JPH0453514B2

JPH0453514B2 -

Info

Publication number: JPH0453514B2
Application number: JP5318184A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Imahori; Hiroshi Nakajima; Kazutsugu Kitahata; Ryoichi Tsuruya; Osamu Konishi; Keiichi Yamamoto
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1984-03-19
Filing date: 1984-03-19
Publication date: 1992-08-26
Also published as: JPS60196196A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、遊離のカルボキシ末端を有するペプ
チドの合成法に関するものである。近年、ペプチドに種々の生理活性が存在するこ
とが相ついで知られ、治療、診断などの医薬品と
しての重要性並びに呈味物質としての重要性がま
すます増大しつつある。それに伴い、ペプチド合
成法の開発も活発である。現在までに知られてい
るペプチド合成法の主なものとしては、例えばフ
アルマシア、レビユー、３号、24−47頁（1980
年）にまとめられているように、化学合成法と酵
素法の二つに大別することができる。その化学合
成法としては、アジド法、混合酸無水物法、活性
エステル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次
的に縮合する方法とフラグメントで縮合させる方
法などが代表的なものであるが、これらどの化学
合成法においても、ラセミ化及び副反応が起きや
すく、反応時間が長く、末端アミノ基を保護基に
て反応前にあらかじめ保護しておく必要があるな
ど種々の問題がある。フラグメント縮合法の場
合、特にラセミ化が起こりやすいという重大な欠
点を有するものである。一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法とし
て、プロテアーゼを用いる酵素法が提案されてい
るが、この方法においてもやはり、反応時間が長
く、末端アミノ基を保護基にて保護しておく必要
があるなど操作の煩雑さを改良するには至らなか
つた。さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法
では、用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有し
ているため、生じたペプチドが合成と併行して分
解され、しばしば目的のペプチドがえられないと
いう重大な欠点を示すものであつた。特に、オリ
ゴペプチドの合成に適用した場合には、一部のア
ミノ酸が欠落した目的外のペプチドがえられる重
大な欠点が指摘されている（ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー誌、256巻、1301
頁（1981年）。また、酵素法によるペプチド合成
法としては、プロテアーゼ法の他に、特定なアミ
ノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種
の酵素としては、例えばグルタミン酸／システイ
ン／グリシンの配列であるトリペプチドを合成す
るグルタチオン合成酵素（特開昭54−122793号公
報）やデカペプチドであるグラミジンＳを合成す
るグラミジンＳ合成酵素（現代化学1974年12月号
12頁）などが報告されている。しかし、これらの
酵素は特殊な酵素であつて、この酵素によつて合
成しうるペプチドは、限定された一種のみのペプ
チドであり、目的とする任意なペプチドを合成す
ることができない。このため、この方法は一般的
なペプチド合成法とはなり得ないのが現状であ
る。本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記
のような欠点、特にラセミ化、副反応の生起、反
応の煩雑さなどの原因となり、同時に経済性を損
なう保護基の必要性を解決し、汎用性のある新規
なペプチド合成法を提供することを目的として鋭
意研究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の一種であ
るtRNAに結合させる作用を有する酵素で、従来
全くペプチド結合を形成する作用が知られていな
かつたアミノアシル−tRNAシンテターゼに驚く
べきことに、ペプチド合成能があることを見いだ
し、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成させることを見いだし、先に特許
出願した（特開昭58−146539号公報参照。）。しか
