JPH055474B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、α−アミノ酸ヒドラジドの製造方法
に関するものである。 α−アミノ酸ヒドラジドは、例えば、アジド法
によるペプチドの合成などに使用される前駆体に
なるものであり、有機合成において価値のある化
合物である。 α−アミノ酸からα−アミノ酸のヒドラジドを
合成する反応は、多数知られている。例えば、(1)
α−アミノ酸のα−アミノ基及び必要なら側鎖の
官能基を保護基で保護した上で、保護基を含有す
るα−アミノ酸誘導体を酸無水物、酸ハロゲン化
物あるいは酸アジド等の形で活性化し、続いてこ
の活性化合物をヒドラジンと反応させ、保護基含
有α−アミノ酸ヒドラジドに変換し、さらに最終
的に保護基を除く方法、(2)(1)と同様に保護基を含
有するα−アミノ酸とヒドラジンとを脱水剤存在
下で縮合させてα−アミノ酸ヒドラジドに変換
し、最後に脱保護する方法、あるいは(3)α−アミ
ノ酸を、まずα−アミノ酸エステルに変換した
後、ヒドラジンと反応させてα−アミノ酸ヒドラ
ジドに変換する方法などが代表的なものである。 これらの反応は、いずれもα−アミノ酸から多
段階の工程を経てα−アミノ酸ヒドラジドを合成
するものである。また、(1)，(2)においては高価な
保護基が必要となるうえ、有機溶媒が通常、必要
となり、α−アミノ酸ヒドラジドを製造する上で
複雑な多工程の設備が必要となる。 一方、安価なα−アミノ酸の混合物を原料に用
いて特定のα−アミノ酸からのみのα−アミノ酸
ヒドラジドを合成することは、非常に難しい。従
つて、α−アミノ酸混合物中から、特定のα−ア
ミノ酸のみのα−アミノ酸ヒドラジドを製造する
ためには、α−アミノ酸混合物から特定のα−ア
ミノ酸を精製した後、ヒドラジド化反応を行う
か、あるいは、α−アミノ酸ヒドラジドの混合物
中から、特定のα−アミノ酸ヒドラジドを分離精
製することが必要である。α−アミノ酸混合物中
からの特定のα−アミノ酸を分離するには、各種
のα−アミノ酸の物性が、非常に似かよつている
ことから、クロマトグラフイー等で分離する場合
でも容易ではない。同様に各種のα−アミノ酸ヒ
ドラジドの混合物中から特定のα−アミノ酸ヒド
ラジドのみを分離精製することも、一般に容易で
はない。 本発明者らは、これらのα−アミノ酸ヒドラジ
ド製造上の問題点すなわち、保護基が必要である
こと、反応が多段階で複雑であること等を解決
し、α−アミノ酸から単一の反応のみで進行し、
保護基の必要がない経済的なα−アミノ酸ヒドラ
ジドの製造方法につき鋭意検討を重ねた結果、α
−アミノ酸を核酸の一種である転移リボ核酸（以
後tRNAと略記。）に結合させてアミノアシル−
tRNAを合成する作用を有する酵素であるアミノ
アシル−tRNAシンテターゼを触媒として使用す
ると、α−アミノ酸が単一の反応のみで容易にα
−アミノ酸ヒドラジドに変換されることを見い出
し、しかも安価な原料であるα−アミノ酸の混合
物から目的とするα−アミノ酸ヒドラジドを製造
できることを見い出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、α−アミノ酸とヒドラジ
ン、メチルヒドラジン、エチルヒドラジン、フエ
ニルヒドラジン、トリルヒドラジン、及びジメチ
ルヒドラジンから選択されるヒドラジンとからα
−アミノ酸ヒドラジドを製造するに際し、触媒と
してアミノアシル−tRNAシンテターゼを用いる
ことを特徴とするα−アミノ酸ヒドラジドの製造
方法である。 本発明の特徴とするところは、触媒としてアミ
ノアシル−tRNAシンテターゼを用いることによ
り、α−アミノ酸を何ら保護することなく、単一
の反応のみでヒドラジド化反応を起せしめてα−
アミノ酸ヒドラジドを製造することにあり、ま
た、α−アミノ酸は必ずしも純粋なものである必
要がなく、安価な二種以上のα−アミノ酸の混合
物であつても適当なアミノアシル−tRNAシンテ
ターゼを選択することにより、目的とする特定の
α−アミノ酸をα−アミノ酸ヒドラジドに変換さ
