JPS58209992A

JPS58209992A - ペプチド又はペプチド誘導体の合成法

Info

Publication number: JPS58209992A
Application number: JP57090426A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Imahori; 今堀　和友; Keiichi Yamamoto; 慶一山本; Hiroshi Nakajima; 宏中島; Isao Tomioka; 富岡　功; Tatsuo Iwasaki; 岩崎　立夫
Original assignee: Unitika Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Unitika Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1982-05-27
Filing date: 1982-05-27
Publication date: 1983-12-07
Also published as: JPH0143558B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規な合成法
に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在することが相つ
いで知られ、治療１診断などの医薬品としての重要性並
びに呈味物質としての重要性がますます増大しつつある
。それに伴いペプチド合成法の開発も活発である。現在
までに知られているペプチド合成法の主なものとしては
１例えばファルマシア、レビュー、３号、２７−４７頁
（１９８０年）にまとめられているように、化学合成法
と酵素法の二つに大別することができる。その化学合成
法としては、アジド法、混合Ｍ無水物法、活性エステル
法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に縮合する方
法とフラグメントで縮合させる方法などが代表的なもの
であるが、これらどの化学合成法においても、ラセミ化
及び副反応が起きやすく反応時間が長く、末端アミノ基
を保護基にて反応前にあらかじめ保護しておく必要があ
るなど種々の問題がある。フラグメント縮合法の場合。

特にラセミ化が起りやすいという重大な欠点を有するも
のである。

、一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法としてプロテ
アーゼを用いる酵素法が提案されているがこの方法にお
いてもやはり１反応時間が長く、末端アミノ基を保護基
にて保護してお（必要があるなど操作の煩雑さを改良す
るには至らなかった。

さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では。

用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有しているため、
生じたペプチドが合成と併行して分解され。

しばしば目的のペプチドが得られないという重大な欠点
を示すものであった。特に、オリゴペプチドの合成に適
用した場合には、一部のアミノ酸が欠落した目的外のペ
プチドが得られる重大な欠点が指摘されている（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌、２５６
巻、　１３０１頁（１９８１年）、また、酵素法による
ペプチド合成法としては、プロテアーゼ法の他に、特定
なアミノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種の酵素
としては２例えばグルタミン酸／システィン／グリシン
の配列であるトリペプチドを合成するグルタチオン合成
酵素（特開昭５４−１２２７９３号公報。）やデカペプ
チドであるグラミシジンＳを合成するグラミシジンＳ合
成酵素（現代化学１９７４年１２月号１２頁）などが報
告されている。しかし、これらの酵素は特殊な酵素であ
って、この酵素によって合成しうるペプチドは、限定さ
れた一種のみのペプチドであり、目的とする任意なペプ
チドを合成することができない。このため、この方法は
一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが現状である
。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記のような
欠点、特にラセミ化、副反応の生起２反応の煩雑さ等の
原因となり、同時に経済性を損う保護基の必要性を解決
し、汎用性のある新規なペプチド合成法を提供すること
を目的として鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の
一種であるｔＲＮＡに結合させる作用を有する酵素で、
従来全くペプチド結合を形成する作用が知られていなか
ったアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼに驚くべきこ
とに、ペプチド合成能があることを見い出し、この酵素
を縮合剤として用いると、前記の目的がすべて達成され
ることを見い出し、先に特許出願した（特願昭５７−１
０３３６号）。しかし、この方法は縮合剤として用いる
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを高純度に精製し
ており、このため、操作が煩雑で所望のアミノアシル−
ｔＲＮＡシンテターゼを得るに長時間を要し、アミノア
シル−Ｌ　１１　Ｎ　Ａシンテターゼ活性が精製中に度
々失われる例があり、このため、酵素の収率の低下をき
たし易い傾向があった。これを改良するため、アミノア
シル−ｔＲＮＡシンテターゼを１例えば微生物など自然
界に広（求めたとしても、取得したアミノアシル−ｔＲ
ＮＡシンテターゼの収率が低い傾向にあり、上記の点を
改善することはできなかった。さらに操作の煩雑性を改
良すべく２例えば、微生物細胞などをホモジナイザーや
ダイノミル等で破砕したままの粗抽出液を用いることを
検討してみたが、この方法では、ペプチド合成時に混在
する他の酵素などの影響のためか１度々副反応が認めら
れて目的ペプチドの収率を低下せしめる傾向にあり、か
つ反応後の目的物の単離精製が十分ではなかった。