し、この方法で、目的として遊離のカルボキシ末
端を有するペプチドの合成を試みる場合、PHを７
以下に維持して反応を行うと、特に良好な収率で
目的物を得ることができない場合もあり、また、
最初からPHを７以上、特に８以上に維持して反応
を行うと、時に副反応が激しく起きるためか、生
成物の単離が困難な場合もあり、特にペプチド鎖
が短い場合、その傾向があり、有効な改良が望ま
れていた。そこで、本発明者らは、上記の点を改良するた
めに鋭意研究を重ねた結果、まずPH７未満の反応
液を得、次いで得られた反応液のPHを７以上に調
整すると、良好な収率で遊離のカルボキシ末端を
有するペプチドが得られることを見い出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、アミノ酸とアミノ酸エス
テル又はペプチドエステルとから遊離のカルボキ
シ末端を有するペプチドを合成するに際し、まず
アミノ酸とアミノ酸エステル又はペプチドエステ
ルとをアミノアシル−tRNAシンテターゼの存在
下で反応させてPH７未満の反応液を得、ついで得
られた反応液のPHを７以上に調整することを特徴
とする遊離のカルボキシ末端を有するペプチドの
合成法である。本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル− tRNA＋AMP＋ピロリン酸の反応を触媒する酵素であり、例えばウサギ、ウ
マ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物組
織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなどの
植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放線菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものななどがあげられる。なかでも、酵素の
取得が容易であることから、微生物より得られる
ものが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス・サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマスアクアテイカス
などの耐熱性細菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。これらの各種アミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイ
ノミルなどで破砕したのち、例えばバイオケミス
トリー誌、13巻、2307頁（1974年）に記載されて
いるようにDEAE−セルロースカラムクロマトグ
ラフイー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフイーなどのクロマトグラフイー及び硫酸ア
ンモニカムによる分別沈殿法など通常の酵素精製
法を用いて、精製することによつて得ることがで
きる。アミノアシル−tRNAシンテターゼは、
種々のα−アミノ酸に特異性のあるものが用いら
れ、例えばチロシンに特異性のあるものとして
は、チロシル−tRNAシンテターゼが、またロイ
シンに特異性のあるものとしては、ロイシル−
tRNAシンテターゼが、さらにバリンに特異性の
あるものとしては、バリル−tRNAシンテター
ゼ、その他イソロシル−tRNAシンテターゼ、フ
エニルアラニル−tRNAシンテターゼ、アラニル
−tRNAシンテターゼ、グルタミル−tRNAシン
テターゼ、アスパラギニル−tRNAシンテター
ゼ、メチオニル−tRNAシンテターゼ、ヒスチジ
ル−tRNAシンテターゼ、リジル−tRNAシンテ
ターゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、セリ
ル−tRNAシンテターゼなどが具体例としてあげ
られる。本説明で好ましく用いられるアミノ酸として
は、例えばチロシン、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フエニルアラニル、メチオニン、リジ
ン、セリン、バリン、アスパラギン、アスパラギ
ン酸、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、シ
ステイン、トレオニン、トリプトフアン、ヒスチ
ジン、プロリン、アルギニンなどのα−アミノ酸
があげられる。本発明に使用されるアミノ酸エステルの好まし
いものとしては、例えばグリシン、アラニン、ロ
イシン、イソロイシン、フエニルアラニン、グル
タミン酸、グルタミン、イソロイシン、システイ
ン、チロシン、アルギニン、バリン、リジン、ヒ
スチジン、アスパラギン酸、メチオニン、トリプ
トフアン、トレオニンなどのα−アミノ酸、β−
アラニン、β−アミノイソ酪酸などのβ−アミノ
