KR20080015074A - γ-글루타밀시스테인의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

시스테인 유도체, γ-글루타밀 공여체, 및 시스테인 유도체에 γ-글루타밀기를 전이시킬 수 있는 효소를, γ-글루타밀기의 상기 시스테인 유도체에의 전이를 촉진시키는 반응 환경하에서 제공하는 것을 포함하는, 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물, 예로서, γ-글루타밀시스테인 또는 γ-글루타밀시스테인 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물, 예로서, γ-글루타밀시스테인 또는 γ-글루타밀시스테인 유도체, 및 그의 용도에 관한 것이다.

시스테인 유도체, γ-글루타밀기, γ-글루타밀 공여체, γ-글루타밀시스테인

Description

γ-글루타밀시스테인의 생산 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF γ-GLUTAMYLCYSTEINE}

본 발명은 γ-글루타밀시스테인을 생산하는 효소적 방법, 및 상기 방법에 의해 생산된 γ-글루타밀시스테인, 및 그의 용도에 관한 것이다.

모든 호기성 유기체는 호흡 및 에너지를 위해 영양분을 산화시키는데 산소 분자를 사용한다. 산소 분자가 물로 환원되는 동안, 자유 라디칼로도 공지되어 있는 활성 산소종이 생성된다. 이는 극도로 반응성이고, DNA, 단백질 및 지질을 비롯한 거의 모든 세포 성분을 공격할 수 있고 손상시킬 수 있다. 이들 활성 산소종에 의해 유도된 산화적 스트레스는 노화, 관절염, 동맥경화증, AIDS, 암, 백내장, 간염, 심근 경색, 알츠하이머병 및 뇌졸증을 비롯한 다수의 다양한 퇴행성 질환에 연루되어 있다. 산화적 스트레스를 퇴치시키기 위하여, 세포는 효소 및 항산화제, 예로서, 아스코르브산염, α-토코페롤, 요산, β-카로틴 및 글루타티온을 비롯한 방어 기전의 병기고를 개발하게 되었다. 주요 세포 항산화제로서 글루타티온의 대사 및 조정이 산화적 스트레스에 대하여 보호하는데 있어 중요하다.

글루타티온 (GSH)은 γ-글루탐산, 시스테인 및 글리신의 트리펩티드이고, 생물학적으로 가장 풍부한 세포 내의 저분자 티올이며, 그의 유리 설피드릴 (-SH)의 환원력에 의해 다수의 세포 과정에서 중요한 역할을 한다. 이는 산화적 스트레스, 생체이물, 및 방사선에 대한 세포 보호를 포함한다. GSH는 그의 구성 요소인 아미노산으로부터 γ-글루타밀시스테인 합성 효소 (γ-GCS) 및 GSH 합성 효소 (GS)의 연속된 작용에 의해, 양 반응 모두에서 ATP를 소비하면서 세포내에서 합성된다:

세포 및 조직내 GSH 수준이 낮다는 것은 이제까지 목록이 증가되고 있는 질환 및 퇴행성 용태, 특히, 자유 라디칼 손상과 관련된 것의 발병 기전과 연루된다. 이러한 다수의 의학적 용태의 치료에서 세포내 GSH 수준을 회복시키는 것이 유익하다고 입증되었다.

GSH가 세포 내로 효과적으로 수송되지 못하고 세포밖에서 그의 아미노산으로 분해되기 때문에 GSH를 투여하는 것은 세포내 GSH를 증가시키는데는 효과가 없다. GSH 합성에서 제한 아미노산인 시스테인을 투여하는 것 또한 효과가 없는 것으로 간주되는데, 이는 빠른 속도로 난용성 시스틴으로 산화되고, 보도에 따르면 독성이기 때문이다. GSH 수준을 증가시키기 위한 전략법은 주로 시스테인 전달 화합물, 예로서, N-아세틸시스테인 및 2-옥소티아잘리딘-4-카복실레이트에 촛점을 맞추고 있다. 시스테인 프로드럭을 사용하여 GSH 수준을 증가시키는 것은, 첫번째 합성 효소 γ-GCS에 대한 GSH의 피드백 저해에 기인하여 사용면에 있어 제한을 받는다. 두번째 효소인, GS는 피드백 저해에 영향을 받지 않고, 그의 기질인 GGC는 일반적으로 GSH 합성에서 제한적인 기질이다. γ-글루타밀시스테인 (GGC)은 GSH로의 바로 직전의 전구체이며, GGC는 보통 시스테인보다 낮은 수준으로 존재한다. 다수의 세포 유형들은 세포막을 가로질러 외인성 GGC를 수송할 수 있는 능력을 갖고 있고, GGC는 세포내 GSH 수준을 증가시키는데 임상적 효능을 갖는 것으로 나타났다.

γ-글루타밀시스테인은 천연적으로 우유에 함유되어 있고, 특히 함유되어 있는 경우에 이는 단백질에 디설파이드 결합으로 연결된 유청 분획 내에 풍부하게 존재한다. 유청 단백질을 음용하는 것이 GSH 수준을 증가시킨다고 다수의 보고에서 입증되었다. 유청 단백질 단리물 류는 상업적으로 구입가능하고, 이들은 활성 구성 요소로서 GSH를 포함하는 것으로 관심을 끌고 있다. 최근 근육의 성능 및 HIV 환자에 대한 인간 임상 시험을 통해 GSH 수준을 증가시키는 유청 단백질 단리물의 효과를 확인하게 되었다.

이미 유청 단백질 단리물에 의해 잘 확립되어 있는 GGC에 대한 건강기능식품 시장과는 별도로, GGC의 다른 적용으로는 GGC를 항산화제로서 식품과 화장품에 첨가하는 것, 및 중금속 또는 산화제에 중독된 환자를 치료하는 것을 포함한다.

현재까지 산업적으로 적합하고, 비용면에서 효율적인 GGC 생산 방법은 없었다. 이는 시스테인의 반응성 설피드릴 및 비전형적인 γ-글루타밀 펩티드 결합에 필요한 복합 보호 및 탈보호 화학법 때문이다.

과학 문헌 및 특허 문헌에 기재되어 있는 글루타티온의 상업적 생산 방법중 대다수는 효모, 특히, 빵 효모, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 발효를 포함하는데, 이는 GSH에 천연적으로 풍부하게 존재한다. 그러나, 미생물에 의해 GGC를 생산하는 것은 부피가 적은 수율; 기질상의 낮은 수율; 장기간의 발효 시간 (수일); 복잡한 정제 과정; 다수의 폐기물 스트림 생성; 및 고도한 설비 자본 비용을 비롯한 다수의 단점이 있는 것으로 밝혀졌다.

대규모 GSH의 화학적 합성 또한 어려움을 겪고 있는데, 이는 구성 아미노산상에 8개의 작용기가 존재하기 때문이다. GGC의 경우에는 6개의 작용기가 존재한다. 대부분의 GSH의 화학적 합성은 수율이 낮다 (<10%). GSH의 화학적 합성의 상업적 성공을 막는 대다수의 장애는 시스테인 및 글루탐산, 양자 모두의 각각에 대한 2번의 보호 단계, 1번의 커플링 단계에 이은, 적어도 또다른 2번의 탈보호 단계가 포함된 단계의 수이다. γ-카복실기의 반응성이 더 높기 때문에 에스테르화에 의해 글루탐산의 α-카복실기를 선택적으로 보호하는 것이 복잡하다는 것도 GSH의 화학적 합성에서 또다른 난점이 된다. 시스테인으로부터의 황은 백금 촉매에 대하여 독성 효과를 미치기 때문에 GGC내 글루타메이트의 아미노기중 벤질옥시카보닐 보호기의 백금 촉매화된 수소화분해 (탈보호)를 사용할 수 없다는 것도 중요 단점이 된다. GSH의 화학적 합성에 대한 몇몇 소수의 장애로는 GGC의 2개의 키랄 중심중 임의의 것이 라세미화될 가능성 (이는 펩티드 합성에 있어 공통적인 문제가 된다), 및 필요한 대량의 유독성 물질과 용매를 사용하는 것에 내재되어 있는 환경 안전상의 우려를 포함한다.

따라서, 상기 확인되어진 단점, 즉, 낮은 수율, 값비싼 회수, 복잡하고/거나 값비싼 단계, 다수의 폐기물 스트림 생성; 장기간의 발효 단계; 및 고도한 설비 자본 비용중 적어도 하나 이상으로 어려움을 겪지 않는, 산업적 규모의 효과적인 γ-글루타밀시스테인 생산 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 반응 단계의 수, 사용되는 원료의 양, 및 부산물 형성에 의한 출발 물질의 손실을 감소시킴으로써 비용면에서 효과적인 방식으로 γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 효율적이며, 상대적으로 간편하고, 비용면에서도 효율적인, 효소적 합성을 사용하여 γ-글루타밀시스테인을 생산하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 시스테인 유도체, γ-글루타밀 공여체, 및 시스테인 유도체에 γ-글루타밀기를 전이시킬 수 있는 효소를, γ-글루타밀기의 상기 시스테인 유도체에의 전이를 촉진시키는 반응 환경하에서 제공하는 것을 포함하는, 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

이러한 실시태양중의 실시태양에 따라, 효소는 γ-글루타밀 에스테라제 또는 γ-글루타밀 아미다제 활성을 갖는 것으로서, 예를 들면, γ-글루타밀트랜스펩티다제이다.

또다른 실시태양에 따라, γ-글루타밀 공여체는 글루탐산의 γ-에스테르 또 는 γ-아미드이다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 γ-글루타밀 공여체의 일례로는 글루탐산의 γ-알킬-, α,γ-디알킬-, γ-p-클로로페닐-, 및 γ-시아노메틸-에스테르를 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 γ-알킬- 및 α,γ-디알킬-글루타밀 에스테르의 일례로는 글루탐산의 γ-메틸-, γ-에틸-, α,γ-디메틸, 및 α,γ-디에틸-에스테르를 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 시스테인 유도체는 수용성이다. 이러한 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 시스테인 유도체의 일례로는

시스테인과 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드;

S-아세틸시스테인;

S-아세트아미도메틸시스테인;

S-메톡시카보닐설페닐시스테인;

S-설포시스테인;

시스틴 디메틸 에스테르; 및

시스틴 모노메틸 에스테르를 포함한다.

혼합된 디설파이드의 제조를 위한 수용성 티올은 임의의 적절한 저분자 수용성 티올, 예로서, 티오글리콜산, 시스타민, 티오아세트산, 메탄티올 또는 에탄티올을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 시스테인의 혼합된 디설파이드는 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드이다.

또다른 실시태양에 따라, 반응 환경은 수성이다. 수-혼화성 용매, 예로서, 디메틸포름아미드가 본 반응 환경에 포함될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에 따라, 효소는 소 γ-글루타밀트랜스펩티다제, 예로서, 소 신장 또는 우유 γ-글루타밀트랜스펩티다제로부터 선택된다.

또다른 실시태양에 따라, 효소는 고정상, 예로서, 수지 위에 고정화되어 있다.

또다른 실시태양에 따라, 본 방법은 배치식 방법일 수 있다. 별법으로, 본 방법은 연속식일 수 있다. 후자의 경우, 고정화된 효소를 포함하는 반응기의 입구내로 γ-글루타밀 공여체 및 시스테인 유도체가 연속적으로 공급될 수 있고, 산물 화합물을 포함하는 용출물은 출구로부터 연속적으로 수집될 수 있다.

본 발명의 방법의 실시태양에 따라, 본 방법은 γ-글루타밀시스테인 유도체를 제조하는 방법이다. 그러한 방법은 γ-글루타밀트랜스펩티다제에 의해 γ-글루타밀 에스테르로부터의 γ-글루타밀기의 시스테인 유도체에의 전이를 촉진시키는 반응 환경하에서

γ-글루타밀 에스테르;

시스테인과 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드;

S-아세틸시스테인;

S-아세트아미도메틸시스테인;

S-메톡시카보닐설페닐시스테인;

S-설포시스테인;

시스틴 디메틸 에스테르; 및

시스틴 모노메틸 에스테르로부터 선택되는 시스테인 유도체; 및

γ-글루타밀트랜스펩티다제를 제공하는 것을 포함할 수 있다.

이러한 방법의 실시태양에 따라, γ-글루타밀 에스테르는 글루탐산의 γ-메틸-, γ-에틸-, α,γ-디메틸, 및 α,γ-디에틸-에스테르로부터 선택되고, γ-글루타밀 수용체는 시스테인과 티오글리콜산 또는 시스타민 또는 다른 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드로부터 선택된다.

상기 기술된 방법에 의해 생산된, 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물 또한 제공된다. 화합물은 γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 유도체일 수 있다.

γ-글루타밀시스테인 유도체 합성을 위한 본 발명의 방법의 또다른 실시태양에 따라, 본 방법은 전기투석 또는 이온 배제 크로마토그래피에 의해 γ-글루타밀시스테인 유도체를 정제하는 추가의 단계를 포함한다.

시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물은 γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체, 예로서, γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 유도체일 수 있다.

따라서, 본 발명의 또다른 실시태양에 따라, 유도체화기는 γ-글루타밀시스테인 유도체로부터 절단됨으로써 γ-글루타밀시스테인을 제공한다. 실시태양에 따라, 유도체화기는 전기화학적 환원에 의해 절단된다. 이어서, γ-글루타밀시스테인은 단리될 수 있고, 임의로는 환원된 형태로서 또는 산화된 형태로서, 또는 환원 된 형태와 산화된 형태의 혼합물로서 정제될 수 있다.

상기 기술된 방법에 의해 생산할 때 γ-글루타밀시스테인 또한 제공한다.

도 1은 pH 9.0하에 50:50 물:DMF중 시스틴 유도체 CDME 및 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 (100mM)와 함께 글루탐산의 γ-메틸 에스테르 (GME, 100mM)의 γ-글루타밀트랜스펩티다제 (γ-GT) (γ-GT)로 촉매화된 GGC 합성에 대한 동역학을 도시한다.

도 2A 및 2B는 pH가, 기질상에서 50:50 물:DMF중 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 (100mM)와 글루탐산의 γ-에틸 에스테르 (GEE, 100mM)을 사용한 γ-GT 촉매화된 GGC 합성의 반응 동역학 (도 2A) 및 효소 안정성 (도 2B)에 미치는 효과를 도시한다.

도 3은 DMF 농도가, 기질로서 Cys-Merc (100mM) 및 GEE (100mM)를 사용한 γ-GT 촉매화된 GGC 합성의 반응 동역학에 미치는 효과를 도시한다.

도 4는 실시예 10에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에서 γ-GGC-머캅토에탄올 디설파이드 생산과 pH 8.0을 유지시키기 위한 수산화나트륨 첨가의 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된, γ-GGC-머캅토에탄올 디설파이드 및 반응물 및 부산물들 포함하는 반응 혼합물의 연속식 이온 배제 크로마토그래피를 위한 개략도이다.

도 6은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된, γ-GGC-머캅토에탄올 디설파이드 (첫번째 용출 피크) 및 반응물 및 부산물들 (이후의 피크들)을 포함하는 효소 반응 혼합물에 대한 분취용 이온 배제 크로마토그래피 용출 프로파일을 제공한다.

도 7은 GGC-머캅토에탄올 디설파이드의 전기화학적 환원을 위한 기기의 도해이다.

도 8은 실시예 12에 기술된 바와 같이, GGC-머캅토에탄올 디설파이드를 전기화학적으로 환원시키는 동안 캐소드액 저장소에 첨가된 수산화나트륨의 그래프이다.

도 9는 본 발명의 γ-GGC 생산을 위한 상업적 생체공정에 대한 흐름도이다.

도 10은 도 4에서 설명된 방법에 의해 γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올로부터 γ-GGC를 수득하기 위한 두번째 옵션에 대한 흐름도이다.

산업적으로 효과적인 GGC 생산 방법은 이용가능하지 않다. 현재의 비-효소적 방법은 전형적으로 복잡한 다단계 방법이고, 값비싼 설비를 필요로 하며, 산물의 회수에 비용이 많이 들고, 독성 화합물 및 유기 용매를 사용하는 것을 포함하며, 다양한 폐기물 스트림을 생산한다. 효소적 방법은 또한 기술된 바 있지만, 이들은 전형적으로 비효율적이고, 수율이 낮으며, 종종 비싸고, 취급이 어려운 출발 물질 또는 중간체를 사용한다.

본 연구 결과로서, 효율적이고 효과적인, 대규모/산업적 규모의 GGC 생산 방법을 고안하게 되었다. 따라서, 본 발명은 시스테인 유도체, γ-글루타밀 공여체, 및 시스테인 유도체에 γ-글루타밀기를 전이시킬 수 있는 효소를, γ-글루타밀기의 상기 시스테인 유도체에의 전이를 촉진시키는 반응 환경하에서 제공하는 것을 포함하는, 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

정의

본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는(comprising)"은 "주로, 그러나, 반드시 단독인 것만은 아니게 포함하는" 것을 의미한다. 단어 용어 "포함하는"의 변형, 예로서, "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"도 상응하게 유사한 의미를 갖는다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "시스테인 유도체"는 하나 이상의 작용기로 치환된 시스테인 또는 그의 산화된/이량체화된 형태의 시스틴을 포함한다.

본원에서 언급되는 바, "유효량"은 원하는 효과를 제공하는데 충분하지만, 비독성인, 물질의 양을 포함한다. "유효량"은 적용에 따라 (예로서, 건강기능시품으로 사용하는 경우에서부터 약제학적 조성물에서 사용하는 경우), 및 적용 내에서도 (예로서, 약제로서 적용시, 및 건강기능시품 형태로도 대상마다) 달라질 것이다. 임의의 소정의 경우를 위해, 적절한 "유효량"은 통상의 실험만을 사용하여 당업계의 통상의 숙련인에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "γ-글루타밀 공여체"는 γ-결합을 통해 시스테인 부위에 전이시킬 수 있는 글루타밀기를 포함하는 임의의 적합한 화합물을 포함한다. 그러한 공여체는 글루탐산의 γ-아미드 또는 γ-에스테르, 예로서, 글루탐산의 γ-알킬 또는 α,γ-디알킬- 또는 γ-아릴-에스테르일 수 있고, 이들은 하이드록시, 에테르, 할로겐, 시아노, 티올, 니트로, 아민, 또는 아미드로부터 선택되는 치환체를 포함할 수 있다.

γ-글루타밀시스테인과 관련하여 사용될 때, 용어 "단리된"은 당해 물질이 반응 혼합물로부터 제거되었고, 관련된 불순물은 감소되었거나 제거되었다는 것을 지시한다. 본질적으로, "단리된" 물질은 동일원 공급원으로부터의 다른 물질과 관련하여 농축되어 있고 (즉, 몰 기준으로 소정의 공급원으로부터의 임의의 다른 개체 종들보다 더욱 풍부하다), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은, '단리된' 물질이 존재하는 모든 분자 종의 적어도 약 60% (몰 기준)를 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 물질 조성물은 조성물내 존재하는 전체 분자 종의 약 80 내지 90% 초과를 포함할 것이다. 가장 바람직하게, '단리된' 물질은 본질적으로 균질성이도록 정제된다 (오염물질 종은 감지할 수 있을 정도의 양으로는 검출될 수 없다).

본원에서 사용되는 바, 용어 "수용성"은 pH 8.0-9.0, 표준 온도 및 압력 (25℃ 및 1 대기압)하에서 물중 최소 약 2g/L로 가용성인 화합물을 언급한다.

아미노산 글루탐산 및 시스테인 (또는 시스틴)과 관련하여 달리 언급되지 않는 한, 이들 화합물의 L-이성체를 암시한다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 효소

시스테인 유도체에 글루타밀 공여체로부터의 γ-글루타밀기를 전이시킬 수 있는 임의의 효소가 본 발명에서 주시된다. 다수 효소의 일반 생물학적 작용은 단백질 또는 펩티드로부터 아미노산을 제거하거나, 단백질 또는 펩티드를 가수분해하는 것이지만, 이러한 반응은 종종 적절한 조건하에서는 가역성이다. 따라서, 열역학적으로 바람직한 반응이 γ-글루타밀기를 화합물에 첨가하거나 전이시키는 것일 때의 그를 위한 효소와 함께, 열역학적으로 바람직한 반응이 화합물로부터 γ-글루타밀기를 제거하는 것일 때의 그를 위한 효소가 본 발명의 범주내에서 주시된다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용하는 것에 대하여 주시되고 있는 효소는 트랜스펩티다제, 예로서, γ-글루타밀트랜스펩티다제 (E.C. 2.3.2.2), 및 에스테라제 활성을 갖는 가수분해 효소, 예로서, γ-글루타밀하이드롤라제 (E.C. 3.4.19.9), 프로테아제 또는 펩티다제, 예로서, 파파인 (E.C. 3.4.22.2), 브로멜라인 (E.C. 3.4.22.32), 피신 (E.C. 3.4.22.3), 트립신 (E.C. 3.4.21.4), 키모트립신 (E.C. 3.4.21.1), 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 및 엘라스타제 (E.C. 3.4.21.37), 및 리파제 (E.C. 3.1.1.3), 예로서, 돼지 췌장, 캔디다 루고사(Candida rugosa), 써모마이세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa), 또는 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei)로부터의 리파제를 포함한다. 시스테인 유도체에 대한 효소의 특이성의 증가가 반응의 효능을 더욱더 증가시킬 것이다.

효소는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있는데, 이로서는 자연발생된 효소의 돌연변이체를 포함한다.

γ- 글루타밀트랜스펩티다제 (E.C. 2.3.2.2)

사실상, γ-글루타밀트랜스펩티다제 (γ-GT)는 글루타티온의 γ-글루타밀 부위를 수용체에 전이시키는 것을 촉매화하는데, 여기에서, 수용체는 물, 아미노산, 또는 디- 또는 트리-펩티드일 수 있다. 이들 효소는 가수분해보다는 아미노분해의 확률을 증가시키면서, 상대적으로는 높은 합성 수율로 물중 동몰 농도의 기질을 사용할 수 있게 하는 특이적인 공여체 및 수용체 부위를 갖는다. 게다가, GGC의 화학적 합성에는 필수적이고, 일반 프로테아제를 사용하는 경우에도 종종 필요한 보호 전략법은, 그의 기질 특이성이 높기 때문에 γ-GT 촉매 반응에는 불필요하다.

