JP3135649B2 - ジアデノシンポリリン酸の製造方法 - Google Patents
ジアデノシンポリリン酸の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミノアシルtRNA合成
酵素を使用するジアデノシンポリリン酸の製造方法に関
するものであり、特に工業的に有利なジアデノシンポリ
リン酸の製造方法に関するものである。
酵素を使用するジアデノシンポリリン酸の製造方法に関
するものであり、特に工業的に有利なジアデノシンポリ
リン酸の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ジアデノシンポリリン酸（以下、Ａｐｎ
Ａと略称する。）（また、ジアデノシン三リン酸、ジア
デノシン四リン酸及びジアデノシン五リン酸を、それぞ
れＡｐ３Ａ、Ａｐ４Ａ及びＡｐ５Ａと略称する。）は、
クリニヒ・ボッフェンシュリフト〔Klinische Wochensc
hrift，67，17−327（1989）〕誌にジェイ・リュッジェ
（J．Luthje）により記載されているように、ＤＮＡ合
成に対する作用、血液凝固に対する作用、血管に対する
作用等様々な生理作用を有し、医薬品及び医薬品原料と
しての利用が期待されている物質である。
Ａと略称する。）（また、ジアデノシン三リン酸、ジア
デノシン四リン酸及びジアデノシン五リン酸を、それぞ
れＡｐ３Ａ、Ａｐ４Ａ及びＡｐ５Ａと略称する。）は、
クリニヒ・ボッフェンシュリフト〔Klinische Wochensc
hrift，67，17−327（1989）〕誌にジェイ・リュッジェ
（J．Luthje）により記載されているように、ＤＮＡ合
成に対する作用、血液凝固に対する作用、血管に対する
作用等様々な生理作用を有し、医薬品及び医薬品原料と
しての利用が期待されている物質である。
【０００３】このＡｐｎＡを得る方法として、アミノア
シルtRNA合成酵素の触媒作用により、アデノシントリリ
ン酸（以下、ＡＴＰと略称する。）とアミノ酸及び必要
によりアデノシンジリン酸（以下、ＡＤＰと略称す
る。）、アデノシンテトラリン酸（以下、ｐｐｐｐＡと
略称する。）等とを反応させてＡｐｎＡを合成する方法
が知られている。この例として、ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー〔Eur.J.Biochem.,12
6,135-142(1982)〕誌にオットマー・ゴエルリッヒ(Ottm
ar GOERLICH) らにより、アミノアシルtRNA合成酵素に
よるＡｐ３Ａ、Ａｐ４Ａ合成法が記載されている。ま
た、バイオケミストリー〔Biochemistry,21,5273-5279
(1982) 〕誌にピエール・プラトー（Pierre Plateau）
らにより、ＡＴＰ５ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ，イソロ
イシン２．５ｍＭ，ＺｎＣｌ2 ０．１ｍＭ，Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ２０ｍＭ（ｐＨ７．８）を含む水溶液に、１０−
１０，０００ｎＭ（１．２ｕ／ｍｌ−１，２００ｕ／ｍ
ｌに相当）となるようにアミノアシルtRNA合成酵素を加
え、３７℃で１０時間反応させ、およそ２ｍＭのＡｐ４
Ａを得るという方法が報告されている。これら従来の方
法はすべて、トリス緩衝液などの緩衝液を含む水溶液中
でＡｐｎＡの合成反応を行うものである。
シルtRNA合成酵素の触媒作用により、アデノシントリリ
ン酸（以下、ＡＴＰと略称する。）とアミノ酸及び必要
によりアデノシンジリン酸（以下、ＡＤＰと略称す
る。）、アデノシンテトラリン酸（以下、ｐｐｐｐＡと
略称する。）等とを反応させてＡｐｎＡを合成する方法
が知られている。この例として、ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー〔Eur.J.Biochem.,12
6,135-142(1982)〕誌にオットマー・ゴエルリッヒ(Ottm
ar GOERLICH) らにより、アミノアシルtRNA合成酵素に
よるＡｐ３Ａ、Ａｐ４Ａ合成法が記載されている。ま
た、バイオケミストリー〔Biochemistry,21,5273-5279
(1982) 〕誌にピエール・プラトー（Pierre Plateau）
らにより、ＡＴＰ５ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ，イソロ
イシン２．５ｍＭ，ＺｎＣｌ2 ０．１ｍＭ，Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ２０ｍＭ（ｐＨ７．８）を含む水溶液に、１０−
１０，０００ｎＭ（１．２ｕ／ｍｌ−１，２００ｕ／ｍ
ｌに相当）となるようにアミノアシルtRNA合成酵素を加
え、３７℃で１０時間反応させ、およそ２ｍＭのＡｐ４
Ａを得るという方法が報告されている。これら従来の方