そこで１本発明者らは上記の点を改良するためにさらに
鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに粗抽出液をリン
酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理して得たアミノア
シル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液を用いると
、上記の点をすべて解決し、ペプチド又はペプチド誘導
体を高収量で合成５− できることを見い出し１本発明を完成した。

すなわち２本発明はアミノ酸からペプチド又はペプチド
誘導体を合成するに際し１生物細胞を破砕して得た粗抽
出液をリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理してア
ミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液を反
応系に加えて合成することを特徴とするペプチド又はペ
プチド誘導体の合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテター
ゼは、酵素分類６．１．１に属し１次式アミノ酸十　八
ＴＰ＋　ｔＲＮ八→へミノアシル−ＬＩＩＮ八十ＡへＰ
＋ピロリン酸の反応を触媒する酵素であり２例えば、ウサギ。

ウマ、ウシ、ラット、ニワトリ、ヘビなどの動物・組織
より得られるもの、イネ、イモ、トマトなどの植物組織
より得られるもの、カビ、酵母、キノコ、細菌、放線菌
などの微生物及び藻類より得られるものなどがあげられ
る。なかでも、酵素の取得が容易であることから、微生
物より得られるものが好ましく、さらに酵素の安定性か
らバチルス６− ・ステアロサーモフィルス、ザーマス・サーモフィルス
、サーマス・フラバス、クロストリジウム・サーモアセ
チカム、サーマス・マグアティカスなどの耐熱性細菌よ
り得られるアミノアシル−ｔｌｌＮＡシンテクーゼが最
適である。

これら各種のアミノアシル−ｔＲＮ八シへテターゼは１
種々のα−アミノ酸に特異性のあるものが用いられ１例
えばチロシンに特異性のあるものとしては、チロシル−
ｔ）ＩＮ八へンテターゼが、またロイシンに特異性のあ
るものとしては、ロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、
さらにバリンに特異性のあるものとしては、バリル−ｔ
ＲＮ八シへテターゼ、その他イソロシル−ｔＲＮへシン
テターゼ、フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、
アラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、グルタミル− ラギニル−ｔＲＮ＾シンテターゼ、メチオニル−ｔＲＮ
Ａシンテターゼ、ヒスチジル−　ｔＲＮＡシンテターゼ
。

リジル−ｔＲＮＡシンテターゼ、トレオニルーｔＲＮＡ
シンテターゼ、セリル−ｔＲＮＡシンテターゼ、などが
具体例としてあげられる、本発明においては，これらのアミノアシル−ｔＲＮＡシ
ンテターゼを含む粗酵素液を得るには，例えば、上記組
織又は細胞をホモジナイザーやダイノミル等で破砕した
後，得られた粗抽出液をリン酸基を有する陽イオン交換
樹脂で処理することが必要である。

このリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理するには
，例えば、　ｐＨ３ないしｐＨ１２，好ましくはｐＨ６
ないしｐＨ９，最適にはｐＨ７ないしｐＨ８で，ｉｎ度
が１ｍＭないしＩＭ，好ましくは２０ｍＭないし１００
ｍＭの緩衝液で平衡化したリン酸基を有する陽イオン交
換樹脂に，上記粗抽出液を加える（バッチ法）か、上記
樹脂をカラムにつめ，そのカラムに粗抽出液を通液（カ
ラム法）して行なえばよい。その時の処理温度としては
。

アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの活性を維持する
温度で行え璧よいが，一般には．０℃から７０℃が好ま
しく，特に０℃から３０℃が最適である。

