JP2000069990A - アデノシン（グアノシン）−５’，５’’’−ｐ１，ｐ４−テトラホスフェートの製造方法 - Google Patents
アデノシン（グアノシン）−５’，５’’’−ｐ１，ｐ４−テトラホスフェートの製造方法Info
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- JP2000069990A JP2000069990A JP10249454A JP24945498A JP2000069990A JP 2000069990 A JP2000069990 A JP 2000069990A JP 10249454 A JP10249454 A JP 10249454A JP 24945498 A JP24945498 A JP 24945498A JP 2000069990 A JP2000069990 A JP 2000069990A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アデノシン（グアノシン）−５'，５'''−Ｐ
１，Ｐ４−テトラホスフェートを高収率で合成すること
のできるアデノシン（グアノシン）−５'，５'''−Ｐ
１，Ｐ４−テトラホスフェートの製造方法を提供する。 【解決手段】 アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い
てアデノシン（グアノシン）−５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４
−テトラホスフェートを製造するに際し、有機溶媒を共
存させることを特徴とするアデノシン（グアノシン）−
５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４−テトラホスフェートの製造方
法。
１，Ｐ４−テトラホスフェートを高収率で合成すること
のできるアデノシン（グアノシン）−５'，５'''−Ｐ
１，Ｐ４−テトラホスフェートの製造方法を提供する。 【解決手段】 アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い
てアデノシン（グアノシン）−５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４
−テトラホスフェートを製造するに際し、有機溶媒を共
存させることを特徴とするアデノシン（グアノシン）−
５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４−テトラホスフェートの製造方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品又はその原
料として有用な下記構造式で示されるアデノシン（グア
ノシン）−５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４−テトラホスフェー
ト（以下Ａｐ４Ｇという。）のアミノアシル−ｔＲＮＡ
合成酵素による製造方法に関するものであり、特に工業
的に有利なＡｐ４Ｇの製造方法に関するものである。
料として有用な下記構造式で示されるアデノシン（グア
ノシン）−５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４−テトラホスフェー
ト（以下Ａｐ４Ｇという。）のアミノアシル−ｔＲＮＡ
合成酵素による製造方法に関するものであり、特に工業
的に有利なＡｐ４Ｇの製造方法に関するものである。
【０００２】
【化１】
【０００３】
【従来の技術】従来、ジヌクレオシドポリリン酸が、ア
ミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒作用により、アデ
ノシン５'−トリホスフェート（以下ＡＴＰという。）
とヌクレオシド５'−トリホスフェート（以下ＮＴＰと
いう。）から合成されることが知られていた（特開平１
−１０４１９１号公報参照）。また、ジャーナル・オブ
・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）
パーキン・トランス１、２００９、（１９９６）では、
リジル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いてＡｐ４Ｇを合成する
ことが報告されている。
ミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒作用により、アデ
ノシン５'−トリホスフェート（以下ＡＴＰという。）
とヌクレオシド５'−トリホスフェート（以下ＮＴＰと
いう。）から合成されることが知られていた（特開平１
−１０４１９１号公報参照）。また、ジャーナル・オブ
・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）
パーキン・トランス１、２００９、（１９９６）では、
リジル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いてＡｐ４Ｇを合成する
ことが報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、このような従