法はすべて、トリス緩衝液などの緩衝液を含む水溶液中
でＡｐｎＡの合成反応を行うものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のような従来法で
は、アミノアシルtRNA合成酵素の触媒性が低く、結果と
して単位酵素当りのＡｐｎＡの収率が低く、工業的な規
模で実施するのに障害となっていた。本発明は、反応系
を工夫することで、アミノアシルtRNA合成酵素の触媒性
を高め、効率的にＡｐｎＡを生産することができる方法
を提供することを目的とするものである。
は、アミノアシルtRNA合成酵素の触媒性が低く、結果と
して単位酵素当りのＡｐｎＡの収率が低く、工業的な規
模で実施するのに障害となっていた。本発明は、反応系
を工夫することで、アミノアシルtRNA合成酵素の触媒性
を高め、効率的にＡｐｎＡを生産することができる方法
を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、有機溶
媒が利用できることを見い出し本発明に達した。
な課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、有機溶
媒が利用できることを見い出し本発明に達した。
【０００６】すなわち、本発明の第一は、ＡＴＰ及びア
ミノ酸を反応基質とし、アミノアシルtRNA合成酵素を使
用するＡｐ４Ａの製造に際し、アルコール類を反応系に
共存させることを特徴とするＡｐ４Ａの製造方法を要旨
とするものであり、また本発明の第二は、ＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ及びアミノ酸を反応基質とし、アミノアシルtRNA合成
酵素を使用するＡｐ３Ｐの製造に際し、アルコール類を
反応系に存在させることを特徴とするジＡｐ３Ａの製造
方法を要旨とするものであり、さらに本発明の第三は、
ＡＴＰ、ｐｐｐｐＡ及びアミノ酸を反応基質とし、アミ
ノアシルtRNA合成酵素を使用するＡｐ５Ａの製造に際
し、アルコール類を反応系に共存させることを特徴とす
るＡｐ５Ａの製造方法を要旨とするものである。
ミノ酸を反応基質とし、アミノアシルtRNA合成酵素を使
用するＡｐ４Ａの製造に際し、アルコール類を反応系に
共存させることを特徴とするＡｐ４Ａの製造方法を要旨
とするものであり、また本発明の第二は、ＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ及びアミノ酸を反応基質とし、アミノアシルtRNA合成
酵素を使用するＡｐ３Ｐの製造に際し、アルコール類を
反応系に存在させることを特徴とするジＡｐ３Ａの製造
方法を要旨とするものであり、さらに本発明の第三は、
ＡＴＰ、ｐｐｐｐＡ及びアミノ酸を反応基質とし、アミ
ノアシルtRNA合成酵素を使用するＡｐ５Ａの製造に際
し、アルコール類を反応系に共存させることを特徴とす
るＡｐ５Ａの製造方法を要旨とするものである。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法においては、アルコール類を共存させる以外は
前記した従来のＡｐｎＡの合成法を使用することができ
る。すなわち、アミノアシルtRNA合成酵素とＡＴＰ、ア
ミノ酸、及び目的とする生成物に応じてさらにＡＤＰ又
はｐｐｐｐＡ、及び反応を円滑にさせ、酵素の失活抑制
を主目的としたマグネシウム、マンガン、亜鉛などの二
価カチオンなどを混合させ、さらにアルコール類を共存
させておこなえばよい。
製造方法においては、アルコール類を共存させる以外は
前記した従来のＡｐｎＡの合成法を使用することができ
る。すなわち、アミノアシルtRNA合成酵素とＡＴＰ、ア
ミノ酸、及び目的とする生成物に応じてさらにＡＤＰ又
はｐｐｐｐＡ、及び反応を円滑にさせ、酵素の失活抑制
を主目的としたマグネシウム、マンガン、亜鉛などの二
価カチオンなどを混合させ、さらにアルコール類を共存
させておこなえばよい。
【０００８】本発明に使用されるアミノアシルtRNA合成
酵素は、ＡｐｎＡを合成し得るものであればどのような
アミノアシルtRNA合成酵素でもよく、酵素の特異性や由
来などによらず適用できる。なかでも、イソロイシルtR
NA合成酵素、ロイシルtRNA合成酵素、リジルtRNA合成酵
素、フェニルアラニルtRNA合成酵素、セリルtRNA合成酵
素又はヒスチジルtRNA合成酵素を用いることが、その中
でも特に酵素活性が高く好ましい。
酵素は、ＡｐｎＡを合成し得るものであればどのような
アミノアシルtRNA合成酵素でもよく、酵素の特異性や由
来などによらず適用できる。なかでも、イソロイシルtR
NA合成酵素、ロイシルtRNA合成酵素、リジルtRNA合成酵
素、フェニルアラニルtRNA合成酵素、セリルtRNA合成酵
素又はヒスチジルtRNA合成酵素を用いることが、その中
でも特に酵素活性が高く好ましい。
【０００９】アミノアシルtRNA合成酵素の使用量は、合