酸、クレアチンなどの含窒素γ−アミノ酸、ピペ
リジン酸などのγ−アミノ酸、ε−アミノカプロ
ン酸などのε−アミノ酸などの各種アミノ酸のエ
ステルがあげられる。また、ペプチドエステルの
好ましいものとしては、例えば上記アミノ酸が異
種又は同種の組み合わせで互いにアミド縮合した
ペプチド類のエステルを用いることができる。以
後アミノ酸エステル又はペプチドエステルを総称
してエステル類という。このエステル類のエステ
ル基としては、例えば炭素数１〜10個、好ましく
は炭素数１〜６個のアルコールから誘導されるも
のがあげられる。このエステル基の具体例として
は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチ
ル、ヘキシル、ドデシル、オクタデシル、シクロ
ヘキシルがあげられ、特にメチル、エチルが好適
である。本発明ではまずアミノ酸とエステル類とからア
ミノアシル−tRNAシンテターゼの作用によりペ
プチド化反応を行つてPH７未満の反応液を得るこ
とが必要である。このためには、まずアミノ酸と
エステル類との混合物を得るか、あるいはエステ
ル類とアミノアシル−tRNAシンテターゼとの混
合物を得ることが望まれる。そのためには、例え
ば水又は緩衝液中アデノシン三リン酸又はデオキ
シアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸とエス
テル類とを混合するか、あるいは水又は緩衝液中
アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リ
ン酸存在下に、エステル類とアミノアシル−
tRNAシンテターゼとを混合することによつて行
えばよい。このときに、次の反応を円滑に進行さ
せ、酵素の失活を防ぐことを主目的として、反応
系にマグネシウム、マンガンなどの二価カチオ
ン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール
などのスルフヒドリン化剤、ピロフオフアターゼ
を単独又は混合して添加してもよい。各添加剤の
好適な濃度としては、二価カチオン0.01mM〜
500mM、スルフヒドリル化剤0.001mM〜
100mM、ピロホスフアターゼ、0.001ユニツト／
ml〜100ユニツト／mlであり、最適な濃度として
は、それぞれ二価カチオン0.1mM〜10mM、ス
ルフヒドリル化剤0.01mM〜1mM、ピロホスフ
アクターゼ１ユニツト／ml〜10ユニツト／mlであ
る。また、アミノ酸、アミノアシル−tRNAシン
テターゼ及びアデノシン三リン酸又はデオキシア
デノシン三リン酸の使用量は特に制限されない
が、実用的な収量を得るためには、アミノ酸とア
ミノアシル−tRNAシンテターゼのモル比を
10⁹：１〜１：１、アミノ酸とアデノシン三リン
酸又はデオキシアデノシン三リン酸とのモル比
１：１〜１：100の範囲内で行うのが好ましい。
さらに、エステル類の濃度としては、10mMから
10Mの範囲が適当であり、100mMから2Mの範囲
が好ましい。また、これよりさらに低くしても用
いることができる。このときに用いる緩衝液としては、アミノ酸、
エステル類、アミノアシル−tRNAシンテターゼ
及びアデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン
三リン酸が溶解し、しかも酵素活性を維持し、所
望のPHが得られるものであれば、いかなるものを
使用してもよい。そのような具体例として、例え
ばトリス塩酸塩緩衝液、ヘペス緩衝液、トリエタ
ノールアミン緩衝液、マレート緩衝液、リン酸緩
衝液などがあげられる。これら緩衝液に親水性有
機溶媒を加えた混合媒体も上記条件を満たしさえ
すれば、使用可能である。この親水性有機溶媒と
しては、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの
ようなエーテル、さらにジメチルスルホキシド、
ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセト
ンなどが好ましく用いられる。これら有機溶媒
は、それぞれ単独又は２種以上組み合わせて使用
してもよい。この時の混合液全体に占める有機溶
媒の容量の濃度としては、0.5〜85％、好ましく
は５〜60％、最適には10〜50％の範囲である。次に、上記で得られたアミノ酸とエステル類と
の混合物とアミノアシル−tRNAシンテターゼと
を混合し、あるいは上記で得られたエステル類と
アミノアシル−tRNAシンテターゼとの混合物と
アミノ酸とを混合し、アミノ酸とエステル類とを
アミノアシル−tRNAシンテターゼの存在下で反
応させればよい。また、あらかじめアミノ酸とア
ミノアシル−tRNAシンテターゼとをアデノシン
三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸の存在
下に反応させて、反応混合物を得、これにエステ
