JPS58209991A - ペプチド又はペプチド誘導体の合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規な合成法
に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在することが相つ
いで知られ、治療、妙所などの医薬品としての重要性並
びに呈味物質としての重要性がますます増大しつつある
。それに伴いペプチド合成法の開発も活発である。現在
までに知られているペプチド合成法の主なものとしては
１例えばファルマシア、レビュー、３号、２７−４７頁
（１９８０年）にまとめられているように、化学合成法
と酵素法の二つに大別することができる。その化学合成
法としては、アジド法、混合酸無水物法、活性エステル
法、゛カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に縮合する
方法とフラグメントで縮合させる方法などが代表的なも
のであるが、これらどの化学合成法においても、ラセミ
化及び副反応が起きやすく反応時間が長く、末端アミノ
基を保護基にて反応前にあらかじめ保護しておく必要が
あるなど種々の問題がある。フラグメント縮合法の場合
。

特にラセミ化が起りやすいという重大な欠点を有するも
のである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法としてプロテア
ーゼを用いる酵素法が提案されているがこの方法におい
てもやはり２反応時間が長く、末端アミノ基を保護基に
て保護しておく必要があるなど操作の煩雑さを改良する
には至らなかった。

さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では。

用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有しているため、
′生じたペプチドが合成と併行して分解され。

しばしば目的のペプチドが得られないという重大な欠点
を示すものであった。特に、オリゴペプチドの合成に適
用した場合には、一部のアミノ酸が欠落した目的外のペ
プチドが得られる重大な欠点が指摘されている（ジャー
ナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー誌、２５６
巻、　１３０１頁（１９８１年）。また、酵素法による
ペプチド合成法としては、プロテアーゼ法の他に、特定
なアミノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種の酵素
としては１例えばグルタミン酸／システィン／グリシン
の配列であるトリペプチドを合成するグルタチオン合成
酵素（特開昭５４−１２２７９３号公報。）やデカペプ
チドであるグラミシジンＳを合成するグラミシジンＳ合
成酵素（現代化学１９７４年１２月号１２頁）などが報
告されている。しかし、これらの酵素は特殊な酵素であ
って、この酵素によって合成しうるペプチドは、限定さ
れた一種のみのペプチドであり、目的とする任意なペプ
チドを合成することができない。このため、この方法は
一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが現状である
。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記のような
欠点、特にラセミ化、副反応の生起２反応の煩雑さ等の
原因となり、同時に経済性を損う保護基の必要性を解決
し、汎用性のある新規なペプチド合成法を提供すること
を目的として鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の
一種であるｔＲＮＡに結合させる作用を有する酵素で、
従来全くペプチド結合を形成する作用が知られていなか
ったアミノアシル−ｔｌ？Ｎ八シンへターゼに驚くべき
ことに、ペプチド合成能があることを見い出し、この酵
素を縮合剤として用いると、前記の目的がすべて達成さ
れることを見い出し、先に特許出願した（特願昭５７−
１０３３６号）。しかし、この方法は良好な収率で目的
物を得るには、ペプチド又はペプチド誘導体の原料であ
る。高価なアミノ酸誘導体を高濃度で反応系に加えてお
り、コストが高くなる傾向があった。また１反応後１反
応液から合成されたペプチド又はペプチド誘導体を分離
、精製することが煩雑となる場合もあり、改良が望まれ
ていた。

そこで１本発明者らは上記の点を改良するためにさらに
鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに親水性有機溶媒
を反応系に加えると、原料のアミノ酸誘導体の濃度を下
げても良好な収率でペプチド又はペプチド誘導体の合成
が可能になることを見い出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明はアミノ酸からペプチド又はペプチド
誘導体を合成するに際し１反応系に親水性有機溶媒を存
在させ、かつ縮合剤としてアミノアシル−ｔＲＮＡシン
テターゼを用いることを特徴とするペプチド又はペプチ
ド誘導体の合成法である。

本発明の特徴とするところは酵素法によるペプチド合成
法において２反応系に親水性有機溶媒を存在させ、かつ
縮合剤としてアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを用
いることにより、アミノ基を保護することなく、ペプチ
ド又はペプチド誘導体を高収率で合成することにある。