成を終了するまでの時間と関連して変動する。使用時の
濃度は特に限定はなく、最大１００ｍＭ（１．２×１０
6 ｕ／ｍｌ）程度までの範囲で使用できる。通常は１ｎ
Ｍ〜２ｍＭ（１．２ｕ／ｍｌ〜２．４×１０3 ｕ／ｍ
ｌ）、さらに実用的には、１０ｎＭ〜１ｍＭ（１２ｕ／
ｍｌ〜１．２×１０3 ｕ／ｍｌ）の範囲で使用すること
が好ましい。
成を終了するまでの時間と関連して変動する。使用時の
濃度は特に限定はなく、最大１００ｍＭ（１．２×１０
6 ｕ／ｍｌ）程度までの範囲で使用できる。通常は１ｎ
Ｍ〜２ｍＭ（１．２ｕ／ｍｌ〜２．４×１０3 ｕ／ｍ
ｌ）、さらに実用的には、１０ｎＭ〜１ｍＭ（１２ｕ／
ｍｌ〜１．２×１０3 ｕ／ｍｌ）の範囲で使用すること
が好ましい。
【００１０】これらのアミノアシルtRNA合成酵素は、お
もにエシエリシア・コリ（E.coli）、バチルス・ステア
ロサーモフィラス（B.stearothermophillus)、酵母菌
（Yeast)等より、抽出、精製して得られるが、ＡｐｎＡ
合成能を有するアミノアシルtRNA合成酵素であれば、そ
の由来ならびに種類については特に限定はない。実用的
には、酵素の得やすいエシエリシア・コリ由来やバチル
ス・ステアロサーモフィラス由来のものを用いることが
好ましい。
もにエシエリシア・コリ（E.coli）、バチルス・ステア
ロサーモフィラス（B.stearothermophillus)、酵母菌
（Yeast)等より、抽出、精製して得られるが、ＡｐｎＡ
合成能を有するアミノアシルtRNA合成酵素であれば、そ
の由来ならびに種類については特に限定はない。実用的
には、酵素の得やすいエシエリシア・コリ由来やバチル
ス・ステアロサーモフィラス由来のものを用いることが
好ましい。
【００１１】本発明の製造方法には他の成分として、反
応基質となるＡＴＰ及びアミノ酸の添加を必要とする。
用いるＡＴＰの濃度としては、１μＭ以上、実用的には
１ｍＭ以上である。さらに目的とする生成物に応じて、
ＡＤＰ、ｐｐｐｐＡを添加すればよい。これらの濃度
は、１μＭ以上、実用的には１ｍＭ以上である。
応基質となるＡＴＰ及びアミノ酸の添加を必要とする。
用いるＡＴＰの濃度としては、１μＭ以上、実用的には
１ｍＭ以上である。さらに目的とする生成物に応じて、
ＡＤＰ、ｐｐｐｐＡを添加すればよい。これらの濃度
は、１μＭ以上、実用的には１ｍＭ以上である。
【００１２】さらに、反応をスムーズに進めるために、
ピロホスファターゼを添加したり、マグネシウムイオ
ン、マンガンイオン、カルシウムイオン、コバルトイオ
ン、カドミウムイオン等の金属イオン等を添加すること
ができる。
ピロホスファターゼを添加したり、マグネシウムイオ
ン、マンガンイオン、カルシウムイオン、コバルトイオ
ン、カドミウムイオン等の金属イオン等を添加すること
ができる。
【００１３】また、緩衝液としては、アミノ酸、アミノ
アシルtRNA合成酵素、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ｐｐｐｐＡなど
が溶解し、また酵素活性を維持し、さらに有機溶媒が混
和し、そして所定のｐＨが得られるものであれば、いか
なるものを使用してもよい。そのような具体例として、
例えばトリス緩衝液、ヘペス緩衝液などのグッド緩衝
液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン緩衝
液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。ｐＨ
は、ｐＨ３ないしｐＨ１０、好ましくはｐＨ４ないしｐ
Ｈ９、最適にはｐＨ５ないしｐＨ８である。
アシルtRNA合成酵素、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ｐｐｐｐＡなど
が溶解し、また酵素活性を維持し、さらに有機溶媒が混
和し、そして所定のｐＨが得られるものであれば、いか
なるものを使用してもよい。そのような具体例として、
例えばトリス緩衝液、ヘペス緩衝液などのグッド緩衝
液、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン緩衝
液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。ｐＨ
は、ｐＨ３ないしｐＨ１０、好ましくはｐＨ４ないしｐ
Ｈ９、最適にはｐＨ５ないしｐＨ８である。
【００１４】本発明で用いられるアルコール類として
は、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレン
グリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等
が挙げられる。
は、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレン
グリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等
が挙げられる。
【００１５】また、用いるアルコール類の反応液中にお
ける濃度範囲は２％〜９０％が好ましく、さらに好まし
くは２０％〜６０％、最適には５０％付近である。
ける濃度範囲は２％〜９０％が好ましく、さらに好まし
くは２０％〜６０％、最適には５０％付近である。
【００１６】本発明の製造方法は、上記した成分を例え
ば、同一の反応器の中に共存させて行う。このとき用い
られる反応器としては、反応をスムーズに進行させうる
ものであれば、いかなるものでもよく、酵素量、基質液
の濃度、ｐＨ及び反応温度等によって、反応器の大きさ
及び形状を選択すればよい。このような反応器の形状と
しては、例えばバッチ式の反応器、膜型の反応器、カラ
ム型反応器等を使用することができる。
ば、同一の反応器の中に共存させて行う。このとき用い
られる反応器としては、反応をスムーズに進行させうる
ものであれば、いかなるものでもよく、酵素量、基質液
の濃度、ｐＨ及び反応温度等によって、反応器の大きさ
及び形状を選択すればよい。このような反応器の形状と
しては、例えばバッチ式の反応器、膜型の反応器、カラ
ム型反応器等を使用することができる。
【００１７】また、使用する酵素を適当な担体、例えば
セルロース、デキストラン、アガロース等のような多糖
類の誘導体、ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重
合体、架橋ポリアクリルアミド等のようなビニルポリマ
ーの誘導体、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸共重合
体、ポリアスパラギン酸等のようなポリアミノ酸又はア
ミドの誘導体、ガラス、アルミナ、ヒドロキシアパタイ
ト等のような無機物の誘導体等に結合、包括あるいは吸
着させて、いわゆる固定化酵素として用いることもでき
る。
セルロース、デキストラン、アガロース等のような多糖
類の誘導体、ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重
合体、架橋ポリアクリルアミド等のようなビニルポリマ
ーの誘導体、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸共重合
体、ポリアスパラギン酸等のようなポリアミノ酸又はア
ミドの誘導体、ガラス、アルミナ、ヒドロキシアパタイ
ト等のような無機物の誘導体等に結合、包括あるいは吸
着させて、いわゆる固定化酵素として用いることもでき
る。
【００１８】次に特にバッチ式の反応器で、ＡｐｎＡを
製造する場合を例にとり反応方法について説明する。反
応槽にＡＴＰ、ＡＤＰ、ｐｐｐｐＡ、アミノ酸、アルコ
ール類、金属イオン、緩衝液などを上述した濃度範囲で
添加し、さらにアミノアシルtRNA合成酵素を上述した濃
度範囲で添加する。反応をスムーズに行うために攪拌を
行うこともできる。また、合成時の温度としては、酵素
活性を維持する観点から、一般に０℃から７０℃が好ま
しく、最適には３０℃から５０℃で行われる。
製造する場合を例にとり反応方法について説明する。反
応槽にＡＴＰ、ＡＤＰ、ｐｐｐｐＡ、アミノ酸、アルコ
ール類、金属イオン、緩衝液などを上述した濃度範囲で
添加し、さらにアミノアシルtRNA合成酵素を上述した濃
度範囲で添加する。反応をスムーズに行うために攪拌を
行うこともできる。また、合成時の温度としては、酵素
活性を維持する観点から、一般に０℃から７０℃が好ま
しく、最適には３０℃から５０℃で行われる。
【００１９】このようにして合成されたＡｐｎＡを、イ
オン交換クロマトグラフィー等一般に広く用いられてい
る方法で精製してＡｐｎＡを単離する。
オン交換クロマトグラフィー等一般に広く用いられてい
る方法で精製してＡｐｎＡを単離する。
【００２０】
【実施例】次に、本発明を典型的な実施例により具体的
に説明するが、これによって本発明は限定されない。な
お、以下の実施例において用いたアミノアシルtRNA合成
酵素はそれぞれ、自家精製して得られたものである。
に説明するが、これによって本発明は限定されない。な
お、以下の実施例において用いたアミノアシルtRNA合成
酵素はそれぞれ、自家精製して得られたものである。
【００２１】イソロイシルtRNA合成酵素は、フェブス・
レターズ〔FEBS letters,185,162-164(1985)〕誌にマコ
ト・カワカミ〔Makoto Kawakami 〕らにより記載されて
いるように、セルフクローニングを行った大腸菌JE5506
-pkD15（微工研菌寄第11950号）より、除核酸などの前
処理のあと、ＤＥＡＥ−セファロース、ヒドロキシアパ
タイトの各カラムクロマトグラフィーにより精製し，電
気泳動的にほぼ単一となった酵素を用いた。
レターズ〔FEBS letters,185,162-164(1985)〕誌にマコ
ト・カワカミ〔Makoto Kawakami 〕らにより記載されて
いるように、セルフクローニングを行った大腸菌JE5506