ル類を反応させればよい。このときの反応液のPH
は７未満、好ましくは５〜6.8、最適には６〜6.8
の範囲である。反応温度としては、酵素活性を維
持する観点から一般に０℃〜70℃、好ましくは10
℃〜50℃、最適には20℃〜40℃で行われる。次に、本発明では上記で得た反応液のPHを７以
上に上げることが必要である。このためには、例
えば水可溶性の塩基を、反応液に撹拌下加えるこ
とによつて達成できる。塩基の例としては、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）グリシン、イミダゾー
ル、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ
酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウ
ム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウ
ムなどのアルカリ又はアルカリ塩、２，４，６−
コリジン緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、
ベロナール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、
２−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオー
ル緩衝液、トリスヒドロキシメチルメタン緩衝
液、ホウ酸緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸緩衝液
などの各種の緩衝液があげられ、これらは単独又
は混合して用いられる。ここで、反応液のPHを７
以上に保つ訳であるが、これにはPH検出器で反応
液を検出しながら、上記塩基を少しづつ添加し、
そのまま放置するのが良い。反応装置としては、
例えばPH検出器と塩基を供給するポンプとを設け
たものを用いることもできる。塩基の添加量とし
ては、所望するPH値に依存して加減すればよい。
好ましいPH範囲はPH７〜11、さらに好ましくはPH
７〜10、最適にはPH７〜９である。この範囲で反
応液は０℃〜70℃に保たれるが、酵素の活性を維
持する観点から好ましい10℃〜60℃、最適には20
℃〜50℃で行われる。放置する時間は通常１時間
以上２日間の間であるが、この範囲には限定され
ない。本発明によつて得られる遊離のカルボキシ末端
を有するペプチドは、例えば血圧降下作用などの
あるブラジキニンや内・外分泌抑制作用などのあ
るソフトスタチンなどの各種ホルモン及び抗生物
質ペプチド、呈味ペプチドのような他の生物学的
活性物質として有用である。本発明によれば、上記有用ペプチドを保護基を
用いることなく、良好な収率で製造することがで
きるので、製造コストも安価である。以下本発明を実施例により具体的に説明する。参考例１バチルス・ステアロサーモフイルスUK788（微
工研菌寄第5141号）の菌体６Kgを２倍量の
100mMトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、
ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離によ
り不溶物を除去し、チロシンに特異的なチロシル
−tRNAシンテターゼを含む粗抽出液を得た。あ
らかじめ5mMメルカプトエタノール、2mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム及び0.1mMホス
ホフエニルスルホニルフルオリドを含む50mMト
リス緩衝液（PH7.5）で平衡化したマートレツク
スゲルブル−Ａ（アミコン社製）を充填したカラ
ムに、上記の粗抽出液をとおし、塩化カリウムを
上記緩衝液に加えた溶液で、線速度60cm・h^-1で
溶出せしめると、チロシル−tRNAシンテターゼ
が溶出した。この区分を集め、濃縮、脱塩を行つ
た結果、約70％の収率でチロシンに特異的なチロ
シル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液を得
た。上記操作をすべて４℃で行つた。参考例２サツカロミセス・セルビシアエαS288C 1000Kg
をダイノミルで細胞破砕後、得られた粗抽出液を
硫酸アンモニウム分画、DEAE−セルロースクロ
マトグラフイー、リン酸セルロース（ワツトマン
社製）クロマトグラフイー、DEAE−セフアセル
（フアルマシア社製）クロマトグラフイー、ウル
トロゲルACA34クロマトグラフイー及びCM−セ
ルロース（ワツトマン社製）クロマトグラフイー
でロイシンに特異的なロイシル−tRNAシンテタ
ーゼを3.2g得た。参考例３ウサギの肝臓1000Kgをワーリングブレンダーで
破砕後、遠心（15000g）し、その上清をさらに
超遠心（105000g）して可溶製タンパク画分を得