本発明に使用されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテター
ゼは、酵素分類８．１．１に属し１次式アミノ酸十　八
ＴＰ＋　ｔＲＮ八→へミノアシル−ｔｌ？Ｎ八十八へＰ
へピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり２例えば、ウサギ。

ウマ、ウシ、ラット、ニワトリ、ヘビなどの動物。

組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなどの植物
組織より得られるもの、カビ、酵母、キノコ、細菌、放
線菌などの微生物及び藻類より得られるものなどがあげ
られる。なかでも、酵素の取得が容易であることから、
微生物より得られるものが好ましく、さらに酵素の安定
性からバチルス・ステアロサーモフィルス、サーマス・
サーモフィルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマスマグアティカスなどの
耐熱性細菌より得られるアミノアシル−１ＲＮΔシンテ
ターゼが最適である。

これらの各種アミノアシル−ｔＲＮ＾シンテターゼは、
上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイノミル等で破
砕したのち１例えばバイオケミストリー誌、１３巻、　
２３０７頁（１９７４年）に記載されているようにＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムクロマｉ・グラフ６− イー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
などのクロマトグラフィー及び硫酸アンモニウムによる
分別沈殿法など通品の酵素楕製法を用いて、精製するこ
とによって得ることができる。

アミノアシル−ｔＲＮΔシンテターゼは１種々のα−ア
ミノ酸に特異性のあるものが用いられ２例えばチロシン
に特異性のあるものとしては、チロシル−ｔＲＮＡシン
テターセが、またロイシンに特異性のあるものとしては
、ロイシル−ｔＲＮ八シへテターゼが、さらにバリンに
特異性のあるものとしては。

ハリル−ｔＲＮへシンテターゼ、その他イソロシル−ｔ
ＲＮへシンテターゼ、フェニルアラニル−テクーゼ，ア
ラニル−ｔＲＮ八シンテターゼ、グルクミル− シンテターゼ、メチオニル−ｔＲＮΔシンテターゼ。

ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ、リジル−ｔｌ’ｉ
Ｎ八シンテへーゼ、トレオニルーｔＲＮＡシンテターゼ
、セリル−ＬＲＮＡシンテターゼ、などが具体例として
あげられる。

本発明に使用される親水性有機溶媒としては。

例えば、メタノール、エタノール、グリセリン。

エチレングリコール、１．４−フタンジオールなどのよ
うなアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフランなど
のようなエーテル、ジメチルスルボキシド．ジメチルボ
ルムアミド、アセトニトリルアセトンなどがあげられ，
特にグリセリンが，酵素の安定性にもよい結果が得られ
るなどの理由で最も好ましく用いられる。また、反応液
全体に占める親水性有機溶媒の容積の濃度としては，０
．５ないし８５％，好ましくは５ないし６０％．最適に
は■０ないし５０％の範囲である。さらに親水性有機溶
媒は，ペプチド化反応詩に存在すればよいのであって，
その添加時期はいつであってもかまわない。

以下，アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導体を合成
する本発明の方法を具体的に説明する。

本発明によれば，アミノ酸とアミノ酸から誘導されるア
ミノ酸誘導体とをアミノアシル−ｔＲＮ八シへテターゼ
及び親水性有機溶媒の存在下で反応させることによって
ペプチド又はペプチド誘導体を合成することができる。

さらに本発明によれば，あらかじめアミノ酸とアミノア
シル−ｔＲＮ八シへテタ−セとを反応させて反応混合物
を得，次いで得られた反応混合物とアミノ酸誘導体及び
親水性有機溶媒とを反応させることによってペプチド又
はペプチド誘導体を合成することができる。このアミノ
アシル−ｔＲＮＡシンテターゼとあらかじめ反応させる
のに好ましく用いられるアミノ酸としては。

例えばチ１コシル，アラニン、ロイシン、イソロイシン
、フェニルアラニン、メチオニン、リジン。

セリン、バリンなどのα−アミノ酸があげられ。

■，体，Ｄ体のいずれでもよい。また、上記反応に好ま
しく用いられるアミノ酸誘導体としては，例えは、グリ
シン、アラニン、ロイシン、インロイシン、フェニルア
ラニン、グルタミン酸，クルクミン。ノルロイシン、シ
スティン、チロシン、アルギニン、バリン、リジン、ヒ
スチジン、アスパラギン酸．アスパラギン、メチオニン
、］・リプトファン，トレオニンなどのα−アミノ酸，
β−アラニン、β−アミノイソ酪酸などのβ−アミノ酸
。