-pkD15（微工研菌寄第11950号）より、除核酸などの前
処理のあと、ＤＥＡＥ−セファロース、ヒドロキシアパ
タイトの各カラムクロマトグラフィーにより精製し，電
気泳動的にほぼ単一となった酵素を用いた。
【００２２】ロイシルtRNA合成酵素は、バチルス・ステ
アロサーモフィラスＮＣＡ−１５０３株（ＦＥＲＭ Ｐ
−４７７８）より、前処理を行った後、ＤＥＡＥ−セフ
ァロース、ホスホセルロース、フェニルセルロファイン
の各カラムクロマトグラフィーにより精製し、電気泳動
的にほぼ単一となった酵素を用いた。
アロサーモフィラスＮＣＡ−１５０３株（ＦＥＲＭ Ｐ
−４７７８）より、前処理を行った後、ＤＥＡＥ−セフ
ァロース、ホスホセルロース、フェニルセルロファイン
の各カラムクロマトグラフィーにより精製し、電気泳動
的にほぼ単一となった酵素を用いた。
【００２３】リジルtRNA合成酵素は、オリエンタル酵母
社より購入したパン酵母より、前処理を行った後、ＤＥ
ＡＥ−セファロース、フェニルセルロファイン、レッド
Ａ−セファロース、ブルーＡ−セファロースの各カラム
クロマトグラフィーにより精製し、電気泳動的にほぼ単
一となった酵素を用いた。
社より購入したパン酵母より、前処理を行った後、ＤＥ
ＡＥ−セファロース、フェニルセルロファイン、レッド
Ａ−セファロース、ブルーＡ−セファロースの各カラム
クロマトグラフィーにより精製し、電気泳動的にほぼ単
一となった酵素を用いた。
【００２４】フェニルアラニルtRNA合成酵素は、大腸菌
Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ １５４８９）よりＤＥＡＥ−セ
ファロース、フェニルセルロファイン、ホスホセルロー
ス、レッドＡ−セファロース、ブルーＡ−セファロース
の各カラムクロマトグラフィーにより精製し、電気泳動
的にほぼ単一となった酵素を用いた。
Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ １５４８９）よりＤＥＡＥ−セ
ファロース、フェニルセルロファイン、ホスホセルロー
ス、レッドＡ−セファロース、ブルーＡ−セファロース
の各カラムクロマトグラフィーにより精製し、電気泳動
的にほぼ単一となった酵素を用いた。
【００２５】セリルtRNA合成酵素は、バチルス・ステア
ロサーモフィラスＮＣＡ−１５０３株より、前処理を行
った後、ＤＥＡＥ−セファロース、ホスホセルロース、
フェニルセルロファイン、レッドＡ−セファロース、ホ
スホセルロースの各カラムクロマトグラフィーにより精
製し、電気泳動的にほぼ単一となった酵素を用いた。
ロサーモフィラスＮＣＡ−１５０３株より、前処理を行
った後、ＤＥＡＥ−セファロース、ホスホセルロース、
フェニルセルロファイン、レッドＡ−セファロース、ホ
スホセルロースの各カラムクロマトグラフィーにより精
製し、電気泳動的にほぼ単一となった酵素を用いた。
【００２６】ヒスチジルtRNA合成酵素は、バチルス・ス
テアロサーモフィルスＮＣＡ−１５０３株より、前処理
を行った後、ＤＥＡＥ−セファロース、ホスホセルロー
ス、レッドＡ−セファロース、ホスホセルロースの各カ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、電気泳動的にほ
ぼ単一となった酵素を用いた。
テアロサーモフィルスＮＣＡ−１５０３株より、前処理
を行った後、ＤＥＡＥ−セファロース、ホスホセルロー
ス、レッドＡ−セファロース、ホスホセルロースの各カ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、電気泳動的にほ
ぼ単一となった酵素を用いた。
【００２７】アミノアシルtRNA合成酵素におけるユニッ
ト（ｕ）とは、一般に用いられるヒドロキサメートによ
るアミノアシルtRNA合成酵素活性測定法において、１分
間に１×１０-11 モルのアミノ酸ヒドロキサメートを生
ずる酵素量を１ｕとする。この活性測定法の原理は、以
下のようである。
ト（ｕ）とは、一般に用いられるヒドロキサメートによ
るアミノアシルtRNA合成酵素活性測定法において、１分
間に１×１０-11 モルのアミノ酸ヒドロキサメートを生
ずる酵素量を１ｕとする。この活性測定法の原理は、以
下のようである。
【００２８】
【００２９】実施例１ 実施例１〜６は、各種アルコール類を反応系に添加する
ことで、Ａｐ４Ａ合成速度が上昇する例を示した。ＡＴ
Ｐ初濃度１５ｍＭ、塩化マグネシウム３０ｍＭ、イミダ
ゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、塩化亜鉛０．５ｍ
Ｍ、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチ
レングリコール、ポリエチレングリコール及びグリセロ
ールの各種アルコール類あるいはコントロールとしての
水１０％及びイソロイシルtRNA合成酵素２，９２０ｕ／
ｍｌ、イソロイシン５ｍＭとなるように、１００ｍｌス
ケールで混合し、バッチ式で４０℃でＡｐ４Ａ合成反応
をおこなった。反応で合成されたＡｐ４Ａ量を測定し、
単位時間あたりのＡｐ４Ａ合成量を求めた。結果を表１
に示した。
ことで、Ａｐ４Ａ合成速度が上昇する例を示した。ＡＴ
Ｐ初濃度１５ｍＭ、塩化マグネシウム３０ｍＭ、イミダ
ゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、塩化亜鉛０．５ｍ
Ｍ、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチ
レングリコール、ポリエチレングリコール及びグリセロ
ールの各種アルコール類あるいはコントロールとしての
水１０％及びイソロイシルtRNA合成酵素２，９２０ｕ／
ｍｌ、イソロイシン５ｍＭとなるように、１００ｍｌス
ケールで混合し、バッチ式で４０℃でＡｐ４Ａ合成反応
をおこなった。反応で合成されたＡｐ４Ａ量を測定し、
単位時間あたりのＡｐ４Ａ合成量を求めた。結果を表１
に示した。
【００３０】実施例２〜６ 実施例１におけるイソロイシルtRNA合成酵素及びイソロ
イシンを、ロイシルtRNA合成酵素３６，６００ｕ／ｍｌ
及びロイシン５ｍＭ（実施例２）、リジルtRNA合成酵素
２００ｕ／ｍｌ及びリジン５ｍＭ（実施例３）、フェニ
ルアラニルtRNA合成酵素１，１００ｕ／ｍｌ及びフェニ
ルアラニン５ｍＭ（実施例４）、セリルtRNA合成酵素
１，５１０ｕ／ｍｌ及びセリン５ｍＭ（実施例５）、ヒ
スチジルtRNA合成酵素８６０ｕ／ｍｌ及びヒスチジン５
ｍＭ（実施例６）に代えた以外は実施例１と同様に反応
を行いＡｐ４Ａの初速度を求めた。結果を表１に示し
た。
イシンを、ロイシルtRNA合成酵素３６，６００ｕ／ｍｌ
及びロイシン５ｍＭ（実施例２）、リジルtRNA合成酵素
２００ｕ／ｍｌ及びリジン５ｍＭ（実施例３）、フェニ
ルアラニルtRNA合成酵素１，１００ｕ／ｍｌ及びフェニ
ルアラニン５ｍＭ（実施例４）、セリルtRNA合成酵素
１，５１０ｕ／ｍｌ及びセリン５ｍＭ（実施例５）、ヒ
スチジルtRNA合成酵素８６０ｕ／ｍｌ及びヒスチジン５
ｍＭ（実施例６）に代えた以外は実施例１と同様に反応
を行いＡｐ４Ａの初速度を求めた。結果を表１に示し
た。
【００３１】
【表１】
【００３２】実施例１〜６の結果より、アルコール類を
添加することで、アミノアシルtRNA合成酵素の触媒作用
が向上することが示された。
添加することで、アミノアシルtRNA合成酵素の触媒作用
が向上することが示された。
【００３３】実施例７ 実施例７〜９では、特にエチレングリコール添加によ
り、イソロイシルtRNA合成酵素のＡｐ３Ａ、Ａｐ４Ａ及
びＡｐ５Ａ合成速度が上昇する例を示した。操作方法は
上述の実施例１と同様である。ＡＴＰ初濃度４ｍＭ、Ａ
ＤＰ初濃度１６ｍＭ、塩化マグネシウム３０ｍＭ、イミ
ダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、イソロイシン５ｍ
Ｍ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、エチレングリコールを０から
９０％までの各濃度、イソロイシルtRNA合成酵素１，２
５０ｕ／ｍｌ、１００ｍｌスケール、４０℃、Ａｐ３Ａ
合成反応の初速度を求めた。
り、イソロイシルtRNA合成酵素のＡｐ３Ａ、Ａｐ４Ａ及
びＡｐ５Ａ合成速度が上昇する例を示した。操作方法は
上述の実施例１と同様である。ＡＴＰ初濃度４ｍＭ、Ａ
ＤＰ初濃度１６ｍＭ、塩化マグネシウム３０ｍＭ、イミ
ダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、イソロイシン５ｍ
Ｍ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、エチレングリコールを０から
９０％までの各濃度、イソロイシルtRNA合成酵素１，２
５０ｕ／ｍｌ、１００ｍｌスケール、４０℃、Ａｐ３Ａ
合成反応の初速度を求めた。
【００３４】実施例８，９ 実施例７におけるＡＴＰ初濃度４ｍＭを１０ｍＭに代
え，又ＡＤＰを添加しなかった以外は実施例７と同様に
行いＡｐ４Ａ合成反応の初速度を求めた（実施例８）。
実施例７におけるＡＤＰ初濃度１６ｍＭをｐｐｐｐＡ初
濃度１６ｍＭに代えた以外は実施例７と同様に行いＡｐ
５Ａ合成反応の初速度を求めた（実施例９）。実施例７
〜９の結果を表２にまとめて示した。
え，又ＡＤＰを添加しなかった以外は実施例７と同様に
行いＡｐ４Ａ合成反応の初速度を求めた（実施例８）。
実施例７におけるＡＤＰ初濃度１６ｍＭをｐｐｐｐＡ初
濃度１６ｍＭに代えた以外は実施例７と同様に行いＡｐ
５Ａ合成反応の初速度を求めた（実施例９）。実施例７
〜９の結果を表２にまとめて示した。
【００３５】
【表２】
【００３６】この結果より、ＡｐｎＡの合成がアルコー
ル類を加えることにより促進されることがわかった。さ
らに５０％程度濃度のアルコール類を用いることが最も
効率的であることがわかった。
