
Аргининметиповьй эЛир (И,5 М)
Аргинин (NOj) метиловый эфир (0,5 к)
Гистидинметиловый эфир (0,5 М)
Треонинметиловый эфир
(0,5 М)
Аланинметиловый эАир (0,5 М)
Bz-Ala-Met-OH
Bz-Ala-Val-OH Bz-Ala-Val-Va
Bz-Ala-Ser-OH
Bz-Ala-Tyr-OH
Bz-Ala-Arg-OH
Br-Ala-Arg(NO.
Bz-Ala-His-OH
Bz-Ala-Thr-OH
Ac-Fne-Ala-OH Ac-Phe-Ala-Ala
Гистидинметиловый эфир Bz-Gly-His-OH
Таблица 5
Катализированный карбоксипёптндазой-Y синтез пептидов с L- и D- изомерами в качестве аминовой компоненты
Bz-Ala-Met-OH
Bz-Ala-Val-OH Bz-Ala-Val-ValBz-Ala-Ser-OH
Bz-Ala-Tyr-OH
Bz-Ala-Arg-OH
Br-Ala-Arg(NO. )-OH
Bz-Ala-His-OH
Bz-Ala-Thr-OH
Ac-Fne-Ala-OH Ac-Phe-Ala-Ala-OH
Bz-Gly-His-OH
Таблица 6
Выход { в % ) в синтезе пептидов с использованием различных эфирных групп в качестве субстратных компонентов при катализе карбоксипептидазой-Y
Таблица 7
Катализированный карбоксипептидазол-Y синтез с депсипептидами в качестве субстратных компонент.
Таблица 8
Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при использовании пептидов в качестве субстратов
Глицинамид f1,3 М)
Таблица 10
Катализированный карбоксипептидазой-У синтез пептидов при различных аминокислотных производных в качестве аминовой компоненты
-Аланинамид (0,2 М)
Глицингидроксаминова  кислота (0,2 М)
D,Б-аланингидроксами- нова  кислота (0,2 М)
Глицин ti -метиламид (0,50 М)
Таблица
Синтез пептидов с использованием карбоксипептидаз из проростков  чмен 
СР-1- или СР-2-1
NK5 ,0 9,5 9,0
5 77 95
8,0 100 7,0 97 6,0 44
Bz-Ala-Ala-NHj 80
Bz-Ala-Gly-NH-OH 75
Bz-Ala-Ala-NH-OH 50
Bz-Ala-Gly-NH-CH;| 20
31137878532
Таблица 12
Сравнение катализируемого карбоксипептидезой-У синтеза пептидов при использовании в качестве субстратов пептидных эфиров с N-концевыми защитными группами и без них
Аминова  компонента (концентраци )
Лейцинамид (0,15 М) Лейцинамид (0,15 М)
Таблица 13
Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов при использовании 50 мМ Bz-Ala-OMe в качестве субстрата и свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты при наличии и отсутствии 20% метанола (МеОН) в 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA
Продукт
Выход,
%
Ас-А1а-А1а-А1а- -Leu-NHj90
Ala-Ala-Ala-Leu- -NH ,
75
Таблица 14
Катализированный карбоксипептидаэой-Y синтез Bz-Alk-Tlir-OH из В7. (50 мМ) и треонина при различных концентраци х полизтиленгликол -300 (PEG-300). Услови : CPD-Y 4 мкМ; рН 9,6; 25 с
О
10 20 30 40
Таблица 15
Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов из 50 мМ Bz-A.a-OMe и указанных аминокислотных эфиров в качестве аминовой компоненты в 3%-ном полизтиленгликоле. О , 1 М КС1, 1 мМ E1DTA Другие услови : CPD-Y 8 мкМ; рН9,6; 25°С
Глутаминова  кислота Bz-Ala-Gly-OH (-OBut)-OMe (0,5 М) (jf-OBut )-ОН
Фенилаланин-ОМе (0,5 М)
L-Метионин-ОМе (0,5 М)
D-Метионин-ОМе (0,5 M)
36 34 31 29 28
38
Bz-Ala-Phe-OH Вг-Ala-Phe-Phe-OH
Bz-Ala-Met-ОН Bz-Ala-Met- blet-OH
Bz-Ala-Met-Met-Met
Bz-Ala-D-Met-OH
Таблица 16,
Катализируемые нерастворимой карбоксипептидазой-Y синтезы
пептидов .