また、その時に用いる緩衝液としては，アミノアシル−
ｔＲＮＡシンテターゼが熔解し，所望のｐＨが得られる
ものであればいかなるものでもよい。そのようなものと
して、例えば、トリス塩酸緩衝液。

ヘペス緩衝液，トリエタノールアミン緩衝液，イミダゾ
ール緩衝液，リン酸緩衝液などがあげられる。さらに酵
素の失活を防ぐことを主目的として。

処理用緩衝液にメルカプトエタノール、ジチオスレイト
ールなどのスルフヒドリル化剤フェニルメチルスルホニ
ルフルオリドなどのタンパク質分解酵素阻害剤，エチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウムなどのキレート剤を添加し
てもよい。前記バッチ法で処理するには，例えば、粗抽
出液を上記緩衝液で平衡化したリン酸基を有する陽イオ
ン交換樹脂に加え，５分以上，好ましくは３０分以上攪
拌し．さらにしばらく放置した後．同じ緩衝液で溶出せ
しめるか，ｐｉ−１の異なる上記緩衝液，濃度変化を持
たせた，あるいは塩を含む緩衝液で吸着した酵素を溶出
せしめることにより，アミノアシル−　ｔＲＮＡシンテ
ターゼを含む粗酵素波を得ることができる。また、カラ
ム法で処理するには，例えば。

カラム内で所望の酵素の吸着・脱着操作を行えば９− よく、原理的にはバッチ法と同じである。処理する時間
としては，できるだけ迅速であることが好ましく．カラ
ム内の線速度が１ｃｍ−ｈ−を以上で行うのがよい。さ
らに分離能を考慮してカラム内の線速度としては，最大
６　０　ｃｍ−ｈ−”であることがより好ましい。さら
にバッチ法及びカラム法で溶出に使用する塩としては，
本質的に完全に解離するものであればどのようなもので
も使用できるが。

特にイオン交換基の対イオンとなる成分が．用いた緩衝
液のそれと同じである塩が好ましい。

このように処理して青たアミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼを含む粗酵素液を，そのまま用いてもよいし，こ
れをさらに凍結乾燥して得た固形状のものも用いられる
。

このように処理して得たアミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼを含む粗酵素液は，さらに口ｔ！ＡＥ樹脂処理を
施してペプチド合成に使用してもよい。

本発明に用いられるリン酸基を有する陽イオン交換樹脂
としては，交換基がリン酸基であるものであれば，いか
なる基材でもよい。なかでも、セ１０− ルロースを基材としたリン酸セルロース樹脂（例えば、
ワンドマン社製、バイオ・ランド社製あるいはセルバ社
製）を用いると、所望のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼを含む粗酵素液が迅速、かつ高収率で得られ、こ
の粗酵素液を用いると高収量でペプチド又はペプチド誘
導体を合成することができて好ましい。

次に、リン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理して得
たアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液
を用いたペプチド又はペプチド誘導体の合成方法を具体
的に説明する。

本発明によれば、アミノ酸とアミノ酸から誘導されるア
ミノ酸誘導体とをアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ
を含む粗酵素液の存在下で反応させることによってペプ
チド又はペプチド誘導体を合成することができる。さら
に本発明によれば、あらかじめアミノ酸とアミノアシル
−ｔＲＮ八シへテターゼを含む粗酵素液とを混合させて
混合物を得２次いで得られた混合物とアミノ酸誘導体及
び親水性有機溶媒とを反応させることによってペプチド
又はペプチド誘導体を合成することができる。このアミ
ノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液とあら
かじめ混合させるのに好ましく用いられるアミノ酸と゛
しては２例えばチロシル、アラニン。

ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニ
ン、リジン、セリン、バリンなどのα−アミノ酸があげ
られ、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。

また、上記反応に好ましく用いられるアミノ酸誘導体と
しては１例えば、グリシン、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、グルタミ
ン、ノルロイシン、システィン、チロシン、アルギニン
、バリン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アス
パラギン、メチオニン、トリプトファン、トレオニンな
どのα−アミノ酸、β−アラニン、β−アミノイソ酪酸
なとのβ−アミノ酸、クレアチンなどの含窒素Ｔ　−ア
ミノ酸、ピペリジン酸などのγ−アミノ酸、ε−アミノ
カプロン酸などのε−アミノ酸などの各種アミノ酸のエ
ステル、チオエステル、アミド。

ヒドロキサミドなどがあげられるが、アミノ基が遊離の
形であるアミノ酸誘導体であれば、上記例示化合物に限
定されるものではない。そのエステルとしては１例えば
メチル、エチル、プロピル。

シクロヘキシル、フェニル、ヘンシルなどの単純な炭化
水素系のエステルから、　　ｔＲＮＡの３’−ＯＨで上
記アミノ酸がエステル化したものまで１種々のエステル
を用いることができる。また、アミドとしては、遊離の
アミドの他１例えば異種あるいは同種のアミノ酸がアミ
ド結合したオリゴペプチドやポリペプチドを用いること
もできる。このオリゴペプチドやポリペプチドがさらに
エステル。

チオエステル、ヒドロキサミド、エーテル化したものを
用いることも可能である。また、上記アミノ酸誘導体は
水溶液の状態で用いるか、あるいは固体のまま用いても
よい。

次に混合物を得るには２例えばｐＨ５ないしｐ　Ｈ１１
好ましくはｐＨ６ないしｐＨ１０，最適にはｐＨ７ない
しｐＨ１０の緩衝液中、アデノシン三リン酸又はデオキ
シアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸とアミノアシ
ルｔ）ＩＮＡシンテターゼ１３− を含む粗酵素液と混合することによって行えばよい。そ
のときの混合の温度としては、酵素活性を維持する観点
から一般に０℃から７０℃が好ましく、最適には０°Ｃ
から３０℃で行われる。また。

そのときに用いられる緩衝液としては、アミノ酸。

アデノシン三すン酸、デオキシアデノシン三リン酸及び
アミノアシル−ｔＲＮＡＲＮＡシンチク含む粗酵素液が
熔解し所望のｐＨが得られるものであれば、いかなるも
のを使用してもよい。例えば、トリス塩酸緩衝液、ヘベ
ス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液１マレート緩衝
液６　リン酸緩衝液などがあげられる。さらに反応を円
滑に進行させ。

酵素の失活を防くことを主目的として３反応系にマグネ
シウム、マンガンなどの二価カチオン、メルカプトエタ
ノール、ジチオスレイトールなどのスルフヒドリル化剤
、ピロフォスファターゼを単独又は混合して添加しても
よい。各添加剤の好適な濃度としては、二価カチオ、ン
０．０１ｍ　Ｍ〜５００ｍＭ、スルフヒドリル化剤０．
００１ｍ　Ｍ　〜Ｌｏｏｍ　Ｍ　。

ピロホスファターゼ　０．００１ユニット／ｍ１〜１０
０１４− ユニット／ｍｌであり、最適な濃度としては、それぞれ
、二価カチオン　０．１ｍＭ〜１０ｍＭＩスルフヒドリ
ル化剤０．０１ｍＭ〜１ｍＭ、　　ピロホスファターゼ
１ユニソｌ−／　ｍ＋−１０ユニット／ｍｌテアル。

また、アミノ酸、アミノアシル−ｔＲＮ八シへテターゼ
を含む粗酵素液及びアデノシン三リン酸又はデオキシア
デノシン三リン酸の使用量は特に制限されないが、実用
的な収量を得るためには、アミノ酸１重量部に対し、ア
ミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液１０
３〜ＩＯ！　重量部（アミノアシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼの濃度としては。

１０／１Ｍ以上のものが好ましい。）の範囲アミノ酸と
アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸と
のモル比を１；１０〜１　：　１００の範囲内で行うの
が好ましい。前記の条件で反応を実施すると１反応は円
滑に進行し、数秒から３０分以内に完結する。