せることにある。 本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式 アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル−
tRNA＋AMP＋ピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放射菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であることから、微生物より得られるも
のが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス・サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマス・アクアテイカ
スなどの耐熱性細菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。 これらのアミノアシル−tRNAシンテターゼの
特徴は、基質であるα−アミノ酸に対しての特異
性が非常に高いことである。たとえば、チロシル
−tRNAシンテターゼは、各種のα−アミノ酸の
なかでも、特にチロシンに対して特異的であり、
実質上チロシンのみを基質として受け入れること
ができる。したがつて、アミノアシル−tRNAシ
ンテターゼとしては、上記チロシル−tRNAシン
テターゼ以外に、またロイシンに特異性のあるも
のとして、ロイシル−tRNAシンテターゼが、さ
らにバリンに特異性のあるものとして、バリル−
tRNAシンテターゼ、その他イソロシル−tRNA
シンテターゼ、フエニルアラニル−tRNAシンテ
ターゼ、アラニル−tRNAシンテターゼ、グルタ
ミル−tRNAシンテターゼ、アスパラギニル−
tRNAシンテターゼ、メチオニル−tRNAシンテ
ターゼ、ヒスチジル−tRNAシンテターゼ、リジ
ル−tRNAシンテターゼ、トレオニル−tRNAシ
ンテターゼ、セリル−tRNAシンテターゼ、アス
パラチル−tRNAシンテターゼ、グルタミル−
tRNAシンテターゼ、システイニル−tRNAシン
テターゼ、プロリル−tRNAシンテターゼ、グリ
シル−tRNAシンテターゼ、アルギニル−tRNA
シンテターゼ、トリプトフアニル−tRNAシンテ
ターゼなどが具体例としてあげられる。 これらの各種アミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイ
ノミル等で破砕したのち、例えばバイオケミスト
リー誌、13巻、2307頁（1974年）に記載されてい
るようにDEAE−セルロースカラムクロマトグラ
フイー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフイーなどのクロマトグラフイー及び硫酸アン
モニウムによる分別沈殿法など通常の酵素精製法
を用いて精製することによつて得ることができ
る。 本発明で好ましく用いられるα−アミノ酸とし
ては、例えばチロシン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、フエニルアラニン、メチオニン、リ
ジン、セリン、バリン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、
システイン、アルギニン、シスチン、ヒスチジ
ン、プロリン、トレオニン、トリプトフアンなど
があげられる。 これらα−アミノ酸は必ずしも純粋なものであ
る必要はなく、２種以上の混合物であつてもよ
い。その場合、これらのα−アミノ酸の合計が、
原料の乾燥重量のうち、少なくとも５重量％、好
ましくは30重量％占めるものが好ましい。このα
−アミノ酸の混合物中に、脂質、炭水化物、核酸
等の生体由来物質、無機イオン等が混入あるいは
混合されていてもよい。 このα−アミノ酸の混合物の例としては、大豆
かす、綿実かす、ごまかす、落花生かす等の植物
性たんぱく質を加水分解したα−アミノ酸の混合
物、魚かす（アンチヨビー）、人毛、羽毛、生糸
くず等の動物性たんぱく質を加水分解したα−ア
ミノ酸の混合物、酵母エキスやSCP（シングルセ
ルプロテイン）等の微生物由来のたんぱく質を加
水分解したもの等の自然に存在するたんぱく質を
加水分解して得たα−アミノ酸の混合物があげら
れる。また、これらのアミノ酸混合物を荒く精製
した混合物でもよい。さらに、通常、例えば食品
加工業等から排出される。たんぱく質あるいはア
ミノ酸を含有する排液なども中和、濃縮、濾過等
の簡単な前処理を行えば、原料として使用するこ
とが可能である。 このように、天然に存在するたんぱく質から由
来するα−アミノ酸の混合物以外にも、任意の組
成の化学合成されたα−アミノ酸の混合物も原料
として使用することが可能である。 本発明に使用されるヒドラジンは、ヒドラジ
ン、メチルヒドラジン、エチルヒドラジン、フエ
ニルヒドラジン、トリルヒドラジン、及びジメチ
ルヒドラジンから選択されるものである。 本発明では、α−アミノ酸とヒドラジンとか
ら、触媒としてアミノアシル−tRNAシンテター
ゼを用いてα−アミノ酸ヒドラジドを製造する
が、そのときにアデノシン三リン酸の存在下で行
うことが望まれる。このアデノシン三リン酸は、
反応を進めるうえでのエネルギー源となる化合物
であり、そのような化合物であれば、他の類緑体
の化合物に置き換えてもよい。このような化合物
としては、例えば3'−デオキシアデノシン三リン
酸、アデノシン三リン酸のβ又はγ−チオ類緑
体、あるいはアデニン環に置換基の入つたアデノ
シン三リン酸などがあげられる。 本発明において、α−アミノ酸、ヒドラジン、
アミノアシル−tRNAシンテターゼ及びアデノシ
ン三リン酸の添加順序はいずれを先に添加しても
よいが、酵素の失活を考えて、アミノアシル−
tRNAシンテターゼを最後に加えるのが望まし
い。 このときに、反応に用いる媒体としては、本法
が酵素を触媒とする反応であるため、主成分とし
て水を含有する溶媒が選ばれる。また、酵素の活
性が維持できる限度で、水溶性の有機溶媒を添加
してもよい。水溶性の有機溶媒としては、例え
ば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、
ジオキサン、テトラハイドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジ
メチルスルホキシドなどがあげられる。このよう
な有機溶媒の添加は、原料のヒドラジンが水に難
溶性である場合、特に有効である。このときに、
反応を円滑に進行させること、あるいは、酵素の
失活を防ぐことを主目的として、反応系にマグネ
シウム、マンガンなどの二価カチオン、メルカプ
トエタノール、ジチオスレイトールなどのスルフ
ヒドリル剤、ピロフオフアターゼを単独又は混合
して添加してもよい。各添加剤の好適な濃度とし
ては、二価カチオン0.01mM〜500mM、スルフ
ヒドリル剤0.001mM〜100mM、ピロホスフアタ
ーゼ0.001ユニツト／ml〜100ユニツト／mlであ
り、最適な濃度としては、それぞれ二価カチオン
0.1mM〜10mM、スルフヒドリル化剤0.01mM〜
1mM、ピロホスフアターゼ１ユニツト／ml〜10
ユニツト／mlである。また、酵素の活性を維持す
るため、溶媒に緩衝液を添加することが好まし
い。その緩衝液の濃度としては、100mM以下が
好ましい。その緩衝液としては、α−アミノ酸、
ヒドラジン、アミノアシル−tRNAシンテターゼ
及びアデノシン三リン酸が溶解し、しかも酵素活
性を維持し、所望のPHが得られ、かつ、副反応を
起こさないものであれば、いかなるものを使用し
てもよい。そのような具体例として、例えばヘペ
ス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、マレー
ト緩衝液、リン酸緩衝液、ビシン緩衝液、エツプ
ス緩衝液などがあげられる。次に反応条件につい
て述べると、アミノアシル−tRNAシンテターゼ
は、通常、反応の至適PHを７〜９付近にもつた
め、反応液のPHを、上記緩衝液で５ないし11に、