Bz-Ala-OMe Фенилаланин (0,15 М) Bz-Ala-Phe 21 (50 мМ) . ,
. Лейцинамид (0,2 М) Bz-Ala-Leu-NH. 91
SU803217951A 1979-04-06 1980-12-05 Способ ферментативного получени пептидов SU1378785A3 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK144379 1979-04-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1378785A3 true SU1378785A3 (ru) 1988-02-28

Family

ID=8104890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU803217951A SU1378785A3 (ru) 1979-04-06 1980-12-05 Способ ферментативного получени пептидов

Country Status (18)

Country Link
US (2) US4339534A (ru)
EP (1) EP0017485B1 (ru)
JP (1) JPS6339237B2 (ru)
AT (1) ATE9595T1 (ru)
AU (1) AU545416B2 (ru)
BR (1) BR8008024A (ru)
CA (1) CA1160973A (ru)
CS (1) CS254954B2 (ru)
DE (1) DE3069259D1 (ru)
FI (1) FI70597C (ru)
HU (1) HU186734B (ru)
IE (1) IE50256B1 (ru)
IL (1) IL59776A (ru)
NZ (1) NZ193375A (ru)
RO (1) RO80806A (ru)
SU (1) SU1378785A3 (ru)
WO (1) WO1980002157A1 (ru)
ZA (1) ZA801929B (ru)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
WO1982004069A1 (en) * 1981-05-20 1982-11-25 Andresen Finn Hede A process for the preparation of insulin derivatives
WO1983001074A1 (en) * 1981-09-15 1983-03-31 Andresen, Finn, Hede Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof
DK149824C (da) * 1982-01-22 1987-03-16 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner
WO1983002772A1 (en) * 1982-02-08 1983-08-18 Robin Ewart Offord An improved method for preparing human insulin from non-human insulin
JPS59112952A (ja) * 1982-12-21 1984-06-29 Taisho Pharmaceut Co Ltd ペプチド誘導体
GB8430255D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Erba Farmitalia Biologically active oligopeptides
FR2584077B1 (fr) * 1985-06-28 1988-07-08 Irceba L-di ou tripeptides possedant une activite biologique utilisable en medecine humaine et veterinaire, procede pour leur obtention et medicament en contenant
JPH01501995A (ja) * 1986-04-10 1989-07-13 コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション 酵素合成方法
US4935355A (en) * 1986-04-15 1990-06-19 Synthetech, Inc. Preparation of dipeptides
US5350681A (en) * 1986-08-18 1994-09-27 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides
US5202235A (en) * 1986-08-18 1993-04-13 The Coca-Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
US5336601A (en) * 1986-08-18 1994-08-09 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the snythesis and separation of peptides
US5002871A (en) * 1986-08-18 1991-03-26 The Coca-Cola Company Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides
US5037741A (en) * 1986-08-18 1991-08-06 The Coca Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
DK72587D0 (da) * 1987-02-13 1987-02-13 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider
US4892820A (en) * 1987-06-10 1990-01-09 The Nutrasweet Company Solvent system for enzymatic coupling process
US5268267A (en) * 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
DE3733198A1 (de) * 1987-10-01 1989-04-13 Kernforschungsanlage Juelich Enzymatisches verfahren zur herstellung von dipeptiden
DE3741515A1 (de) * 1987-12-08 1989-06-22 Degussa Verfahren zur herstellung von dipeptiden
DK15888D0 (da) * 1988-01-14 1988-01-14 Carlsberg Biotechnology Ltd Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af immunmodulerende pentapeptider samt mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden
DE3803124A1 (de) * 1988-02-03 1989-08-10 Degussa Verfahren zur enzymatischen peptidsynthese
DE68924196T2 (de) * 1988-06-03 1996-05-09 Sharp Kk Elektronische Anordnung mit einer Kalenderfunktion.
