JPH0455679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規
な合成法に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在するこ
とが相ついで知られ、治療、診断などの医薬品と
しての重要性並びに呈味物質としての重要性がま
すます増大しつつある。それに伴ない、ペプチド
合成法の開発も活発である。現在までに知られて
いるペプチド合成法の主なものとしては、例え
ば、フアルマシア、レビユー、３号、27〜47頁
（1980年）にまとめられているように、化学合成
法と酵素法の二つに大別することができる。その
化学合成法としては、アジド法、混合酸無水物
法、活性エステル法、カルボジイミド法でアミノ
酸を逐次的に縮合する方法とフラグメントで縮合
させる方法などが代表的なものであるが、これら
どの化学合成法においても、ラセミ化及び副反応
が起きやすく反応時間が長く、末端アミノ基を保
護基にて反応前にあらかじめ保護しておく必要が
あるなど種々の問題がある。フラグメント縮合法
の場合、特にラセミ化が起こりやすいという重大
な欠点を有すものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法とし
て、プロテアーゼを用いる酵素法が提案されてい
るがこの方法においてもやはり、反応時間が長
く、末端アミノ基を保護基にて保護しておく必要
があるなど操作の煩雑さを改良するには至らなか
つた。さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法
では、用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有し
ているため、生じたペプチドが合成と併行して分
解され、しばしば目的のペプチドが得られないと
いう重大な欠点を示すものであつた。特に、オリ
ゴペプチドの合成を適用した場合には、一部のア
ミノ酸が欠落した目的外のペプチドが得られる重
大な欠点が指摘されている〔ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー誌、256巻、1301
頁（1981年〕。また、酵素法によるペプチド合成
法としては、プロテアーゼ法の他に、特定なアミ
ノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種
の酵素としては、例えば、グルタミン酸／システ
イン／グリシンの配列であるトリペプチドを合成
するグルチオン合成酵素（特開昭54−122793号公
報）やデカペプチドであるグラミシジンＳを合成
するグラミシジンＳ合成酵素（現代化学1974年12
月号12頁）などが報告されている。しかし、これ
らの酵素は特殊な酵素であつて、この酵素によつ
て合成しうるペプチドは、限定された一種のみの
ペプチドであり、目的とする任意なペプチドを合
成することができない。このため、この方法は一
般的なペプチド合成法とはなり得ない現状であ
る。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記
のような欠点、特にラセミ化、副反応の生起、反
応の煩雑さなどの原因となり、同時に経済性を損
なう保護基の必要性を解決し、汎用性のある新規
なペプチド合成法を提供することを目的として鋭
意研究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の一種であ
るtRNAに結合させる作用を有する酵素で、従来
全くペプチド結合を形成する作用が知られていな
かつたアミノアシル−tRNAシンテターゼに驚く
べきことに、ペプチド合成能があることを見い出
し、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成されることを見い出し、先に特許
出願した（特開昭58−146539号公報参照）。しか
し、この方法は良好な収率で目的物を得るには、
ペプチド又はペプチド誘導体の原料である高価な
アミノ酸又アミノ酸誘導体を高濃度で反応系に加
えており、コストが高くなる傾向があつた。

そこで、本発明者らは上記の点を改良するため
さらに鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに反
応系に４級アンモニウム化合物又は４級ホスホニ
ウム化合物を加えると、原料のアミノ酸又はアミ
ノ酸誘導体の濃度を低くしても良好な収率でペプ
チド又はペプチド誘導体の合成が可能になること
を見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、アミノ酸とアミノ酸又は
アミノ酸から誘導されるアミノ酸誘導体とをアミ
ノアシル−tRNAシンテターゼの存在下で反応さ
せてペプチド又はペプチド誘導体を合成するに際
し、該反応系に４級アンモニウム化合物又は４級
ホスホニウム化合物を加えることを特徴とするペ
プチド又はペプチド誘導体の合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式 アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル −tRNA＋AMP＋ピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放射菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であることから、微生物より得られるも
のが好ましく、さらに酵素の安定性からバチル
ス・ステアロサーモフイルス、サーマス・サーモ
フイルス、サーマス・フラバス、クロストリジウ
ム・サーモアセチカム、サーマス・マグアテイカ
スなどの耐熱性細菌より得られるアミノアシル−
tRNAシンテターゼが最適である。