来法では、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒性が
低く、結果として単位酵素あたりのＡｐ４Ｇの合成収率
が悪く、工業的な規模で実施するのに障害となってい
た。本発明は、反応系を工夫することで、アミノアシル
−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒性を高め、効率的にＡｐ４Ｇ
を製造することができるＡｐ４Ｇの製造方法を提供する
ことを目的とするものである。
来法では、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒性が
低く、結果として単位酵素あたりのＡｐ４Ｇの合成収率
が悪く、工業的な規模で実施するのに障害となってい
た。本発明は、反応系を工夫することで、アミノアシル
−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒性を高め、効率的にＡｐ４Ｇ
を製造することができるＡｐ４Ｇの製造方法を提供する
ことを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
課題を解決するために鋭意検討の結果、有機溶媒が利用
できることを見出し本発明に到達した。すなわち、本発
明は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いてＡｐ４
Ｇを製造するに際し、有機溶媒を共存させることを特徴
とするＡｐ４Ｇの製造方法を要旨とするものである。
課題を解決するために鋭意検討の結果、有機溶媒が利用
できることを見出し本発明に到達した。すなわち、本発
明は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いてＡｐ４
Ｇを製造するに際し、有機溶媒を共存させることを特徴
とするＡｐ４Ｇの製造方法を要旨とするものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いてＡ
ＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸からＡｐ４Ｇを製造する際に、
有機溶媒を共存させて反応を行うというものである。
本発明は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いてＡ
ＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸からＡｐ４Ｇを製造する際に、
有機溶媒を共存させて反応を行うというものである。
【０００７】本発明に用いられる有機溶媒としては、特
に限定されるものではないが、アルコール類を用いるこ
とが好ましく、特に、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、グリセロール等が好ましい。また、用いる有機溶媒
の反応液中における濃度範囲としては、１〜９０ｖ／ｖ
％が好ましく、１０〜６０ｖ／ｖ％がさらに好ましい。
に限定されるものではないが、アルコール類を用いるこ
とが好ましく、特に、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、グリセロール等が好ましい。また、用いる有機溶媒
の反応液中における濃度範囲としては、１〜９０ｖ／ｖ
％が好ましく、１０〜６０ｖ／ｖ％がさらに好ましい。
【０００８】アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素として
は、Ａｐ４Ｇを合成し得るものであれば特に酵素の特異
性や由来等は限定されるものではないが、中でもイソロ
イシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ロイシル−ｔＲＮＡ合成酵
素、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニル−ｔ
ＲＮＡ合成酵素、セリル−ｔＲＮＡ合成酵素、プロリル
−ｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素
は、酵素活性が高く好ましい。反応液中のアミノアシル
−ｔＲＮＡ合成酵素の酵素濃度としては、特に限定され
るものではないが、通常は１〜１×１０6 ユニット／ｍ
ｌ、さらに実用的には、１０〜１×１０5 ユニット／ｍ
ｌの範囲で使用することが好ましい。
は、Ａｐ４Ｇを合成し得るものであれば特に酵素の特異
性や由来等は限定されるものではないが、中でもイソロ
イシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ロイシル−ｔＲＮＡ合成酵
素、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニル−ｔ
ＲＮＡ合成酵素、セリル−ｔＲＮＡ合成酵素、プロリル
−ｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素
は、酵素活性が高く好ましい。反応液中のアミノアシル
−ｔＲＮＡ合成酵素の酵素濃度としては、特に限定され
るものではないが、通常は１〜１×１０6 ユニット／ｍ
ｌ、さらに実用的には、１０〜１×１０5 ユニット／ｍ
ｌの範囲で使用することが好ましい。
【０００９】これらのアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素
は、エシェリチア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）、酵母菌（ｙｅａｓｔ）等より、抽
出、精製して得ることができる。また、本発明において
は、市販のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を使用する
ことができる。
は、エシェリチア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）、酵母菌（ｙｅａｓｔ）等より、抽
出、精製して得ることができる。また、本発明において
は、市販のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を使用する
ことができる。
【００１０】これらの微生物を培養してアミノアシル−
ｔＲＮＡ合成酵素を得るには、通常の方法に従って菌体
を培養した後、例えば圧破砕機や超音波破砕機、ダイノ
ミル（商標名）等を用いる方法又はリゾチーム、トリト
ン等を添加する方法等によって細胞を破砕し、ろ過や遠
心分離を行えばよい。本発明においては、このようにし
て得られる抽出物をそのまま用いてもよく、さらに塩
析、カラムクロマトグラフィー等の通常行われている方
法によって精製された酵素を用いてもよい。
ｔＲＮＡ合成酵素を得るには、通常の方法に従って菌体
を培養した後、例えば圧破砕機や超音波破砕機、ダイノ
ミル（商標名）等を用いる方法又はリゾチーム、トリト
ン等を添加する方法等によって細胞を破砕し、ろ過や遠
心分離を行えばよい。本発明においては、このようにし
て得られる抽出物をそのまま用いてもよく、さらに塩
析、カラムクロマトグラフィー等の通常行われている方
法によって精製された酵素を用いてもよい。
【００１１】合成は、膜型又はカラム型等の反応器を用
いて連続的にＡｐ４Ｇを合成してもよいし、バッチ式の
反応器を用いて合成してもよい。反応器として膜型反応
器を用いると、酵素は高分子物質であるのに対して反応
生成物は低分子であるので、酵素がそのまま反応器の中
にとどまった状態で使用することができるので有効であ
る。また、カラム型反応器を用いる場合には、使用する
酵素を適当な担体、例えば、セルロース、デキストラ
ン、アガロース等のような多糖類の誘導体、ポリスチレ
ン、エチレン−マレイン酸共重合体、架橋ポリアクリル
アミド等のようなビニルポリマーの誘導体、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−グルタミン酸共重合体、ポリアスパラギン酸等
のようなポリアミノ酸又はアミドの誘導体、ガラス、ア
ルミナ、ヒドロキシアパタイト等のような無機物の誘導
体等に結合、包括あるいは吸着させて、いわゆる固定化
酵素としてカラムに充填して使用すればよい。
いて連続的にＡｐ４Ｇを合成してもよいし、バッチ式の
反応器を用いて合成してもよい。反応器として膜型反応
器を用いると、酵素は高分子物質であるのに対して反応
生成物は低分子であるので、酵素がそのまま反応器の中
にとどまった状態で使用することができるので有効であ
る。また、カラム型反応器を用いる場合には、使用する
酵素を適当な担体、例えば、セルロース、デキストラ
ン、アガロース等のような多糖類の誘導体、ポリスチレ
ン、エチレン−マレイン酸共重合体、架橋ポリアクリル
アミド等のようなビニルポリマーの誘導体、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−グルタミン酸共重合体、ポリアスパラギン酸等
のようなポリアミノ酸又はアミドの誘導体、ガラス、ア
ルミナ、ヒドロキシアパタイト等のような無機物の誘導
体等に結合、包括あるいは吸着させて、いわゆる固定化
酵素としてカラムに充填して使用すればよい。
【００１２】以下に、バッチ式の反応器でＡｐ４Ｇを製
造する場合を例にとり、反応条件について説明する。反
応液中のＡＴＰ及びＧＴＰの濃度としては、１０μＭ以
上、特に１００μＭ〜１００ｍＭ、さらに１ｍＭ〜３０
ｍＭが適当である。また、アミノ酸の濃度としては、
０．１μＭ以上、特に１μＭ〜１０ｍＭ、さらに１０μ
Ｍ〜１ｍＭが好ましい。
造する場合を例にとり、反応条件について説明する。反
応液中のＡＴＰ及びＧＴＰの濃度としては、１０μＭ以
上、特に１００μＭ〜１００ｍＭ、さらに１ｍＭ〜３０
ｍＭが適当である。また、アミノ酸の濃度としては、
０．１μＭ以上、特に１μＭ〜１０ｍＭ、さらに１０μ
Ｍ〜１ｍＭが好ましい。
【００１３】さらに、本発明においては、反応をスムー
ズに進めるために、ピロフォスファターゼや、マグネシ
ウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、亜鉛
イオン、コバルトイオン、カドミウムイオン等の金属イ
オンを添加してもよい。反応のｐＨとしては、おおむね
中性付近、すなわちｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜
９の範囲である。ｐＨの調整は、緩衝液を用いて行えば
よく、反応に使用する緩衝液としては、アミノアシル−
ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどが溶
解し、また酵素活性を維持し、さらに有機溶媒が混和
し、そして所定のｐＨが得られるものであれば、いかな
るものを使用してもよい。具体例として、トリス緩衝
液、ヘペス緩衝液などのグッド緩衝液、イミダゾール緩
衝液、トリエタノールアミン緩衝液、酢酸緩衝液、リン
酸緩衝液などが挙げられる。
ズに進めるために、ピロフォスファターゼや、マグネシ
ウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、亜鉛
イオン、コバルトイオン、カドミウムイオン等の金属イ
オンを添加してもよい。反応のｐＨとしては、おおむね
中性付近、すなわちｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜
９の範囲である。ｐＨの調整は、緩衝液を用いて行えば
よく、反応に使用する緩衝液としては、アミノアシル−
ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどが溶
解し、また酵素活性を維持し、さらに有機溶媒が混和
し、そして所定のｐＨが得られるものであれば、いかな
るものを使用してもよい。具体例として、トリス緩衝
液、ヘペス緩衝液などのグッド緩衝液、イミダゾール緩
衝液、トリエタノールアミン緩衝液、酢酸緩衝液、リン
酸緩衝液などが挙げられる。
【００１４】また、反応の温度としては、酵素の失活が
起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であれば特に
限定されるものではないが、２０〜８０℃、特に２５〜
５５℃の範囲が好ましい。反応の時間としては、１〜１
００時間が好ましく、特に４〜５０時間が好ましい。
起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であれば特に
限定されるものではないが、２０〜８０℃、特に２５〜
５５℃の範囲が好ましい。反応の時間としては、１〜１
００時間が好ましく、特に４〜５０時間が好ましい。
【００１５】このようにして合成したＡｐ４Ｇは、イオ
ン交換クロマトグラフィー等一般に広く用いられている
方法で精製し、単離することができる。
ン交換クロマトグラフィー等一般に広く用いられている
方法で精製し、単離することができる。
【００１６】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。以下に本発明において用いられるアミノアシル−
ｔＲＮＡ合成酵素の活性測定法と、高速液体クロマトグ
ラフィー（以下ＨＰＬＣという。）によるＡｐ４Ｇの測
定法を解説する。 （１）アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の活性測定法 アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素におけるユニットは、
一般に用いられるヒドロキサメートによるアミノアシル
−ｔＲＮＡ合成酵素活性測定法において、１分間に１×
１０-11 モルのアミノ酸ヒドロキサメートを生ずる酵素
量を１ユニットとする。この活性測定法の原理は、下記
の通りである。
する。以下に本発明において用いられるアミノアシル−
ｔＲＮＡ合成酵素の活性測定法と、高速液体クロマトグ
ラフィー（以下ＨＰＬＣという。）によるＡｐ４Ｇの測
定法を解説する。 （１）アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の活性測定法 アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素におけるユニットは、
一般に用いられるヒドロキサメートによるアミノアシル
−ｔＲＮＡ合成酵素活性測定法において、１分間に１×
１０-11 モルのアミノ酸ヒドロキサメートを生ずる酵素
量を１ユニットとする。この活性測定法の原理は、下記
の通りである。
【００１７】
【化２】
【００１８】（２）ＨＰＬＣによるＡｐ４Ｇの定量法 ウォーターズ社製ノバパックＣ１８カラムを用いて、Ａ
ｐ４Ｇの定量を行った。移動相は、過塩素酸テトラブチ
ルアンモニウム ３ｍＭ、リン酸１カリウム３０ｍＭ、
メタノール １５ｖ／ｖ％、水 ８５ｖ／ｖ％である。
流速１．０ｍｌ／分、検出はＵＶの吸収（λ＝２５４ｎ
ｍ）を測定することにより行った。
ｐ４Ｇの定量を行った。移動相は、過塩素酸テトラブチ
ルアンモニウム ３ｍＭ、リン酸１カリウム３０ｍＭ、
メタノール １５ｖ／ｖ％、水 ８５ｖ／ｖ％である。
流速１．０ｍｌ／分、検出はＵＶの吸収（λ＝２５４ｎ
ｍ）を測定することにより行った。
【００１９】参考例１ エシェリチア・コリＮ４８３０−１／ｐＳＩ１０（微工
研菌寄第Ｐ−１３９０７号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、イソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を
得た。ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）を
充填したカラムにこの粗抽出液を通し、０〜１Ｍの塩化
カリウム水溶液の塩濃度勾配で溶出し、イソロイシル−
ｔＲＮＡ合成酵素の活性画分を集め、濃縮、脱塩を行っ
た。上記操作はすべて４℃にて行った。
研菌寄第Ｐ−１３９０７号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、イソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を
得た。ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）を
充填したカラムにこの粗抽出液を通し、０〜１Ｍの塩化
カリウム水溶液の塩濃度勾配で溶出し、イソロイシル−
ｔＲＮＡ合成酵素の活性画分を集め、濃縮、脱塩を行っ
た。上記操作はすべて４℃にて行った。
【００２０】参考例２ バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３（微
工研菌寄第Ｐ−４７７８号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、ロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得
た。これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。
上記操作はすべて４℃にて行った。
工研菌寄第Ｐ−４７７８号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、ロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得
た。これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。
上記操作はすべて４℃にて行った。
【００２１】参考例３ 市販のパン酵母（オリエンタル酵母社）を、ソニケータ
を用いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除
去し、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得
た。これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。
上記操作はすべて４℃にて行った。
を用いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除
去し、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得
た。これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。
上記操作はすべて４℃にて行った。
【００２２】参考例４ バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３（微
工研菌寄第Ｐ−４７７８号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、セリル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得た。
これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。上記
操作はすべて４℃にて行った。
工研菌寄第Ｐ−４７７８号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、セリル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得た。
これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。上記
操作はすべて４℃にて行った。
【００２３】参考例５ バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３（微
工研菌寄第Ｐ−４７７８号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得
た。これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。
上記操作はすべて４℃にて行った。
工研菌寄第Ｐ−４７７８号）の菌体を、ソニケータを用
いて細胞を破砕した後、遠心分離により不溶物を除去
し、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む粗抽出液を得
た。これを参考例１と同様に精製、濃縮及び脱塩した。
上記操作はすべて４℃にて行った。
【００２４】実施例１ 参考例１で得たイソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い
てバッチ法でＡｐ４Ｇの合成を行った。すなわち、ＡＴ
Ｐ５ｍＭ、ＧＴＰ５ｍＭ、イソロイシン５ｍＭ、塩化マ
グネシウム１５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシ
ル−ｔＲＮＡ合成酵素３５０ユニット／ｍｌ、イミダゾ
ール緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍＭからなる反応溶液
に、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチ
レングリコール、ポリエチレングリコール又はグリセロ
ールを２０ｖ／ｖ％、もしくはコントロールとして水を
混合し、４０℃で反応させた。反応液の量は１００ｍｌ
であった。反応で合成されたＡｐ４ＧをＨＰＬＣで分析
し、単位時間当たりのＡｐ４Ｇ合成量を求めた。その結
果を表１に示す。
てバッチ法でＡｐ４Ｇの合成を行った。すなわち、ＡＴ
Ｐ５ｍＭ、ＧＴＰ５ｍＭ、イソロイシン５ｍＭ、塩化マ
グネシウム１５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシ
ル−ｔＲＮＡ合成酵素３５０ユニット／ｍｌ、イミダゾ
ール緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍＭからなる反応溶液
に、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチ
レングリコール、ポリエチレングリコール又はグリセロ
ールを２０ｖ／ｖ％、もしくはコントロールとして水を
混合し、４０℃で反応させた。反応液の量は１００ｍｌ
であった。反応で合成されたＡｐ４ＧをＨＰＬＣで分析
し、単位時間当たりのＡｐ４Ｇ合成量を求めた。その結
果を表１に示す。
【００２５】実施例２〜５ イソロイシン５ｍＭとイソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素
３５０ユニット／ｍｌを、ロイシン５ｍＭと参考例２で
得たロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素３６０００ユニット／
ｍｌ（実施例２）、リジン５ｍＭと参考例３で得たリジ
ル−ｔＲＮＡ合成酵素２００ユニット／ｍｌ（実施例
３）、セリン５ｍＭと参考例４で得たセリル−ｔＲＮＡ
合成酵素１５００ユニット／ｍｌ（実施例４）、ヒスチ
ジン５ｍＭと参考例５で得たヒスチジル−ｔＲＮＡ合成
酵素９００ユニット／ｍｌ（実施例５）に変えた以外
は、実施例１と同様にして単位時間当たりのＡｐ４Ｇ合
成量を求めた。その結果を表１に示す。
３５０ユニット／ｍｌを、ロイシン５ｍＭと参考例２で
得たロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素３６０００ユニット／
ｍｌ（実施例２）、リジン５ｍＭと参考例３で得たリジ
ル−ｔＲＮＡ合成酵素２００ユニット／ｍｌ（実施例
３）、セリン５ｍＭと参考例４で得たセリル−ｔＲＮＡ
合成酵素１５００ユニット／ｍｌ（実施例４）、ヒスチ
ジン５ｍＭと参考例５で得たヒスチジル−ｔＲＮＡ合成
酵素９００ユニット／ｍｌ（実施例５）に変えた以外
は、実施例１と同様にして単位時間当たりのＡｐ４Ｇ合
成量を求めた。その結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】実施例６、比較例１ 参考例１で得たイソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用
い、メタノール添加によるＡｐ４ＧとＡｐ４Ａの合成比
率への影響を調べた。すなわち、ＡＴＰ５ｍＭ、ＧＴＰ
５ｍＭ、イソロイシン５ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍ
Ｍ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシル−ｔＲＮＡ合成
酵素３５０ユニット／ｍｌ、イミダゾール緩衝液（ｐＨ
７．０）２５ｍＭからなる反応溶液に、メタノールを２
０ｖ／ｖ％を添加し、４０℃で反応させた。反応液の量
は１００ｍｌであった（実施例６）。また、比較のた
め、メタノールに代えて水を用いた以外は同様にして反
応を行った（比較例１）。それぞれの反応液で、反応で
合成されたＡｐ４Ｇ及びＡｐ４ＡをＨＰＬＣで分析し、
単位時間当たりのＡｐ４Ｇ合成量及びＡｐ４Ａ合成量に
対するＡｐ４Ｇの合成量を求めた。 その結果を表２に
示す。
い、メタノール添加によるＡｐ４ＧとＡｐ４Ａの合成比
率への影響を調べた。すなわち、ＡＴＰ５ｍＭ、ＧＴＰ
５ｍＭ、イソロイシン５ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍ
Ｍ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシル−ｔＲＮＡ合成
酵素３５０ユニット／ｍｌ、イミダゾール緩衝液（ｐＨ
７．０）２５ｍＭからなる反応溶液に、メタノールを２
０ｖ／ｖ％を添加し、４０℃で反応させた。反応液の量
は１００ｍｌであった（実施例６）。また、比較のた
め、メタノールに代えて水を用いた以外は同様にして反
応を行った（比較例１）。それぞれの反応液で、反応で
合成されたＡｐ４Ｇ及びＡｐ４ＡをＨＰＬＣで分析し、
単位時間当たりのＡｐ４Ｇ合成量及びＡｐ４Ａ合成量に
対するＡｐ４Ｇの合成量を求めた。 その結果を表２に
示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】表２から、Ａｐ４Ｇを合成する際に有機溶
媒を共存させることにより、Ａｐ４Ｇの合成量が増加す
ると共に、Ａｐ４Ａに対するＡｐ４Ｇの合成量が増加す
ることがわかる。
媒を共存させることにより、Ａｐ４Ｇの合成量が増加す
ると共に、Ａｐ４Ａに対するＡｐ４Ｇの合成量が増加す
ることがわかる。
【００３０】実施例７ 参考例１で得たイソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い
てＡｐ４Ｇの合成を行った。すなわち、ＡＴＰ５ｍＭ、
ＧＴＰ５ｍＭ、イソロイシン５ｍＭ、塩化マグネシウム
１５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシル−ｔＲＮ
Ａ合成酵素３５０ユニット／ｍｌ、イミダゾール緩衝液
（ｐＨ７．０）２５ｍＭからなる反応溶液に、メタノー
ルを２０ｖ／ｖ％添加して４０℃で２４時間反応させ
た。反応液の量は１００ｍｌであった。反応で合成され
たＡｐ４ＧをＨＰＬＣで分析した結果、３．４ｍＭのＡ
ｐ４Ｇが生成していた。
てＡｐ４Ｇの合成を行った。すなわち、ＡＴＰ５ｍＭ、
ＧＴＰ５ｍＭ、イソロイシン５ｍＭ、塩化マグネシウム
１５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシル−ｔＲＮ
Ａ合成酵素３５０ユニット／ｍｌ、イミダゾール緩衝液
（ｐＨ７．０）２５ｍＭからなる反応溶液に、メタノー
ルを２０ｖ／ｖ％添加して４０℃で２４時間反応させ
た。反応液の量は１００ｍｌであった。反応で合成され
たＡｐ４ＧをＨＰＬＣで分析した結果、３．４ｍＭのＡ
ｐ４Ｇが生成していた。
【００３１】比較例２ メタノールを添加しない以外は実施例７と同様にしてＡ
ｐ４Ｇの合成を行った。反応で合成されたＡｐ４ＧをＨ
ＰＬＣで分析した結果、１．６ｍＭのＡｐ４Ｇ
ｐ４Ｇの合成を行った。反応で合成されたＡｐ４ＧをＨ
ＰＬＣで分析した結果、１．６ｍＭのＡｐ４Ｇ
【００３２】
【発明の効果】本発明の製造方法によると、アミノアシ
ル−ｔＲＮＡ合成酵素で飛躍的に高収率にＡｐ４Ｇを合
成することができる。このことから、本発明は工業的な
Ａｐ４Ｇの製造方法としてきわめて有利である。
ル−ｔＲＮＡ合成酵素で飛躍的に高収率にＡｐ４Ｇを合
成することができる。このことから、本発明は工業的な
Ａｐ４Ｇの製造方法としてきわめて有利である。
Claims (1)
- 【請求項１】 アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い
てアデノシン（グアノシン）−５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４
−テトラホスフェートを製造するに際し、有機溶媒を共
存させることを特徴とするアデノシン（グアノシン）−
５'，５'''−Ｐ１，Ｐ４−テトラホスフェートの製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10249454A JP2000069990A (ja) | 1998-09-03 | 1998-09-03 | アデノシン（グアノシン）−５’，５’’’−ｐ１，ｐ４−テトラホスフェートの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10249454A JP2000069990A (ja) | 1998-09-03 | 1998-09-03 | アデノシン（グアノシン）−５’，５’’’−ｐ１，ｐ４−テトラホスフェートの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000069990A true JP2000069990A (ja) | 2000-03-07 |
Family
ID=17193211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10249454A Pending JP2000069990A (ja) | 1998-09-03 | 1998-09-03 | アデノシン（グアノシン）−５’，５’’’−ｐ１，ｐ４−テトラホスフェートの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000069990A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10942187B2 (en) | 2017-03-28 | 2021-03-09 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Method for quantifying amino acid and amino acid quantification kit |
-
1998
- 1998-09-03 JP JP10249454A patent/JP2000069990A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10942187B2 (en) | 2017-03-28 | 2021-03-09 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Method for quantifying amino acid and amino acid quantification kit |
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