DK163435C (da) * 1988-08-12 1992-07-20 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf
US5002872A (en) * 1989-05-10 1991-03-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Enzyme mediated coupling reactions
US5300437A (en) * 1989-06-22 1994-04-05 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US4950606A (en) * 1989-06-22 1990-08-21 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US5169780A (en) * 1989-06-22 1992-12-08 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
US5279954A (en) * 1989-06-30 1994-01-18 Board Of Regents Of The University Of Nebraska And Bionebraska Exopeptidase catalyzed site-specific bonding of supports, labels and bioactive agents to proteins
US5366862A (en) * 1990-02-14 1994-11-22 Receptor Laboratories, Inc. Method for generating and screening useful peptides
DE4014564C1 (ru) * 1990-05-07 1991-07-18 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
DK133990D0 (da) * 1990-05-30 1990-05-30 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af growth hormone releasing factor (grf) og peptider anvendelige som mellemprodukter ved fremgangsmaaden
DK220890D0 (da) * 1990-09-14 1990-09-14 Ole Buchardt Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider
US5580751A (en) * 1990-09-14 1996-12-03 Carlsberg A/S Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
KR930002966B1 (ko) * 1990-11-24 1993-04-16 주식회사 미 원 디펩티드의 제조방법
CA2115159A1 (en) * 1991-08-08 1993-02-09 Jeffrey A. Bibbs Production of peptide amides
DE59205565D1 (de) * 1991-10-07 1996-04-11 Hoechst Ag Carbonsäureester-Schutzgruppen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Kopplung an eine funktionelle Gruppe sowie ihre Verwendung
EP0566824A1 (en) * 1992-01-28 1993-10-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic peptide synthesis
US5356805A (en) * 1992-03-03 1994-10-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Gamma-polyglutamate hydrolase
FR2721030B1 (fr) * 1994-06-09 1996-08-30 Pasteur Institut Composés modifiant la transmission sérotoninergique; applications diagnostiques et thérapeutiques.
ATE211483T1 (de) 1993-10-04 2002-01-15 Pasteur Institut Verbindungen, die die serotoninerge übertragung beeinflussen; ihre diagnostischen und therapeutischen anwendungen
US6187579B1 (en) * 1993-10-28 2001-02-13 Carlsberg A/S Customized proteases
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
US5585359A (en) * 1994-09-29 1996-12-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU4415796A (en) * 1994-12-07 1996-06-26 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
JPH11505522A (ja) * 1995-04-21 1999-05-21 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト エンドセリン阻害剤としてのｎ−アロイルアミノ酸アミド
US5985627A (en) * 1997-02-28 1999-11-16 Carlsberg Laboratory Modified carboxypeptidase
NL1006069C2 (nl) * 1997-05-16 1998-11-17 Dsm Nv Werkwijze voor de bereiding van peptiden.
WO2000027800A1 (en) * 1998-11-09 2000-05-18 Smithkline Beecham Corporation Ccr-3 receptor antagonists
US20030060413A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-27 Zimmer Robert H. Derivatives of pseudo-peptides, their preparation and their biological uses
US7671029B2 (en) 1999-08-06 2010-03-02 Immupharma Sa Compositions and methods for enhanced pharmacological activity of compositions comprising peptide drug substances
US6908900B2 (en) * 2001-01-17 2005-06-21 Zimmer & Associates Ag Compositions and methods for enhanced pharmacological activity through oral and parenteral administration of compositions comprising polypeptide drug substances and other poorly absorbed active ingredients
US6624147B1 (en) * 1999-09-28 2003-09-23 Rijksuniversiteit Leiden Inhibitors of prenylated pyrophosphate consuming enzymes
US6939693B2 (en) * 1999-10-29 2005-09-06 Novus International, Inc. Enantioselective oligomerization of α-hydroxy carboxylic acids and α-amino acids