고수준의 γ-GT를 함유하는 생물학적 공급원은 동물 (아스카리스 수움(Ascaris suum), 신선한 우유, 소 신장, 인간 신장, 양 신장, 돼지 신장, 래트 신장, 래트 간암, 래트 췌장), 세균 (액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실러스 서브틸리스 나토(Bacillus subtilis Natto) (상등액), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 푸소박테리움 누클리아툼(Fusobacterium nucleatum), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)), 진균 (아가리쿠스 비스포러스(Agaricus Bisporus), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 모르첼라 에스쿨렌타(Morchella esculenta), 페니실리움 로크포르티(Penicillium roqueforti), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae)) 및 식물 (악키 종자, 강낭콩 열매)에서 확인되었다. γ-GT의 편리한 공급원은 우유의 유청 분획이다. 그러나, 대체 γ-GT 공급원에 대한 연구를 통해 보다 용이하게 이용할 수 있는 효소 및/또는 보다 우수한 파라미터, 예로서, 시스테인 특이성을 갖는 효소를 제공할 수 있다.

γ-글루타밀트랜스펩티다제는 당업계에 공지되어 있는 비용면에서 저렴한 방법, 예로서, 한외여과에 의한 농축, 염석, 용매 침전, 및 단백질 분해성 분해 (오염성 단백질을 제거하기 위한 단백질 분해성 분해) 기법, 또는 그의 조합을 사용하여 우유 유청 분획으로부터 가장 편리하게 수득할 수 있다. 반응 칼럼에 함유되어 있는 적합한 수지 비드 기판상에 정제된 γ-GT를 고정시킴으로써 연속 흐름 방법이 가능하게 되었고, 이로써 효소 안정성의 증가와 다중의 배치식 방법을 위한 고정된 γ-GT의 재사용을 장점으로 한다.

γ- 글루타밀하이드롤라제 (E.C. 3.4.19.9)

γ-글루타밀하이드롤라제는 프테로일 폴리-γ-글루타메이트로부터 폴리-γ-글루타메이트 또는 γ-글루타메이트를 제거하여 프테로일 글루타메이트 (엽산)를 수득하는 것을 촉매화한다. 효소는 γ-글루타밀 결합에 대하여 특이성을 갖는 바, 이는 가역적으로 γ-글루타밀기의 수용체 분자에의 전이에 사용할 수 있다.

프로테아제 및 펩티다제

다수의 프로테아제 및 펩티다제는 사실상, 가수분해성이지만, 수분 퍼텐셜의 감소 (가수분해보다는 축합을 촉진시키기 위해), 및 온도 저하를 비롯한 적절한 조건이 주어진다면, 가역적, 합성 반응을 촉매화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 범주내에서 주시되는 프로테아제 및 펩티다제로는 에스테라제 활성을 갖는 프로테아제, 예로서, 파파인 (E.C. 3.4.22.2), 브로멜라인 (E.C. 3.4.22.32), 피신 (E.C. 3.4.22.3), 트립신 (E.C. 3.4.21.4), 키모트립신 5 (E.C. 3.4.21.1), 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 및 엘라스타제 (E.C. 3.4.21.37)를 포함할 수 있다. 이들 효소들에 대한 반응 환경은 합성 반응을 촉진시키기 위하여 고비율의 수-혼화성 용매 (예로서, DMF)를 첨가할 것을 필요로 할 수 있는데 반해, γ-GT에 의해 촉매화되는 반응은 100% 물중에서 실시될 수 있다는 점이 이들 효소보다 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 사용하는 주된 장점이 된다.

리파제 (E.C. 3.1.1.3)

리파제는 프로테아제와 유사하게 사실상, 가수분해성이지만, 수분 퍼텐셜의 감소 (가수분해보다는 축합을 촉진시키기 위해), 및 온도 저하를 비롯한 적절한 조건이 주어진다면, 가역적, 합성 반응을 촉매화하는데 사용될 수 있다. 리파제는 프로테아제와는 달리 α-카복실에 대하여 제한된 특이성을 갖지 않고, 이들은 글루탐산의 γ-카복실에 대한 유용한 활성을 제공할 수 있다. 본 발명의 범주내에서 주시되는 리파제로는 임의의 적합한 리파제, 예로서, 돼지 췌장, 캔디다 루고사, 써모마이세스 라누기노사, 또는 리조무코르 미에헤이로부터의 리파제를 포함할 수 있다. 이들 효소들에 대한 반응 환경은 합성 반응을 촉진시키기 위하여 고비율의 수-혼화성 용매 (예로서, DMF)를 첨가할 것을 필요로 할 수 있는데 반해, γ-GT에 의해 촉매화되는 반응은 100% 물중에서 실시될 수 있다는 점이 이들 효소보다 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 사용하는 주된 장점이 된다.

효소 고정화

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 효소는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 및 예를 들면, (문헌 [Wiseman, A. (1995) Handbook of Enzyme Biotechnology (London, Ellis Horwood)])에 기재되어 있는 바와 같은 방법 및 물질을 사용하여 임의의 적절한 지지체에 고정화될 수 있다. 제안된 방법과 관련하여 고정화 매트릭스에 대한 주된 기준은, 고정화 매트릭스는

1. 고도의 효소 결합능을 가져야 하고;

2. 반응 조건하에서 효소의 안정성을 유지시키고 재사용될 수 있어야 하고;

3. 유동층 반응을 견딜 수 있을 만큼 충분히 강인하여야 하고;

4. 비용면에서 효율적이어야 한다는 것이다.

예를 들면, 제공받은 설명서를 사용하고, 임의로는 적절한 스페이서를 이용하여 효소를 상업적으로 구입가능한 활성화된 지지체, 예로서, 유퍼지트(Eupergit)® 활성화된 수지 (예를 들면, 유퍼지트® C250L 활성화된 고정화 수지 비드) 상에 고정화시킬 수 있다. 별법으로는, 디이미드, 에폭시, 또는 시아노겐 브로마이드를 사용하여 효소를 원하는 표면, 전형적으로는 크로마토그래픽 지지체 비드에 고정화시킬 수 있다.

펩티드전이 기질

γ- 글루타밀 공여체

하기 조건을 충족시키는 임의의 적합한 γ-글루타밀 공여체가 본 발명에서 주시된다:

■ 용매 시스템중에서의 적합한 용해도 (>0.1M);

■ γ-글루타밀 공여체와 효소의 적합한 활성; 및

■ 유리 γ-글루타밀시스테인을 유리시키기 위해서는 임의의 유도체화기가 용이하게 제거되어야 한다. 예를 들면, 유도체화기, 예로서, 벤질옥시카보닐은 γ-글루타밀 수용체가 하나 이상의 티올기를 갖고 있을 경우, 상기의 기를 제거하기 위해서 티올기에 의해 독성화되는 백금 촉매를 사용하여야 하기 때문에 비적합하다.

공여체 기질의 화학적 유도체화가 γ-글루타밀 전이 효소의 상대적인 활성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, γ-GT를 사용하는 경우, γ-에틸 에스테르보다는 보다 강력한 전자 흡인 효과를 갖는γ-에스테르로 글루탐산을 유도체화하는 것이 추가로 아미노분해 반응을 증가시킬 수 있다. 따라서, 글루탐산의 γ-벤질 및 γ-p-니트로벤질 에스테르 (양자 모두 강력한 전자 흡인기를 갖는다)는 아미노분해를 증가시켜야 하지만, 용매 시스템중에서의 용해도 (<30mM)는 불충분한 것으로 밝혀졌다. 활성화된 에스테르, 예로서, p-클로로페닐 및 시아노메틸 에스테르는 활성이 불충분한 에스테라제 효소에 대한 적합한 유도체일 수 있다. 에스테르를 선택하는 것에 대한 주된 한계는 유도체 비용과 용해도에 미치는 그의 효과이다.

γ-GT는 γ-글루타밀 공여체상의 유리 α-아미노기에 대한 절대 요건을 갖지만, α-카복실은 활성 손실없이도 유도체화될 수 있다. 또한, α-메틸 에스테르화 (예를 들면, 글루탐산 α,γ-디에틸 에스테르에 존재하는 것과 같은)는 자가펩티드전이 반응을 저해할 수 있다.

펩티드전이를 위해 적합한 공여체인 γ-글루타밀 유도체의 일례로는:

■ 글루탐산-γ-에틸, 메틸, 프로필 또는 다른 수용성 에스테르

■ 글루탐산 γ-에틸렌 글리콜 에스테르

■ 글루탐산 메톡시에탄올 또는 에톡시에탄올 에스테르

■ 글루탐산-γ-p-클로로페닐 에스테르

■ 글루탐산-γ-시아노메틸 에스테르

■ 글루탐산 α,γ-디에틸 에스테르 (또는 디메틸)

■ γ-글루타밀 에틸, 메틸, 프로필 또는 다른 수용성 아미드를 포함한다.

γ- 글루타밀 공여체 합성

a. γ- 글루타밀 에스테르

글루탐산의 γ-알킬 에스테르는 산성 조건하에서 글루탐산을 적절한 알킬 알코올로 표준 에스테르화하여 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 글루탐산 에스테르는 종래의 방법, 예를 들면, 촉매로서의 무기산 (예로서, 염화수소 또는 황산)의 존재하에 아미노산을 적절한 알코올 (예로서, 에틸 에스테르의 경우 에탄올)에 용해시키는 피셔(Fischer) 에스테르화에 따라 합성할 수 있다. 글루탐산의 γ-카복실기는 α-카복실기보다 더욱 염기성이기 때문에 우선적으로 에스테르화된다. 오직 장시간의 반응 시간동안 가열한 후에만 α,γ-디에스테르가 형성된다.

글루탐산 γ-에틸 에스테르를 합성하기 위해 하기 방법을 사용할 수 있고, 임의로는 규모를 확대시킬 수 있다. 용해된 건성 염화수소 기체 (23g; 63mmol)를 함유하는 무수 에탄올 (35OmL)중 글루탐산 (35g; 24mmol) 현탁액은 모든 고체가 용해될 때까지 (대략 20분) 실온에서 교반하여 제조한다. 무수 에탄올을 사용하여 상기 용액을 1L로 희석시키고, 용액이 알칼리성이 될 때까지 트리에틸아민을 적가한다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시켜 결정질 현탁액을 수득하고, 부흐너(Buchner) 깔대기에서 여과하여 수집한 후, 차가운 무수 에탄올에 이어서 에테르로 연속하여 세척할 수 있다. 이어서, 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시킨다.

글루탐산/무수 에탄올 용액을 염화수소 기체로 포화시키고, 3시간동안 완만하게 환류가열시킨 후, 무수 에탄올을 사용하여 1L로 희석시키기 전에 1시간동안 실온으로 냉각시켜 α,γ-디에틸 에스테르를 합성할 수 있다.

별법으로, 약간 개질된 방법, 즉, 건성 염화수소 기체 대신, 황산 (98%)을 무수 에탄올중의 교반된 글루탐산 현탁액에 적가하고, 혼합물을 약 2시간동안 실온에서 반응시키는 방법에 의해 글루탐산 γ-에틸 에스테르를 제조할 수 있다. 이어서, 에탄올 농도를 약 60%v/v 이상으로 유지시키면서 (황산나트륨은 이 용액에서 불용성이지만, 글루탐산 γ-에틸 에스테르는 가용성이다), 10℃ 미만에서 수산화나트륨을 사용하여 혼합물을 주의하여 중화시키고, 여액을 농축시키고, 에탄올을 약 80%v/v로 가하여 결정화시킨다. 결정화 대신, 에탄올을 증류시킬 수 있고, 임의로 희석된 글루탐산 γ-에틸 에스테르 용액을 본 발명의 방법에 직접 사용할 수 있다.

b. γ- 글루타밀 아미드

수개의 글루탐산 γ-아미드가 펩티드전이 반응을 위한 적합한 공여체일 수 있다. 예를 들면, 실시예 2에서 사용된 아미드 L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드가 유효한 γ-글루타밀 공여체라고 입증되었다. 그러나, L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드 및 다수의 다른 유사 γ-글루타밀 아미드를 합성하기 위하여 사용되는 복합 보호 및 탈보호 화학법에 대한 필요성이 그의 유용성을 경제적인 이유에서 배제시킨다. 수개의 단순한 γ-글루타밀 아미드는 보호기를 필요로 않으면서 합성될 수 있고, 이들 보호기는 피롤리돈카복실산 (글루탐산을 18O℃로 가열시킬 때 물이 손실됨으로써 형성되는 사이클릭 유도체)과의 반응시 자발적으로 γ-글루타밀 아미드를 형성할 수 있는 강한 염기성 아민, 예로서, 메틸아민 및 에틸아민이다. 예를 들면, 문헌 [Lichtenstein, N. Preparation of γ-alkylamides of glutamic acid. Journal of the American Chemical Society, 1942. 64 p.1021-1022)에는, 피롤리돈카복실산의 수용액을 37℃에서 10일동안 적절한 아민으로 처리하는 수개의 γ-글루타밀알킬아미드 (메틸 및 에틸)의 합성법이 기재되어 있다. 글루타민은 피롤리돈카복실산을 수성 암모니아로 처리해서는 수득되지 않았다. 실시예 3에서 사용되는 가장 단순한 γ-글루타밀 아미드, 글루타민은 비효과적인 γ-글루타밀 공여체라고 입증되었다.

시스테인 유도체

시스테인은, 수용체로서 시스틴에 대하여 대략 100-배 더 특이적인 효소인 γ-글루타밀트랜스펩티다제에 의해 촉매화되는 반응에 대해서는 불충분한 γ-글루타밀 수용체이다. 그러나, 시스틴은 난수용성이고 (37℃ 및 pH 9.1에서 대략 5g/L, 온도와 pH 값이 더욱 낮을수록 용해도는 더 낮다), 결과적으로, 시스틴은 산업적 규모의 방법을 위해서 γ-글루타밀 수용체로서 사용하기에는 부적합하다.

수용체 기질의 화학적 유도체화 (시스테인 유도체)가 γ-글루타밀화된 유도체 생산에 영향을 줄 수 있다. 최고의 반응 효율을 위해서 시스테인 유도체는 이상적으로 하기 기준을 충족시켜야 한다:

■ 용매 시스템중의 적합한 용해도 (>0.1M);

■ 효소와 γ-글루타밀 수용체와의 적합한 활성; 및

■ 유리 γ-글루타밀화된 유도체를 유리시키기 위해서는 수용체상의 임의 보호기 및/또는 가용화기는 용이하게 제거되어야 한다 (예를 들면, S-벤질 시스테인과 같은 유도체는 제거를 위해서 가혹한 환경 조건을 필요로 하기 때문에 부적합하다).

이러한 연구 과정에서, 수개의 시스틴(시스테인) 유도체가 유력한 유도체로서 확인되었다. 이는 시스테인 및 머캅토에탄올 (Cys-Merc)의 혼합된 디설파이드, 시스테인 및 티오글리콜산의 혼합된 디설파이드, S-설포-시스테인 염, 및 가능하게는 시스틴의 부분적인 에스테르화에 의해 합성될 수 있는 시스틴의 모노메틸에스테르 (절반의 에스테르)를 포함한다. 3개의 유도체 모두는 우수한 수용해도를 가져야 하고, 과량의 티올을 사용하는 환원에 의해 또는 전기화학적으로 용이하게 탈보호된다. 유도체 S-아세트아미도메틸시스테인은 수용해도가 높다는 것이 입증되었고 (가능한 2M), 약제학적 펩티드의 산업적 합성에서 가장 보편적으로 사용되는 보호된 형태의 시스테인들중 하나이다. 요오드로 처리하여 보호된 형태의 시스테인를 제거하고, 이로써 상응하는 디설파이드를 형성하게 된다.

α-아미노의 pK_a를 감소시키는 시스테인 유도체가 아미노분해 반응을 현저하게 증가시킬 수 있다. α-아미노기에 매우 인접해 있기 때문에 시스틴(시스테인)의 α-카복실기를 유도체화하는 것은 S-유도체화보다는 그의 pK_a에 더 많은 영향을 줄 수 있다. 이상적으로, 시스틴(시스테인)의 α-카복실기는 전자-흡인기, 예로서, 아민에 의해 유도체화될 것이다. 그러나, 그의 적합성은 기가 얼마나 용이하게 제거되는가에 크게 의존할 것이며, 프로테아제-촉매화된 탈보호도 가능한 옵션이 될 것이다.

펩티드전이 반응을 위해 적합한 시스테인 유도체의 일례로는:

■ 시스테인 및 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드;

■ S-아세틸시스테인;

■ S-아세트아미도메틸시스테인;

■ S-메톡시카보닐설페닐시스테인;

■ S-설포시스테인;

■ 시스틴 디메틸 에스테르

■ 시스틴 모노메틸 에스테르를 포함한다.

혼합된 디설파이드의 제조를 위한 수용성 티올은 임의의 적절한 저분자 수용성 티올, 예로서, 티오글리콜산, 시스타민, 티오아세트산, 메탄티올 또는 에탄티올을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 적합한 시스테인의 혼합된 디설파이드의 일례는 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드이다.

시스틴(시스테인) 유도체 합성

시스테인의 티올기를 효과적으로 보호하는 것이 펩티드 화학에서의 당면 문제이고, 유도체화기/보호기에 대한 충분한 개관이 실시되었다 (문헌 [Kudryavtseva, E. V., et al. Peculiarities of synthesis of the cysteine-containing peptides. Uspekhi Khimii 1998. 67(7): p.611-630]). 그러나, 상기 문헌상에 기재되어 있는 것으로서, 거의 모든 시스테인 유도체가 갖는 주된 단점은, 유도체가 비-극성 유기 용매중에서 가용성이도록 디자인되었는 바, 이로써, 물이 정선된 용매인 기술된 본 발명에는 부적합하다는 것이다. 수개의 수용성 시스테인 유도체가 확인되었고, 하기에 열거한다.

a. 혼합된 디설파이드

혼합된 디설파이드를 형성하는데는 다수의 옵션이 존재하는데, 이는 2-머캅토에탄올을 사용한 S-설포-시스테인 중간체 환원 (문헌 [(Stapleton, I. W., et al. Amino acids and peptides .9. Some unsymmetrical disulphides derived from cysteine. Australian Journal of Chemistry, 1962. 15(3): p.570)]), 시스테인을 사용한 S-(2-하이드록시에틸)-메탄티올설포네이트 중간체의 환원 (문헌 [Nagasawa, H.T., J.F. Cohen, and W.B. Rathbun, Mixed disulfides of L-cysteine and its derivatives with 2-mercaptoethanol. Organic Preparations and Procedures International ( Briefs ), 1996. 28(2): p. 237-241]), 및 디아쿠아코빈아미드 촉매화된, 혼합된 디설파이드 형성 (문헌 [Budy, B., et al., A facile synthesis of homocysteine-cysteine mixed disulfide. Analytical Biochemistry. 2001. 291(2): p. 303-305])을 포함한다. 시스테인 및 티오글리콜산의 혼합된 디설파이드는 예를 들면, (문헌 [Greenstein, J.P. and M. Winitz, Chemistry of the amino acids. Vol. 3. 1961, New York: John Wiley & Sons. p. 1879-1928])에 기재되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 혼합된 디설파이드를 형성하는 다른 방법으로는 시스테인과 과량의 머캅토에탄올 및 시아노겐 브로마이드를 반응시키는 것을 포함한다. 시스테인 또는 머캅토에탄올과 알콕시카보닐설페닐 클로라이드와의 반응을 통해 S-알킬옥시카보닐설페닐 유도체가 형성되고, 이는 티올과 용이하게 반응하에 혼합된 디설파이드를 형성한다 (문헌 [Rietman, B. H., et al. A facile method for the preparation of S-(alkylsulfenyl)cysteines. Synthetic Communications, 1994. 24(9): p.1323-1332]).

시스테인의 혼합된 디설파이드를 합성하는 하나의 방법은 최초로 (문헌 [Schoberl, A., et al. Synthese und reaktions weise von unsymmetrischen disulfiden .6. Aminocarbonsauren und haarkeration mit unsymmetrisch eingebauten disulfidaustausches. Annalen Per Chemie - Justus Liebig , 1958. 617(1-3): p.71-88])에 기재된 바와 같이 티올설피네이트 (모노 디설파이드 옥시드) 중간체를 사용하는 것이다.

생성된 설펜산은 하기와 같이 추가로 티올에 의해 환원되어 혼합된 디설파이드를 형성할 수 있다:

R-SOH + R¹SH → R-S-S-R¹ + H₂O

상기 반응 도식에서, 시스테인 또는 유도체화기 (예로서, 머캅토에탄올)는 R 또는 R¹일 수 있다. 시스테인 티올설피네이트 및 대부분의 다른 티올설피네이트는 (문헌 [Savige, W. E., et al. The S-monoxides of cystine, cystamine and homocystine. Tetrahedron Letters , 1964. (43-4): p.3289-3293], [Walti, M., et al. Synthesis of isomers of mono- and di-hydroxy-analogues of cystine and comparison with metabolites excreted in urine. Journal of the Chemical Society C-Organic, 1971. 12: p.2326] 및 [Batistaviera, F., et al. Solid-phase thiolsulfmates for the reversible immobilization of thiols. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1994. 44(1): p.1-14])에 의해 입증된 바와 같이, 유기 과산 (예로서, 퍼아세트산, 퍼포름산, 및 모노퍼옥시프탈레이트)으로 산환시킴으로써 합성될 수 있다.

시스테인의 혼합된 디설파이드를 합성하는 또다른 방법은 하기와 같이 구리 이온 촉매화된 대기/O₂ 산화이다:

R-SH 또는 R-S-S-R + R¹H 또는 R¹S-S-R¹ + ½O₂ → R-S-S-R¹ + R-S-S-R + R¹-S-S-R¹ + H₂O

R-SH는 머캅토에탄올일 수 있거나 R-S-S-H는 2,2'-디티오디에탄올 (DTDE)일 수 있고, R¹SH는 시스테인일 수 있거나 R¹S-S-R¹은 시스틴일 수 있다. 혼합된 디설파이드 (R-S-S-R¹, Cys-Merc)가 주된 반응 산물이 되도록 하기 위해서는 3-4몰 과량의 R-SH 또는 R-S-S-H (R-SH에 기준)가 필요하다. 더욱 빠른 반응 종결을 위해서는 출발 티올 농도가 더 낮을수록 바람직하고, 시스틴 침전을 막기 위해서는 3-4 몰 과량의 R-SH 또는 R-S-S-H (R-SH에 기준)가 필요하기 때문에, R-S-S-R (예로서, DTDE)과 R¹SH (시스테인)를 포함하는 산화가 R-SH와 R¹-S-S-R¹ 사이의 반응보다 빠를 것이고, 결국, R-SH와 R¹H 사이의 반응보다도 더 빠를 것이다. 본 발명의 방법에서 원치않는 GGC-시스틴이 생산될 수 있기 때문에 생성된 혼합된 디설파이드의 시스틴 오염 또한 비바람직할 수 있다. 3-4 몰 과량의 R-SH 또는 R-S-S-H (R-SH에 기준)를 사용하는 것이 시스틴 오염의 위험성을 감소시킬 것이다.

왕성하게 포기시키면서, 예를 들면, 프릿을 통해 대기를 반응 혼합물 내로 버블링시키면서, pH 8.5 내지 pH 9.0 이하에서 구리 이온(II) (Cu^{2 +}) 이온의 존재하에 반응이 일어난다. 추후, GGC 유도체를 티올 형태로 환원시키기 위하여 전기화학적 환원을 사용하고자 하는 경우, Cys-Merc 합성 종결시 구리 이온(II)을 제거하여야 한다. 이는 예를 들면, 구리 이온(II)에 대하여 고도의 특이성을 갖는 킬레이트화 수지 칼럼, 예로서, 고정화된 이미노디아세트산기를 갖는 세파로즈(Sepharose)를 통해 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 반응 혼합물이 완전하게 용출되기 전에는 수지상의 말단부에 도달할 수 없는 구리 이온의 킬레이트화에 의해 부여되는 수지의 강한 청색 착색에 의해 칼럼 내에서 효과적으로 제거되었음을 눈으로 관찰한다.

상기 방법에 의해 생산된 시스테인의 혼합된 디설파이드를 정제하거나 결정화할 수 있거나, 반응 혼합물을 본 발명의 방법에 직접 사용할 수 있다. 예를 들면, 아세트산을 사용하여 pH 5.2 (Cys-Merc의 등전점)로 조정한 후, -2O℃에서 3 부피의 아세톤을 첨가하여 빠른 속도로 Cys-Merc 결정이 증착되도록 하여 Cys-Merc 혼합된 디설파이드를 결정화시킬 수 있다.

시스테인의 혼합된 디설파이드의 합성은 또한 전기화학적 산화를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이는 본질적으로, 추가로 하기 및 실시예 12에서 논의되는 것과 같되, 단, GGC가 시스테인으로 대체된 전기화학적 환원 반응의 역 반응이다. 티올로부터 디설파이드를 합성하기 위해 애노드에서 수행되는 산화 반응이 혼합된 디설파이드의 합성에 대해서도 보고되었다 (문헌 [Do, Q. A new electrochemical method of preparation of unsymmetrical disulfides Tetrahedron Letters, 1997, 38, 3383-3384]).

b. S- 아세트아미도알킬 유도체

시스테인의 S-아세트아미도알킬 유도체는 묽은 염산중 적절한 N-(하이드록시알킬)아세트아미드과 시스테인 하이드로클로라이드의 반응에 의해 가장 편리하게 제조된다. 예를 들면, 문헌 [Milkowski, J. D., et al. Thiol protection with the acetamidomethyl group-S-acetamidomethyl-1-cysteine hydrochloride. Organic Syntheses, 1988. 6: p.5-8])에 N-(하이드록시메틸)아세트아미드를 사용하여 S-아세트아미도메틸시스테인을 합성하는 것이 기재되어 있고, 하기에 반응 도식을 도시한다.

쯔비터이온 형태의 S-아세트아미도메틸시스테인은 수산화나트륨를 사용하는 중화에 의한 하이드로클로라이드로부터, 이온-교환 크로마토그래피, 또는 피리딘을 사용한 이소프로판올로부터의 침전에 의해 용이하게 수득할 수 있다. S-아세트아미도메틸시스테인은 또한 무수 조건하에, 액상 플루오르화수소 및 트리플루오로아세트산중에서 N-(하이드록시메틸)아세트아미드로부터 제조될 수 있다. 요오드로 처리하여 S-아세트아미도메틸기를 제거하고, 상응하는 디설파이드를 형성한다.

c. S- 설포시스테인

S-설포시스테인을 형성하는데는 다수의 옵션이 존재하는데, 이는 많은 과량의 아황산암모늄을 사용한 시스틴 암모니아 용액 처리 (문헌 [Clarke, H. T. Journal of Biological Chemistry, 1932. 97: p.235]), 구리 이온(II)의 존재하에 아황산나트륨에 의한 시스틴 또는 시스테인의 전환 (문헌 [Moore, W., et al. Inactivation of γ-glutamylcystine synthetase, but not glutamine synthetase, by S-sulphocystine and S-sulphohomocystine. The Journal of Biological Chemistry, 1987. 262: p.16771-16777]) 또는 시스테인에 대한 나트륨 테트라티오네이트의 작용에 의한 시스틴 또는 시스테인의 전환 (문헌 [Maugras, L, et al. Peptide-synthesis using novel S-sulphocysteine derivatives. International Journal of Peptide and Protein Research, 1995. 45(2): p.152-156])을 포함한다. 하기 반응 도식에 도시되어 있는 후자의 옵션에 따라 S-설포시스테인의 모노나트륨 염을 대규모로 그리고 우수한 수율을 제조할 수 있다.

HSCH₂CH(NH₂)CO₂H + Na₂S₄O₆ → NaO₃S-SCH₂CH(NH₂)CO₂H + S₂ + NaHSO₃ 시스테인 + 나트륨 테트라티오네이트 → 나트륨 S-설포시스테인 + 황 + 아황산나트륨

S-설포기는 (문헌 [Jocelyn, P. C, Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzymology. 1987. 143: p. 246-56])에 기재되어 이는 바와 같은 표준 조건하에서 이산화황 기체로서 용이하게 제거된다.

d.시스틴의 알킬 에스테르

시스틴 에스테르는 종래의 방법, 예를 들면, 촉매로서의 무기산 (예로서, 염화수소 또는 황산)의 존재하에 시스틴을 적절한 알코올 (예로서, 에틸 에스테르의 경우 에탄올)에 용해시키는 피셔 에스테르화에 따라 합성할 수 있다. 환류하에 장시간의 반응 시간동안 많은 과량의 알코올을 사용하여 시스틴 디알킬 에스테르를 형성한다. 예를 들면, 메탄올을 사용하여 시스테인 디메틸 에스테르 디하이드로클로라이드를 합성하는 것이 하기 반응 도식에 도시되어 있다.

CO₂H(NH₂)CH₂SSCH₂CH(NH₂)CO₂H + HCl + CH₃OH →

CH₃COH(NH₂)CH₂SSCH₂CH(NH₂)COCH₃.2HCl + H₂O

시스틴 + HCl + 메탄올 →

시스틴 디메틸 에스테르 디하이드로클로라이드 + 물

유사한 반응 조건하에서, 시스틴의 클로로포름 용액중 화학양론적 양의 절반의 양으로 알코올을 사용하여 시스틴 모노알킬 에스테르를 형성한다. 유기 염기 형태의 에스테르는 수산화나트륨를 사용하는 중화에 의한 하이드로클로라이드로부터, 이온-교환 크로마토그래피, 또는 피리딘을 사용한 이소프로판올로부터의 침전에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 과량의 수산화나트륨으로 비누화하여 에스테르를 제거한다.

e. S- 알콕시카보닐설페닐 유도체

시스테인의 S-알콕시카보닐설페닐 유도체는 메탄올 용액중 시스테인 하이드로클로라이드와 적절한 알콕시카보닐설페닐 클로라이드와의 반응에 의해 가장 편리하게 제조된다. 예를 들면, 문헌 [Rietman, B. H. A facile method for the preparation of S-(alkylsulfenyl)cysteines. Synthetic Communications, 1994. 24(9): p.1323-1332])에는 메톡시카보닐설페닐 클로라이드를 사용하여 S-(메톡시카보닐설페닐)시스테인.HCl을 합성하는 것이 기재되어 있고, 이는 하기 반응 도식에 도시되어 있다.

쯔비터이온 형태의 S-아세트아미도메틸시스테인은 수산화나트륨를 사용하는 중화에 의한 하이드로클로라이드로부터, 이온-교환 크로마토그래피, 또는 피리딘을 사용한 이소프로판올로부터의 침전에 의해 용이하게 수득할 수 있다. S-메톡시카보닐설페닐기는 (문헌 [Jocelyn, P. C, Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzymology., 1987. 143: p. 246-56])에 기재된 바와 같이 표준 환원 조건하에서 용이하게 제거된다.

f. S-아세틸시스테인

티오아세트산을 사용하는 시스테인의 산 촉매화된 S-에스테르화 (문헌 [Uotila, L. Preparation and assay of glutathione esters. Biochemistry, 1973. 12 p.3938-3943]), 또는 시스테인의 아미노기를 보호하기 위하여 용매로서 트리플루오로아세트산을 사용하는 시스테인 상에서의 아세틸 클로라이드의 작용이라는 2개의 방법에 따라 S-아세틸시스테인의 제조를 실시할 수 있다. 하기 반응 도식에 도시되어 있는 후자의 옵션은 특허 ([Galzigna, L. A process for the preparation of glutathione S-acyl derivatives. 1990. PCT/EP91/01154])에서 최초로 입증되었는데, 상기 특허는 고수율과 고선택성을 갖는 S-아실화된 글루타티온에 대한 방법을 기술한다.

S-아세틸기는 산성 또는 알칼리성 가수분해에 의해 제거할 수 있다.

반응 조건

시스틴(시스테인) 유도체 및 γ-글루타밀 공여체 사이의 α,γ-아미드 결합 (펩티드 결합)의 효소 촉매화된 형성을 촉진시키는 조건하에 선택된 효소의 존재하에서 γ-글루타밀 공여체 (예로서, 글루탐산 γ-에스테르) 및 γ-글루타밀 수용체/시스틴(시스테인) 유도체 (예로서, 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드)를 혼합할 수 있다 (예를 들면, 동몰 농도로). γ-글루타밀 공여체가 글루탐산 γ-에스테르인 경우, 적절한 효소는 에스테라제 활성를 나타낼 수 있고, 예를 들면, γ-글루타밀트랜스펩티다제이다.

a. pH

반응 환경은 대상 효소에 의해 γ-글루타밀기를 시스테인 유도체에 전이시키기 위한 최적의 pH의 약 1 내지 2 pH 단위 내에 있는 pH를 가져야 한다. 그러나, 효소가 상대적으로 균일한 pH 활성 프로파일을 가질 경우, 보다 광범위한 pH 5 범위가 적용될 수 있다. 반응 pH는 또한 반응 농도에 영향을 줄 수 있고, 이것이 결정 인자가 될 수 있으며, 효소의 최적의 pH가 반드시 최적의 반응 조건을 제공할 수 있는 것은 아니다. 일단 염기성 효소 및 반응물 파라미터가 공지되면, 직접적인 방법 및 모델링에 의해 당업자는 용이하게 pH를 최적화할 수 있다.

본 반응에 대하여 최적인 pH가 가역 반응에 대하여 최적인 pH와 반응시 동일하지 않을 것이다.

소 γ-GT의 최적의 pH는 대략 pH 8.8 - pH 9.0이지만, 약 pH 9.5 초과의 pH 값으로 변성될 수 있다. 따라서, 소 γ-GT가 사용되는 반응 환경 pH는 약 pH 7 내지 약 pH 9.5, 예로서, 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.4, 약 pH 7.9 내지 약 pH 9.3, 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0, 약 pH 8.1 내지 약 pH 9.2, 약 pH 8.3 내지 약 pH 9.1, 약 pH 8.5 내지 약 pH 9.0, 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9 또는 약 pH 9.0일 수 있다.

다수의 가수분해 효소, 예로서, γ-글루타밀 하이드롤라제, 카복시펩티다제, 및 아미노펩티다제의 최적의 pH는 전형적으로 중성 미만이고, 그러므로, 최적의 pH는 효소에 따라 약 pH 2.5 약 내지 pH 7 사이일 수 있다.

소 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 사용한 본 연구에서, 반응 pH를 약 8.5-9로 유지시키기 위해서는 상대적으로 고농도의 완충제 (DEA, 0.2M)가 필요하다는 것이 밝혀졌는데, 이는 반응 혼합물의 이온 강도를 현저히 증가시켜 뚜렷한 γ-GT의 활성에 현저하게 영향을 미치고, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다른 효소 활성에도 영향을 줄 수 있다. 특정 설정점까지 pH를 유지시키기 위한, pH 탐침과, 산 또는 염기를 첨가하기 위한 펌프가 장착된 반응 베쓸인 pH-stat의 사용으로 완충처리할 필요가 없어야 하고, 반응 혼합물의 이온 강도는 감소되어야 한다.

pH가 8.5 초과일 때, 소 γ-글루타밀트랜스펩티다제의 아미다제 활성은 γ-글루타밀 유도체 산물을 가수분해하는 것으로 밝혀졌는데 (하기 항목 (d) 참조), 이는 수-혼화성 용매, 예로서, 디메틸포름아미드를 사용함으로써 감소시킬 수 있거나 막을 수 있다. 그러나, 예로서, pH-Stat를 사용함으로써 달성가능한 것처럼 반응 pH를 보다 잘 조절함으로써 pH-Stat 및 pH 8.0을 사용하여 보다 낮은 pH를 선택할 수 있고, γ-글루타밀 유도체 산물의 2차 가수분해는 동일한 정도로 발생하지 않음을 발견하게 되었다.

b. 온도

일반적으로 말해, 사용하고자 하는 온도는 가열 비용, 효소의 안정성, 반응물 및/또는 산물에 비례하여 증가된 온도에 의해 얻은 개선에 의해 영향을 받을 수 있지만, 사용하고자 하는 온도란 최대 반응 속도를 제공하는 온도일 것이다. 일단 염기성 효소 및 반응물 파라미터가 공지되면, 직접적인 방법 및 모델링에 의해 당업자는 용이하게 반응 온도를 최적화할 수 있다.

γ-GT에 의해 촉매화되는 반응인 경우, 최적 온도는 약 37℃인 것으로 밝혀졌지만, 약 2O℃ 내지 약 50℃, 예로서, 약 2O℃, 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃, 38℃, 4O℃, 42℃, 44℃, 46℃, 48℃, 또는 50℃의 온도도 사용될 수 있다.

가능하게는 수용체가 보다 낮은 온도에서 효소에 더욱 밀착하여 결합하는 바, 고정화된 효소 및 가용성 효소, 양자 모두와 함께, 보다 낮은 반응 온도 (-15 내지 2O℃)에서 프로테아제를 사용하는 동역학적으로 조절되는 반응이 또한 수율을 증가시킬 수 있다. 보다 낮은 온도는 또한 매질의 유전율을 증가시켜 유기 공-용매가 효소에 대하여 미치는 부작용을 상쇄시킬 수 있다.

c. 반응물 농도

일반적으로 말해, 반응물은 최대 반응 속도를 제공하는 농도로 반응 환경에 제공되어야 한다. 그러나, 농도는 또한 반응 시간에 의해 지시될 것이고, 배치식 방법에서 농도는 달성가능하거나 원하는 최종의 산물 농도에 의해 결정될 것이고, 연속식 방법에서 농도는 또한 반응기내 체류시간에 제한받게 될 것이다. 특히, 연속 반응의 경우, 용출물 스트림내 미반응 성분들의 농도를 최소화하기 위해서는 최적화되어야 하지만, 일단 염기성 효소 및 반응물 파라미터가 공지되면, 최적화는 직접적인 방법으로 달성될 수 있고/거나 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

반응물 농도는 또한 각 반응물 가격과 가장 값비싼 반응물에 기준하여 반응 수율의 최적화에 따라 달라질 것이다. 다시말해, 일단 염기성 효소가 공지되면, 그러한 반응을 최적화시키기 위한 모델 및 방법은 이용가능하고/거나 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

전형적으로, 반응이 γ-글루타밀트랜스펩티다제에 의해 촉매화되는 경우, γ-글루타밀 메틸 또는 에틸 에스테르가 γ-글루타밀 공여체로서 사용되고, 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드가 시스테인 유도체로서 사용되며, γ-글루타밀 공여체의 농도 및 시스테인 유도체의 농도는 독립적으로 약 4M 이하, 예로서, 약 2M, 약 1.75M, 약 1.5M, 약 1.25M, 약 1M, 약 90OmM, 약 80OmM, 약 70OmM, 약 60OmM, 약 50OmM, 약 40OmM, 약 30OmM, 약 20OmM, 또는 약 10OmM일 수 있다.

최대 반응물 농도 또한 수-혼화성 용매의 존재, 또는 반응 환경의 다른 성분들 또는 파라미터 (예로서, 온도)에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드는 오직 물만이 있는 경우 보다는 수-혼화성 용매로서 DMF를 포함하는 반응 환경에서 덜 가용성인 반면, 덜 수용성인 반응물은 물보다는 상기와 같은 환경하에서 더욱 가용성일 수 있다 .

d. 용매

다수의 효소와 함께, 물이 존재하는 것이 가수분해 반응을 촉진시킬 수 있다. 이는 프로테아제, 펩티다제, γ-글루타밀하이드롤라제, 및 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 사용하는 경우이다. 이러한 상황하에서 반응 (γ-글루타밀기를 시스테인 유도체에 전이) 효율은 물 농도를 저하시키기 위해 수-혼화성 용매를 포함함으로써 개선될 수 있다. 또한, γ-글루타밀트랜스펩티다제를 포함하는 반응 혼합물중 수-혼화성 용매를 포함하는 것이, 유의적인 에스테라제 활성은 그대로 유지시키면서 아미다제 반응 (GGC로부터 γ-글루타밀 부위를 제거)을 저해한다는 것을 발견하게 되었다.

적합한 수-혼화성 용매는, 예를 들면, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸설폭시드, 디옥산, 디메틸포름아미드 (DMF), 에탄올, 에톡시에탄올, 에틸렌글리콜, 글리세롤, 이소프로판올, 메탄올, 및 메톡시에탄올을 포함할 수 있다.

상기 항목 (a)에서 언급한 바와 같이, 적절하게 pH가 조절될 수 있다면, 보다 낮은 반응 pH가 사용될 수 있는데, 예로서, pH 약 8.0와 같은 보다 낮은 반응 pH에서의 아미다제 반응은, 수-혼화성 용매를 첨가할 필요도 없이 보다 낮은 정도로 발생하는 것으로 밝혀졌다.

e. 반응 시간

반응 시간은 배치식 방법을 사용하는지 또는 연속식 방법을 사용하는지에 따라 달라질 것이며, 배치식 방법에서의 효소 농도, 및 연속식 방법에서의 칼럼 체류 시간도 결정 요인이 된다. 양 경우 모두에서 반응 시간의 최적화는 필요한 것이며, 이는 표준 시도 및 실험에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다.

효소, 반응물 또는 산물을 분해시키는 미생물의 반응 오염을 감소시키거나 막기 위하여 반응 용액(들)중에 항미생물제를 포함할 수 있다.

f. 방법

본 방법은 유가식(fed-batch) 또는 배치식 방법 또는 γ-GT 고정화된 반응 칼럼을 사용하는 연속 흐름 방법으로 실시될 수 있다.

i) 배치식 방법

도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, γ-GT를 사용하여 GGC를 산업적으로 생산하는 배치식 방법은 분명, 본 발명의 방법들의 특성에는 영향을 주지 않으면서 광범위하게 변형되거나 개조될 수 있지만, 3개의 주요 단계로 구성될 수 있다.

예로서, 상기 기술된 것과 같은 적합한 γ-글루타밀 유도체의 제조법이 제1 단계중의 하나일 것이다. 예를 들면, 무기산의 존재하에 25℃에서 출발 물질로서, 글루탐산 및 알코올, 바람직하게 에탄올을 알코올 용액중에서 반응시켜 글루탐산 γ-에스테르를 함유하는 용액을 제조한다. 염기를 첨가하여 과량의 산을 중화시킨다. 과량의 알코올은 증발시켜 제거하고, 물로 대체하여 그를 글루탐산 γ-에스테르 수용액, 바람직하게는 농도가 적어도 0.2M인 글루탐산 γ-에스테르 수용액으로 전환시킨다.

예로서, 상기 기술된 것과 같은 적합한 시스테인 유도체의 제조법이 GGC의 산업적 생산의 제1 단계의 또다른 하나일 것이다. 예를 들면, 출발물질 시스테인을 다수의 유도체화제와 반응시킬 수 있는데, 그중 일부는 티올기 (-SH)가 난용성인 시스틴으로 산화되지 못하도록 한다. 따라서, 유도체화기는 시스틴의 수용해도를 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 여기에서 확인된 시스테인의 효과적인 유도체화기는 시스테인-머캅토에탄올 (Cys-Merc)의 혼합된 디설파이드이다. 유도체 시스테인-머캅토에탄올은 예를 들면, 티올설피네이트 중간체를 사용하여, 또는 상기 기술된 바와 같이, 머캅토에탄올 또는 DTDE 및 시스테인 또는 시스틴의 구리 이온에 의해 촉매화된 대기/O₂ 산화에 의해 합성될 수 있다.

효소, 이상적인 γ-글루타밀트랜스펩티다제의 제조법이 GGC의 산업적 생산의 또다른 제1 단계일 것이다. γ-글루타밀트랜스펩티다제는 당업계에 공지되어 있는 비용면에서 저렴한 방법, 예로서, 한외여과에 의한 농축, 염석, 용매 침전, 및 단백질 분해성 분해 (오염성 단백질을 제거하기 위한 단백질 분해성 분해) 기법, 또는 그의 조합을 사용하여 우유 유청 분획으로부터 가장 편리하게 수득된다.

GGC의 산업적 생산을 위한 배치식 방법에서 제2 단계는 γ-글루타밀 결합 형성을 포함할 것이다. 제조된, 2개의 아미노산 유도체의 수용액을 적합한 pH하에 온도 조절형 베쓸에서 대략 동몰의 비율로 함께 혼합하고, 여기에서, 반응은 γ-글루타밀트랜스펩티다제에 의해 촉매화되고, 혼합물의 pH는 이상적으로 약 pH 8.0 내지 약 9.0으로 조정된다. 반응 pH가 약 8.5 이상인 경우, 임의로는, 산물 형성을 개선시키고 펩티드 산물의 가수분해를 막기 위하여 효소를 첨가하기 이전에 수-혼화성 유기 용매, 예로서, 디메틸포름아미드를 약 50%(v/v) 이하의 농도로 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 반응 pH가 약 8.5 미만, 예로서, 약 8.0인 경우, γ-글루타밀시스테인 산물의 비바람직한 아미다제 가수분해는 보다 덜 유의적인 정도로 발생하기 때문에 수-혼화성 용매를 첨가할 필요가 없다는 것을 발견하게 되었다. 동결건조된 것일 수도 있는 제조된 γ-GT를 반응 혼합물에 가하여 약 1-5U/mL의 최종 농도로 수득하고, 시간마다 샘플링하여 반응 진행 과정을 모니터한다. γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 디설파이드의 수율이 최대 (약 30%)에 도달하였을 때, 진한 수산화나트륨을 사용하여 혼합물의 pH를 약 pH 12로 조정함으로써 반응을 종결시킨다.

GGC의 산업적 생산의 제3 단계는 머캅토에탄올기의 제거와, 최종의 산물의 정제 또는 GGC-머캅토에탄올 디설파이드의 정제, 및 머캅토에탄올기의 제거에 이어서, 추가로 정제하는 것을 포함할 것이다. 반응 혼합물로부터 GGC 또는 GGC-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드를 정제하는 것에 대하여 수개의 옵션이 가능하며, 음이온 교환 또는 이온 배제 크로마토그래피, 전기투석, 분별 결정, 또는 그의 조합을 포함하고, 머캅토에탄올기는 그러한 정제 이전 또는 이후에 제거한다. 산업적 용도를 위해 확장될 수 있는 몇몇의 적절한 실험실-규모의 방법은 실시예 12 내지 14에서 상세히 설명한다.

GGC-머캅토에탄올 디설파이드로부터 실질적으로 순수한 GGC를 형성하는 것에 대한 단계 순서는, GGC-머캅토에탄올 디설파이드를 전기화학적으로 환원시켜 머캅토에탄올기를 절단한 후, 반응 혼합물로부터 머캅토에탄올을 제거하는 것을 포함한다. 비-극성 용매를 사용하여 분배함으로써 머캅토에탄올을 제거할 수 있고, 에탄올을 가하여 (80%v/v 초과로) 정제된 GGC를 침전시킬 수 있다.

별법으로, 디설파이드 상호교환 반응을 유도하여 GGC-머캅토에탄올 디설파이드로부터 머캅토에탄올기를 절단할 수 있다. 반응 혼합물의 pH를 pH 12로 조정하여 개시하고, 혼합된 디설파이드가 존재하지 않을 때까지 (수시간동안) HPLC 분석에 의해 반응을 모니터한다. 동시에, 감압하에서 증발시켜 반응 혼합물로부터 물을 제거할 수 있다. 이어서, 반응 혼합물의 pH는 아세트산을 사용하여 pH 3으로 조정하는데, 동시에 미반응 시스틴은 침전되어야 하며, 이를 여과하여 제거할 수 있다. 여액의 연속식 역류 추출에 의해 부산물 2-하이드록시에틸 디설파이드를 에틸아세테이트로 분배하고, 감압하에서 증발시켜 생성된 수성상의 부피를 추가로 감소시킬 수 있다. 반응 부산물 시스틴 및 2-하이드록시에틸 디설파이드를 임의로 다음 생산 배치에서 사용하기 위하여 임의로 재활용할 수 있다. 분별 결정 후, 이온 교환 크로마토그래피의 임의의 최종적 연마 단계를 수행함으로써 비스-γ-글루타밀시스틴을 정제시킬 수 있다.

ii) 연속식 방법

도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, γ-GT를 사용하는 GGC의 산업적 생산을 위한 연속식 방법은 분명, 본 발명의 방법들의 특성에는 영향을 주지 않으면서 광범위하게 변형되거나 개조될 수 있지만, 3개의 주요 단계로 구성될 수 있다.

효소 반응에 대하여 적합한 기질을 형성하기 위한 글루탐산 및 시스테인의 화학적 유도체화는 상기 배치식 방법에 대하여 기술된 제1 단계의 동일 부분이다. 효소, 이상적으로 γ-GT의 제조는, 효소가 바람직하게 연속 흐름 칼럼에서 패키징하기 적합한 고체 기질상에 고정되어 있다는 점에서 배치식 방법과 상이하다. 연속식 방법에서 제2 단계는 또한, 산물의 최대 수율에 대하여 최적화된 속도로 반응 혼합물이 고정화된 효소 칼럼을 통해 펌핑된다는 점에서 배치식 방법과 상이하다. 이 진행 옵션은 배치식 방법에 비하여 수개의 장점을 갖는데, 이는 효소 활성상의 뚜렷한 손실은 없고 단위 부피당 생산성이 증가됨을 포함한다.

고정화된 효소를 제조하는 것이 GGC의 산업적 생산을 위한 연속식 방법에서 제1 단계일 것이다. 배치식 방법에 대하여 상기에 기술된 바와 같이, γ-GT는 가장 편리하게 우유의 유청 분획으로부터 수득되지만, 상등액중 가용성 효소는 적합하게 활성화된 수지 비드와의 반응에서 고정화된다. 생성된 수지는 대략 350U/g의 γ-GT를 함유할 수 있다.

GGC의 산업적 생산을 위한 연속식 방법에서 다음 단계는 γ-글루타밀 결합 형성을 포함할 것이다. 제조된, 2개의 아미노산 유도체 (상기 배치식 방법에서 기술된 것과 같음)의 수용액을 적합한 pH 조절형 연속 흐름 혼합 장치를 통해 펌핑시켜 대략 동몰의 비율로 함께 혼합하고, 여기에서, 반응은 γ-글루타밀트랜스펩티다제에 의해 촉매화되고, 혼합물의 pH는 이상적으로 약 pH 8.0 내지 약 9.0으로 조정된다. 칼럼내 pH 조절이 어렵기 때문에 적절한 완충 처리가 필요할 수 있고, 특히, 8.0에 가까운 pH를 사용하는 경우에는 특히 중요할 수 있다. pH가 약 8.5 이상인 경우, 임의로는, 산물 형성을 개선시키고 펩티드 산물의 가수분해를 막기 위하여 효소를 첨가하기 이전에 수-혼화성 유기 용매, 예로서, 디메틸포름아미드를 약 50%(v/v) 이하의 농도로 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 제조된, 고정화된 γ-GT 효소 수지 비드를 약 37℃로 자동 온도 조절되는 재킷이 장착된 칼럼 내로 패킹하고, 어느 기질상에서도 γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올의 수율이 소정의 설정점 (약 30%) 아래로 떨어지지 않은 속도로 상기 혼합물을 칼럼을 통해 펌핑한다. 50% DMF를 공-용매로서 사용하지 않을 경우, 특히 사용되는 pH가 약 8.5 이상인 경우, 이때 γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올중 임의의 상당부가 2차 가수분해되기 전에 최적의 칼럼 체류 시간을 측정하기 위하여 반응을 모니터하여야 한다. 유출물 배출 반응 칼럼은 적합한 pH 조절형 연속 흐름 혼합 장치를 통해 펌핑하고, 진한 수산화나트륨을 사용하여 혼합물의 pH를 pH 12로 조정하여 반응을 종결시킨다.

GGC의 산업적 생산을 위한 연속식 방법의 제3 단계는 머캅토에탄올기의 제거 및 최종의 산물의 정제, 또는 GGC-머캅토에탄올 디설파이드의 정제, 머캅토에탄올기의 제거, 및 추가로 GGC의 정제 및 그의 결정화를 포함할 수 있고, 이는 상기 배치식 방법에 기술된 것과 동일한 방식으로 실시될 수 있다.

g. 유도체화기 또는 가용화기의 제거

반응 산물에 결합된 유도체화기를 제거할 수 있고, 디설파이드 환원 단계를 사용하는지 여부에 따라 순수한 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스테인 또는 γ-글루타밀시스테인을 당업계에 잘 공지되어 있는 것과 같은 다양한 방법/화학법에 의해, 이온 교환 크로마토그래피, 가장 바람직하게는, 분별 결정화에 의해 회수할 수 있다.

i) γ- 글루타밀 부위로부터 보호기/가용화기의 제거

γ-글루타밀 공여체로서 글루탐산 α,γ-알킬 에스테르를 사용하는 경우, 1M의 수산화나트륨을 사용하여 비누화함으로써 α-에스테르기를 용이하게 제거하되, 디설파이드 상호교환 반응 (pH를 12로 조정)을 정제 옵션으로서 사용하는 경우에는 동시에 수행되어야 한다.

ii ) 시스테이닐 부위로부터 보호기/가용화기의 제거

시스테이닐 부위로부터 보호기/가용화기를 제거하는 것은 사용되는 특정 보호기/가용화기에 따라 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로 혼합된 디설파이드는 화학적 수단 (즉, 과량의 티올 첨가, 강한 환원제, 예로서, 수소화붕소나트륨의 사용, 또는 산 용해-금속 반응에 의해 생성된 발생기 수소의 사용) (문헌 ([Jocelyn, P. C. Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzymology, 1987. 143: p.246-56])에 의해, 또는 상기 기술된 것과 같은 전기화학적 수단 (Genders, J. D., et al. High yield methods for electrochemical preparation of cysteine and analogues. 1988. 미국 특허 제5,106,463호)에 의해 그의 상응하는 티올로 환원될 수 있다. 대체 옵션은 묽은 NaOH로 처리함으로써 디설파이드 상호교환 반응을 유도하는 것이다. 제안된 반응 체계에서, 반응 혼합물 내의 혼합된 (비대칭형) 디설파이드 모두는 그의 대칭형 디설파이드로 전환된다. 디설파이드 상호교환 반응은 미량의 티올을 첨가하거나, UV 광 조사에 의해 개시될 수 있고 (문헌 [Eager, J. E., et al. Photolysis and photo-oxidation of amino acids and peptides .6. A study of the initiation of disulphide interchange by light irradiation. Photochemistry and Photobiology, 1963. 2(1): p.25-37]), 반응은 셀레놀 (문헌 [Singh, R., et al. Selenols catalyze the interchange reactions of dithiols and disulfides in water. Journal of Organic Chemistry, 1991. 56(24): p.6931-6933]) 또는 전이 금속 이온 (문헌 [Choi, J. S., et al. Synthesis of disulfides by copper-catalyzed disproportionation of thiols. Journal of Organic Chemistry, 1995. 60(11): p.3266-3267])에 의해 촉매화될 수 있다.

시스틴의 정전류 감소에 의한 시스테인의 배치식 전기 합성은 본 방법의 수율과 선택성이 거의 100%에 가까운, 산업상 확립된 방법이다. 디설파이드, 예로서, 시스틴을 전기화학적으로 환원시키는 일반 방법은 이온 교환 막에 의해 분리된 캐소드 챔버 (캐소드액) 및 애노드 챔버 (애노드액)을 갖는 평행판 건전기 (도 7 참조)에서 수행된다. 건전기 분리가 애노드에서의 디설파이드 또는 티올의 산화를 막는다. 캐소드 물질은 Pb, Zn, Ag, 스텐레스 스틸 또는 흑연을 비롯한 수개의 물질로부터 선택될 수 있고, 환원시키고자 하는 디설파이드를 함유하는 용액과 접촉하게 된다. 애노드 물질은 Pt, DSA, 백금 티타늄 또는 흑연을 비롯한 수개의 물질로부터 선택될 수 있고, 황산 용액과 접촉하게 된다. 전기 전류를 가하면 하기 반응이 일어난다.

R-S-S-R + 2H⁺ + 2e^- → 2R-SH 캐소드 반응

2H₂O → O₂ + 4H⁺ + 4e^- 애노드 반응

본 방법은 배치식에서 모든 디설파이드가 티올 형태로 환원될 때까지 배치식 재순환 방식으로 작동된다.

h. γ- 글루타밀 유도체의 단리 및/또는 정제

보호기/가용화기를 제거한 후, γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체를 분별 결정화에 의해 반응 혼합물로부터 정제할 수 있다. 본 방법에서는 어떤 유도체가 사용되었는지에 따라, 효소 방법 후, 반응 혼합물은 예로서; 시스틴, 글루탐산, 글루탐산 γ-에스테르, 디설파이드 (예로서, 2-하이드록시에틸 디설파이드) 및 무기염과 같은 다양한 오염물질을 함유할 수 있다. 증발시켜 반응 혼합물로부터 대부분의 물을 제거한 후, 시스틴 및 글루탐산은 pH 3에서의 그의 낮은 수용해도 (각각 0.1 및 8.6g/L)에 기인하여 결정화에 의해 용이하게 제거된다. 대부분의 저분자 디설파이드는 비-극성이고, 적절한 비-극성 유기 용매 (예를 들면, 에틸아세테이트, 부틸 아세테이트, 1-부탄올 또는 2-에틸-1-헥사놀)로 분배하여 제거될 수 있다. γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체는 고도한 수용해도 (>50g/L)를 가져야 할 것으로 보이고, 대다수의 산물은 수-혼화성 유기 용매 (예로서, 에탄올, 아세톤)를 첨가함으로써 침전될 수 있다고 예측된다. 침전된 산물의 순도에 따라 최종 연마 단계는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 실시될 수 있다.

γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체를 단리/정제시키는 대체 수단은 이온 교환 크로마토그래피, 이온 배제 크로마토그래피 (예를 들면, [Eisenbraun, A, "Separation of Amino acid by ion exclusion", 1962, 미국 특허번호 제3,045,026호 참조), 및 γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체 및 반응물 (γ-글루타밀 공여체 및 시스테인 유도체)이 충분히 상이할 경우에는, 전기투석을 포함한다.

예를 들면, γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 디설파이드 (GGC-Merc pI = 3.0)과 기질 (Cys-Merc, pI = 5.3 및 GEE pI = 5.8) 사이에는 등전점 (pI)상에 큰 차이가 존재한다. 이를 통해 이온 전하에 기초한 정제 시스템, 예로서, 이온 교환 크로마토그래피, 이온 배제 크로마토그래피 및 전기투석은 용이하게 이용될 수 있다.

이온 교환, 이온 배제 또는 전기투석 방법이 사용될 수 있는 경우, 이는 효소 반응과 동시에 실시될 수 있고, 이로써, 산물이 형성됨에 따라 산물을 효과적으로 제거 (또는 포획)함으로써 산물의 수율을 증가시킴으로써 산물 형성으로의 평형이 추진된다. 일례로서, 산성 산물 GGC-Merc을 중화시키기 위하여 효소 반응에 수산화나트륨을 첨가하는 대신, pH를 유지시킬 뿐만 아니라 반응 산물도 선택적으로 제거하기 위해 OH^- 형태로 음이온 교환 수지를 첨가할 수 있다. 유사하게, 효소 반응을 전기투석 전지에서 실시함으로써 GGC-Merc의 연속적인 제거를 촉진시킬 수 있다.

GGC 또는 GGC-Merc의 경우, 물이 용매/용리제로서 사용될 수 있기 때문에 이온 배제 크로마토그래피가 특정의 관심의 대상이 되는 기법이고, GGC 또는 GGC-Merc는 pH 5-7에서 전적으로 배제된 부피의 양이온 교환 수지 칼럼에서 용출되는 반면, Cys-Merc는 상기 pH에서 미세하게 양전하를 띠는 것에 기인하여 Cys-Merc의 용출은 지연되는데, 글루탐산 γ-에틸 에스테르의 용출도 그와 같고, 사실상 상기 pH에서 전하는 띠지 않을 것이다.

금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)가 γ-글루타밀시스테인 또는 그의 유도체의 정제를 정제하는데 적용될 수 있는 또다른 가능한 방법이다. 여러 명의 연구자들을 통해 이미노디아세트산기가 결합된 수지상에 고정화된 구리 이온(_II)을 사용하여 아미노산 및 디펩티드를 효과적으로 분리하였음이 보고되었다 (예를 들면, Belew and Porath, Immobilized metal ion affinity chromatography: effect of solute structure, ligand density and salt concentration on the retention of peptides, Journal of Chromato graphv, 1990, 516, 333-54]; [Shao and Liu, Preparation of chromatograph medium for separating amino acid and polypeptide and separating process thereof, 1997, 중국 특허번호 제1163902호 참조).

γ-글루타밀시스테인 유도체, 예로서, γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 디설파이드를 단리/정제하는 경우, 유도체화기 (예로서, 머캅토에탄올)를 제거하기 위해서 화학적 또는 전기화학적 환원을 필요로 할 수 있다. 이어서, 유리된 화합물/오염물질 화합물 (예로서, 2-머캅토에탄올)로부터 γ-글루타밀시스테인을 분리시키는 것이 필요할 수 있는데 - 이는 당업계에 공지된 다수의 기법중 임의의 것, 예로서, 증발 및 분별 결정화, 또는 오염물질 화합물을 적절한 비-극성 유기 용매 (예를 들면, 에틸아세테이트, 부틸 아세테이트, 1-부탄올 또는 2-에틸-1-헥사놀) 내로 분배하는 것을 비롯한 상기 기술된 기법에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 기법인 γ-글루타밀시스테인으로부터 머캅토에탄올을 제거하는데 효과적이라고 밝혀졌다.

본 발명의 예시적인 방법에서, 적합한 γ-글루타밀 유도체를 제조하는 것이 GGC의 산업적 생산의 제1 단계중 하나일 것이다. 1000L 규모의 효소 반응을 위해, 하기 기술되는 바와 같이, 여럿중 한 쌍의 방법에 의해 바람직한 γ-글루타밀 유도체, 글루탐산 γ-에틸 에스테르를 합성할 수 있다.

제1 방법에서, 용해된 염화수소 기체 (9kg)를 함유하는 무수 에탄올 (150L)에 글루탐산 (15kg)을 현탁시키고, 모든 고체가 용해될 때까지 약 25℃로 자동 온도 조절되는 냉각 재킷이 장착된 반응 베쓸 내에서 교반한다. 용액을 물 (250L)로 희석시키고, 과량의 산은 50% 수산화나트륨 용액을 첨가하여 중화시킨다. 감압하에 증발시켜 반응 혼합물로부터 에탄올을 제거할 수 있고, 손실된 부피는 물로 대체한다 (최종 부피 400L). 글루탐산 γ-에틸 에스테르의 최종 수율은 약 17kg으로 예측될 것이다.

제2 방법에서, 글루탐산 γ-에틸 에스테르는 US 3,770,807 (1973)에 기술된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 글루탐산 (23kg)을 무수 에탄올 (150L)에 가용화시킬 수 있고, 진한 황산 (98%, 18.7kg, 이는 또한 에스테르화 촉매로서의 역할을 한다)을 적가하고, 27℃에서 2시간동안 반응시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물 (에탄올 부피의 40%)에 용해된 동몰량의 수산화나트륨을 천천히 가하여 산을 중화시킨다. 이를 통해 60% 에탄올에는 불용성인 황산나트륨을 결정화한다. γ-글루타밀 에스테르는 60% 에탄올에 가용성이다. 증발시켜 생성된 여액을 농축시킬 수 있고, 최종적으로 80% 초과의 에탄올을 첨가하여 결정화시킨다. 에탄올은 증류될 수 있고, 물로 대체될 수 있으며, 추후 효소 반응에서 직접 사용될 수 있기 때문에 에스테르의 결정화는 필요하지 않을 수 있다. 글루탐산 γ-에틸 에스테르의 최종의 수율은 약 17 내지 18kg인 것으로 예측될 것이다. 적합하게 가용성인 시스테인 유도체를 제조하는 것이 GGC의 산업적 생산의 제1 단계의 또다른 하나일 것이다. 1000L 규모의 효소 반응을 위해, 임의의 적합한 수단, 예로서, 티오설피네이트 중간체의 사용에 의해, 또는 상기 기술된 바와 같은 2-머캅토에탄올 또는 DTDE 및 시스틴 또는 시스테인의 구리 이온 대기/O₂ 산화를 사용하여 바람직한 시스테인 유도체, 시스테인-머캅토에탄올 디설파이드 (Cys-Merc)를 합성할 수 있다.

예를 들면, 티오설피네이트 중간체를 사용하는 경우, 2-하이드록시에틸 디설파이드 (머캅토에탄올 디설파이드) (10kg)를 20℃로 자동 온도 조절되는 냉각 재킷이 장착된 반응 베쓸 내에서 물 (100L)에 용해시킨다. 일정하게 교반시키면서 25% (w/v) 아세트산 (100L)에 용해된 퍼아세트산 (9.8kg)을 천천히 첨가한다. 3시간동안 교반한 후, 감압하에서 증발시켜 용매를 제거한다. 물 (200L)을 생성된 2-하이드록시에틸 티올설피네이트에 첨가하고, 50% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 pH 6.5로 조정한다. 물 (200L)에 용해되고 pH 6.5로 조정된 교반된 시스테인 (14kg) 용액에 2-하이드록시에틸 티올설피네이트 용액을 20분에 걸쳐 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새도록 교반하고, 임의의 미반응 2-하이드록시에틸 티올설피네이트는 연속식 역류 추출에 의해 에틸아세테이트로 분배한다. 이어서, 50% 수산화나트륨을 사용하여 수성상을 pH 5.2로 조정하고, 임의의 잔류성 에틸아세테이트 용매는 감압하에 증발시켜 제거한다 (최종 부피 400L). Cys-Merc최종의 수율은 약 19kg인 것으로 예측될 것이다.

별법으로, Cys-머캅토에탄올 중간체의 구리 이온 대기/O₂ 산화의 경우에는, 2-하이드록시에틸 디설파이드 (10kg) 및 시스테인 (5.2kg)을 물 (~210L)에 용해시킬 수 있고, 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 pH 약 8.5로 조정하고, 온도는 37℃으로 조절하고, 분취량 (약 45mL)의 염화구리(II) 용액 (100mg/mL)을 첨가한다. 이어서, pH는 약 8.5로 유지시키면서 혼합물을 약 18시간동안 왕성하게 포기시킨다. 생성된 반응 혼합물중의 구리 이온은 구리 이온(_II)에 대하여 고도한 선택성을 갖는 킬레이트화 수지를 사용하여 제거할 수 있다. 생성된 반응 혼합물은 대략 0.2M Cys-Merc를 함유할 것이고, GGC 또는 그의 유도체의 생산을 위한 추후의 효소 촉매화된 반응에 직접 사용될 수 있거나, 동량의 아세톤을 첨가하고 아세트산을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 5.2로 조정함으로써 Cys-Merc를 단리시킬 수 있고, 생성된 결정질 물질은 여과 또는 Q 원심분리에 의해 회수하고, 임의로 세척하고 건조시킬 수 있다.

적정량의 효소 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 제조하는 것이 GGC의 산업적 생산에서 또다른 제1 단계일 것이다. 당업계에 공지되어 있는 비용면에서 저렴한 방법, 예로서, 한외여과에 의한 농축, 염석, 용매 침전, 및 단백질 분해성 분해 (오염성 단백질을 제거하기 위한 단백질 분해성 분해) 기법, 또는 그의 조합을 사용하여 우유 유청 분획으로부터 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 추출하고 정제하는 것이 바람직할 수 있다. γ-글루타밀트랜스펩티다제를 포함하는 용액에 유퍼지트 C250L (룀 게엠베하 & 코포레이션(Rohm GmbH & Co) 에폭시 활성화된 수지 비드 (20kg)를 현탁시키고, 혼합물을 실온에서 3시간동안 인큐베이션시켜 가용화된 γ-GT를 고정화시킬 수 있다. 이상적인 조건하에서, 수지는 대략 총 7,000,000 유니트의 γ-GT를 함유하여야 한다.

GGC의 산업적 생산의 제2 단계는 γ-글루타밀 결합 형성을 포함할 것이다. 제조된, 2개의 아미노산 유도체의 400L의 수용액을 혼합하고, 혼합물의 pH는 약 pH 8.0 내지 약 9.0으로 조정된다. 크로마토그래피 칼럼내 pH 조절이 어렵기 때문에 pH를 원하는 수준으로, 또는 그에 가깝게 유지시키기 위해서는, 특히, 8.0에 보다 가까운 pH를 사용하는 경우에는 적절한 완충 처리가 필요할 수 있다. γ-글루탐산 에틸 에스테르의 최종 농도는 대략 18g/L 및 Cys-Merc의 최종 농도는 20g/L (최종 부피 대략 1000L)이 되도록 부피를 조정한다. 제조된, 고정화된 γ-GT 효소 수지 비드를 약 37℃로 자동 온도 조절되는 재킷이 장착된 칼럼 내로 패킹하고, 유출물이 적어도 10g/L의 γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 디설파이드 (어느 기질상에서나 수율은 30%)를 함유하는 속도로 상기 혼합물을 칼럼을 통해 펌핑한다.

GGC의 산업적 생산을 위한 연속식 방법의 제3 단계는 머캅토에탄올기의 제거 에 이어서, GGC의 정제, 또는 GGC-머캅토에탄올 디설파이드의 단리, 머캅토에탄올기의 제거, 및 추가로 GGC의 정제를 포함할 것이다.

GGC 또는 GGC-Merc는 반응물 (γ-글루타밀 공여체, 시스테인 유도체 및 부산물, 예로서, 5-옥소피롤리돈-2-카복실산)로부터, 또는 γ-글루타밀시스테인 유도체로부터 유리된 유도체로부터, 일부는 이미 상기에 기술된 바 있는 임의의 적합한 수단에 의해 단리되거나 정제될 수 있다. 산업적 방법에 적용될 수 있는, 특히 관련된 방법은 용매 분배, 분별 결정화, 이온-교환 크로마토그래피 (칼럼 내에서 실시될 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다), 이온-배제 크로마토그래피, 전기투석 또는 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 포함한다.

GGC 또는 GGC-머캅토에탄올 디설파이드의 산업적 정제를 위해 특히 편리한 것은 이온-배제 크로마토그래피로서, 여기에서, 적합한 양이온 교환체와 함께 패킹된, 전적으로 배제된 부피, 또는 공극 부피의 칼럼에서 (약 pH 5-7) GGC 또는 GGC-Merc는 용출되고, 시스테인-머캅토에탄올, 글루탐산 γ-에틸 에스테르 혼합된 디설파이드 및 부산물은 실질적으로 존재하지 않는다. 반응물 및 부산물은 지연 분획에서 용출된다. 소정 기간동안 분리 갯수를 증가시키기 위하여 이전 주입의 마지막 피크가 용출되지 전에 주입하여 효소 반응 혼합물의 추후 분취량을 증가시킬 수 있다.

머캅토에탄올기는 단리/정제 이전 또는 이후에 GGC-Merc로부터 절단될 수 있고, 유리된 GGC는 정제되거나, 일부는 이미 상기에 기술된 바 있는 임의의 적합한 수단에 의해 추가로 정제될 수 있다.

예를 들면, GGC-머캅토에탄올 디설파이드로부터 실질적으로 순수한 GGC를 형성하는 것에 대한 하나의 단계 순서는 특히 산업적 방법에서 실시하는 것에 대하여 관심의 대상이 되는 것으로서, GGC-머캅토에탄올 디설파이드를 전기화학적으로 환원시켜 머캅토에탄올기를 절단한 후, 반응 혼합물로부터 머캅토에탄올을 제거하는 것을 포함한다. 비-극성 용매를 사용하여 분배함으로써 머캅토에탄올을 제거할 수 있고, 에탄올을 가하여 (80%v/v 초과로) 정제된 GGC를 침전시킬 수 있다.

머캅토에탄올기를 절단하고, 유리된 GGC를 정제하기 위한 또다른 수단에서, 50% 수산화나트륨을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 12로 조정하여 디설파이드 상호교환 반응을 개시하고, 혼합된 디설파이드가 존재하지 않을 때까지 (수시간동안) HPLC 분석에 의해 반응을 모니터한다. 동시에, 부피가 절반 (500L)으로 감소할 때까지 감압하에서 증발시켜 반응 혼합물로부터 물을 제거할 수 있다. 이어서, 반응 혼합물의 pH는 빙초산을 사용하여 pH 3으로 조정하는데, 동시에 미반응 시스틴은 침전되어야 하며, 이를 여과하여 제거할 수 있다. 여액의 연속식 역류 추출에 의해 부산물 2-하이드록시에틸 디설파이드를 에틸아세테이트로 분배하고, 감압하에서 증발시켜 생성된 수성상의 부피를 추가로 감소시킬 수 있다. 분별 결정화에 이어 최종 연마 단계로서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 비스-γ-글루타밀시스틴을 정제할 수 있다. 비스-γ-글루타밀시스틴의 최종 수율은 약 15kg으로 예측될 것이다.

본 발명의 방법에 의해 수득된 , γ- 글루타밀시스테인 또는 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 다른 화합물의 용도

본 발명의 방법은 시스테인과 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 광범위한 화합물을 제조하기 위하여 사용될 수 있지만, γ-글루타밀시스테인, 그의 산화된 이량체 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 및 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르 (에스테르가 γ-글루타밀시스테인보다 더욱더 효과적으로 세포막을 가로질러 수송되는 것으로 나타났고, 항산화제 효과에 있어서도 개선된 것이 뚜렷이 나타났다)가 특히 본 발명에 의해 주시된다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 및 시스테인과 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 다른 화합물, 예로서, γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르로부터 선택되는 화합물에 관한 것이다. 본 화합물은 원하는 정도로 정제될 수 있다.

γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르는 촉매, 반응제 또는 환원제/항산화제로서 매우 다양하게 적용시키는데 사용될 수 있다. 적용 분야는 개인 건강 관리, 약제, 건강기능식품, 화장품, 식품 (빵 및 발효 기술 방법), 농업 (동물 사료 포함), 및 발효 배지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 약제학적 목적을 위해 γ-글루타밀시스테인은 바람직하게 정제된 화합물, 전형적으로 60% 초과의 순도, 더욱 전형적으로 70% 초과의 순도, 더욱 전형적으로 80% 초과의 순도, 더욱더 전형적으로 90% 초과의 순도, 및 더욱 바람직하게, 95% 초과의 순도로 제공된다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 개인 건강 관리용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 그러한 약제학적 조성물은 예를 들면, 암, 심혈관 질환 (예로서, 죽상동맥경화증), 조직에 대한 산화적 손상 (예로서, 노화, 또는 수정체에서 진행성 단백질 산화), 호흡곤란증후군, 독성증(toxicology), AIDS, 및 간질환의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 임의로 하나 이상의 식품 성분들과 배합된, 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르를 포함하는 식품 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 식품/건강기능식품 조성물은 액체, 반고체 및 고체로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르, 및 적합한 담체를 포함하는 반죽 또는 제빵 개량 조성물에 관한 것이다. 담체는 소맥분 및/또는 설탕을 비롯한 매우 다양한, 제빵에 허용가능한 성분들로부터 선택될 수 있고, 본 조성물은 또한 다른 제빵 개량 성분들, 예로서, 효소 (셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 자일라나제, 아라비노자일라나제, 덱스트리나제, 말타제 등 포함)를 포함할 수 있다. 본 조성물은 분말형, 과립형 또는 액체 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르, 및 적합한 담체를 포함하는 동물 사료 첨가제에 관한 것이다. 담체는 매우 다양한, 허용가능한 동물 사료 성분들, 예로서, 소맥분 (밀, 옥수수 또는 콩 포함)로부터 선택될 수 있고, 본 조성물은 또한 식품의 소화율을 개선시키는 것을 비롯한 다른 동물 사료 첨가제, 예로서, 효소 (셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 자일라나제, 아라비노자일라나제, 덱스트리나제, 말타제 등 포함)를 포함할 수 있다. 본 조성물은 분말형, 과립형 또는 액체 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르, 및 수의용으로 허용가능한 담체를 포함하는 동물 건강 관리 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르의 유효량을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 순환 또는 조직에서 산화적 손상을 막는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 유효량의, 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르, 또는 그를 포함하는 조성물을 식품에 첨가하는 것을 포함하는, 식품이 산화적으로 변질되지 못하도록 하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 제조된 식품 또한 제공된다. 식품은 액체, 반고체, 또는 고체일 수 있다.

본 발명은 또한 반죽 성분들과 유효량의, 본 발명의 방법에 의해 수득된 γ-글루타밀시스테인, 비스-γ-글루타밀시스틴, γ-글루타밀시스틴 또는 γ-글루타밀시스테인 α-글루타밀알킬 에스테르를 배합하는 것을 포함하는, 반죽을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 반죽, 또는 그로부터 유도된 빵 제품 또한 제공한다.

이제, 비교 데이타를 포함하는 하기 실시예를 단지 일례로서 참고하여 본 발명의 바람직한 형태를 설명하되, 이는 어느 방식으로든 본 발명의 범주 또는 정신을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1 - 재료 및 방법

1.1 HPLC 샘플 제조

산에 정지된 효소 반응 혼합물 (100㎕)을 0.1M의 K₂HPO₄ (900㎕)로 희석시키고, 분취량 (250㎕)을 동일한 완충액 (250㎕)중 0.2M의 머캅토에탄올을 함유하는 에펜돌프 튜브내로 분배하였다. 상기 튜브를 37℃에서 20분동안 인큐베이션시켜 모든 디설파이드를 환원시키고, 3개의 분취량의 에틸아세테이트 (750㎕)로 추출하여 과량의 머캅토에탄올을 제거하였다. 샘플을 HPLC 이동상에서 적절하게 희석시키고, 즉시 HPLC상에 주입될 수 있도록 4℃에서 저장하였다.

1.2 HPLC 를 사용한 티올 측정

알티마(Alltima) (알테크(Alltech)) C18, 5㎛, (250 x 4.6mM) 칼럼 (P/N 88057)을 포함하는 시마즈(Shimadzu) (클래스 VP) HPLC 시스템을 사용하여 티올을 분리하였다. 0.1M의 인산2수소칼륨, 85% (w/v) 인산을 사용하여 pH 3.0으로 조정된 0.35%(v/v) 아세토니트릴로 구성된 이동상을 사용하여 1ml/분의 유속으로 동용매 용출을 실시하였다. 코울로케(Coulochem) II (매사추세츠주 베드포드에 소재하는 ESA) 검출기 세트를 700mV로 사용하여 검출화학적 검출법에 의해 티올을 측정하였다. GGC 표준 용액은 4 내지 25㎛ 사이의 농도로 이동상에서 제조하고, 전형적 으로는 20㎕의 샘플 또는 표준 용액을 HPLC 시스템 상에 주입하였다.

1.3 γ- 글루타밀트랜스펩티다제 (γ-GT)

가장 고농도로 γ-GT를 함유하는 조직은 신장이고, γ-GT의 공급원으로서 보편적으로 사용되고 있는 바, 하기 실시예중 다수에서 사용되는 γ-GT는 소 신장으로부터 유래된 조 시료였다. 그러나, 우유가 상대적으로 고농도 (~4U/ml)인 것으로 밝혀짐으로써 우유가 γ-GT의 세포외 공급원으로서 확인되었고, 이 효소는 구체적으로 명시한 실시예에서 사용되었다. 산업적 생산에 적합한, 우유로부터의 고수율의 γ-GT 정제물은 또한 오염성 단백질을 제거하는 파파이 분해, 및 아세톤 침점 (동량의 아세톤 첨가)에 이어 동결건조시켜 제조하였다. 최종의 동결건조된 산물은 초기 활성시 30%의 수율로 23.3U/g의 γ-GT를 함유하고, 정제 계수는 167배였다. 우유 γ-GT를 사용하여 반응 조건하에 예비 시험한 결과, 활성 및 GGC 수율에 있어 신장으로 기원된 효소의 것과는 현저한 차이가 없는 것으로 나타났다. 정제법의 일례는 하기와 같을 수 있다: 우유 유청을 초기에 한외여과시켜 10-배로 농축시키고, 대다수의 오염성 단백질은 적합한 프로테아제, 바람직하게 파파인으로 분해시켜 제거한다. 37℃에서 몇시간동안 분해한 후, 혼합물을 물에 대하여 정용여과시키고, 2-배로 농축시킨다. 황산암모늄 (40% w/v)을 첨가하여 농축물내의 γ-GT를 침전시키고, 형성된 고체를 원심분리에 의해 수집한다. 1% 트리톤 X 1OO을 함유하는 pH 8.5의 0.5M 인산칼륨 완충액에 효소 침전물을 재현탁시키고, 용해되지 않고 남아있는 임의의 고체는 여과시켜 제거한다. 동량의 아세톤을 가하여 농축물내 γ-GT를 침전시키고, 형성된 고체는 원심분리하여 수집한다. 이어서, 고체를 동결건조시켜, 바람직하게 적어도 20 U/mg의 γ-GT를 함유하는 건조 분말을 수득할 수 있다.

하기와 같이 우유로부터 γ-GT를 정제하는 대체 방법이 개발되었다:

트리톤 X-100 (10g)을 4℃에서 강하게 혼합시키면서, 신선한 저온 살균을 하지 않은 우유 (10L, 대략 3U/mL의 γ-글루타밀트랜스펩티다제 함유)에 첨가하였다. 3개의 하기 방법중 우유의 주요 단백질 성분 (카제인, 80%)이 임의의 것에 의해 침전될 수 있다.

종래 방법 (1번)으로는 일반적으로 우유 효소 활성의 50%가 손실된다. 나머지 2개의 방법 (2번 및 3번)으로는 일반적으로 10% 이하가 손실된다. 그로부터의 유청이 폐산물인 상업적 치즈 제조에서 제1 단계를 나타내는 것으로서 방법 1이 주어진다.

1. 20℃에서, 강하게 혼합시키면서, 50%의 아세트산 용액을 천천히 가함으로써 우유 (10L)중 1% 트리톤 X-1OO의 pH를 4.5로 조정하였다. 미세한 나일론 메쉬를 통해 여과시켜 응유 (카제인)을 제거하고, 추가 공정을 위해 유청을 수집하였다.

2. 강하게 혼합시키면서, 키토산 용액 (4.5L, 10mM의 아세트산나트륨중 1%, pH 5.9)을 우유 (10L)중 1% 트리톤 X-100에 가하였다. 미세한 나일론 메쉬를 통해 여과시켜 응유 (카제인)을 제거하고, 추가 공정을 위해 유청을 수집하였다.

3. 4℃에서 강하게 혼합시키면서, 4℃로 냉각된 에탄올 (4.5L)을 우유 (10L)중 1% 트리톤 X-100에 천천히 가하였다. 미세한 나일론 메쉬를 통해 여과시켜 응 유 (카제인)을 제거하고, 추가 공정을 위해 유청을 수집하였다.

상기 3개의 방법중 임의의 것으로부터 제조된 유청에 대하여 하기 방법을 사용할 수 있다. 본 실시예에서는 2번 방법에 의해 제조된 유청을 사용하였다. 1M의 수산화나트륨 사용하여 생성된 유청의 pH를 pH 7.4로 조정하고, 및 1M의 염화칼슘 (100mL)을 가하여 오염성 및 잠재적으로 막오염성인 지질단백질을 침전시켰다. 용액을 30℃에서 4시간동안 인큐베이션시키고, 5,000g으로 15분동안 원심분리하여 고체를 제거하였다. 상등액은 막 필터 (싸토리우스(Sartorius), 하이드로사트(Hydrosart) 0.2㎛, 0.6㎡)를 통해 교차 흐름 여과에 의해 정화시킨 후, 교차 흐름 한외여과 (싸토리우스, 울트라사트(Ultrasart) 10,000Mwt 컷 오프, 0.7㎡)에 의해 초기 부피의 10%까지 농축시켰다. 50mM의 트리에탄올아민 완충액 (20L)에 대하여 정용여과시켜 보유물을 세척하고, 이를 2회에 걸쳐 반복하되, 매회 초기 부피의 10%까지 농축시켰다. 이나트륨 EDTA (1g/L), 시스테인 (0.5g/L) 및 파파인 (3000U)을 보유물 (1.5L)에 첨가하고, 1M의 염산을 첨가하여 pH를 pH 5.0으로 조정하였다. 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켜 오염성 단백질을 가수분해하였다. 이어서, 1M의 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 pH 7.0으로 조정하고, 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 1M의 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 pH 5.0으로 조정하고, 37℃에서 추가로 1시간동안 인큐베이션시켰다. 가수분해물을 15℃까지 냉각시키고, 염화암모늄을 40% 포화시까지 가하였다. 8,000g으로 10분동안 원심분리하여 오염성 단백질 고체를 제거하고, 상등액을 60% 포화 염화암모늄으로 제조하였다. 8,000g으로 10분동안 원심분리하여 생성된 고체 γ-글루타밀트랜스펩티다제 를 수집하고, 물 (200mL)에 재현탁시키고, -20℃에 저장하거나 냉동 건조시켰다. 농축물은 특이 활성이 8U/mg 총 단백질 (로우리 단백질 분석법의 (문헌 [Peterson, Simplification of Protein Assay 5 Method of Lowry Et A1-Which Is More Generally Applicable, Analytical Biochemistry , 1977, 83, 346-56]) 변형에 따라 측정된 단백질)인, 130U/mL의 γ-글루타밀트랜스펩티다제 (87% 수율)를 함유하였다.

1.4 γ- 글루타밀트랜스펩티다제 분석법

반응 샘플을 0.1M의 트리스 완충액 (pH 8.0)에 희석시켜 희석된 샘플중 γ-글루타밀트랜스펩티다제의 최종 농도가 0.02-0.44 유니트/mL 범위가 되도록 하였다. 효소 농도가 상기 범위내인 샘플이 0.060-1.300 흡광도 유니트의 정확한 흡광도 판독치 (410nm)를 제공하였고, 이는 γ-글루타밀-p-니트로아닐리드 분석법의 선형 영역으로서 확인되었다 (데이타로 나타내지 않음). 분취량 (100㎕)을 37℃에서 10분동안 2mM L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드 기질, 0.1M의 글리실글리신, 10mM 염화나트륨 및 pH 8.0으로 조정된 0.1M의 트리스 완충액을 함유하는 반응 혼합물 (900㎕)에 첨가하였다. 1.5N의 아세트산 (2.0mL)을 첨가하여 반응을 퀸칭시키고, 410nm에서 흡광도를 측정하였다 (p-니트로아닐린에 대한 ε_{410 nm}은 8800M^-1 cm^-1이다). 37℃, pH 8.0에서 1분간 1㎛ole의 p-니트로아닐리드를 유리시키는 효소의 양을 γ-글루타밀트랜스펩티다제 1 유니트로 정의하였다. 본 연구에서 사용된, 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co.)에 의해 공급받은 γ-글루타밀트랜스펩티다제 는 (문헌 [Szewczuk, A. and T. Baranowski, Purification and Properties of γ-Glutamyltranspeptidase from Beef Kidney. Biochimische Zeitschrift, 1963. 338(338): p. 317-329])에 기재된 바와 같이 소 신장으로부터 추출되어진, 동결건조된 원료였고 - 정제된 효소의 최적의 pH는 pH 8.8-9.0였다. 효소 활성은 7.2U/mg 고체인 것으로 측정되었다.

1.5 γ- 글루타밀메틸아미드의 합성 (문헌 [Lichtenstein, N. Preparation of γ-alkylamides of glutamic acid. Journal of the American Chemical Society, 1942. 64: p.1021-1022])로부터 개조됨

피롤리돈카복실산 (2.5g)을 17% 메틸아민 수용액 (30mL)에 용해시키고, 37℃에서 10일동안 밀봉된 병에서 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물을 결정화 접시로 옮기고, 데시케이터내에서 황산 위에 놓고, 감압하에서 1일동안 농축시켰다. 생성된 시럽을 에탄올 (25mL)으로 문지르고, 4℃에서 밤새도록 정치시켰다. 부흐너 깔대기에서 여과하여 생성된 결정질 침전물을 수집하고, 냉 에탄올로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다.

1.6 시스테인- 머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 합성

1.6.1a 시스틴 티오설포네이트 합성

시스틴 (9.6g)을 자기 교반기, 온도계가 장착된 500mL의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 혼합시키면서 포름산 (88%; 222mL)을 첨가하였다. 용액의 온도를 2O℃로 유지시켜야 할 때 플라스크를 얼음 배쓰에 침지시켜 플라스크를 냉각시켰다. 진한 염산 (36%; 8mL)을 천천히 첨가한 후, 일정하게 교반시키면서 과산화수소 (30%; 10mL)를 천천히 첨가하였다. 2.5시간동안 20℃에서 교반한 후, 용매는 감압하게 5O℃로 설정된 수조를 갖는 회전식 증발기상에서 제거하였다. 물 (100mL)을 생성된 진한 시럽에 첨가한 후, 수산화암모늄 (26%; ~10mL)을 첨가하여 pH를 pH 3.5로 조정하였다. 플라스크를 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 빙냉수 (30mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다.

1.6.1b 시스테인- 머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 ( Cys - Merc ) 합성

물 (25mL)중 머캅토에탄올 (1.02g; 13mmol) 용액을 2M의 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.3으로 조정하였다. 2M의 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.3으로 조정된, 물 (70mL)중의 시스틴 티오설포네이트 (4.17g; 16.3mmol)는 일정하게 교반시키면서 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새도록 실온에서 교반한 후, 3 x 50mL부(portion)의 에틸아세테이트로 추출하여 미반응 머캅토에탄올을 제거하였다. 이어서, 수성상은 2M의 수산화나트륨을 사용하여 pH 5.2로 조정하고, 용매는 감압하에 6O℃로 설정된 수조를 갖는 회전식 증발기상에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 뜨거운 물 (50mL)에 용해시키고, 부흐너 깔대기에서 와트만 번호 1번 종이를 통해 여과시킴으로써 정화시켰다. 지속적으로 혼탁하게 될 때까지 가온 이소프로필 알코올 (대략 100mL)을 여액에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 30%(v/v) 이소프로필 알코올 (30mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다.

상기 기술된 바와 같이 시스틴 티오설포네이트 중간체를 통해 시스테인-머캅토에탄올을 합성하는 것 이외에도, 수개의 대체 방법이 가능하고, 이를 하기에 기술한다.

1.6.2 시스테인- 머캅토에탄올 디설파이드의 대안적 합성 (문헌 [Schoberl, A. Synthese und reaktions weise von unsymmetrischen disulfiden .6. Aminocarbonsauren und haarkeration mit unsymmetrisch eingebauten disulfidaustausches. Annalen Per Chemie - Justus Liebig, 1958. 617(1-3): p.71-88)] 및 [Nagasawa et al ("Mixed disulfides of L-cysteine and its derivatives with 2-mercaptoethanol" Organic Preparations and Procedures International ( Briefs ), 1996. 28(2): p. 237-241])로부터 개조됨

2-하이드록시에틸 디설파이드 (머캅토에탄올 디설파이드) (7.7g)를 자기 교반기 및 온도계가 장착된 50OmL의 둥근 바닥 플라스크중 메탄올 (100mL)에 용해시켰다. 용액의 온도를 2O℃로 유지시켜야 할 때 플라스크를 얼음 배쓰에 침지시켜 플라스크를 냉각시켰다. 25%(w/v) 아세트산 (100 ml)에 용해된 퍼아세트산 (3.8g)은 일정하게 교반시키면서 천천히 첨가하였다. 3시간동안 교반한 후, 용매는 감압하에 6O℃로 설정된 수조를 갖는 회전식 증발기상에서 제거하였다. 물 (10OmL)을 생성된 진한 2-하이드록시에틸 티올설피네이트 시럽에 첨가하고, 2M 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.5로 조정하였다. pH 6.5로 조정된, 물 (15OmL)중의 교반된 시스테인 (1Og) 용액에 2-하이드록시에틸-티올설피네이트 용액을 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새도록 교반한 후, 3 x 10OmL부의 에틸아세테이트로 추출 하여 미반응 2-하이드록시에틸 티올설피네이트를 제거하였다. 이어서, 2M 수산화나트륨을 사용하여 수성상을 pH 5.2로 조정하고, 용매는 감압하에 6O℃로 설정된 수조를 갖는 회전식 증발기상에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 뜨거운 물 (20OmL)에 용해시키고, 부흐너 깔대기에서 와트만 번호 1번 종이를 통해 여과시킴으로써 정화시켰다. 지속적으로 혼탁하게 될 때까지 가온 이소프로필 알코올 (대략 300mL)을 여액에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 30%(v/v) 이소프로필 알코올 (30mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. (문헌, [Jocelyn, P. C, Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzymology, 1987. 143: p. 246-56])에 기재된 바와 같이 표준 환원 조건하에서 머캅토에탄올기는 용이하게 제거된다.

1.6.3a 시스틴- 머캅토에탄올 디설파이드 대안적 합성 - 시스틴 티올설피네이트 (S- 모노옥시드 ) 합성 - 문헌 [Walti, M. Synthesis of isomers of mono- and di-hydroxy-analogues of cystine and comparison with metabolites excreted in urine. Journal of the Chemical Society C- Organic. 1971. (12): p.2326-&]으로부터 개조됨

시스틴 (1Og)을 자기 교반기 및 온도계가 장착된 50OmL의 둥근 바닥 플라스크중 2N 황산 (10OmL)에 용해시켰다. 용액의 온도를 0℃로 유지시켜야 할 때 플라스크를 얼음 배쓰에 침지시켜 플라스크를 냉각시켰다. 아세트산 (100 ml)에 용해된 1M 퍼아세트산 (83mL) 용액은 일정하게 교반시키면서 천천히 첨가하였다. 혼합 물을 0℃에서 밤새도록 유지시킨 후, 냉 피리딘을 사용하여 pH 4로 조정하였다. 에탄올 (500ml)을 혼합물에 첨가하고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 먼저 메탄올 (10OmL)로 세척한 후, 이어서, 에테르 (50mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. 머캅토에탄올를 사용하여 혼합된 디설파이드를 제조하기 위하여 생산된 시스틴 티올설피네이트를 하기의 합성에서 사용할 수 있다.

1.6.3b 시스테인- 머캅토에탄올 디설파이드의 대안적 합성 (문헌 [Walti, M. Synthesis of isomers of mono- and di-hydroxy-analogues of cystine and comparison with metabolites excreted in urine. Journal of the Chemical Society C-Organics, 1971. (12): p.2326-&] 및 [Nagasawa et al ("Mixed disulfides of L-cysteine and its derivatives with 2-mercapto에탄올" 유기 Preparations and Procedures International ( Briefs ), 1996. 28(2): p. 237-241])로부터 개조됨

2M 수산화나트륨을 사용하여 물 (25mL)중의 머캅토에탄올 (3.9g; 50mmol) 용액을 pH 6.3으로 조정하였다. 2M 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.3으로 조정된, 상기와 같이 제조된 물 (10OmL)에 용해되어 있는 시스틴 티올설피네이트 용액은 일정하게 교반시키면서 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새도록 실온에서 교반한 후, 3 x 5OmL부의 에틸아세테이트로 추출하여 미반응 머캅토에탄올을 제거하였다. 반응 산물을 상기 실시예에 기술된 바와 같이 후처리하였다: 이어서, 2M 수산화나트륨을 사용하여 수성상을 pH 5.2로 조정하고, 용매는 감압하에 6O℃로 설정 된 수조를 갖는 회전식 증발기상에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 뜨거운 물 (20OmL)에 용해시키고, 부흐너 깔대기에서 와트만 번호 1번 종이를 통해 여과시킴으로써 정화시켰다. 지속적으로 혼탁하게 될 때까지 가온 이소프로필 알코올 (대략 300mL)을 여액에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 30%(v/v) 이소프로필 알코올 (30mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다.

1.6.3c 시스테인- 머캅토에탄올 디설파이드의 대안적 합성

2-하이드록시에틸 디설파이드 (2-머캅토에탄올 디설파이드) (23.3g) 및 시스테인 (12.1g)을 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크중 물 (500mL)에 용해시키고, 수산화나트륨 (2M)을 사용하여 용액의 pH를 pH 8.5로 조정하였다. 플라스크를 37℃로 자동 온도 조절되는 수조에 넣고, 분취량 (100㎕)의 염화구리 용액 (100mg/mL)을 가하였다. 18시간동안 스테인레스 스틸 프릿을 통해 대기중에서 버블링시킴으로써 혼합물을 왕성하게 포기시켰다. 반응 기간동안 때때로 pH를 체크하고, 필요할 경우, 묽은 염산을 첨가하여 pH를 pH 8.5로 조정하였다. 반응 혼합물중 티올의 농도는 엘만 시약(Ellman's reagent)을 사용하여 분광광도계로 편리하게 모니터하였다. 반응 혼합물을 분취량을 엘만 시약에 첨가하였을 때 황색 색상이 형성되지 않는 것이 관찰될 경우 반응은 종결된 것으로 간주하고, 이로써, 티올 모두가 디설파이드로 산화된 것으로 나타내었다. 구리 이온_{( II )}에 대하여 고도의 선택성을 갖는 킬레이트화 수지, 예로서, 켈렉스(Chelex) 100 수지 (바이오-래드(Bio-Rad))의 칼럼 (1 x 3 cm)을 통해 통과시킴으로써 생성된 반응 혼합물중 구리 이온을 제거하였다. 생성된 반응 혼합물은 0.2M의 Cys-Merc을 함유하였고, GGC 또는 그의 유도체 생산을 위한 추후의 효소 촉매화된 반응에서 직접 사용될 수 있거나, Cys-Merc는, 동량의 아세톤을 첨가하고, 아세트산을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 5.2로 조정하여 단리시킬 수 있다. 자발적으로 결정화되고, 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시켰다. 생성된 결정질 현탁액을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 50% 아세톤으로 세척하고, 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. 건조시, Cys-Merc (17.9g, 이론치 수율 91%)를 수득하였다.

1.7 시스틴 디메틸 에스테르 디하이드로클로라이드 ( CDME ) 합성

건성 염화수소 기체 스트림을 신속하게 무수 메탄올 (50mL)중 시스틴 (10g) 현탁액에 분사하고, 자기 교반기를 사용하여 교반하였다. 모든 시스틴이 용해된 후, 가온 용액을 얼음 배쓰에서 냉각시키고, 0-5℃에서 포화시까지 HCl을 계속하여 분사시켰다. 염화칼슘 건조 튜브를 사용하여 대기 수분으로부터 반응 혼합물을 보호하고, 실온에서 3시간동안 정치시켰다. 용매는 감압하에 5O℃로 설정된 수조를 갖는 회전식 증발기상에서 제거하였다. 분취량의 메탄올 (50mL)을 생성된 시럽에 첨가한 후, 회전식 증발에 의해 농축시키고, 이를 반복하였다. 자발적으로 결정화시키면서 무수 에테르 (20mL)를 건성의 시럽형 잔류물에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 결정질 현탁액을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 무수 에테르 (30mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에서 수산화칼륨 펠릿상에서 건조시켰다.

1.8 다른 수용성 시스테인(시스틴) 유도체의 합성

1.8.1 S- 아세트아미도알킬 유도체

S-아세트아미도메틸시스테인 하이드로클로라이드의 합성. (문헌 [Milkowski, J. 0 D. Thiol protection with the acetamidomethyl group - S-acetamidomethyl-L-cysteine hydrochloride. Organic Syntheses, 1988. 5: p.5-8])로부터 개조됨.

1ℓ의 둥근 바닥 플라스크내에서, N-(하이드록시메틸)아세트아미드 (127g), 및 시스테인 하이드로클로라이드 모노하이드레이트 (228g)를 물 (35OmL)에 용해시켰다. 진한 염산 (5OmL)을 천천히 가하면서 생성된 용액을 와류시키고, 얼음 배쓰에서 냉각시켰다. 플라스크는 질소를 사용하여 플러쉬(flush)하고, 질소-충진된 풍선을 사용하여 캡핑하고, 1-2일동안 실온에서 정치시켰다. 전개 용매로서 10:2:3 (v/v/v)의 1-부탄올, 아세트산, 및 물의 용액을 사용하여 실리카겔 60F-254 예비피복된 플레이트 (머크(Merck))상에서 실시될 수 있는 TLC에 의해 반응 진행을 모니터하였다. UV 광으로, 또는 닌히드린을 사용하여 스팟을 가시화할 수 있다. 더이상 시스테인 하이드로클로라이드를 검출할 수 없을 때, 용액을 감압하에 약 40℃의 배스 온도에서 증발시켰다. 남아있는 고체를 소량의 무수 에탄올에 현탁시키고, 충돌을 막기 위해 혼합물을 다시 조심스럽게 증발시켰다. 무수 에탄올을 사용하여 비말 동반 방법을 수회에 걸쳐 반복함으로써 미량의 물을 제거하였다. 건성 고체를 최소량의 메탄올에 용해시키고, 운점에 도달할 때까지 무수 디에틸 에테르 를 첨가하였다. 혼탁한 용액을 4℃에서 1주동안 정치시키고, 상기 기간동안 결정질 덩어리를 수회에 걸쳐 분해시켰다. 백색 결정질 산물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 에테르로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. S-아세트아미도메틸시스테인 유도체를 펩티드전이 반응에서 수용체로서 직접 사용할 수 있었고, S-아세트아미도메틸은 요오드 또는 Hg(_II) 염과의 반응을 비롯한 다양한 방법에 의해 제거할 수 있었다.

1.8.2 S- 설포시스테인

S-설포시스테인 나트륨 염 디하이드레이트의 합성. (문헌 [Maugras, I. Peptide-synthesis using novel S-sulfocysteine derivatives. International Journal of Peptide and Protein Research, 1995. 45(2): p.152-156])으로부터 개조됨.

물 (10OmL)중 시스테인 하이드로클로라이드 디하이드레이트 (10.54g) 용액에 1M 수산화나트륨 (6OmL) 및 나트륨 테트라티오네이트 디하이드레이트 (18.38g)를 연속하여 첨가하였다. 1시간동안 실온에서 교반한 후, 반응을 종결시켰다 (상기 기술된 바와 같이 TCL 모니터링). 반응 혼합물을 감압하에 회전식 증발기상에서 그의 부피의 ½까지 농축시키고 4℃에서 밤새도록 방치하였다. 생성된 고체는 여과하여 제거하고, 폐기하였다. 수시간동안 4℃에서 정치시킨 후, 여액으로부터 침전된 황을 여과에 의해 제거하였다. 감압하에 회전식 증발기상에서 여액의 부피를 10OmL까지 감소시키고, 에탄올 (80OmL)을 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 70%(w/v) 에탄올로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. S-설포시스테인 유도체는 펩티드전이 반응에서 수용체로서 직접 사용될 수 있거나, (문헌 [Stapleton, I. W. Amino acids and peptides .9. Some unsymmetrical disulphides derived from cysteine. Australian Journal of Chemistry, 1962. 15(3): p.570-&])에 기재된 바와 같이 원하는 티올과의 반응에 의해 시스테인의 혼합된 디설파이드를 합성하기 위하여 사용될 수 있다. S-설포기는 (문헌 [Jocelyn, P. C, Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzvmology., 1987. 143:p. 246-56])에 기재된 바와 같은 표준 환원 조건하에서 용이하게 제거되었다.

1.8.3 시스틴의 알킬 에스테르

시스틴 디메틸 에스테르를 합성하기 위하여 하기 방법을 사용할 수 있고, 임의로는 규모를 확장시킬 수 있다. 환류하에서 메탄올 (30OmL)중 시스테인 (20g) 현탁액을 2시간동안 일정하게 건성 염화수소 기체를 통해 버블링시켰다. 실온에서 추가의 1시간 후, 반응 혼합물을 감압하에 회전식 증발기상에서 농축시키고, 메탄올 (50mL)을 첨가하고, 건조될 때까지 반복하여 증발시켰다. 건성 잔류물을 에테르 (50mL)로 희석하고, 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집될 수 있는 결정질 현탁액을 수득한 후, 에테르로 세척하였다. 이어서, 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에서 실리카 및 수산화나트륨 펠릿상에서 건조시켰다.

시스틴의 모노메틸 에스테르 합성은, 단지 ½ 몰 당량의 메탄올을 사용하여 염화수소 기체를 사용하여 클로로포름 용액중의 시스틴/메탄올 용액을 포화시키고, 1시간동안 완만하게 환류할 때까지 가열한 후, 대략 1시간동안 실온으로 냉각시키는, 유사한 경로에 의해 실시할 수 있다. 상기 실시예에 기술된 바와 같이 반응 산물을 후처리하였다.

1.8.4 S- 알콕시카보닐설페닐 유도체

S-메톡시카보닐설페닐시스테인 하이드로클로라이드 합성. (문헌 [Rietman, B. H. A facile method for the preparation of S-(alkylsulfenyl)cysteines. Synthetic Communications, 1994. 24(9): p.1323-1332])로부터 개조됨.

무수 메탄올 (38mL)중 시스테인 하이드로클로라이드 (4.46g)의 용액에 염화수소를 사용하여 그를 통해 단기간동안 버블링시켰다. 혼합물을 메탄올 (4OmL)중 메톡시카보닐설페닐 클로라이드 (5ml)의 용액에 천천히 점적시키고, 0℃에서 자기적으로 교반하였다. 1시간 후 교반 반응은 종결되고, 용매를 감압하에 회전식 증발기상에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 에테르로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. S-메톡시카보닐설페닐시스테인 유도체는 펩티드전이 반응에서 수용체로서 직접 사용될 수 있거나, (문헌 [Brois, S. J., et al. A new pathway to unsymmetrical disulfides. The thiol-induced fragmentation of sulfenyl thiocarbonates. Journal of the American Chemical Society, 1970. 92(26): p.7629] 및 [Rietman, B. H. A facile method for the preparation of S- (alkylsulfenyl)cysteines. Synthetic Communications, 1994. 24(9): p.1323-1332])에 기재된 바와 같이, 원하는 티올과의 반응에 의해 시스테인의 혼합된 디설파이드를 합성하기 위하여 사용될 수 있다. S-메톡시카보닐설페닐기는 (문헌 [Jocelyn, P. C, Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzvmology., 1987. 143: p. 246-56])에 기재된 바와 같이, 표준 환원 조건하에서 용이하게 제거하였다.

1.8.5 S- 아세틸시스테인

S-아세틸시스테인의 합성. (문헌 [Galzigna, L., et al. S-acetyl-glutathione and S-phenylacetyl-glutathione as glutathione precursors in rat plasma and tissue preparations. Enzyme & Protein. 1994. 48(2): p.98-104])으로부터 개조됨.

질소 블랭킷(blanket)하에 교반시키면서, 아세틸 클로라이드 (9.57g)를 실온에서 트리플루오로아세트산 (200ml)중 시스테인 (6.09g) 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 40℃까지 가열하고, 약 20분후에 물 (5ml)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 40℃에서 추가의 20분동안 인큐베이션시킨 후, 용매를 감압하에 회전식 증발기상에서 제거하고, 생성된 오일을 에틸아세테이트에 용해시켰다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 침전물을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하였다. 조 침전물을 가온 (40℃) 아세톤/물 (2/1, 200ml)에 용해시켰다. 약 2시간동안 빙수조에서 냉각시킨 후, 수득한 용액을 더 많은 아세톤 (100ml)으로 추가적으로 희석시키고, 형성된 백색 결정질 물질은 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하고, 차가운 용매 혼합물로 세척하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. S-아세틸시스테인 유도체는 펩티드전이 반응에서 수용체로서 직접 사용될 수 있거나, S-아세틸기는 산성 또는 알칼리성 가수분해에 의해 제거될 수 있다.

1.8.6 S- 에틸아미노카보닐 -L-시스테인

시스테인 하이드로클로라이드 (158g)를 디메틸포름아미드 (1.5L)에 용해시키고, 0℃에서 에틸 카바메이트 (EtNCO, 78.3g)로 처리하고, 70시간동안 20℃에서 정치시켰다. 용매를 감압하에서 제거하고, 점성 잔류물을 디에틸 에테르로 분쇄하고, 물 (2L)에 용해시키고, pH 6.5로 조정하고, 감압하에서 증발시켜 1.3L로 농축시켰다. 0℃에서 밤새도록 농축물을 결정화시켜 131g을 수득하였다. S-에틸아미노카보닐-L-시스테인. S-에틸아미노카보닐기는 산성 및 중성 조건하에서는 안정성이지만, 이는 염기성 시약에 의해서는 용이하게 절단되지 않는다; 시스테인의 탈황화도 라세미화도 관찰되지 않았다 (문헌 [Guttmann, S., Synthesis of glutathione and oxytocin by using a new thiol protecting group, Helvetica Chimica Acta, 1965, 49, 83-96])로부터 개조됨).

1.9 글루탐산 γ-에틸 에스테르의 합성

글루탐산 (70g)을 에탄올 (450mL)에 현탁시키고, 자기 교반기 및 온도계가 장착된 둥근 바닥 플라스크 (1L)에 채웠다. 반응 혼합물의 온도를 27℃로 유지시키면서, 황산 (56g, 96% (w/v))는 강하게 혼합시키면서 현탁액에 적가하였다. 황산 첨가하는 것을 마친 후, 반응물을 실온에서 2시간동안 유지시켰다. 이어서, 혼 합물을 O℃로 냉각시키고, 이것에 수산화칼륨 용액 (230mL의 물중 64g)을 적가하였다. 플라스크를 냉각시킴으로써 중화시키는 동안 온도를 10℃ 미만으로 유지시켰다. 중화 후 형성된 슬러리를 여과하고, 에탄올 (79mL) 및 물 (40g)로 구성된 혼합물로 필터 케이크를 세척하였다. 수집한 고체를 건조시켜, 황산칼륨 (99g)을 수득하였다.

여액을 세척액을 배합하고, 혼합물을 감압하에 회전식 증발기에 의해 중량 82g까지 농축시켰다. 생성된 시럽에 에탄올 (105mL)을 첨가하여 자발적으로 결정화시켰다. 혼합물을 4℃에서 밤새도록 정치시키고, 생성된 결정질 현탁액을 부흐너 깔대기에서 여과하여 수집하였다. 필터 케이크를 데시케이터내 감압하에 실리카겔상에서 건조시켰다. 건조시, 글루탐산 γ-에틸 에스테르 (67g, 이론치 수율 80%)를 수득하였다 (융점 191℃).

1.10 고정화된 γ- 글루타밀트랜스펩티다제 제조

제1형 소 신장 γ-GT (100mg, 시그마-알트리트(Sigma-Aldrich))를 플라스틱 튜브 (20mL 부피)중의 pH 8.5인 1M의 인산칼륨 완충액 (6mL)에 용해시켰다. 완만하게 혼합시키면서 유퍼지트® C250L 활성화된 고정화 수지 비드 (1g)를 가하고, 실온에서 3일동안 흐트러지지 않게 인큐베이션시켰다. 흡인시키면서 비드를 소결 유리 필터상에서 수집하고, pH 8.5인 0.1M의 인산칼륨 완충액으로 광범위하게 세척하였다. 고정화된 효소를 4℃에서 0.5g/L의 메틸 p-하이드록시벤조에이트를 함유하는 동일환 완충액에 저장하였다.

흡인 건조시킨 고정화된 효소 (10mg)를 에펜돌프에 넣고, 튜브 가열 블록에 서 예비가온시켰다. γ-GT 분석법 완충액 (1mL)을 가하고, 튜브를 5분동안 1분간격으로 잘 혼합하였다. 이어서, 튜브를 수초동안 원심분리시키고, 1.5M의 아세트산 (2mL)을 함유하는 큐베트에 상등액을 분배하였다. 410nm에서의 흡광도를 분광 광도계로 측정하고, 활성 (U/g)를 실시예 1에서와 같이 산출하였다.

실시예 2 - 아미드 결합된 γ- 글루타밀 공여체를 사용하는 γ- 글루타밀시스테인 ( GGC ) 합성

시스틴 (36mg, 3mM)을 가온시키면서 pH 8.5인 50mM 인산나트륨 완충액 (50mL)에 용해시켰다. L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드 (GPNA) (4mg, 1.5mM)를 함유하는 시험 튜브에 분취량 (1OmL)을 분배하고, 10% NaOH를 사용하여 pH를 pH 8.5로 조정하였다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션시키고, γ-GT (3mg, 2.2U/mL)를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 15분, 30분 및 90분 간격으로 샘플 (0.5mL)을 취하고, 동량의 4.5% (w/v) 인산을 첨가함으로써 반응을 퀸칭하였다. HPLC 분석에 앞서 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 90분동안 인큐베이션시킨 후, 시스틴상에서의 21% 및 GPNA상에서의 42%인 최대 이론치에 기초한 수율로 반응물은 156mg/L의 GGC를 함유하였다. 상기 기술한 바와 같이 반응을 반복하고, 원 기질 농도 (시스틴; 16.6mM, GPNA 8.4mM)의 5.5배는 pH 8.5에서의 100mM 인산염 완충액중 GPNA 및 시스틴, 양자 모두의 용해도 한계와 일치하였다. GGC (1.4g/L)의 최대 농도는 30분동안 인큐베이션시킨 후에 도달하였고, 수율은 GPNA상에서 66.5% 및 시스틴상에서 34%였다. 기질 L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드 $50.90/g (시그마)의 비용이 고가이기 때문에 상기 반응이 경제적으로 실현가능하다고 보기는 어렵다. 고가의 비용 은 기질 제조에 필요한 복합 및 다중 단계 합성과 관련된다.

실시예 3 - 에스테르 결합된 γ- 글루타밀 공여체를 사용하는 γ- 글 루타밀시스테인 ( GGC )의 합성

γ-글루타밀 공여체로서 L-글루타민 및 γ-글루타밀 에스테르를 사용하여 GGC를 합성하는 것은 수용액에서 실시하였다. 시험 튜브중의 글루타민 (14.6mg, 10mM) 및 글루탐산 γ-메틸 에스테르 (GME) (16mg, 10mM)에 시스틴 (50mg, 20mM)을 따로따로 첨가하였다. 각 튜브의 내용물을 100mM 인산나트륨 완충액 (10mL)에 용해시키고, 2M의 NaOH를 사용하여 pH 8.5로 조정하였다. γ-GT (3mg, 2.2U/mL)를 첨가하여 반응을 개시하고, 튜브를 37℃에서 인큐베이션시키고, 24시간에 걸쳐 주기적으로 샘플을 취하였다. GGC의 수율은 대략 5시간 인큐베이션하였을 때 피크였고, GME를 사용하여 생산된 78.4mg/L의 GGC 수율 (γ-글루타밀 공여체 기준)은 3.1%였고, 글루타민을 사용하여 생산된 1.5mg/L GGC의 수율을 1% 미만이었다.

실시예 4 - 반응 혼합물중 수 - 혼화성 용매 포함

하기 수-혼화성 유기 용매; 아세토니트릴, 디메틸설폭시드, 디옥산, 및 디메틸포름아미드 (DMF)를 초기에 시스틴을 용해시키는 그들의 능력에 대하여 물과의 50:50의 비율로 시험하였다. 용매 DMF는 그의 용매화 성질이 우수하기 때문에 정선된 유기 공용매인 것으로서 확인되었다. 그러나, 다른 용매 혼합물중의 Cys-Merc 유도체의 용해도는 알려지지 않은 바, 조사해 볼 만한 가치가 있을 수 있다.

50% DMF 의 존재하에 GME 를 사용하는 GGC 합성

시스틴 (50mg, 20mM) 및 γ-글루타밀 메틸 에스테르 (GME, 16mg, 10mM)를 시 험 튜브에 넣었다. 튜브의 내용물을 초기에 100mM 인산나트륨 완충액 (5mL)에 용해시키고, 동량의 디메틸포름아미드 (DMF) (5mL)를 첨가하였다. γ-GT (3mg, 2.2U/mL)를 첨가하여 반응을 개시하고, 24시간에 걸쳐 주기적으로 샘플을 취하였다. GGC의 수율은 대략 9시간 인큐베이션하였을 때 피크였고, GME상에서 18.6% 및 시스틴상에서 9.3%의 수율로 465mg/L의 GGC를 수득하였다. 상기 반응을 반복하였고, pH 9.0 초과에서는 시스틴의 용해도가 현저하게 증가하는 바, 시스틴의 최고로 가능한 농도 (포화 용액) (대략 30mM)를 사용하는 반응은 pH 9.1에서 실시되었다. 인산염 완충액은 pH 9.1에서는 효능이 없는 바, 디에탄올아민 (DEA) 완충액으로 대체하였다. GGC의 수율에 있어 유의적인 개선은 관찰되지 않았고, 이는, 반응이 실용 가치가 있도록 하기 위해서는 시스틴의 용해도가 상당 수준으로 개선될 필요가 있음을 시사한다.

실시예 5 - 시스테인 유도체를 사용하는 γ- 글루타밀시스테인 ( GGC )의 합성

반응이 실용적 가치가 있는지를 결정하는 기준은 제안된 효소 생체공정을 위한 단위 부피당의 생산성이 되는 바, 시스틴의 용해도 한계는 이미 대략 30mM (9g/L)에 도달하였기 때문에 기질의 농도가 현저히 증가되어야 했다.

● 용매 시스템에서 용해도 증가,

● 수용체에 대한 효소 활성에 있어서 유의적 손실은 없음,

● 화학적 유도체는 유리 GGC를 유리시키기 위해서는 용이하게 제거되어야 한다는 기준을 충족시켜야 하는 시스틴의 일련의 화학적 유도체를 평가하였다.

가용성 티올, 예로서, 머캅토에탄올과 시스테인의 혼합된 (비대칭) 디설파이 드의 형성은 공지되어 있다. Cys-Merc 유도체의 용해도 증가 (~20g/L)와는 별도로, 이러한 유형의 디설파이드 결합된 보호기가 갖는 장점은 환원적 방법에 의한 제거가 용이하다는 점, 예로서, 과량의 환원제, 예로서, 머캅토에탄올로 디설파이드-설피드릴 평형을 변경시킨다는 점이다.

효소 활성을 유지하되, 보다 가용성 형태인 시스틴을 생산하기 위하여 시스틴의 화학적 유도체화를 시도하였다. 시스틴과 머캅토에탄올 (Cys-Merc)의 혼합된 디설파이드는 실시예 1.5.1에 기술된 바와 같이 합성하고, 대략 50%의 수율로 수득하되, 2개의 단계 각각에서는 시스틴에 기초하여 25%의 누적 수율을 수득하였다. 시스틴 디메틸 에스테르 디하이드로클로라이드 (CDME) 또한 실시예 1.7에 기술된 바와 같이 시스틴에 기초하여 90%의 수율로 합성하였다. 유도체 양자 모두는 상대적으로 높은 수용해도 (Cys-Merc ~20g/L, CDME >20g/L)를 갖는 것으로 측정되었다.

pH 9.0하에 50:50 물: DMF 에서 GME (100 mM )을 사용하는 GGC 합성을 위한 수용체로서 2개의 시스틴 유도체 CDME 및 Cys - Merc (100 mM )의 비교

시험 튜브중의 시스틴 디메틸 에스테르.HCl (CDME) (343mg, 100mM) 및 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드 (Cys-Merc) (199mg, 100mM)에 글루탐산 γ-메틸 에스테르 (GME, 161mg, 100mM)를 따로따로 첨가하였다. 각 튜브의 내용물을 초기에 200mm 디에탄올아민 (DEA) (5mL)에 용해시키고, 동량의 DMF (5mL)를 첨가하였다. 5M의 HCl를 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 9.0으로 조정하고, γ-GT (12.5mg, 9U/mL)을 가하여 반응을 개시하였다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션시키고, 21시간에 걸쳐 주기적으로 샘플을 취하였다. 메틸 에스테르기를 제거하기 위 하여, 1M의 NaOH (250㎕)을 함유하는 에펜돌프 튜브에 CDME 반응물 (250㎕)로부터 취한 샘플을 분배하고, HPLC 분석에 앞서 6O℃ 15분동안 인큐베이션시켰다.

시스틴 유도체 양자 모두는 용매 혼합물 (~20g/L)에 용이하게 가용성이었다. 21시간의 인큐베이션 후, Cys-Merc 수용체 기질을 사용하였을 때 GGC의 최대 농도는 4.7g/L이고, 양 기질 모두에 대한 수율은 18.8%에 도달하였다 (도 1 참조). 12시간의 인큐베이션 후, CDME 수용체 기질을 사용하였을 때 GGC의 최대 농도는 1.6g/L이고, 양 기질 모두에 대한 수율은 6.3%에 도달하였다.

가용성인 2개의 시스틴 유도체, Cys-Merc 및 CDME를 평가함으로써, 동일한 반응 조건하에서 GGC의 최종 농도는 포화된 비유도성 시스틴을 함유하는 이전 반응과 비교할 때 거의 7-배 증가될 수 있다는 것이 입증되었다. 유도체 Cys-Merc는 CDME보다 3배 더 효과적인 γ-글루타밀 수용체였고, 21시간의 인큐베이션 후 반응 혼합물을 4.7g/L GGC를 함유하였고, 양 기질 모두에 대한 수율은 18.8%였다.

실시예 6 - Cys - Merc 와 1:1 및 1:2 비율인, 글루탐산의 γ- 메틸 및 γ-에틸 에스테르가 GGC 의 수율에 미치는 효과

수용체 및 공여체 기질의 비율의 차이가 GGC 수율 및 에스테르 치환체에 미치는 효과를 조사하였다. 200mM의 DEA를 함유하는 50:50 DMF/물 (40mL)에 유도체 Cys-Merc (796mg, 100mM)를 용해시켰다. 분취량 (1OmL)을 4개의 시험 튜브에 분배하고, 하기의 각각의 γ-글루타밀 에스테르 기질: GME (80mg, 50mM), GME (161mg, 100mM), 글루탐산 γ-에틸 에스테르 (GEE) (88mg, 50mM), 및 GEE (175mg, 100mM).을 튜브에 용해시켰다. 5M의 HCl 또는 2M의 NaOH를 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 9.0으로 조정하고, γ-GT (7mg, 5U/mL)를 첨가하여 반응을 개시하였다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션시키고, 10시간에 걸쳐 주기적으로 샘플을 취하였다. 효소의 안정성을 측정하기 위하여 10시간된 샘플상에서 γ-GT 효소 활성 분석법 (실시예 1)를 실시하였다.

글루탐산의 γ-에틸 에스테르 (GEE)를 사용한 결과, γ-메틸 에스테르 (GME)와 비교할 때 GGC의 수율은 40% 증가하였다. 10시간의 인큐베이션 후, 100mM의 동몰의 반응물에서 GGC의 최대 농도는 7.6g/L이고, GEE 및 Cys-Merc상에서 수율은 30.4%에 도달하였다 (표 1).

4개의 반응물 모두의 동역학은 γ-에틸 에스테르와 유사한 경향을 따랐고, 양 몰비 모두에서 γ-메틸 에스테르보다 40% 더 많은 GGC가 수득되었다 (표 1 참조). 10시간된 샘플중 γ-GT의 활성은 0.8U/mL이였고, 이는 효소 안정성인 현저히 손실되었음을 (84%) 시사하는 것이다. 수용체 Cys-Merc의 몰비가 2배일 때, GEE상에서의 수율은 48%까지 증가하였고, 동시에 Cys-Merc상에서의 수율은 24%까지 감소하였다. GEE 대 Cys-Merc의 몰비를 2:1로 증가시키는 것은 Cys-Merc상에서의 GGC의 수율을 30% 초과로 증가시키지 못했고, GEE상에서의 수율을 15% 미만으로 저하시켰다. 아미노분해 반응에 대한 γ-에틸 에스테르의 반응성의 증가는 아마도 γ-에틸기의 보다 강한 전자 흡인 효과에 기인하는 것으로 간주진다.

표 1 - 에스테르 치환체 및 몰비가 9.5시간된 반응 샘플중의 GGC 수율에 미치는 효과

기질	몰비 (Glu:Cys)	GGC (g/L)	Glu 공여체상에서의 GGC 수율(%)	Cys-Merc상에서의 GGC 수율(%)
γ-메틸 에스테르	1:2	3.8	30.7	15.3
γ-메틸 에스테르	1:1	4.6	18.3	18.3
γ-에틸 에스테르	1:2	6.0	48.1	24.0
γ-에틸 에스테르	1:1	7.6	30.4	30.4

수용체 (Cys-Merc) 대 γ-글루타밀 에스테르의 비를 증가시켰을 때 GEE상에서의 수율은 증가하였지만, 시스틴이 공여체 (GEE)보다 현저하게 더많이 비싸기 때문에 Cys-Merc상에서의 GGC 수율을 최적화하는 것이 필수적인 바, 이로써, 모든 추후의 반응은 동몰로 실시되었다.

실시예 7 - 반응 pH 가 GGC 의 합성 및 γ- GT 의 안정성에 미치는 효과

글루탐산 γ-메틸 에스테르 (85mg, 100mM) 및 Cys-Merc (0.1g, 100mM)를 별개의 시험 튜브 3개에 넣었다. 튜브 하나의 내용물을 분취량의 0.4M의 NaH₂PO₄ (2.5mL)에 용해시키고, 동량의 DMF (2.5mL)를 첨가하였다. 2M의 NaOH를 사용하여 혼합물의 pH를 pH 7.5로 조정하였다. 나머지 2개의 튜브의 내용물은 각각 분취량의 0.4M의 DEA (2.5mL)에 용해시키고, 동량의 DMF (2.5mL)를 첨가하였다. 5M의 HCl을 사용하여 튜브의 pH를 pH 8.3 또는 pH 9.0으로 조정하였다. γ-GT (12mg, 17.2U/mL)를 첨가하여 반응을 개시하고, 튜브들을 37℃에서 인큐베이션시키고, 20시간에 걸쳐 주기적으로 샘플을 취하였다. HPLC 분석 (4.5% (w/v) 인산 (100㎕)을 함유하는 에펜돌프 튜브로 즉시 분배됨)을 위해, 및 γ-GT 효소 활성 분석법을 위해 샘플 (100㎕ x 2)을 취하고, 이들 모두를 -20℃에서 저장하였다.

pH 8.3에서 진행된 반응에서, 19시간의 인큐베이션 후, GGC의 최대 농도는 8.3g/L (도 2A 참고)이고, 양 기질 모두에 대하여 수율은 33.2%에 도달하였다. pH 7.5 및 9.0에서 진행된 반응에서는 반응 속도 및 GGC 최종 수율이 약간 감소하는 것으로 나타났다.

최적의 반응 조건하에서 효소 안정성을 측정한 바, 활성은 현저히 손실되었는데, 활성은 10시간의 인큐베이션 후, 초기 활성의 10% 미만까지로 감소하였다. 예로서, 제안된 것과 같은 생체공정에서 효소 비용이 상당할 수 있는 바, 반응이 실용 가치가 있도록 하기 위해서는 반응 혼합물중 효소의 안정성은 상당 수준으로 개선될 필요가 있다.

효소 안정성을 개선시키는 것과 관련하여 수개의 옵션을 사용하여 연구할 수 있었다. pH 9.4 초과에서 래트 신장 γ-GT는 비가역적으로 불활성화되기 때문에 반응 pH를 효소 안정성에서의 가능 인자로서 측정하였다. 그러나, pH 7.5, 8.3 및 9.0에서 진행된 반응에서는 3개의 pH 처리군에 있어 효소 안정성 상에 현저한 차이는 관찰되지 않았고, 3개의 반응 pH 모두에서 활성은 10시간의 인큐베이션 후 초기 활성의 30% 미만까지 감소하였다 (도 2B).

실시예 8 - 고정화된 γ- GT 시료를 사용한 GGC 의 합성 및 안정성

흡인 건조시킨 고정화된 γ-GT 효소 (200mg) (실시예 1)를 2개의 에펜돌프 튜브 (2mL 부피)에 넣었다. 200mM의 DEA를 함유하는 50:50 DMF/물 용액, 및 100mM의 Cys-Merc 및 100mM의 GEE로 구성된 pH 9.0인 반응 혼합물 (1.5mL)을 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 37℃ 인큐베이터에서 10rpm으로 회전식 휠상에서 인큐베이션시켰다. 고정화된 효소를 펠릿화하기 위해 샘플링하기 앞서 튜브를 수초동안 원심분리하였다. 상등액 (100㎕) 샘플을 30시간동안 주기적으로 취하고, 각 샘플링 후 동량의 새로운 반응 혼합물로 튜브중 하나를 보충하였다. pH 9.0으로 200mM DEA (1.5mL)중 고정화된 효소 (200mg)를 함유하는 음성 대조군 튜브 또한 제조하고, 반응 튜브와 함께 인큐베이션시켰다. 30시간의 인큐베이션 후, 3개의 모든 튜브로부터 얻은 사용한 고정화된 효소를 소결 유리 필터상에서 수집하고, pH 8.5에서 0.5M의 트리스 완충액로 철저하게 세척하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 사용된 고정화된 효소에 대하여 γ-GT 활성 분석법을 실시하였다.

보충하지 않은 반응에서, 30시간의 인큐베이션 후, GGC의 최대 농도는 7.2g/L이고, 양 기질 모두에서의 수율은 28.7%에 도달하였다. 보충한 반응에서, 30시간의 인큐베이션 후, GGC의 최대 농도는 6.8g/L이고, 양 기질 모두에서의 수율은 27.2%에 도달하였다.

반응에서 사용된 고정화된 γ-GT의 초기 활성은 122.3U/g (표 2 참조)이었고, 이는 16.2U/mL의, 반응 혼합물중 투여 수준과 일치하였다. 30시간의 인큐베이션 후, 보충하지 않은 반응 튜브에서는 초기 γ-GT 활성의 55%가 남아 있었고, 보충한 튜브에서는 48%가 남아 있었다. 음성 대조군 튜브에서는 초기 γ-GT 활성에서 10% 감소된 것이 관찰되었다.

표 2 반응 혼합물에서 30시간의 인큐베이션 후, 고정화된 γ-GT의 안정성

유퍼지트 C250L, 고정화된 γ-GT	활성(U/g)
초기 미사용시	122.3
보충하지 않은 반응(50% DMF)	66.8
보충한 반응(50% DMF)	58.7
음성 대조군(0% DMF)	110.5

고정화된 γ-GT는 현저히 증가된 안정성을 가졌고, 30시간의 인큐베이션 후에도 그의 초기 활성의 50% 초과의 활성이 유지되었다 (표 2). 고정화된 γ-GT를 사용하는 반응은, GGC 형성 속도 및 GGC의 최종 수율에 있어서 현저히 감소되지는 않는다는 것을 시사하였다. 혼합물을 새로운 반응 혼합물로 일정하게 보충하였을 때의 반응에서는 GGC 수율이 현저히 감소하는 것으로 관찰되지는 않았다. 이는, 배치식 방법에 비하여 수개의 장점을 갖고 있는 연속식 효소 방법에서 고정화된 효소의 전환 속도가 만족할만하고, 가장 주목할 만한 것은 생산성을 최대화시킴으로써 경제적으로 대규모의 반응을 실시할 수 있는 능력이라는 것을 제안하고 있다.

고정화된 γ-GT를 사용하였을 때 DMF를 함유하지 않는 음성 대조군 혼합물에서의 효소는 30시간의 인큐베이션에 걸쳐 활성이 단지 10%만 손실되었다는 것이 관찰되었다. 이는 DMF가 효소 안정성에 대하여 현저히 유해한 효과를 갖고 있음을 시사하는 것이었다.

실시예 9 - DMF 농도가 γ- GT 안정성에 미치는 효과

글루탐산 γ-에틸 에스테르 (43mg, 100mM) 및 Cys-Merc (50mg, 100mM)를 별개의 시험 튜브 4개에 넣었다. 0, 10, 25 및 50%의 농도로 DMF를 함유하는, 분취량의 200mM의 DEA (2.5mL)에 튜브 각각의 내용물을 용해시켰다. 2M의 NaOH 또는 5M의 HCl을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 8.5로 조정하였다. γ-GT (1mg, 7.2U/mL)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 튜브를 37℃에서 인큐베이션시키고, 24시간에 걸쳐 주기적으로 샘플을 취하였다.

예상밖으로 100% 물을 사용한 반응에서 GGC의 최고 수율이 관찰되었고, 5시간의 인큐베이션 후, GGC의 최대 농도는 6.0g/L (도 3 참조)이고, 양 기질 모두에 대하여 24%의 수율에 도달하였다. DMF 농도가 증가함에 따라 GGC 수율은 10, 25, 및 50% DMF 처리군과 함께 증가하였고, 수율은 각각, 6.9, 7.6 및 8.0g/L이었다. 0-25% DMF 반응의 동역학은 유사한 패턴을 따랐고, 5시간의 인큐베이션 후에 최대 GGC 농도에 도달한 후, 모든 반응에 있어 GGC의 농도는 추후 20시간에 걸쳐 5g/L까지 감소하였다. 50%의 DMF를 함유하는 반응에서는 18시간의 인큐베이션 후에 최대 GGC 농도에 도달하였고, 추후 GGC 농도는 감소되지 않았다. 물 활성을 저하시키고, 가수분해 반응을 감소시키는 것과는 별도로, 수-혼화성 용매를 첨가하는 것은 또한 유의적인 에스테라제 (아미노분해) 활성은 그대로 남겨두는 반면, γ-GT의 아미다제 활성을 저해시켰다. 50% DMF의 존재하에서 장기간동안 인큐베이션한 후에도 펩티드 산물 GGC의 분해는 없다는 것이 분명하게 드러났다. 2차 가수분해도 고정화된 반응에서는 관찰되지 않았다.

0, 10, 및 25%의 DMF를 함유하는 반응에서 효소 반응은 35시간의 인큐베이션에 걸쳐 안정하였고, 25% DMF 처리군에서 단지 25시간 후에 아주 적게 14%의 활성이 손실된 것이 관찰되었다.

실시예 10 - pH 8.0하의 비 수- 혼화성 용매중에서 GGC - 머캅토에탄올 디설파이드의 효소적 합성

자기 교반기, 온도계 및 pH 탐침이 장착된, 편평한 바닥 반응기 베쓸 (500mL)를 R.O. 물 (150mL)로 채웠다. 베쓸을 37℃로 자동 온도 조절되는 수조에 넣고, 내용물이 37℃에 도달할 때까지 교반하였다. 이어서, Cys-Merc (5.9g, 0.2M) 및 냉동 건조된 우유 γ-글루타밀트랜스펩티다제 (6 유니트/mL), 양자 모두를 첨가하고, 용해될 때까지 혼합하였다. 수산화나트륨 (2M)을 가하여 pH를 pH 8.0으로 조절하기 위하여 pH-Stat (라디오미터(Radiometer), PHM 290)를 활성화시켰다. 일단 용액이 pH 8.0에 도달하면, 글루탐산 γ-에틸 에스테르 (5.3g 0.2M)를 10분에 걸쳐 소량으로 (~1g) 첨가하였다. 일정한 간격으로 샘플을 취하고, GGC-Merc의 생산 및 NaOH의 첨가에 대하여 모니터하였다 (도 4 참조).