次いで、上記のようにして得られた混合物とアミノ酸誘
導体とを混合して反応させることにより目的のペプチド
又はペプチド誘導体を得ることができる。（この段階を
以後ペプチド化と称する。）このときに用いる反応混合
物は、そのままペプチド化反応に用いることもできるが
、Ｇ−２５（ファルマシア社Ｗ）Ｇ−７５（ファルマシ
ア社製）などのゲルクロマトグラフィーを行うことによ
りて１反応後に混在するアデノシン三すン酸、アデノシ
ンーリン酸あるいはピロリン酸等を除去して用いること
もできる。また、ペプチド化反応の温度としては、０℃
から７０℃が好ましく、酵素の失活防止と適正な反応速
度を得るという観点から。

１０℃から５０℃、特に２０℃から４０℃で行うことが
好ましい。　　ｐＨとしては、既出の各種緩衝液等を用
いて９５ないし１１好ましくは６ないし１０．最適には
マないし９で行えばよい。

反応混合物とアミノ酸誘導体との混合比として例えば、
容量で１：０．Ｌ〜１　：　１００の範囲で行えばよい
。また、この時用いるアミノ酸誘導体の濃度としては１
０ｍＭからＩＯＭの範囲であるが。

これをさらに低くして用いることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結し７目的
のペプチド又はペプチド誘導体を得ることができる。

本発明によって得られるペプチド誘導体は２例えば血圧
降下作用等のあるブラジキニンや内・外分泌抑制作用等
のあるソマトスタチンなどの各種ホルモン及び抗生物質
ペプチド、呈味ペプチドのような他の生物学的活性物質
として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチド誘導体
を保護基を用いることなく、安価に製造することができ
、さらにより高収量で製造できるため、工業的に極めて
有用である。

以下本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例エバチルス・ステアロサーモフィルス菌体６　ｋｇを。

２倍量の１００ｍＭ１−リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）に懸濁し、ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分
離により不溶物を除去し、チロシンに特異的なチロシル
−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗抽出液を得た。あらか
じめ５ｍＭメルカプトエタノール２ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム及び０．１ｌ７− ｍＭホスホフェニルスルホニルフルオリドを含む５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したリン酸セル
ロース（ワットマン社製）を充填したカラムに、上記の
粗抽出液をとおし、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた
溶液で、線速度６０ｃｍ・ｈ　で溶出せしめると、チロ
シル−ｔＲＮＡシンテターゼが溶出した。この区分を集
め、ａ縮、脱塩を行った結果、８０％以上の高い収率で
チロシンに特異的なチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼを
含む粗６ゲ素液を得た。上記操作をすべて４℃で行った
。

このようにリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理し
て得たチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液
３０ｇ（純度１％）、塩化マグネシウム０．４ｇ、　ア
デノシン三リン酸０．１ｇ、　　Ｌ−チロシン１ｍｇピ
ロホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）２
００ユニツト及びジチオスレイトール０．０１ｍｇを２
０抛１の２０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ８，０に熔解し、４
℃で１５分間混合させて混合物を得た。得られた混合物
にＬ−フェニルアラニンメチルエステル４ｇを加え、よ
く混合し１反応温１８− 度を３０℃に保って１日放置して反応させた。

次いで得られた反応液にアセトン２００ｍ１を加え沈殿
を濾別後、上清をエバポレーターにて約２０ｍ１に濃縮
し、ボンダバックＣ１ａカラム（ウォーターズ社製）に
供し、アセトニトリル１５０ｍＭリン酸カリ水溶液、８
５／１５．ｐＨ７を展開溶媒として用いて分離し、Ｌ−
チロシル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを０．
４ｍｇ得た。