US6605590B1 (en) 1999-10-29 2003-08-12 Novus International, Inc. Oligomers and oligomeric segments of alpha-hydroxy carboxylic acids and alpha-amino acids
PT2308874E (pt) 2005-12-07 2013-04-26 Basilea Pharmaceutica Ag Monobactamas ligadas por pontes, úteis como inibidores de beta-lactamase
CN103073618A (zh) * 2013-01-15 2013-05-01 吉尔生化（上海）有限公司 一种苄氧羰基丙氨酰丙氨酸的制备方法
AU2017246706B2 (en) 2016-04-04 2020-09-17 Research Triangle Institute Neuropeptide s receptor (NPSR) agonists
CN107936089B (zh) * 2017-11-07 2021-01-29 重庆大学 一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3276961A (en) * 1963-04-08 1966-10-04 Squibb & Sons Inc Process for preparing human insulin
US3972773A (en) * 1975-04-29 1976-08-03 Sagami Chemical Research Center Process for producing peptide
US4119493A (en) * 1975-10-23 1978-10-10 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4116768A (en) * 1975-04-29 1978-09-26 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4086136A (en) * 1975-10-23 1978-04-25 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase
JPS5411294A (en) * 1977-05-23 1979-01-27 Toyo Soda Mfg Co Ltd Recovery of protease
JPS5411293A (en) * 1977-05-23 1979-01-27 Toyo Soda Mfg Co Ltd Recovery of protease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isova j., Omor М. Syntes of peptiols with proteolitic enzyms.- Bull. Chem. Soc., Japan, 1977, 30, .2762-65. Патент GB IP 1533129, кп. С 07 С I03/52j опублик. 1978. *

Also Published As

Publication number Publication date
US4806473A (en) 1989-02-21
ZA801929B (en) 1981-11-25
IL59776A (en) 1985-01-31
JPS56500519A (ru) 1981-04-23
FI70597C (fi) 1986-09-24
NZ193375A (en) 1983-06-14
EP0017485B1 (en) 1984-09-26
IE800694L (en) 1980-10-06
RO80806A (ro) 1983-02-01
US4339534A (en) 1982-07-13
AU545416B2 (en) 1985-07-11
FI70597B (fi) 1986-06-06
WO1980002157A1 (en) 1980-10-16
FI801035A (fi) 1980-10-07
IE50256B1 (en) 1986-03-19
DE3069259D1 (en) 1984-10-31
HU186734B (en) 1985-09-30
CS239980A2 (en) 1987-07-16
AU5981580A (en) 1980-10-22
IL59776A0 (en) 1980-06-30
ATE9595T1 (de) 1984-10-15
EP0017485A1 (en) 1980-10-15
CA1160973A (en) 1984-01-24
CS254954B2 (en) 1988-02-15
BR8008024A (pt) 1981-03-31
JPS6339237B2 (ru) 1988-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1378785A3 (ru) Способ ферментативного получени пептидов
US4256836A (en) Addition compound of dipeptide derivative and amino acid derivative
US4119493A (en) Process for producing a peptide
US5304470A (en) Process for the enzymatic preparation of protected and unprotected di- and oligopeptides in aqueous solutions
US4116768A (en) Process for producing a peptide
EP0278787B1 (en) A process for enzymatic production of dipeptides
CA1059051A (en) Process for producing a peptide
EP0359399B1 (en) Process for the enzymatic production of dipeptides
Kaptein et al. Enantiopure Cα-tetrasubstituted α-amino acids. Chemo-enzymatic synthesis and application to turn-forming peptides
JP2012509089A (ja) 酵素的活性化およびカップリングを使用したペプチド合成
Pellegrini et al. Pepsin‐catalyzed peptide synthesis
Davies et al. Chiral analysis of the reaction stages in the Edman method for sequencing peptides
JPH06510281A (ja) ペプチドアミドの製造
EP0324659B1 (en) Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process
Kuhl et al. On the use of carboxamidomethyl esters in the protease-catalyzed peptide synthesis
JPS625994A (ja) リジン誘導体の製造法
Kise et al. Enantiospecificity of. ALPHA.-Chymotrypsin at S'1 Site for Peptide Synthesis in Aqueous-Organic Media.
CA1177429A (en) Process for enzymatic production of peptides
Lee et al. PEG-papain catalyzed synthesis of a kyotorphin derivative in aqueous organic media
JPS58209991A (ja) ペプチド又はペプチド誘導体の合成法
Itoh et al. Methyltrypsin-catalyzed peptide coupling: comparison of alkyl ester and guanidinophenyl ester derivatives as acyl donor component
JPS5834120B2 (ja) ペプチドの製造方法
KR20030002010A (ko) 물-혼합성 유기용매 단일계에서 단백질 가수분해효소를이용한 엔케팔린 제조방법
EP0303602A1 (en) Enzymatic synthesis
NO157706B (no) Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider.