JPS6170998A - ペプチド又はペプチド誘導体の合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規な合成法
に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在することが相つ
いで知られ、治療１診断などの医薬品としての重要性並
びに呈味物質としての重要性がますます増大しつつある
。それに伴い、ペプチド合成法の開発も活発である。現
在までに知られているペプチド合成法の主なものとして
は９例えば。

ファルマシア、レビエー、３号、２７〜４７頁（１９８
０年）にまとめられているように、化学合成法と酵素法
の二つに大別することができる。その化学合成法として
は、アジド法、混合酸無水物法、活性エステル法、カル
ボジイミド法でアミノ酸を逐次的に縮合する方法とフラ
グメントで縮合させる方法などが代表的なものであるが
、これらどの化学合成法においても、ラセミ化及び副反
応が起きやす（反応時間が長（、末端アミノ基を保護基
にて反応前にあらかじめ保護しておく必要があるなど種
々の問題がある。フラグメントｍ合法の場合。

特にラセミ化が起こりやすいという重大な欠点を有する
ものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法として。

プロテアーゼを用いる酵素法が提案されているがこの方
法においてもやはり１反応時間が長く、末端アミノ基を
保護基にて保護しておく必要があるなど操作の煩雑さを
改良するには至らなかった。

さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では。

用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有しているため、
生じたペプチドが合成と併行して分解され。

しばしば目的のペプチドが得られないという重大な欠点
を示すものであった。特に、オリゴペプチドの合成を適
用した場合には、一部のアミノ酸が欠落した目的外のペ
プチドが得られる重大な欠点が指摘されている〔ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌、２５６
巻、　１３０１頁（１９Ｂ１年〕。また、酵素法による
ペプチド合成法としては、プロテアーゼ法の他に、特定
なアミノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種の酵素
としては１例えば、グルタミン酸／システィン／グリシ
ンの配列であるトリペプチドを合成するグルタチオン合
成酵素（特開昭５４−１２２７９３号公報）やデカペプ
チドであるグラミシジンＳを合成するグラミシジンＳ合
成酵素（現代化学１９７４年１２月号１２頁）などが報
告されている。しかし、これらの酵素は特殊な酵素であ
って、この酵素によって合成しうるペプチドは、限定さ
れた一種のみのペプチドであり、目的とする任意なペプ
チドを合成することができない。このため、この方法は
一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが現状である
。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記のような
欠点、特にラセミ化、副反応の生起２反応の煩雑さなど
の原因となり、同時に経済性を損なう保護基の必要性を
解決し、汎用性のある新規なペプチド合成法を提供する
ことを目的として鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸を核
酸の一種であるｔＲＮＡに結合させる作用を有する酵素
で、従来全くペプチド結合を形成する作用が知られてい
なかったアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼに驚くべ
きことに、ペプチド合成能があることを見い出し。

この酵素を縮合剤として用いると、前記の目的がすべて
達成されることを見い出し、先に特許出願した（特開昭
５８−１４６５３９号公報参照）。しかし。

この方法は良好な収率で目的物を得るには、ペプチド又
はペプチド誘導体の原料である高価ぴアミノ酸誘導体を
高濃度で反応系に加えており、コストが高くなる傾向が
あった。

そこで９２本発明者らは上記の点を改良するためにさら
に鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに反応系に４級
アンモニア化合物又は４級ホスホニウム化合物を加える
と、原料のアミノ酸誘導体の濃度を低くしても良好な収
率でペプチド又はペプチド誘導体の合成が可能になる。

ことを見い出し。

本発明を完成した。

すなわち９本発明は、アミノ酸とアミノ酸から誘導され
るアミノ酸誘導体とをアミノアシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼの存在下で反応させてペプチド又はペプチド誘導体
を合成するに際し、該反応系に４級アンモニア化合物又
は４級ホスホニウム化合物を加えることを特徴とするペ
プチド又はペプチド誘導体の合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテター
ゼは、酵素分類６．１．１に属し１次式アミノ酸＋ＡＴ
Ｐ　＋　ｔＲＮＡ→アミノアシル−ｔＲＮＡ　＋ＡＭＰ
＋ピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり１例えば、ウサギ。

ウマ、ウシ、ラット、ニワトリ、ヘビなどの動物組織よ
り得られるもの、イネ、イモ、トマトなどの植物組織よ
り得られるもの、カビ、酵母、キノコ、細菌、放射菌な
どの微生物及び藻類より得られるものなどがあげら、れ
る。なかでも、酵素の取得が容易であることから、微生
物より得られるものが好ましく、さらに酵素の安定性か
らバチルス・ステアロサーモフィルス、サーマス・サー
モフィルス、サーマス・フラバス、クロストリジウム・
サーモアセチカム、サーマス・マクアティカスなどの耐
熱性細菌より得られるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼが最適である。

これら各種のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは９
種々のα−アミノ酸に特異性のあるものとしては、チロ
シル−ｔＲＮＡシンテターゼが、またロイシンに特異性
のあるものとしては、ロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ
が、さらにバリンに特異性のあるものとしては、バリル
−ｔＲＮＡシンテターゼ、その他イソロシルーｔＲＮＡ
シンテターゼ、フェニルアラニル−ｔＲＮ＾シンテター
ゼ、アラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、グルタミル−ｔ
ＲＮＡシンテターゼ、アスパラギニルーｔＲＮＡシンテ
ターゼ、メチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒスチジ
ル−ｔＲＮＡシンテターセ、リシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼ、トレオニルーｔＲＮＡシンテターゼ、セリル−ｔ
ＲＮＡシンテターゼ。

アスパラチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、グルタミル−ｔ
ＲＮＡシンテターゼ、システイニル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼ、プロリル−ｔＲＮＡシンテターゼ、グリシル−ｔ
ＲＮＡシンテターゼ、アルギニル−ｔＲＮＡシンテター
ゼ、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼなどが具
体例としてあげられる。

本発明に使用される４級アンモニア化合物としては９例
えば、塩化テトラメチルアンモニウム。

フッ化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラプロヒル
アンモニウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、塩化
メチルトリオクチルアンモニウム。

臭化Ｎ−ブチルピリジニウム、臭化Ｎ−Ｆテシルピリジ
ニウム、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、水酸化
ベンジルトリメチルアンモニウム。

臭化へキシルトリエチルアンモニウム、臭化ドデシルト
リエチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリエチルア
ンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムなど
があげられる。また、４級ホスホニウム化合物としては
２例えば、塩化テトラフェニルホスホニウム、臭化フェ
ニルトリメチルホスホニウム、塩化テトラブチルホスホ
ニウム。

臭化エチルトリオクチルホスホニウム、臭化ヘキサデシ
ルトリエチルホスホニウムなどがあげられる。

以下、アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導体を合成
する本発明の方法を具体的に説明する。

本発明によれば、アミノ酸とアミ４ノ酸から誘導される
アミノ酸誘導体とをアミノアシル−ｔＲＮＡシンテター
ゼ及び４級アンモニウム化合物又は４級ホスホニウム化
合物の存在下で反応させることによってペプチド又はペ
プチド誘導体を合成することができる。さらに本発明に
よれば、あらかじめアミノ酸とアミノアシル−ｔＲＮＡ
シンテターゼとを反応させて反応混合物を得５次いで得
られた反応混合物とアミノ酸誘導体を４級アンモニウム
化合物又は４級ホスホニウム化合物の存在下で反応させ
ることによってペプチド又はペプチド誘導体を合成する
゛ことができる。このアミノアシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼとあらかじめ反応させるのに好ましく用いられるア
ミノ酸としては９例えばチロシン。

アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン
、メチオニン、リジン、セリン、バリン。

アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン
、グルタミン酸、システィン、トレオニン。

トリプトファン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンな
どのα−アミノ酸があげられ、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも
よい。また、好ましく用いられるアミノ酸誘導体として
は１例えばグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、フェニルアラニン。

グルタミン、イソロインシ、システィン、チロシン、ア
ルギニン、バリン、リジン、ヒスチジン。

アスパラギン酸、メチオニン、トリプトファン。

トレオニンなどのα−アミノ酸、β−アラニン。

β−アミノイソ酪酸などのβ−アミノ酸、クレアチンな
どの含窒素γ−アミノ酸、ピペリジン酸などのＴ−アミ
ノ酸、ε−アミノカプロン酸などのε−アミノ酸など−
の各種アミノ酸のエステル、チオエステル、アミド、ヒ
ドロキサミドなどがあげられるが、アミノ基が遊離の形
であるアミノ酸誘導体であれば、上記例示化合物に限定
されるものではない。そのエステルとしては２例えばメ
チル。

エチル、プロピル、シクロヘキシル、フェニル。

ベンジルなどの単純な炭化水素系のエステルから。

ｔＲＮＡの３’−ＯＨで上記アミノ酸がエステル化した
ものまで１種々のエステルを用いることができる。

また、アミドとしては、遊離のアミドの他１例えば異種
あるいは同種のアミノ酸がアミド結合したオリゴペプチ
ドやポリペプチドを用いることもできる。このオリゴペ
プチドやポリペプチドがさらにエステル、千オニステル
、ヒドロキサミド、エーテル化したものを用いることも
可能である。

次に反応混合物を得るには９例えばｐＨ，５ないしｐＨ
１１好ましくはｐＨ６ないしｐＨ１０の緩衝液中、アデ
ノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸存在下
に、アミノ酸とアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼと
混合することによって行えばよい。そのときの反応の温
度としては、酵素活性を維持する観点から一般に０℃か
ら７０℃が好ましく、最適には０℃から３０℃で行われ
る。また、そのときに用いられる緩衝液としては、アミ
ノ酸、アデノシン三すン酸、デオキシアデノシン三リン
酸及びアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが溶解し、
所望のｐＨが得られるものであれば、いかなるものを使
用してもよい。例えば、トリス塩酸緩衝液、ヘペス緩衝
液、トリエタノールアミン緩衝液、マレート緩衝液、リ
ン酸緩衝液などがあげられる。さらに反応を円滑に進行
させ、酵素の失活を防ぐことを主目的として２反応系に
マグネシウム、マンガンなどの二価カチオン、メルカプ
トエタノール、ジチオスレイトールなどのスルフヒドリ
ル化剤、ピロフォスファターゼを単独又は混合して添加
してもよい。各添加剤の好適な濃度としては、二価カチ
オ７０．０１ｍＭ〜５００ｄ、　ス／Ｌ／　７　ヒトＩ
Ｊ　ル化剤０．００１ｍＭ〜１００＋＋＋Ｍ、　　ピロ
ホスファターゼ０．００１ユニット／ｍ１〜１００ユニ
ット／Ｉｌｌであり、最適な濃度としては、それぞれ、
二価カチオン０．１ｓＭ〜５０ｍＭ、スルフヒドリル化
剤０．０１ｏ＋Ｍ〜５ａ＋Ｍ、　　ピロホスファターゼ
１ユニツト／ｍｌ〜１０ユニット／ｍｌである。また、
アミノ酸、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ及びア
デノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸の使
用量は特に制限されないが、実用的な収量を得るために
は、アミノ酸とアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの
モル比をｌ：１〜１：１０゜アミノ酸とアデノシン三リ
ン酸又はデオキシアデノシン三リン酸とのモル比１：１
０〜１：１００の範囲内で行うのが好ましい、前記の条
件で反応を実施すると１反応は円滑に進行し、数秒から
３０分以内に完結する。

次いで、上記のようにして得られた反応混合物とアミノ
酸誘導体とを４級アンモニウム化合物又は４級ホスホニ
ウム化合物の存在下に反応させることにより目的のペプ
チド又はペプチドｍ８体を得ることができる（この段階
を以後ペプチド化と称する。）。このときに反応液全体
に占める４級アンモニウム化合物又は４級ホスホニウム
化合物の濃度としては、これら化合物を単独で用いた場
合も、あるいは併用して用いた場合も１ｍＭ〜ＩＭの範
囲で゛あればよい、このときに親水性有機溶媒も使用す
ることができるが、その有機溶媒としては２例えばジメ
チルアセクール、２．２−ジメトキシプロパン、エチレ
ングリコールジメチルエーテル、ジオキサン、テトラヒ
ドロフラン、ジメチルスリホキシト、ジメチルアセトア
ミド、ジメチルホルムアミドアセトニトリル、アセトン
などがあげられる。

これら親水性有機溶媒は任意の濃度で使用できるが、ア
ミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの安定性という面か
らは反応液全体の４０％以下の濃度で。

これら親水性有機溶媒を使用することが好ましい。

このときに用いる反応混合物は、そのままペプチド化反
応に用いることもできるが、Ｇ−２５（ファルマシア社
製）Ｇ−７５（ファルマシア社製）などのゲルクロマト
グラフィーを行うことによって。

反応後に混在するアデノシン三すン酸、アデノシンーリ
ン酸あるいはピロリン酸等を除去して用い／　　　　　
　ることもできる。また、ペプチド化反応の温度として
は、０℃から７０℃が好ましく、酵素の失活防止と適正
な反応速度を得るという観点から１０℃から＄Ｏ℃、特
に２０℃から４０℃で行うことが好ましい。

ｐｉとしては、既出の各種緩衝液等を用いて、５ないし
１１．好ましくはらないし１０．最適にはフないし９で
行えばよい。

反応混合物とアミノ酸誘導体との混合比として例えば、
容量で１　：　０．１〜１：１００の範囲で行えばよい
。また、この時用いるアミノ酸誘導体の濃度としては１
０ｍＭからＩＯＭの範囲であるが、これをさらに低くし
て用いることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結し、目的
のペプチド又はペプチド誘導体を得ることができる。

本発明によって得られるペプチド誘導体は１例えば血圧
降下作用等のあるブラジキニンや内・外分泌抑制作用等
のあるソマトスタチンなどの各種ホルモン及び抗生物質
ペプチド、呈味ペプチドのような他の生物学的活性物質
として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチド誘導体
を保護基を用いることなく、低濃度の原料を使用しても
製造することができるので、製造コストも安価である。

以下１本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１，２ バチルス・ステアロサーモフィルスＡ　１５０３　（微
工研菌寄、第４７７８号よりバイオケミストリー誌。

１３巻、　２３０７頁（１９７４年）記載の方法に従い
精製されたチロシンに特異的なチロシル−ｔＲＮＡシン
テターゼ０．４　ｇ　、塩化マグネシウム０．４　ｇ　
、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩０．１ｇ、Ｌ−チ
ロシン０．８ｏ＋ｇ、　ビロホスファクターゼ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）　　２００ユニツト及びジチ
オスレイトール０．０１ｍｇを９０■ｌの２０閣ｉヘペ
ス緩衝液ｐｉ　ｓ、。

に溶解し、４℃で１５分間反応させて反応混合物を得た
。得られた反応混合物にＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステル０．４ｇ、塩化テトラブチルアンモニウム０．１
ｇ及びアセトニトリル１抛ｌを加えてよく混合し９反応
混度を３０℃に保って１日放置して反応させた。

次いで、得られた反応液にアセトン２００ｍ　ｌを加え
沈殿を濾別後、上清をエバポレーターにて約２０ｍ１に
濃縮し、ボンダバックＣ１，カラム（ウォーターズ社製
）に供し、アセトニトリル１０．０１Ｎ塩酸水溶液、　
８５／１５．　ＰＨ４を展開溶媒として用いて分離し、
Ｌ−チロシル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩
酸塩を０．６ａｕｇ得た。

その元素分析（Ｃ＋ｑＨｚｓＣＩＮｚ　Ｏａ　−３７８
，８９）は。

計算値（％）　Ｃ−６０，２３８−６，１３Ｎ−７，４
０ 測定値（％）　Ｃ−６０，２９Ｈ−６，１１Ｎ−７，３
６ であった。

また、比較（比較例１）のため２抛Ｈヘペス緩衝液を１
００ｍ１．　　Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを
４ｇ使用して、塩化テトラブチルアンモニウム及びアセ
トニトリルを共存させなかったほかは実施例１と全く同
様に行った。

その結果、Ｌ−チロシル−し−フェニルアラニンメチル
エステル塩酸塩の収量は０．４５ｍｇであり。

実施例１゛の収量より少なかった。この比較例１で用い
たＬ−フェニルアラニンメチルエステル４ｇであるのに
対し、実施例１ではその１／１０の０．４　ｇでよかっ
た。

さらに比較（比較例２）のため、　２０ａ＋１１ヘペス
緩衝液を１００ｍ１使用して、塩化テトラブチルアンモ
ニウム及びアセトニトリルを共存させなかったほかは実
施例１と全く同様に行った。