その元素分析（Ｃｘ９ＨＱＩＩ　Ｎ２Ｏ４＝　３４２．
３９）は。

計算値（％）　　Ｃ＝６６．６５　　　Ｈ＝　　６．４
８Ｎ＝　　８．１８測定値（％）　　Ｃ＝６６．７１　　　Ｈ＝　　６．３
７Ｎ＝　　８．２３であった。

次に比較のため、バチルス・ステアロサーモフィルス６
ｋｇから、上記と同様の方法で粗抽出液を得、続いて陰
イオン交換樹脂のＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラ
フィー、　　ＤＥＡＥ−セファデックスカラムクロマト
グラフィー、硫酸アンモニウムによる分別沈殿法、ヒド
ロキシアパタイトグラフィー、　ＤＥＡＲ−セファデッ
クスカラムクロマトグラフィー及びセファデックスＧ−
１５０カラムクロマトグラフイー法で単一に精製したチ
ロシル−ｔＲＮＡシンテターゼを用い、上記と同様にし
てＬ　−チロシル−し−フェニルアラニンメチルエステ
ルを０．１ｍｇ得た。

実施例２．比較例２バチルス・ステアロサーモフィルス菌体５５＋ｔｇを用
い、実施例１と同様にして得た粗抽出液を。

あらかじめ５ｍＭメルカプトエタノール、２ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウム及び０．１ｍＭホスホフェ
ニルスルホニルフルオリドヲ含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）で平衡化したリン酸セレックス（バイオ
−ランド社製）に加え。

３０分攪拌し、数分放置後、上清を除去し、塩化ナトリ
ウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出させると、チロシ
ル−ｔＲＮＡシンテターゼが溶出した。

上記操作をすべて３０℃下で行った。

このリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理して得た
チロシル−ｔＲＮへシンテターセを含む粗酵素液２７ｇ
（純度１％）、塩化マグネシウム５０ｍｇ、アデノシン
三リン酸３００ｍｇ、　　Ｌ−チロシン９ｍｇ＋ピロホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）２００ユ
ニツト及びジチオスレイトール０、ＯＬｍｇを　２０Ｏ
ｎ＋１の２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８，５に溶解し、４
℃で２０分間反応させたのち１反応混合物をＧ−７５（
ファルマシア社製〉カラムに供し、ヘベス緩衝液にて溶
出し、ボイド容の画分３００ｎ＋１を集め反応混合物を
単離した。単離した混合物にＤ−バリンメチルエステル
１．０ｇを加え。

よく混合し２反応温度を２０℃に保って３０分間反応さ
せた。

次いで得られた反応液をアセトン１１を加え。

沈殿を炉別後、上清をエバポレーターにて約３０ｍ１に
濃縮し、ボンダバックＣカラムに供し、実施例１と同様
に分離して、Ｌ−チロシル−〇−バリンメチルエステル
１４．６ｍｇを得た。

その元素分析（Ｃ１ｓ　Ｈ２ｓ　Ｎ２　０４　　＝　２
９４．３６）は計算値（％＞　　Ｃ＝６１．２Ｌ　　　
Ｈ＝　　７：５３Ｎ＝　　９．５２２１− 測定値（％）　　Ｃ＝６１．４１　　　Ｈ＝　　７．５
ＯＮ＝　　　９．３９であった。

次に比較のため、上記と同じ菌体量を用い、比較例１と
同様にして得たチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼで反応
を行ってＬ−チロシル−１）−／＼リンメチルエステル
を３．６ｍｇ得た。

実施例３．比較例３パン酵母から実施例１と同様の操作で得た粗抽出液を、
あらかじめ、１０ｍＭメルカプトエタノール、２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸プ川・リ用ム及び０．１ｍＭホ
スホフェニルスルホニルフルオリドを含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したリン酸セルロース
（セルバ社製）を充填したカラムに通し、塩化カリウム
を上記緩衝液に加えた溶液で、線速度１０　ｃｍ−ｈ−
”で溶出せしめると、メチオニル−ｔＲＮＡシンテター
ゼを含む粗酵素液が熔出し、これを凍結乾燥して粉末状
の粗酵素標品を得た。