7시간의 인큐베이션 후, GGC-Merc의 합성은 92mM에서 피크에 도달하였다 (이론치 수율 46%). GGC-Merc (디카복실산)가 산성의 성질을 나타내기 때문에 pH 8로 유지시키기 위해서는 GGC-Merc 합성 속도와 수산화나트륨 첨가 속도 사이에는 밀접한 관련이 있는 것이 관찰되었다.

실시예 11 - GGC - Merc 정제

반응 산물 (GGC-Merc pI = 3.0)과 기질 (Cys-Merc, pI = 5.3 및 GEE pI = 5.8) 사이의 등전점 (pI)상에 있어 큰 차이는 이온 전하에 기초한 정제 시스템, 예로서, 이온 교환 크로마토그래피, 이온 배제 크로마토그래피 및 전기투석을 용이하게 이용할 수 있게 한다. 게다가, 이온 교환, 및 전기투석 방법이 효소 반응과 동시에 실시될 때에는 산물이 형성됨에 따라 산물을 효과적으로 제거 (또는 포획)함으로써 산물의 수율은 증가될 수 있고, 이로써, 산물 형성으로의 평형이 추진된다. 일례로서, 산성 산물 GGC-Merc을 중화시키기 위하여 상기 실시예 10에 기술된 바와 같이 효소 반응에 수산화나트륨을 첨가하는 대신, pH를 유지시킬 뿐만 아니라 반응 산물도 선택적으로 제거하기 위해 OH^- 형태로 음이온 교환 수지를 첨가할 수 있다. 유사하게, 효소 반응을 전기투석 전지에서 실시함으로써 GGC-Merc의 연속적인 제거 를 촉진시킬 수 있다.

이온 배제 크로마토그래피

이온 배제 크로마토그래피에서, 효소 방법으로부터의 반응 혼합물을 pH 5-7 사이로 조정하고, Na⁺ 형태로 양이온 교환 수지 (설폰산 유형)의 칼럼 상에 적재하였다. GGC-Merc가 다른 반응 성분들보다 더욱 산성을 띠기 때문에 도난(Donnan) 배제로 명명되는 방법에 의해 수지 비드로 유입되지 못하고, 이로써, 공간 부피로 용출된다. 다른 성분들 (예로서, Cys-Merc 혼합된 디설파이드)는 비전하성이거나, 미세하게 양전하를 가지고, 이는 수지 비드내로 확산되어 추후 용출된다. 순수한 물이 이동상으로서 사용되고, 염 또는 pH 구배는 산물을 용출시키는데 필요치 않다는 점이 본 기법의 주된 장점이 된다. 단백질 가수분해물로부터 L-글루탐산을 분리하기 위해서는 (예를 들면, Eisenbraun, A., "Separation of amino acids by ion exclusion", 1962, 미국 특허 번호 제3,045,026호 참조)에 기술된 바와 같이, 이러한 유형 분리법을 연속 방식으로도 수행할 수 있다. 칼럼상에 물과 반응 혼합물을 대체 공급하는 시간을 조정하여 첫번째 것이 용출되지 이전에 새로운 배치의 반응 혼합물을 칼럼상에 적재시킬 수 있다 (도 5 참조). GGC-Merc로부터 염을 분리시키기 위하여 초기 pH를 변경시킴으로써 크로마토그래피 조건을 조작할 수 있다.

실험적으로, 나트륨 형태로 설폰산 양이온 교환 수지(도웩스(Dowex) 50WX4, 100-200 메쉬 크기)와 함께 패킹된 칼럼 (3.5cm (직경) x 30cm (높이))을 제조하였다. R.O. 물 (15ml/분)의 이동상을 사용하여 실온에서 칼럼을 평형화시켰다. 각 사이클의 분리는 실시예 10에서 제조된 효소 반응 혼합물 (10mL, pH 5.0으로 조정됨)을 칼럼상에 주입하는 것으로 구성되었다. 온라인 UV-Vis HPLC 검출기에 의해 250nm에서 유출물의 흡광도를 모니터하였다. 디설파이드의 농도는 250nm에서의 흡광도에 비례하였고, 분획 수집기를 사용하여 유출물의 분획을 수집하였다. 피크에 상응하는 분획 (도 6)은 9분 내지 40분 사이에 수집되었고, HPLC에 의해 분석하였다; 9-13분, GGC-Merc 1.6mM, 14-16분 5-옥소프롤린 1.5mM, 20-33분 Cys-Merc 0.5mM. 소정 기간동안 분리 갯수를 증가시키기 위해서는 이전 주입의 마지막 피크가 용출되지 전에 주입하여 효소 반응 혼합물의 추후 분취량을 증가시킬 수 있다.

실시예 12 - GGC - Merc 의 전기화학적 환원

기하학적 캐소드 면적이 50c㎡이고, 전해질 흐름 방향으로 전해질 채널은 10cm이며, 폭은 0.5cm(전류 흐름 방향)인 평행판 필터 프레스 흐름 전지 (도 7 참조)를 앞서 (문헌 [Ralph, et al., Evaluation of a reactor model and cathode materials for batch electrolysis of L-cystine hydrochloride, Journal of Electroanalvtical Chemistry, 1999, 462, 97-110])에 기재되어 있는 바와 같이 조립하였다. 나피온(Nafion)® 117 양이온 교환막을 사용하여 캐소드액 및 애노드액 구획을 분리하였다. 전지용 하우징, 엔드 플레이트 및 전지 프레임을 폴리프로필렌으로부터 제작하였다. 완성된 조립체를 네오프렌 개스킷으로 밀봉하고, 나사프레스로 단단히 조였다. 전해질 흐름 루프가 캐소드액 및 애노드액, 양자 모두에 대한 배치 재순환을 가동시켰다. 납 캐소드 및 0.2M 이하의 GGC-Merc 디설파이드를 함유하는 캐소드액 (200mL)을 사용하여 배치 전기 분해를 실시하고, 저장소에서 각각 온도를 25℃로 일정하게 유지시키고 pH를 pH 7로 유지시켰다. 애노드는 백금화된-티타늄이고 애노드액 (200mL)은 2M의 황산이었다. 전기 분해하기 앞서, 두개 전극 모두를 1200 등급의 실리콘 카바이드 종이를 사용하여 습식 연마하였다. 캐소드액 및 애노드액 유속은 연동 펌프를 사용하여 20ml/분으로 설정하고, 3V에서 1A의 정전류를 전기에 가하였다. HPLC 분석을 위해 애노드액 저장소로부터 샘플을 주기적으로 제거하고, pH를 pH 7로 유지시키기 위하여 pH-Stat에 의해 첨가되는 1M의 수산화나트륨의 부피를 기록하였다. 미처리 효소 반응 혼합물 및 정제된 GGC-Merc의 풀링 분획, 양자 모두에서 전기화학적 환원을 실시하였다. 양 혼합물에 대하여 전기분해한지 몇시간내에 디설파이드 결합 모두가 완전하게 환원되었다. 유리 티올기가 산성의 성질을 띠는 것에 기인하여, 디설파이드 환원 속도와, 캐소드액의 pH를 pH 7로 유지시키기 위한 수산화나트륨의 첨가 속도 사이에는 밀접한 관계가 있음이 관찰되었다 (도 8 참조). 미처리/미분리 효소 반응 혼합물로부터 제조된 캐소드액의 GGC 내용물을, 실시예 11에 기술된 방법과 유사하게 수행되는 이온 배제 크로마토그래피시킬 수 있고, 유사한 정도의 효과를 얻을 수 있지만, GGC의 재-산화를 막기 위해서는 특별한 예방적 조치가 요구된다.

실시예 13 - GGC 로부터 머캅토에탄올의 분리

실시예 12에 기재된 바와 같이 전기화학적 환원에 의해 생성된 2-머캅토에탄올은 유기 용매로 분배하여 효과적으로 제거할 수 있다. 전기화학적 환원으로부터의 수개의 애노드액 배치 (실시예 12)를 50% 부피의 1-부탄올, 에틸아세테이트, 부틸 아세테이트 또는 2-에틸-1-헥사놀을 사용하여 3회에 걸쳐 추출하였다. 티올이 재산화되는 것을 막기 위하여 모든 작업은 질소 대기하에서 수행하였다. 2-머캅토에탄올은 시험한 4개의 용매 모두에 의해 수성상에서 원 농도의 5% 미만으로 효과적으로 환원되었다.

GGC-Merc의 환원된 풀링 분획으로부터 2-머캅토에탄올을 추출한 후, 냉동 건조시켜 크림 백색의 분말을 수득하였다. HPLC에 의해 측정된 순도: GGC 98%, (시스테인 1%, 머캅토에탄올은 검출불가능).

실시예 14 - GGC 생산을 위한 상업적 생체공정

본 연구 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 γ-GT를 사용하여 GGC를 생산하기 위한 상업적 생체공정을 개발할 수 있었다. 처음 2개의 단계는 2개의 아미노산 기질의 화학적 유도체화로 구성된다. 이어서, 배치식 방법, 또는 더욱 유리하게는, 연속식 방법으로 고정화된 효소를 사용하여 γ-GT 촉매화된 합성을 실시할 수 있다. 우유는 5U/mL 이하의 γ-GT를 함유하는, γ-GT의 세포외 공급원으로서 확인되었다. 산업적 생산을 위해 적합한 것으로서, 우유로부터 γ-GT를 정제하는 적합한 방법은 앞서 실시예 1.3에 기술된 바 있다. 이상적으로, 고정화된 γ-GT를 칼럼 내로 패킹하고, 한쪽 끝에서는 새로운 기질을 연속적으로 펌핑하고, GGC를 함유하는 반응 혼합물은 다른 한쪽 끝으로부터 인출한다. 50% DMF를 공-용매로서 사용하지 않을 경우, 이때는 임의의 상당부가 2차 가수분해되기 전에 GGC 수거를 위한 최적의 동역학 (또는 연속식 방법에서 체류 시간)을 측정하기 위하여 반응을 모니터하여야 한다. 별법으로, 반응은 pH 약 8.0에서 수행될 수 있으며, 이 경우 γ-GT의 아미다제 활성은 현저히 더 낮았고, γ-GGC 유도체 산물의 가수분해도 더 적었 음을 발견하게 되었다.

미반응 기질을 제거시키는 것 및 GGC 또는 그의 유도체 (예로서, GGC-Merc)를 반응 혼합물로부터 제거하는 것에 대하여 수개의 옵션이 존재한다. GGC, 또는 GGC-Merc (및 추후 GGC로 환원)에 대한 바람직한 정제 방법은 상기 실시예 11 내지 12에 기술되어 있는 것과 같다.

실시예 13은 GGC 및 2-머캅토에탄올을 포함하는 혼합물로부터 GGC를 정제하고, 이어서, 냉동-건조시키는 것을 기술한다. 그러나, 냉동-건조가 산업적 규모에서 경제적으로 유익한 옵션이라는 것은 예측하지 못했다. 종래의, 40℃ 초과의 온도에서 증발에 의해 물을 제거하는 것은 산물을 분해시킨다. 그러나, 나노여과에 의한 농축 방법은 낮은 온도와 비용면에서 효과적인, 물 제거 방법이기 때문에 산업적 규모에서는 가장 적합한 것으로 예측된다. 아미노산 및 펩티드를 농축시키기 위한 나노여과의 효과는 잘 확립되어 있고 (문헌 [Martin-Orue, C. et at, Nanofiltration of amino acid and peptide solutions: mechanisms of separation, Journal of Membrane Science, 1998, 142, 225-33]), 최근 글루타티온 분리를 위한 나노여과의 용도가 입증되었다 (문헌 [Gotoh, K. et ah, Separation of glutathione and its related amino acids by nanofiltration, Biochemical Engineering Journal, 2004, 19, 165-70]). 나노여과에 의해 대다수의 물을 제거하고, pH를 등전점 (GGC = pH 2.8) pH로 조정한 후, 반용매, 예로서, 에탄올 또는 아세톤을 첨가하여 자발적으로 결정화를 개시하도록 할 수 있다. 여과하여 최종 산물을 수집하고 감압하에 건조시킬 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산되는 GGC 정제에 대하여 산업적으로 적용가능한, 다른 2개의 가능한 옵션은 하기에 기술하고 도 9 및 10에 도시되어 있다. GGC 합성시 장애가 되었던 불용성 시스틴을 사용하여 추후의 GGC 정제를 촉진시킬 수 있다.

정제 옵션 1

첫번째 옵션은 과량의 머캅토에탄올을 첨가하거나 전기화학적 환원에 의해 반응 혼합물내의 모든 디설파이드 결합을 초기에 환원시키는 것이다:

R¹S-S-R² + 2H⁺ + 2e^- → R¹SH + R²-SH (전기화학적 환원)

에틸아세테이트로 용매 추출하는 것을 사용하여 환원된 머캅토에탄올 및 산화된 머캅토에탄올, 양자 모두를 유기상 내로 선택적으로 분배할 수 있다. GGC, 시스테인 및 글루타메이트의 혼합물을 함유하는 수성상은 이온 교환 크로마토그래피 (옵션 1A)에 의해 정제되어 순수한 GGC (환원)를 수득할 수 있다. 예를 들면, 혼합물을 도웩스 I 포르메이트 칼럼상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 칼럼을 초기에 세척하고, 동량의 물과 0.4M 포름산 사이에서 선형 구배가 확립되었다. GGC를 함유하는 용출된 분획을 조합하고 냉동-건조시킬 수 있다. 다른 대안 (옵션 1B)은 장기간동안 대기에 노출시켜 시스틴을 형성시킴으로써 혼합물중의 티올을 재산화시키는 것인데, 시스테인은 pH를 pH 3으로 강하시킬 때 침전될 것이다 (pH 3에서의 시스틴의 용해도 0.1g/L). 고체를 제거한 후, 증발시켜 용액을 농축시키고, 남아있는 유리산 형태의 글루탐산으로부터 순수한 비스-γ- 글루타밀시스틴을 분별 결정화할 수 있고, 이는 단지 8.6g/L로 가용성이다.

정제 옵션 2

두번째 옵션은 디설파이드 상호교환 반응을 유도하는 것이다:

제안된 반응 체계에서, 반응 혼합물중의 모든 혼합된 (비대칭) 디설파이드 (Cys-Merc 및 GGC-Merc)는 묽은 NaOH 처리에 의해 (염기는 또한 임의의 GEE를 에탄올 및 글루타메이트로 비누화시켜야 한다) 그의 대칭형 디설파이드로 전환된다. 생성된 머캅토에탄올 디설파이드는 에틸아세테이트중 용매 분배에 의해 제거된다. 수성상의 pH를 pH 3으로 강하시키는 경우 시스틴은 침전되어야 하고, 옵션 1A에 대하여 기술된 바와 같은 정제에 따라 순수한 비스-γ-글루타밀시스틴을 수득할 수 있다.

GGC 산물의 최종 형태

GGC의 최종 형태가 γ-글루타밀시스틴으로서 환원된 상태인지 또는 비스-γ-글루타밀시스틴으로서 디설파이드 형태인지는 디펩티드의 최종 적용에 따라 달라진다. 마우스에서 GGC의 사용에 대한 예비 연구 결과, 환원된 형태의 GGC 및 디설파이드 형태의 GGC, 양자 모두 투여시 글루타티온 수준을 현저시 증가시키는 것으로 나타났다. 산화된 형태의 비스-γ-글루타밀시스틴은 설피드릴의 산화를 막아야 하는 특별한 예방적 조치가 필요치 않기 때문에 건강기능식품 보충물로서 적용시키기에는 더욱 적합할 수 있는 반면, 중독 치료시 또는 식품 또는 화장품에서의 항산화 제로서 적용되는 경우에는 γ-글루타밀시스테인의 설피드릴의 환원력을 필요로 할 것이다. 원하는 형태가 무엇이든 간에, 양자 모두는 상대적으로 용이하게, 화학적으로 (문헌 [Jocelyn, P. C, Chemical reduction of disulfides. Methods in Enzvmology., 1987. 143: p. 246-56], 전기화학적으로 (문헌 [Genders, J.D., NX. Weinberg, and DJ. Mazur, High yield methods for electrochemical preparation of cysteine and analogues. 1988, US Patent 5,106,463. The Electrosynthesis Company, Inc.]) 달성될 수 있는 환원에 의해 상호전환되거나, 간단하게는 반응을 촉매화시키기 위하여 첨가된 미량의 구리 또는 철 이온과 함께, 용액을 대기 (산소)에 노출시킴으로써 디설파이드 형태로 산화된다.

GGC는 또한

양이온: Na, K, Ca, Mg과의 염, 염기성 아미노산, 예로서, 류신, 아르기닌과의 염 이량체, 및 폴리아민, 예로서, 키토산과의 염으로서 제공될 수 있거나;

음이온: HCl, 메탄 설폰산, 아세테이트, 및 폴리양이온, 예로서, 카복시메틸셀룰로즈와의 염으로서 제공될 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양은 설명하기 위한 목적으로 본원에 기술되었지만, 하기 청구의 범위에서 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims (34)

1. 시스테인 유도체, γ-글루타밀 공여체, 및 시스테인 유도체에 γ-글루타밀기를 전이시킬 수 있는 효소를, γ-글루타밀기의 상기 시스테인 유도체에의 전이를 촉진시키는 반응 환경하에서 제공하는 것을 포함하는, 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이에 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소가 γ-글루타밀 에스테라제 또는 γ-글루타밀 아미다제 활성을 갖는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 효소가 γ-글루타밀트랜스펩티다제인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 γ-글루타밀 공여체가 글루탐산의 γ-에스테르 또는 γ-아미드인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 γ-글루타밀 공여체가 γ-글루타밀-에스테르인 방법.
6. 제4항에 있어서, γ-글루타밀 공여체가 글루탐산의 γ-알킬-, α,γ-디알킬-, γ-p-클로로페닐-, 및 γ-시아노메틸-에스테르인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 γ-글루타밀 공여체가 글루탐산의 γ-메틸-, γ-에틸-, α,γ-디메틸, 및 α,γ-디에틸-에스테르인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 γ-글루타밀 공여체가 γ-글루타밀-에틸 에스테르인 방법.
9. 제1항에 있어서, 시스테인 유도체가 수용성인 방법.
10. 제9항에 있어서, 시스테인 유도체가

    시스테인과 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드;

    S-아세틸시스테인;

    S-아세트아미도메틸시스테인;

    S-메톡시카보닐설페닐시스테인;

    S-설포시스테인;

    시스틴 디메틸 에스테르; 및

    시스틴 모노메틸 에스테르로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, γ-글루타밀 수용체가 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드인 방법.
12. 제1항에 있어서, 반응 환경이 수성인 방법.
13. 제12항에 있어서, 수-혼화성 용매가 반응 환경에 포함되어 있는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 반응 환경이 약 30%v/v 내지 약 60%v/v의 수-혼화성 용매를 포함하는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 수-혼화성 용매가 디메틸포름아미드를 포함하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 수-혼화성 용매가 디메틸포름아미드인 방법.
17. 제16항에 있어서, 반응 환경이 약 50%v/v의 디메틸포름아미드를 포함하는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 효소가 소 γ-글루타밀트랜스펩티다제인 방법.
19. 제18항에 있어서, 효소가 소 신장 또는 우유로부터 수득되는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, 반응 환경이 pH 약 8.0 내지 약 9.0으로 유지되는 것인 방 법.
21. 제1항에 있어서, 효소가 고정상에 고정화되어 있는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 효소가 수지상에 고정화되어 있는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 배치식 방법인 방법.
24. 제1항에 있어서, 연속식 방법인 방법.
25. 제24항에 있어서, γ-글루타밀 공여체 및 시스테인 유도체를 고정화된 효소를 포함하는 반응기의 입구내로 연속적으로 공급하고, 산물 화합물을 포함하는 용출물을 출구로부터 연속적으로 수집하는 방법.
26. 제1항에 있어서, γ-글루타밀시스테인 유도체를 제조하기 위한 방법.
27. 제26항에 있어서, γ-글루타밀트랜스펩티다제에 의해 γ-글루타밀 에스테르로부터의 γ-글루타밀기를 시스테인 유도체에 전이시키는 것을 촉진시키는 반응 환경하에서

    γ-글루타밀 에스테르;

    시스테인과 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드;

    S-아세틸시스테인;

    S-아세트아미도메틸시스테인;

    S-메톡시카보닐설페닐시스테인;

    S-설포시스테인;

    시스틴 디메틸 에스테르; 및

    시스틴 모노메틸 에스테르로부터 선택되는 시스테인 유도체; 및

    γ-글루타밀트랜스펩티다제를 제공하는 것을 포함하는 방법.
28. 제27항에 있어서, γ-글루타밀 에스테르가 글루탐산의 γ-메틸-, γ-에틸-, α,γ-디메틸, 및 α,γ-디에틸-에스테르로부터 선택되고;

    γ-글루타밀 수용체가 시스테인과 티오글리콜산 또는 시스타민 또는 다른 저분자 수용성 티올의 혼합된 디설파이드로부터 선택되는 것인 방법.
29. 제27항에 있어서, γ-글루타밀 에스테르가 γ-글루타밀-에틸 에스테르이고; γ-글루타밀 수용체가 시스테인-머캅토에탄올 혼합된 디설파이드인 방법.
30. 제26항에 있어서, 전기투석 또는 이온 배제 크로마토그래피에 의해 γ-글루타밀시스테인 유도체를 정제하는 추가 단계를 포함하는 방법.
31. 제26항에 있어서, 상기 γ-글루타밀시스테인 유도체가 γ-글루타밀시스테인-머캅토에탄올 디설파이드인 방법.
32. 제1항에 있어서, 시스테인 부위와 글루탐산 부위 사이의 α,γ 아미드 결합을 포함하는 화합물로부터 유도체화기(들)를 절단함으로써 γ-글루타밀시스테인을 수득하는 추가 단계를 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 유도체화기를 전기화학적 환원에 의해 절단하는 방법.
34. 제32항에 있어서, γ-글루타밀시스테인을 이어서 단리하고, 임의로는 환원된 형태 또는 산화된 형태로 정제하는 방법.

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