その結果、Ｌ−チロシル−し−フェニルアラニンエチル
エステルの収量は０．１ｍｇであり、実施例１の収量の
１７４であった。

実施例２．比較例３．４ 実施例１で用いたチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ５ｇ
、塩化マグネシウム１５０ｍｇ、アデノシン三リン酸二
ナトリウム塩３００ｍｇ、　　ｌ、−チロシン９　ｆｆ
１Ｌピロホスフアターゼ（ベーリンガーマンハイム社製
）　　２００ユニツト及びジチオスレイトール０．０１
Ｂを２０ｍ１の１０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ８，５に溶解
し、４℃で２００分間反応せたのち９反応混合物をＧ−
７５（ファルマシア社製）カラムに供し、同上ヘペス緩
衝液にて溶出し、ボイド容の百分３０ｍ１を集め反応混
合物を単離した。単離した反応混合物にグリシルグリシ
ンエチルエステル０．５ｇ及び塩化テトラブチルホス、
ホニウム０．２ｇを加え、よ（混合し。

反応温度を２０℃に保って３００分間反応せた。

次いで得られた反応液をそのままボンダパックｃｐｓカ
ラムに供し、実施例１と同様に分離して。

Ｌ−チロシルグリシルグリシンエチルエステル塩酸を１
５−ｇを得た。

次に比較（比較例３）のため、グリシルグリシンエチル
エステルを４ｇ使用して、ブチルホスホニウムを共存さ
せなかったほかは実施例２と全く同様に行った。

その結果、Ｌ−チロシルグリシルグリシンエチルエステ
ル塩酸塩の収量は１４ｍｇであった。

また、比較（比較例４）のため、塩化テトラブチルホス
ホニウムを共存させなかったほかは、実施例２と全（同
様に行った。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシンエチルエステル
塩酸塩の収量は３ｍｇであった。

実施例３；４．比較例５ 酵母Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　Ｒ−１４（ａ工研菌寄、第
３１１４号）からＤＥＴＥ−セルロース、フェニルセフ
ェロース及びアフィ・ゲルブルー（バイオランド社製）
のカラムクロマトグラフィーにより調製したロイシル−
ｔＲＮＡシンテターゼ５００ｍｇ、塩化マグネシウム２
０ＩＩＩｇ、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩５ｍｇ
、　　Ｌ−ロイシン１＋ｓｇ＋　ピロホスファターゼ（
ベーリンガーマンハイム社製）１０ユニツト及びメルカ
プトエタノール２０μｌを２０ｍ１の３０ｍＭ　２．５
−ジメチルイミダゾール緩衝液ｐｌｉＢに加えて、実施
例２と同様に反応したのち、実施例２と同様に反応混合
物を単離し、これにＬ−フェニルアラニンアミド０．２
ｇを加えて２０℃で５時間反応した。得られた反応物に
アセトン２０ｍ１を加え生じた沈殿を濾別し、エバポレ
ーターにて約１抛ｌに濃縮後、害施例１と同様分離し、
Ｌ−ロイシル−し−フェニルアラニンアミド塩酸塩を得
た（実施例３）。

次に、塩化テトラフェニルホスホニウム０．１ｇの代わ
りに塩化フェニルトリエチルアンモニウム０．０５ｇ及
び臭化ヘキサデシルトリエチルホスホニウム０．１ｇを
使用した以外は実施例３と同様に行った（実施例４）。

さらに、比較（比較例５）のため、塩化テトラフェニル
ホスホニウムを共存させなかったほかは実施例３と全く
同様に行った。

その結果、Ｌ−ロイシル−し−フェニルアラニンアミド
塩酸塩の収量は以下に示すとおりであった。

収量（ｍｇ） 実施例３１．４ 実施例４１．３ 比較例５０．２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸とアミノ酸から誘導されるアミノ酸誘導
   体とをアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの存在下で
   反応させてペプチド又はペプチド誘導体を合成するに際
   し、該反応系に４級アンモニア化合物又は４級ホスホニ
   ウム化合物を加えることを特徴とするペプチド又はペプ
   チド誘導体の合成法。