これら各種のアミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、種々のα−アミノ酸に特異性のあるものが
用いられ、例えば、チロシンに特異性のあるもの
としては、チロシル−tRNAシンテターゼが、ま
たロイシンに特異性のあるものとしては、ロイシ
ル−tRNAシンテターゼが、さらにバリンに特異
性のあるものとしては、バリル−tRNAシンテタ
ーゼ、その他イソロシル−tRNAシンテターゼ、
フエニルアラニル−tRNAシンテターゼ、アラニ
ル−tRNAシンテターゼ、グルタミニル−tRNA
シンテターゼ、アスパラギニル−tRNAシンテタ
ーゼ、メチオニル−tRNAシンテターゼ、ヒスチ
ジル−tRNAシンテターゼ、リジル−tRNAシン
テターゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、セ
リル−tRNAシンテターゼ、アスパラチル−
tRNAシンテターゼ、グルタミル−tRNAシンテ
ターゼ、システイニル−tRNAシンテターゼ、プ
ロリル−tRNAシンテターゼ、グリシル−tRNA
シンテターゼ、アルギニル−tRNAシンテター
ゼ、トリプトフアニル−tRNAシンテターゼなど
が具体例としてあげられる。

本発明に使用される４級アンモニウム化合物と
しては、例えば、塩化テトラメチルアンモニウ
ム、フツ化テトラエチルアンモニウム、臭化テト
ラプロピルアンモニウム、ヨウ化テトラブチルア
ンモニウム、塩化メチルトリオクチルアンモニウ
ム、臭化Ｎ−ブチルピリジニウム、臭化Ｎ−ドデ
シルピリジニウム、塩化ベンジルトリエチルアン
モニウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウ
ム、臭化ヘキシルトリエチルアンモニウム、臭化
ドデシルトリエチルアンモニウム、臭化ヘキサデ
シルトリエチルアンモニウム、塩化フエニルトリ
メチルアンモニウムなどがあげらる。また、４級
ホスホニウム化合物としては、例えば、塩化テト
ラフエニルホスホニウム、臭化フエニルトリメチ
ルホスホニウム、塩化テトラブチルホスホニウ
ム、臭化エチルトリオクチルホスホニウム、臭化
ヘキサデシルトリエチルホスホニウムなどがあげ
られる。

以下、アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導
体を合成する本発明の方法を具体的に説明する。

本発明によれば、アミノ酸とアミノ酸又はアミ
ノ酸から誘導されるアミノ酸誘導体とをアミノア
シル−tRNAシンテターゼ及び４級アンモニウム
化合物又は４級ホスホニウム化合物の存在下で反
応させることによつてペプチド又はペプチド誘導
体を合成することができる。さらに本発明によれ
ば、あらかじめアミノ酸とアミノアシル−tRNA
シンテターゼとを反応させて反応混合物を得、次
いで得られた反応混合物とアミノ酸又はアミノ酸
誘導体を４級アンモニウム化合物又は４級ホスホ
ニウム化合物の存在下で反応させることによつて
ペプチド又はペプチド誘導体を合成することがで
きる。このアミノアシル−tRNAシンテターゼと
あらかじめ反応させるのに好ましく用いられるア
ミノ酸としては、例えばチロシン、アラニン、ロ
イシン、イソロイシン、フエニルアラニン、メチ
オニン、リジン、セリン、バリン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン、グ
ルタミン酸、システイン、トレオニン、トリプト
フアン、ヒスチジン、プロリン、アルギニン、な
どのα−アミノ酸があげられ、Ｌ体、Ｄ体、のい
ずれでもよい。また、好ましく用いられるアミノ
酸又はアミノ酸誘導体としては、例えばグリシ
ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フエニ
ルアラニン、グルタミン、イソロイシン、システ
イン、チロシン、アルギニン、バリン、リジン、
ヒスチジン、アスパラギン、メチオニン、トリプ
トフアン、トレオニンなどのα−アミノ酸、β−
アラニン、β−アミノイソ酪酸などのβ−アミノ
酸、クレアラチンなどの含窒素γ−アミノ酸、ピ
ペリジン酸などのγ−アミノ酸、ε−アミノカプ
ロン酸などのε−アミノ酸などの各種アミノ酸又
はこれらの各種アミノ酸のエステル、チオエステ
ル、アミド、ヒドロキサミドなどがあげられる
が、アミノ基が遊離の形であるアミノ酸誘導体で
あれば、上記例示化合物に限定されるものではな
い。そのエステルとしては、例えばメチル、エチ
ル、プロピル、シクロヘキシル、フエニル、ベン
ジルなどの単純な炭化水素系のエステルから、
tRNAの3′−OHで上記アミノ酸がエステル化し
たものまで、種々のエステルを用いることができ
る。また、アミドとしては、遊離ののアミドの
他、例えば異種あるいは同種のアミノ酸がアミド
結合したオリゴペプチドやポリペプチドを用いる
こともできる。このオリゴペプチドやポリペプチ
ドがさらにエステル、チオエステル、ヒドロキサ
ミド、エーテル化したものを用いることも可能で
ある。