これを硫酸アンモニウム分画セフアデツクスＧ−
200（フアルマシア社製）ゲルクロマトグラフイ
ー、DEAEセフアセルクロマトグラフイー及びハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフイーでメチ
オニル−tRNAシンテターゼを4.5g得た。参考例４エシエリヒア・コリＫ−12株150Kgから参考例
１と同一のカラム操作で、アスパラギン酸に特異
的アスパラチル−tRNAシンテターゼを1.5g得
た。参考例５バチルス・ステアロサーモフイルスNCA1503
株100Kgから参考例１と同一のカラム操作でアル
ギニンに特異的なアルギニル−tRNAシンテター
ゼを1.1g得た。実施例１、比較例１，２Ｌ−フエニルアラニンエチルエステル8gを含
む20mMピペス緩衝液、PH7.0、45mlに、塩化マ
グネシウム0.15g、アデノシン三リン酸二ナトリ
ウム0.3g、Ｌ−チロシン10mg、ピロホスフアクタ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）200ユニ
ツト及びジチオスレイトール0.01mgを加え、混合
液の容量を50mlに調整した。この混合液のPHを
6.8に維持した状態で、参考例１で得たチロシル
−tRNAシンテターゼ0.6mgを加え、よく混合し、
反応温度を30℃に保つて１日放置して反応させて
PH6.8の反応液を得た。次いで、この反応液にINの水酸化ナトリウム
を撹拌下に加え、PHを8.7に調整し、30℃で１日
間反応液を放置した後、ゾルバツクス0DSカラム
に反応液を供し、塩酸水溶液PH5.0とアセトニト
リルとの直線濃度勾配により分離溶出し、Ｌ−チ
ロシル−Ｌ−フエニルアラニン塩酸塩18mgを得
た。その元素分析値（C₁₈H₂₀N₂O₄Cl＝363.82）
は計算値（％）Ｃ＝59.42 Ｈ＝5.54 Ｎ＝7.70 Cl＝9.74 測定値（％）Ｃ＝59.18 Ｈ＝5.38 Ｎ＝7.91 Cl＝9.9 であつた。次に、比較（比較例１）のため、PH6.8に維持
したままで、他は実施例１と同様にして反応を行
つたところ、目的のＬ−チロシル−Ｌ−フエニル
アラニン塩酸塩は根跡程度しか得られなかつた。
また、比較（比較例２）のため、PHを最初から
8.7に維持したままで、他は実施例１と同様にし
て反応を行つたところ、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエ
ニルアラニン塩酸塩の収量は９mgであり、実施例
１の半分であつた。実施例２〜４、比較例３〜８Ｌ−アルギニン−メチルエステル9.5gを含む
50mMへペス緩衝液、PH7.5、45mlに塩化マグネ
シウム100mg、アデノシン三リン酸二ナトリウム
200mg、Ｌ−チロシン９mg、ピロホスフアクター
ゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）200ユニツ
ト及びジチオスレイトール0.01mgを加え、混合液
のPHを6.5に維持しながら容量を50mlに調整した。
この混合液に参考例１で得たチロシル−tRNAシ
ンテターゼ0.4mgを加え、よく混合して、PH6.5、
反応温度40℃に保つて、２時間反応させてPH6.5
の反応液を得た。次いで、この反応液に500mMのトリスヒドロ
キシメチルアミノメタン緩衝液を10ml撹拌下に加
えPH8.8に調整し、40℃で１日間引き続き撹拌し
た。得られた反応液を実施例１と同様の方法で分
離し、Ｌ−チロシル−Ｌ−アルギニン塩酸塩17mg
を得た。その元素分析（C₁₅H₂₃N₅O₄Cl＝388.83）
は計算値（％）Ｃ＝46.33 Ｈ＝5.96 Ｎ＝18.01 Cl＝9.12 測定値（％）Ｃ＝46.50 Ｈ＝5.93 Ｎ＝17.82 Cl＝9.0 であつた。次に、Ｌ−アルギニン−メチルエステルの代わ
りにＤ−アルギニンエチルエステル8.3gを加えて
実施例２と全く同様に反応を行つた（実施例３）。その結果、Ｌ−チロシル−Ｄ−アルギニン塩酸
塩を16mgを得た。さらに、実施例２のＬ−チロシンの代わりにＤ
−チロシンを用いて実施例２と全く同様に反応を
行つた（実施例４）。その結果、Ｄ−チロシル−Ｌ−アルギニン塩酸
塩16.5mgを得た。なお、比較（比較例３，４，５）のため、PHを
6.5に維持したままで、他は実施例２，３，４と
それぞれ同様にして反応を行つたところ、目的物
の収量は表１に示すとおりであつた。また、比較
（比較例６，７，８）のため、PHを最初から8.8に
維持したままで、他は実施例２，３，４とそれぞ
れ同様にして反応を行つたところ、目的物の収量
は表１に示すとおりであつた。

【表】実施例５、比較例９，10 Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル2gを含
む30mM2.5−ジメチルイミダゾール緩衝液PH6.0
13mlに塩化マグネシウム20mg、アデノシン三リン