！！このリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理２２
− して得たメチオニル−ｔＲＮＡシンテクーゼを含む粗ｈ
ゲ素標品２ｇ（純度１０％）、塩化マグネシウム２０　
ｍｇ、アデノシン三すン酸４０ｍｇ、Ｄ−メチオニン１
　ｍｇ、　ピロホスファターゼ（ベーリンガー・マンハ
イム社製）１０ユニツト及びメルカプトエタノール２０
　を３Ｏｎ＋１の５０ｍＭ２．５−ジメチルイミダゾー
ル緩衝液ｐＨ９，０に加えて実施例２と同様に反応させ
た後、実施例２と同様に反応混合物を単離し、これにＬ
−ロイシンエチルエステル１ｇを固体のまま加えて２０
　”Ｃで５時間反応させた。得られた反応物にアセトン
２０ｍ１を加え生じた沈殿を濾別し、エバポレーターに
て約１０ｍ１に濃縮後、実施例１と同様に分離し、Ｄ−
メチオニル−Ｌ−ロイシンエチルエステルを１．８ｍｇ
得た。

その元素分析（Ｃ１３ｔ１２６Ｎ２　０３　　Ｓｌ　　
＝２９０．４３）は。

計算値（％）Ｃ＝５３．７７　　８＝９．０２Ｎ＝　　
９．６４測定値（％）　　Ｃ＝　５３．８０　　、　Ｈ＝８．９
ＯＮ＝　　９．７５であった。

次に比較のため、上記で得た粗抽出液をリン酸基を有す
る陽イオン交換樹脂で処理することなくそのまま用い、
上記と同様の方法で反応を行ってＤ−メチオニル−し−
ロイシンエチルエステルを０．２ｍｇ得た。

実施例３に比べると粗抽出液中に存在する他の酵素など
の影響による副反応のためか、収率は低下する１頃向に
あった。

実施例４．比較例４ウサギの肝臓からホモジナイザーを使って、実施例１と
同様の操作でセリル−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗抽
出液を得た。あらかじめ、１ｍＭジチオスレイトール、
２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム及び０．１ｍ
Ｍホスホフェニルスルホニルフルオリドを含む２５ｍＭ
イミダゾール緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したリン酸
セルロース（ワットマン社製）に上記粗抽出液を加え、
１時間攪拌し、静置後、上清を除去した。これを塩化カ
リウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめると。

セリル−ｔＲＮＡシンテターゼが溶出した。

こうして得たセリル−ｔＲＮ八シへテターゼを含む粗酵
素液３ｇ（純度ｌＯ％）、塩化マグネシウム５０■、デ
オキシアデノシン三リン酸５０■、Ｌ−七リン１■、ピ
ロホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）　　
２００ユニツト及びジチオスレイトール０．０１ｍｇを
用いて、実施例３と同様に反応させ、Ｇ−２５（ファル
マシア社製）カラムを用いて反応混合物を得た。次いで
、これにβ−アラニルアミド４ｇを加え、混合し、５０
℃で１０分間反応させた。得られた反応液をボンダパッ
クＣカラムにより実施例１と同様に分離し、Ｌ−セリル
−β−アラニルアミド　１．３ｍｇを得た。

その元素分析（Ｃ６１１１３Ｎ３０３　　＝　１７５．
１９）は。

計算値（％）　　Ｃ＝４１．１４　　　Ｈ＝７．４８Ｎ
＝　２３．９９測定値（％）　　Ｃ＝４１．１０　　　Ｈ＝７．４３Ｎ
　７２４．０５であった。

次に比較のため、上記で得た粗抽出液をリン酸２５− 基を有する陽イオン交換樹脂で処理することなくそのま
ま用いて、上記と同様の方法で反応を行ってＬ−セリル
−β−アラニルアミド０．２ｍｇを得た。

実施例４に比べると、収率は低下する傾向にあった。

代理人児玉雄三２６−

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アミノ酸からのペプチド又はペプチド誘導体を合
成するに際し、生物細胞を破砕して得た粗抽出液をリン
酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理してアミノアシル
−ｔＲＮＡシンテターゼを含む粗酵素液を得、得ら−れ
た粗酵素液を反応系に加えて合成することを特徴とする
ペプチド又はペプチド誘導体の合成法。