次に反応混合物を得るには、例えばPH５ないし
PH11好ましくはPH６ないしPH10の緩衝液中、アデ
ノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸
存在下に、アミノ酸のアミノアシル−tRNAシン
テターゼと混合することによつて行えばよい。そ
のときの反応の温度としては、酵素活性を維持す
る観点から一般に０℃から70℃が好ましく、最適
には０℃から30℃で行われる。また、そのときに
用いられる緩衝液としては、アミノ酸、アデノシ
ン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸及びア
ミノアシル−tRNAシンテターゼが溶解し、所望
のPHが得られるものであれば、いかなるものを使
用してもよい。例えば、トリス塩酸緩衝液、ヘペ
ス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、マレー
ト緩衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。さら
に反応に円滑に進行させ、酵素の失活を防ぐこと
を主目的として、反応系にマグネシウム、マンガ
ンなどの二価カチオン、メルカプトエタノール、
ジチオスレイトールなどのスルフヒドリル化剤、
ピロフオスフアターゼを単独又は混合して添加し
てもよい。各添加剤の好適な濃度としては、二価
カチオン0.01ｍＭ〜500ｍＭ、スルフヒドリル化
剤0.001ｍＭ〜100ｍＭ、ピロホスフアターゼ
0.001ユニツト／ml〜100ユニツト／mlであり、最
適な濃度としては、それぞれ、二価カチオン0.1
ｍＭ／50ｍＭ、スルフヒドリル化剤0.01ｍＭ〜５
ｍＭ、ピロホスフアターゼ１ユニツト／ml〜10ユ
ニツト／mlである。また、アミノ酸、アミノアシ
ル−tRNAシンテターゼ及びアデノシン三リン酸
又はデオキシアデノシン三リン酸の使用量は特に
制限されないが、実質的な収量を得るためには、
アミノ酸のアミノアシル−tRNAシンテターゼの
モル比を１：１〜１：10、アミノ酸とアデノシン
三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸とのモ
ル比１：10〜１：100の範囲内で行うのが好まし
い。前記の条件で反応を実施すると、反応は円滑
に進行し、数秒から30分以内に完結する。

次いで、上記のようにして得られた反応混合物
とアミノ酸誘導体とを４級アンモニウム化合物又
は４級ホスホニウム化合物の存在下に反応させる
ことにより目的のペプチド又はペプチド誘導体を
得ることができる。（この段階を以後ペプチド化
と称する。）。このとき反応液全体に占める４級ア
ンモニウム化合物又は４級ホスホニウム化合物の
濃度としては、これら化合物を単独で用いた場合
も、あるいは併用して用いた場合も１ｍＭ〜1M
の範囲であればよい。このときに親水性有機溶媒
も使用することができるが、その有機溶媒として
は、例えばジメチルアセタール、２，２−ジメト
キシプロパン、エチレングリコールジメチルエー
テル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチ
ルホルムアミド、アセトニトリル、アセトンなど
があげられる。

これら親水性有機溶媒は任意の濃度で使用でき
るが、アミノアシル−tRNAシンテターゼの安定
性という面からは反応液全体の40％以下の濃度
で、これら親水性有機溶媒を使用することが好ま
しい。このときに用いる反応混合物は、そのまま
ペプチド化反応に用いることもできるが、Ｇ−25
（フアルマシア社製）Ｇ−75（フアルシマシア社
製）などのゲルクロマトグラフイーを行うことに
よつて、反応後に混在するアデノシン三リン酸、
アデノシン一リン酸あるいはピロリン酸等を除去
して用いることもできる。また、ペプチド化反応
の温度としては、０℃から70℃が好ましく、酵素
の失活防止と適正な反応速度を得るという観点か
ら10℃から50℃、特に20℃から40℃で行うことが
好ましい。PHとしては、既出の各種緩衝液等を用
いて、５ないし11、好ましくは６ないし10、最適
には７ないし９で行えばよい。

反応混合物とアミノ酸又はアミノ酸誘導体との
混合比として例えば、容量で１：0.1〜１：100の
範囲で行えばよい。また、この時用いるアミノ酸
又はアミノ酸誘導体の濃度としては10ｍＭから
10Mの範囲であるが、これをさらに低くして用い
ることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結
し、目的のペプチド又はペプチド誘導体を得るこ
とができる。

本発明によつて得られるペプチド誘導体は、例
えば血圧降下作用等のあるブラジキニンや内・外
分泌抑制作用等のあるソマテスタチンなどの各種
ホルモン及び抗生物質ペプチド、呈味ペプチドの
ような他の生物学的活性物質として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチ
ド誘導体を保護基を用いることなく、低濃度の原
料を使用しても製造することができるので、製造
コストも安価である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

実施例１、比較例１、２ バチルス・ステアロサーモフイルスNCA1503
（微工研菌寄、第4778号）よりバイオケミストリ
ー誌、13巻、2307頁（1974年）記載の方法に従い
精製されたチロシンに特異的なチロシル−tRNA
シンテターゼ0.4ｇ、塩化マグネシウム0.4ｇ、ア
デノシン三リン酸二ナトリウム塩0.1ｇ、Ｌ−チ
ロシン0.8mg、ピロホスフアクターゼ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）200ユニツト及びジチオ
スレイトール0.01mgを90mlの20ｍＭヘペス緩衝液
PH8.0に溶解し、４℃で15分間反応させて反応混
合物を得た。得られた反応混合物にＬ−フエニル
アラニンメチルエステル0.4ｇ、塩化テトラブチ
ルアンモニウム0.1ｇ及びアセトニトリル10mlを
加えてよく混合し、反応温度を30℃に保つて１日
放置して反応させた。

次いで、得られた反応液にアセトン200mlを加
えて沈殿を濾別後、上清をエバポレーターにて約
20mlに濃縮し、ボンダパツクC₁₈カラム（ウオー
ターズ社製）に供し、アセトニトリル／0.01N塩
酸水溶液、15／85PH４を展開溶媒として用いて分
離し、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩を0.6mg得た。

その元素分析（C₁₉H₂₃ClN₂O₄＝378.89）は、 計算値（％） Ｃ＝60.23H＝6.13N＝7.40 測定値（％） Ｃ＝60.29H＝6.11N＝7.36 であつた。

また、比較（比較例１）のため20ｍＭヘペス緩
衝液を100ml、Ｌ−フエニルアラニンメチルエス
テルを４ｇ使用して、塩化テトラブチルアンモニ
ウム及びアセトニトリルを共存させなかつたほか
は実施例１と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステル塩酸塩の収量は0.4mgであり、
実施例１の収量より少なかつた。この比較例１で
用いたＬ−フエニルアラニンメチルエステル４ｇ
であるのに対し、実施例１ではその1/10の0.4ｇ
でよかつた。

さらに比較（比較例２）のため、20ｍＭヘペス
緩衝液を100ml使用して、塩化テトラブチルアン
モニウム及びアセトニトリルを共存させなかつた
ほかは実施例１と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンエチルエステルの収量は0.1mgであり、実施例
１の収量の1/4であつた。

実施例２、比較例３、４ 実施例１で用いたチロシル−tRNAシンテター
ゼ５ｇ、塩化マグネシウム150mg、アデノシン三
リン酸二ナトリウム塩300mg、Ｌ−チロシン９mg、
ピロホスフアターゼ（ベーリンガーマンハイム社
製）200ユニツト及びジチオスレイトール0.01mg
を20mlの10ｍＭヘペス緩衝液PH8.5に溶解し、４
℃で20分間反応させたのち、反応混合物をＧ−75
（フアルマシア社製）カラムに供し、同上ヘペス
緩衝液にて溶出し、ボイド容の画分30mlを集め反
応混合物を単離した。単離した反応混合物にグリ
シルグリシンエチルエステル0.5ｇ及び塩化テト
ラブチルホスホニウム0.2ｇを加え、よく混合し、
反応温度を20℃に保つて30分間反応させた。