　９　− クレアチンなどの含窒素γーアミノ酸，ピペリジン酸な
どのγーアミノ酸，εーアミノカプロン酸などのε−ア
ミノ酸などの各種アミノ酸のエステル、チオエステル、
アミド、ヒドロキサミドなどがあげられるが，アミノ基
が遊離の形であるアミノ酸誘導体であれば，上記例示化
合物に限定されるものではない。そのエステルとしては
，例えばメチル、エチル、プロピル、シクロヘキシル、
フェニル、ベンジルなどの単純な炭化水素系のエステル
から，　　ＬＲＮＡの３’−〇Ｈで上記アミノ酸がエス
テル化したものまで，種々のエステルを用いることがで
きる。また、アミドとしては，遊離のアミドの他，例え
ば異種あるいは同種のアミノ酸がアミド結合したオリゴ
ペプチドやポリペプチドを用いることもできる。このオ
リゴペプチドやポリペプチドがさらにエステル、チオエ
ステル、ヒドロキサミド、エーテル化したものを用いる
ことも可能である。また、上記アミノ酸誘導体は水溶液
の状態で用いるか，あるいは固体のまま用いても　　　
　　　′よい。

＝１０− 次に反応混合物を得るには１例えばｐＨ５ないしｐＨｉ
　１好ましくはｐＨ６ないしｐＨ１０，最適にはｐＨ７
ないしｐＨ１０のｖｉ衝液液中アデノシン二リン酸又は
デオキシアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸とアミ
ノアシル−ｔＲＮ＾シンテターゼと混合することによっ
て行えばよい。そのときの反応の温度としては、酵素活
性を維持する観点から一般に０℃から７０℃が好ましく
、最適には０℃から３０℃で行われる。また、そのとき
に用いられる緩衝液としては、アミノ酸、アデノシン三
すン酸、デオキシアデノシン三リン酸及びアミノアシル
−ｔＲＮＡシンテターゼが熔解し、所望のｐＨが得られ
るものであれば、いかなるものを使用してもよい。例え
ば、トリス塩酸緩衝液、ヘペスｗｋ衝液、トリエタノー
ルアミン緩衝液、マレート緩衝液、リン酸緩衝液などが
あげられる。さらに反応を円滑に進行させ、！素の失活
を防ぐことを主目的として１反応系にマグネシウム、マ
ンガンなどの二価カチオン、メルカプトエタノール。

ジチオスレイトールなどのスルフヒドリル化剤。

ピロフォスファターゼを単独又は混合して添加してもよ
い。各添加剤の好適な濃度としては、二価カチオン０．
０１ｍ　Ｍ〜５００ｍ　Ｍ　、スルフヒドリル化剤０．
００１ｍ　Ｍ　〜１００ｍ　Ｍ　、ピロホスファターゼ
０．００１ユニツト≠ 最適な濃度としては、それぞれ、二価カチオン０．１ｍ
Ｍ〜１０ｍＭ、スルフヒドリル化剤０．０１ｍ　Ｍ〜１
ｍＭ、　ピロホスファターゼ１ユニツト／ｍｌ〜１０ユ
ニット／ｍｌである。また、アミノ酸、アミノアシル−
ｔＲＮＡシンテターゼ及びアデノシン三リン酸又はデオ
キシアデノシン三リン酸の使用量は特に制限されないが
、実用的な収量を得るためには、アミノ酸とアミノアシ
ル−ｔＲＮＡシンテターゼのモル比を１：１〜１ｒｉｏ
、アミノ酸とアデノシン三リン酸又はデオキシアデノシ
ン三リン酸とのモル比を１：１０〜１　：　１００の範
囲内で行うのが好ましい。前記の条件で反応を実施する
と１反応は円滑に進行し、数秒から３０分以内に完結す
る。