好ましくは６〜10に制御することが好ましい。ま
た、反応の温度としては、アミノアシル−tRNA
シンテターゼの触媒活性が維持できる限り、特に
限定されないが、通常０〜70℃が好ましく、最適
には、10〜40℃で行うことが好ましい。さらに原
料の濃度としては、特に限定されるものではない
が、実用的な収量を得るためには、目的のα−ア
ミノ酸の濃度が0.1mM以上、好ましくは1mM以
上とし、アデノシン三リン酸を目的とするα−ア
ミノ酸に対し、１〜10倍、好ましくは１〜５倍相
当量を使用し、アミノアシル−tRNAシンテター
ゼを、目的とするアミノ酸に対し、1/1〜1/10000
0相当量、好ましくは1/100〜１／100000相当量の濃 度で、実施することが好ましい。また、ヒドラジ
ンの濃度は、通常、10mMから10Mの範囲が好ま
しい。本発明によれば、α−アミノ酸のアミノ基
を保護することなく、常温、常圧の極めて穏和な
条件下でα−アミノ酸のヒドラジドを合成するこ
とが可能である。また、安価な原料であるα−ア
ミノ酸の混合物から特定のα−アミノ酸のみを、
選択的にヒドラジド化することが可能である。 以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、実施例中で、酵素の濃度は、ユニツト
単位で表示しており、このユニツトは、以下のよ
うに定義する。 (1) アミノアシル−tRNAシンテターゼ；１ユニ
ツトは、10分間に30℃で1μmoleのα−アミノ
酸を、アミノアシル−tRNAに変換する能力。 (2) ピロホスフアターゼ；１ユニツトは、ピロリ
ン酸から、1.0μmoleの無機りん酸を、１分間
に25℃で、PH7.2で生成させることができる能
力。 参考例 １ バチルス・ステアロサーモフイルスUK788（微
工研菌寄 第5141号）の菌体６Kgを２倍量の
100mMトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、
ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離によ
り不溶物を除去し、ヒスチジンに特異的なヒスチ
ジル−tRNAシンテターゼを含む粗抽出液を得
た。あらかじめ5mMメルカプトエタノール、
2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム及び
0.1mMホスホフエニルスルホニルフルオリドを
含む50mMトリス緩衝液（PH7.5）で平衡化した
マートレツクスゲルレツドＡ（アミコン社製）を
充填したカラムに、上記の粗抽出液をとおし、塩
化カリウムを上記緩衝液に加えた溶液で、線速度
60cm・h^-1で溶出せしめると、ヒスチジル−
tRNAシンテターゼが溶出した。この区分を集
め、濃縮、脱塩を行つた結果、約52％の収率でヒ
スチジンに特異的なヒスチジル−tRNAシンテタ
ーゼを含む粗酵素液を得た。上記操作をすべて４
℃で行つた。 参考例 ２ バチルス・ステアロサーモフイルスUK788 ５
Kgよりバイオケミストリー誌13巻、2307頁（1974
年）記載の方法に従い、チロシンに特異的に作用
するチロシル−tRNAシンテターゼを精製した。 精製酵素の収率は67％で、総ユニツトは700000
ユニツトであつた。 実施例 １ アデノシン三リン酸・二ナトリウム塩３mg，Ｌ
−ヒスチジン1.6mg、塩化マグネシウム六水和物
10mg、及びフエニルヒドラジン塩酸塩43mgを含む
50mM−ビシン緩衝液溶液800μを調整し、PHを
水酸化ナトリウムで8.0とした。これに参考例１
で得られた濃度が10万unit／mlまで濃縮されたヒ
スチジル−tRNAシンテターゼ200μを加え、十
分攪拌後、30℃で２日放置して反応を完結させて
反応混合物を得た。 この反応混合物に、0.1N−水酸化ナトリウム
10mlを加え、酢酸エチル20mlで３回抽出した。酢
酸エチル層は、混合して蒸溜水で２回洗浄後無水
硫酸ナトリウムで乾燥させ、しかる後溶媒を減圧
下で蒸発させて除去した。蒸発残査を、0.5mlの