次いで得られた反応をそのままボンダパツク
C₁₈カラムに供し、実施例１と同様に分離して、
Ｌ−チロシルグリシルグリシンエチルエステル塩
酸を15mgを得た。

次に比較（比較例３）のため、グリシルグリシ
ンエチルエステル４ｇ使用して、塩化テトラブチ
ルホスホニウムを共存させなかつたほかは実施例
２と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシルグリシルグリシンエチ
ルエステル塩酸塩の収量は14mgであつた。

また、比較（比較例４）のため、塩化テトラブ
チルホスホニウムを共存させなかつたほかは、実
施例２と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−チロシルグリシルグリシンエチ
ルエステル塩酸塩の収量は３mgであつた。

実施例３、４、比較例５ 酵母Torulpsis Ｒ−14（微工研菌寄、第3114号）
からDETE−セルロース、フエニルセフアロース
及びアフイ・ゲルブルー（バイオラツド社製）の
カラムクロマトグラフイーにより調製したロイシ
ル−tRNAシンテターゼ500mg、塩化マグネシウ
ム20mg、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩５
mg、Ｌ−ロイシン１mg、ピロホスフアターゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社製）10ユニツト及びメル
カプトエタノール20μを20mlの30ｍM2，５−
ジメチルイミダゾール緩衝液PH８に加えて、実施
例２と同様に反応したのち、実施例２と同様に反
応混合物を単離し、これにＬ−フエニルアラニン
アミド0.2ｇ及び塩化テトラフエニルホスホニウ
ム0.1ｇを加えて20℃で５時間反応した。得られ
た反応物にアセトン20mlを加え生じた沈殿を濾別
し、エバポレーターにて約10mlに濃縮後、実施例
１と同様分離し、Ｌ−ロイシル−Ｌ−フエニルア
ラニンアミド塩酸塩を得た（実施例３）。

次に、塩化テトラフエニルホスホニウム0.1ｇ
の代りに塩化フエニルトリエチルアンモニウム
0.05ｇ及び臭化ヘキサデシルトリエチルホスホニ
ウム0.05ｇを使用した以外は実施例３と同様に行
つた。（実施例４）。

さらに、比較（比較例５）のため、塩化テトラ
フニルホスホニウムを共存させなかつたほかは実
施例３と全く同様に行つた。

その結果、Ｌ−ロイシン−Ｌ−フエニルアラニ
ンアミド塩酸塩の収量は以下に示すとおりであつ
た。

収量（mg） 実施例３ 1.4 実施例４ 1.3 比較例５ 0.2 実施例５、比較例６ ウサギ（北山ラベス、KBL：JW日本白色種）
の肝臓からホモジナイザーを使つて、実施例１と
同様の操作で得たチロシル−tRNAシンテターゼ
0.7ｇ、塩化マグネシウム30mg、アデノシン三リ
ン酸二ナトリウム塩７mg、Ｄ−チロシン２mg、ピ
ロフオスフアターゼ15ユニツトおよびメルカプト
エタノール20μを80mlの50ｍＭビシン緩衝液PH
8.5に加えて、10℃で10分間反応させた後、これ
に塩化ベンジルトリルエチルアンモニウム50mgお
よびＬ−アルギニン0.4ｇを加え、さらに30℃に
て２時間反応させた。この反応液を実施例１と同
様に処理してＤ−チロシル−Ｌ−アルギニン二塩
酸塩3.6mgを得た。

次に比較（比較例６）のため、塩化ベンシルト
リエチルアンモニウムを使用しなかつたほかは実
施例５と全く同様に行つた。

その結果、Ｄ−チロシル−Ｌ−アルギニン二塩
酸塩の収量は0.2mgであつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アミノ酸とアミノ酸又はアミノ酸から誘導さ
   れるアミノ酸誘導体とをアミノアシル−tRNAシ
   ンテターゼの存在下で反応させてペプチド又はペ
   プチド誘導体を合成するに際し、該反応系に４級
   アンモニウム化合物又は４級ホスホニウム化合物
   を加えることを特徴とするペプチド又はペプチド
   誘導体の合成法。