酸二ナトリウム50mg、ピロホスフアターゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）10ユニツト、メルカ
プトエタノール20μ及び参考例２で得たロイシ
ル−tRNAシンテターゼ３mgを加え、混合液のPH
を6.5に維持しながら容量を15mlに調整した。こ
れにＬ−ロイシン１mgを加え、よく混合し、反応
温度を20℃に保つて10時間反応させてPH6.5の反
応液を得た。次いで、この反応液の温度を40℃に上げ、同時
にIN炭酸カリウム水溶液を加えてPHを9.0に合わ
せて２日放置した。得られた反応混合物を実施例１と同様に分離
し、Ｌ−ロイシル−Ｌ−フエニルアラニン塩酸塩
1.8mgを得た。その元素分析値（C₁₅H₂₂N₂O₃Cl＝313.81）は計算値（％）Ｃ＝57.41 Ｈ＝7.07 Ｎ＝8.93 Cl＝11.30 測定値（％）Ｃ＝58.00 Ｈ＝6.73 Ｎ＝9.01 Cl＝10.7 であつた。次に、比較（比較例９）のため、PHを6.5に維
持したままで、他は実施例５と同様にして反応を
行つたところ、Ｌ−ロイシン−Ｌ−フエニルアラ
ニン塩酸塩の収量は、約0.01mgであつた。また、
比較（比較例10）のため、PHを最初から9.0に維
持したままで、他は実施例５と同様にして反応を
行つたところ、Ｌ−ロイシル−Ｌ−フエニルアラ
ニン塩酸塩の収量は、0.7mgであつた。実施例６、比較例11，12 β−アラニンプロピルエステル5gを含む50mM
リン酸緩衝液、PH6.0、35mlに塩化マグネシウム
100mg、Ｌ−メチオニン２mg、ピロホスフアター
ゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）100ユニツ
ト、ジチオスレイトール0.01mgを加えて混合液を
得た。この混合液に参考例３で得たメチオニル−
tRNAシンテターゼを１mgを加え、混合液のPHを
6.0に維持しながら容量を40mlに調整し、これに
デオキシアデノシン三リン酸二ナトリウム100mg
を加え、PH6.0に保つてPH6.0の反応液を得、この
反応液を実施例５と同様に反応を行い、分解して
Ｌ−メチオニル−β−アラニン塩酸塩３mgを得
た。その元素分析（C₁₁H₂₂N₂O₂CIS＝281.82）は計算値（％）Ｃ＝46.88 Ｈ＝7.87 Ｎ＝9.94 Cl＝12.58 測定値（％）Ｃ＝46.71 Ｈ＝7.88 Ｎ＝10.00 Cl＝12.7 であつた。次に、比較（比較例11）のため、PHを6.0に維
持したままで、他は実施例６と同様にして反応を
行つたところ、Ｌ−メチオニル−β−アラニン塩
酸塩の収量は、約0.01mgであつた。また、比較
（比較例12）のため、PHを最初から9.0に維持した
ままで、他は実施例６と同様にして反応を行つた
ところ、Ｌ−メチオニル−β−アラニン塩酸塩の
収量は、約0.8mgであつた。実施例７、比較例13〜16 Ｌ−フエニルアラニンエチルエステル8gを含
む20mMピペス緩衝液、PH6.2、45mlに塩化マグ
ネシウム150mg、アデノシン三リン酸二ナトリウ
ム300mg、Ｌ−アスパラギン酸２mg、ピロホスフ
アターゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）200
ユニツト及びジチオスレイトール0.01mgを加え、
混合液をPH6.2、容量50mlに調整した。これに参
考例４で得たアスパラチル−tRNAシンテターゼ
0.1mgを加え、よく混合し、PH6.2、反応温度30℃
に保つて１日静置反応させてPH6.2の反応液を得
た。この反応液を実施例１と同様に処理して、Ｌ
−アスパラチル−Ｌ−フエニルアラニン塩酸塩
3.4mgを得た。次にＬ−アスパラギン酸の代わりにＬ−アルギ
ニンを、アスパラチル−tRNAシンテターゼの代
わりに参考例５で得たアルギニル−tRNAシンテ
ターゼを用いて実施例７と全く同様に反応を行つ
て、Ｌ−アルギニル−フエニルアラニン塩酸塩
3.0mgを得た。なお、比較（比較例13，14）のため、PHを6.2
に維持したままで、他は実施例７，８それぞれ同
様にして反応を行つたところ、目的物の収量は、
実施例７，８の約1/100であつた。また、比較
（比較例15，16）のため、PHを最初から8.7に維持
したままで、他は実施例７，８とそれぞれ同様に
して反応を行つたところ、目的物の収量は、実施
例７，８の約1/2であつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１アミノ酸とアミノ酸エステル又はペプチドエ
ステルとから遊離のカルボキシ末端を有するペプ
チドを合成するに際し、まずアミノ酸とアミノ酸
エステル又はペプチドエステルとをアミノアシル
−tRNAシンテターゼの存在下で反応させてPH７
未満の反応液を得、次いで得られた反応液のPHを
７以上に調整することを特徴とする遊離のカルボ
キシ末端を有するペプチドの合成法。