水と0.5mlのアセトニトリルの混合物に溶解後、
ボンダパツクC₁₈カラム（ウオーターズ社製）を
担体とし、アセトニトリル／50mM−リン酸カリ
ウム水溶液を展開溶媒として、高速液体クロマト
グラフイーで生成物を分離した。 この生成物は、Ｌ−ヒスチジン−２−フエニル
ヒドラジドであり、収量は2.1mgであつた。 この化合物の元素分析（C₁₂H₁₅N₅Ｏ＝245.28）
の結果は、次のとおりであつた。 計算値（％） Ｃ＝58.76，Ｈ＝6.16，Ｎ＝
28.55 実測値（％） Ｃ＝58.82，Ｈ＝6.21，Ｎ＝
28.47 実施例 ２ α−アミノ酸として、Ｌ−ヒスチジン1.6mg，
Ｌ−セリン1.0mgの混合物を使用すること以外は、
実施例１と全く同様にして１−Ｌ−ヒスチジル−
２−フエニルヒドラジド1.8mgを得た。 このときに、１−Ｌ−セリン−２−フエニルヒ
ドラジドの生成は検出されなかつた。 実施例 ３ アデノシン三リン酸・二ナトリウム塩30mg，Ｌ
−チロシン3.6mg、グリシン1.5mg，Ｌ−バリン2.3
mg、塩化マグネシウム六水和物102mg及びジチオ
スレイトール８mgを、20mMのヘペス緩衝液に溶
解し、水酸化ナトリウムでPHを8.5に調整し、さ
らに20mMのビシン緩衝液を加えて、溶液量を
7.5mlとし、50℃程度に加熱して均一な溶液を得
た。 この溶液を、室温に戻した後、ピロホスフアタ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製、20unit／
ml）を、20mMのヘペス緩衝液で透析して得た溶
液0.5ml，塩酸でPHを8.5に調整した5M−１，１
−ジメチルヒドラジン水溶液１ml及び参考例２で
得られた20万unit／mlのチロシル−tRNAシンテ
ターゼで溶液１mlを混合し、総計10mlとした。こ
の溶液を30℃の恒温槽中で一日放置して反応を完
結させて反応液を得た。 次いで得られた反応液にアセトン200mlを加え、
沈殿を濾別後、上漬をエバポレーターにて、溶媒
を蒸発乾固した。得られた固体を水に再溶解後、
ボンダパツクC₁₈カラム（ウオーターズ社製）に
供し、アセトニトリル／50mMリン酸カリ水溶液
（5/95）PH6.5を展開溶媒として用いて分離し、Ｌ
−チロシン−２，２−ジメチルヒドラジド1.6mg
を得た。 この収率は、チロシンを基として約50％であつ
た。また、グリシン及びバリンのヒドラジドは認
められなかつた。 この化合物の元素分析（C₁₁H₁₇N₃O₂＝223.27）
の結果は、次のとおりであつた。 計算値（％） Ｃ＝59.18，Ｈ＝7.67，Ｎ＝
18.82 実測値（％） Ｃ＝59.21，Ｈ＝7.70，Ｎ＝
18.80 実施例 ４〜７ 実施例３と同様の条件下でヒドラジンとして、
ヒドラジン、メチルヒドラジン、エチルヒドラジ
ン、Ｐ−トリルヒドラジンの四種のヒドラジンを
用い、反応を行つた。 反応混合液を、そのままゾルバツクスODS（デ
ユポン社製）を担体とし、溶出液としてアセトニ
トリル／50mM−リン酸カリウム水溶液を使用
し、アセトニトリル濃度を０〜50％にグラデイエ
ントをかけながら、高速液体クロマトグラフイー
で分析した。 それぞれＬ−チロシン−ヒドラジド、Ｌ−チロ
シン−２−メチルヒドラジド、Ｌ−チロシン−２
−エチルヒドラジド、１−Ｌ−チロシル−２−Ｐ
−トリルヒドラジドの生成が認められた。 グリシン及びＬ−バリンからのヒドラジドは、
いずれの場合も実質上高速液体クロマトグラフイ
ーでは検出されなかつた。 出発原料中のＬ−チロシン量を基準に収率を計
算すると表１の結果となつた。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ α−アミノ酸とヒドラジン、メチルヒドラジ
   ン、エチルヒドラジン、フエニルヒドラジン、ト
   リルヒドラジン、及びジメチルヒドラジンから選
   択されるヒドラジンとからα−アミノ酸ヒドラジ
   ドを製造するに際し、触媒としてアミノアシル−
   tRNAシンテターゼを用いることを特徴とするα
   −アミノ酸ヒドラジドの製造方法。