次いで、上記のようにして得られた反応混合物とアミノ
＠誘導体及び親水性有機溶媒とを混合して反応させるこ
とにより目的のペプチド又はペプチド誘導体を得ること
ができる。（この段階を以後ペプチド化と称する。）こ
のときに用いる反応混合物は、そのままペプチド化反応
に用いることもできるが、Ｇ−２５（ファルマシア社製
）Ｇ−７５（ファルマシア社製）などのゲルクロマトグ
ラフィーを行うことによって２反応後に混在するアデノ
シン三すン酸、アデノシンーリン酸あるいはピロリン酸
等を除去して用いることもできる。

また、ペプチド化反応の温度としては、０℃から７０℃
が好ましく、酵素の失活防止と適正な反応速度を得ると
いう観点から、ｉｏ”ｃがら５０℃。

特に２０℃から４０℃で行うことが好まし−い。

ｐ）（とじては、既出の各種緩衝液等を用いて、５ない
し１１好ましくは６ないし１０．最適には）ないし９で
行えばよい。

反応混合物とアミノ酸誘導体との混合比として例えば、
容量で１：０．１〜１　：　１００の範囲で行えばよい
。また、この時用いるアミノ酸誘導体の濃１３一 度としては１０ｍＭからＩＯＭの範囲であるが。

これをさらに低くして用いることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結し、目的
のペプチド又はペプチド誘導体を得ることができる。

本発明によって得られるペプチド誘導体は１例えば血圧
降下作用等のあるブラジキニンや内・外分泌抑制作用等
のあるソマトスタチンなどの各種ホルモン及び抗生物質
ペプチド、呈味ペプチドのような他の生物学的活性物質
として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチド誘導体
を保護基を用いることなく、低濃度の原料を使用しても
製造することができるので、製造コストも安価である。

以下本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１，２ バチルス・ステアロサーモフィルスよりバイオケミスト
リー誌、１３巻、　２３０７頁（１９７４年）記載の方
法に従い精製されたチロシンに特異的なチロシル−ｔＲ
ＮＡシンテターゼ０．４ｇ　、塩化マグネシウ１４− ム０．４ｇ、アデノシン三リン酸０．１ｇ、　　Ｌ−チ
ロシンｉ　ｎ＋ｇ、ピロホスファターゼ（ベーリンガー
・マンハイム社製）２００ユニツト及びジチオスレイト
ール０．０１ｍｇを１４０ｍ１の２０ｍＭヘペス緩衝液
ｐＨ８，０に溶解し、４℃で１５分間反応させて反応混
合物を得た。得られた反応混合物にＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステル０．４ｇ及びグリセリン６０ｍ１（３
０容量％）を加え、よく混合し９反応塩度を３０℃に保
って１日放置して反応させた。

次いで得られた反応液にアセトン２００ｍ１を加え沈殿
を濾別後、上演をエバポレーク−にて約２０ｍ１に濃縮
し、ボンダパックＣ＋ｇカラム（ウォーターズ社製）に
供し、アセトニトリル１５０ｍＭリン酸カリ水溶液、８
５／１５．ｐＨ７を展開溶媒として用いて分離し、Ｌ−
チロシル−し−フェニルアラニンメチルエステルを０．
４ｍｇ得た。

その元素分析（Ｃ＋＊　Ｈ□Ｎ、　　０．　　＝　３４
２．３９）は。

計算値（％）　　Ｃ＝６６．６５　　８＝　　６．４８
Ｎ＝　　８．１８ 測定値（％）　　Ｃ＝６６．４８　　　Ｈ＝　　６．５
２Ｎ＝　　８．５２ であった。

また、比較（比較例１）のため、２０ｍＭヘペス緩衝液
を２００ｍ１．　　Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルを４ｇ使用して、グリセリンを共存させなかったほか
は実施例１と全く同様に行った。

その結果、Ｌ−チロシル−し−フェニルアラニンメチル
エステルの収量は０．４＋ｎｇであり、実施例１の収量
と同じであった。この比較例１で用いたし一フェニルア
ラニンメチルエステル４ｇであるのに対し、実施例１で
はその青の０．４ｇでよかった。

さらに比較（比較例２）のため、２０ｍＭヘペス緩衝液
を２００ｍ　ｌ使用して、グリセリンを共存させなかっ
たほかは実施例１と全く同様に行っ°た。

その結果、Ｌ−チロシル−し−フェニルアラニンメチル
エステルの収量は０．１ｍｇであり、実施例１の収量の
１であった。

実施例２．比較例３，４ 実施例１で用いたチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ４ｇ
、塩化マグネシウム５０　ｍｇ、アデノシン三リンｆｐ
　２００Ｂ、　　Ｌ−チロシン９　ｍｇ、　　ピロホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）２００ユニ
ツト及びジチオスレイトール０．ｏｉｍｇを２０ｍ１の
１０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ８，５に熔解し、４°Ｃで２
００分間反応せたのち２反応混合物をＧ−７５（ファル
マシア社製）カラムに供し、同上へベス緩衝液にて溶出
し、ボイド容の両分３Ｑｍｌを集め反応混合物を単離し
た。単離した反応混合物にＤ−ロイシンエチルエステル
０．５ｇ及びグリセリン５ｍ１（１４容量％）を加え、
よく混合し１反応塩度を２０℃に保って３００分間反応
せた。

次いで得られた反応液をそのままボンダバックＣｐｓカ
ラムに供し、実施例１と同様に分離して。

Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチルエステル１５ｍｇを
得た。

その元素分析（Ｃ１０Ｈｚｓ　Ｎ２　０４　　＝　３２
２．３９）は計算値（％）　　Ｃ＝６３．３３　　　Ｈ
＝　　８．１３Ｎ＝　　８．６９ 測定値（％）　　Ｃ＝６３．３０　　　Ｈ＝　　８．０
８Ｎ＝　　８．７５ １７− であった。

次に比較（比較例３）のため、Ｄ−ロイシンエチルエス
テルを４ｇ使用して、グリセリンを共存させなかったほ
かは実施例２と全く同様に行った。

その結Ｌ　　Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチルエステ
ルの収量は１６Ｂであった。

また、比較（比較例４）のため、グリセリンを共存させ
なかったほかは、実施例２と全く同様に行った。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチルエステル
の収量は５ｍｇであった。

実施例３，４．比較例５ パン酵母よりジャーナル・オブ・バイオケミストリー誌
、６３巻、４３４頁（１９６８年）記載の方法に従って
調製したチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ２０　ｍｇ、
塩化マグネシウム２０　ｍｇ、アデノシン三リンｒ！１
５ｍｇ、Ｄ−チロシン０．１ｍｇ、　ピロホスファター
ゼ（ペーリンガーマンハイム社製）１０ユニツト及びメ
ルカプトエタノール２０μｍを２０ｍ１の３　Ｑ　ｍＭ
　２．５−ジメチルイミダゾール緩衝液ｐＨ１８− ９に加えて、実施例２と同様に反応したのち、実施例２
と同様に反応混合物を単離し、これにＬ−ロイシンエチ
ルエステル０．１ｇ及びグリセリン１０ｍ１（２５容量
％）加えて２０℃で５時間反応した。得られた反応物に
ア七トン２０ｍ１を加え生じた沈殿を濾別し、エバポレ
ーターにて約１０ｍ１に濃縮後、実施例１と同様分離し
、Ｄ−チロシル−し−ロイシンエチルエステルを得た（
ｌ［例３）次にグリセリン１０ｍ１の代わりにジメチル
スルホキシド１０ｍ１を加えて上記と同様にして行った
（実施例４）。

さらに、比較（比較例５）のため、グリセリン１０ｍ１
を共存させなかったほかは実施例３と全く同様に行った
。

その結Ｌ　　Ｄ−チロシル−Ｌ−ロイシンエチルエステ
ルの収量は以下に示すとおりであった。

収量（ｍｇ） 実施例３　　　　　０．１５ 実施例４　　　　　０．１３ 比較例５　　　　　０．０８ 代理人　児玉雄三 ＝１９＝

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸からのペプチド又はペプチド誘導体を合
   成するに際し９反応系に親水性有機溶媒を存在させ、か
   つ縮合剤としてアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを
   用いることを特徴とするペプチド又はペプチド誘導体の
   合成法。