ル類を加えることにより促進されることがわかった。さ
らに５０％程度濃度のアルコール類を用いることが最も
効率的であることがわかった。
【００３７】実施例１０ ＡＴＰ初濃度として０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍ
Ｍ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭを用いた反応をおこなっ
た。ＭｇＣｌ2 は、ＡＴＰ初濃度に対し２倍のモル濃度
を用いた。それぞれのＡＴＰ初濃度に対してエチレング
リコール濃度を０％、１０％、２０％、３０％、４０％
と変化させ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、
イソロイシン５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシ
ルtRNA合成酵素１２０ｕ／ｍｌとなるように、１００ｍ
ｌスケールで混合し４０℃で反応を行い、それぞれの場
合でのＡｐ４Ａ合成量を測定し初速度を求めた。これよ
り、Ａｐ４Ａ合成反応の速度パラメータを求めた。結果
は表３に示した。
Ｍ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭを用いた反応をおこなっ
た。ＭｇＣｌ2 は、ＡＴＰ初濃度に対し２倍のモル濃度
を用いた。それぞれのＡＴＰ初濃度に対してエチレング
リコール濃度を０％、１０％、２０％、３０％、４０％
と変化させ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、
イソロイシン５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、イソロイシ
ルtRNA合成酵素１２０ｕ／ｍｌとなるように、１００ｍ
ｌスケールで混合し４０℃で反応を行い、それぞれの場
合でのＡｐ４Ａ合成量を測定し初速度を求めた。これよ
り、Ａｐ４Ａ合成反応の速度パラメータを求めた。結果
は表３に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】この結果より、アルコール類を添加するこ
とで、反応パラメータのミカエリス定数Ｋｍが減少し、
最大速度Ｖｍａｘが上昇することがわかった。これによ
り、アルコール類を添加することで、酵素の触媒反応そ
のものが上昇することが示された。
とで、反応パラメータのミカエリス定数Ｋｍが減少し、
最大速度Ｖｍａｘが上昇することがわかった。これによ
り、アルコール類を添加することで、酵素の触媒反応そ
のものが上昇することが示された。
【００４０】実施例１１ 以下実施例１１〜１３で、アルコール類により酵素量を
少なく使用するＡｐｎＡ生産が行われた実例を示した。
ＡＴＰ初濃度３ｍＭ、ＡＤＰ初濃度１２ｍＭ、塩化マグ
ネシウム３０ｍＭ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．
５）、イソロイシン５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、エチ
レングリコール濃度５０％、イソロイシルtRNA合成酵素
１，６５０ｕ／ｍｌ、１００ｍｌスケール、４０℃でＡ
ｐ３Ａの生産を行った。
少なく使用するＡｐｎＡ生産が行われた実例を示した。
ＡＴＰ初濃度３ｍＭ、ＡＤＰ初濃度１２ｍＭ、塩化マグ
ネシウム３０ｍＭ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．
５）、イソロイシン５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、エチ
レングリコール濃度５０％、イソロイシルtRNA合成酵素
１，６５０ｕ／ｍｌ、１００ｍｌスケール、４０℃でＡ
ｐ３Ａの生産を行った。
【００４１】実施例１２ ＡＴＰ初濃度１５ｍＭ、塩化マグネシウム３０ｍＭ、イ
ミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、イソロイシン
２．５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、エチレングリコール
５０％、イソロイシルtRNA合成酵素２７０ｕ／ｍｌ、１
００ｍｌスケール、４０℃でＡｐ４Ａの生産を行った。
ミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、イソロイシン
２．５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、エチレングリコール
５０％、イソロイシルtRNA合成酵素２７０ｕ／ｍｌ、１
００ｍｌスケール、４０℃でＡｐ４Ａの生産を行った。
【００４２】実施例１３ ＡＴＰ初濃度３ｍＭ、ｐｐｐｐＡ初濃度１２ｍＭ、塩化
マグネシウム３０ｍＭ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ
７．５）、イソロイシン５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、
エチレングリコール濃度５０％、イソロイシルtRNA合成
酵素１，６５０ｕ／ｍｌ、１００ｍｌスケール、４０℃
でＡｐ５Ａの生産を行った。以上の実施例１１〜１３の
結果をまとめて表４に示した。
マグネシウム３０ｍＭ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ
７．５）、イソロイシン５ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、
エチレングリコール濃度５０％、イソロイシルtRNA合成
酵素１，６５０ｕ／ｍｌ、１００ｍｌスケール、４０℃
でＡｐ５Ａの生産を行った。以上の実施例１１〜１３の
結果をまとめて表４に示した。
【００４３】
【表４】
【００４４】この結果より、アルコール類を添加するこ
とで、ＡｐｎＡの生産が支障なくおこなえることがわか
った。
とで、ＡｐｎＡの生産が支障なくおこなえることがわか
った。
【００４５】実施例１４ 以上の実施例をもとに工業的スケールでＡｐ４Ａを生産
した例をエチレングリコールを添加した場合、しなかっ
た場合と比較した。ＡＴＰ初濃度１５ｍＭ、塩化マグネ
シウム３０ｍＭ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．
５）、イソロイシン０．１ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、
エチレングリコール５０％、イソロイシルtRNA合成酵素
２７０ｕ／ｍｌ、４００ｌスケール、４０℃でＡｐ４Ａ
の合成反応をおこなった。結果は表５に示した。また、
従来法であるエチレングリコールを含まない反応での結
果も表５に示した。
した例をエチレングリコールを添加した場合、しなかっ
た場合と比較した。ＡＴＰ初濃度１５ｍＭ、塩化マグネ
シウム３０ｍＭ、イミダゾール１００ｍＭ（ｐＨ７．
５）、イソロイシン０．１ｍＭ、塩化亜鉛０．５ｍＭ、
エチレングリコール５０％、イソロイシルtRNA合成酵素
２７０ｕ／ｍｌ、４００ｌスケール、４０℃でＡｐ４Ａ
の合成反応をおこなった。結果は表５に示した。また、
従来法であるエチレングリコールを含まない反応での結
果も表５に示した。
【００４６】
【表５】
【００４７】この結果より、工業的な規模で使用酵素
量、転換率、収率とも著しく有利にＡｐｎＡを製造する
ことができることがわかった。
量、転換率、収率とも著しく有利にＡｐｎＡを製造する
ことができることがわかった。
【００４８】
【発明の効果】本発明の製造方法によると、アミノアシ
ルtRNA合成酵素の触媒作用が飛躍的に上昇し、かつＡｐ
ｎＡの収率も向上することから、工業的な規模でＡｐｎ
Ａを製造することができる。
ルtRNA合成酵素の触媒作用が飛躍的に上昇し、かつＡｐ
ｎＡの収率も向上することから、工業的な規模でＡｐｎ
Ａを製造することができる。
Claims (3)
- 【請求項１】 アデノシントリリン酸及びアミノ酸を反
応基質とし、アミノアシルtRNA合成酵素を使用するジア
デノシン四リン酸の製造に際し、アルコール類を反応系
に共存させることを特徴とするジアデノシン四リン酸の
製造方法。 - 【請求項２】 アデノシントリリン酸、アデノシンジリ
ン酸及びアミノ酸を反応基質とし、アミノアシルtRNA合
成酵素を使用するジアデノシン三リン酸の製造に際し、
アルコール類を反応系に共存させることを特徴とするジ
アデノシン三リン酸の製造方法。 - 【請求項３】 アデノシントリリン酸、アデノシンテト
ラリン酸及びアミノ酸を反応基質とし、アミノアシルtR
NA合成酵素を使用するジアデノシン五リン酸の製造に際
し、アルコール類を反応系に共存させることを特徴とす
るジアデノシン五リン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03348127A JP3135649B2 (ja) | 1991-12-03 | 1991-12-03 | ジアデノシンポリリン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03348127A JP3135649B2 (ja) | 1991-12-03 | 1991-12-03 | ジアデノシンポリリン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05153993A JPH05153993A (ja) | 1993-06-22 |
| JP3135649B2 true JP3135649B2 (ja) | 2001-02-19 |
Family
ID=18394930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03348127A Expired - Fee Related JP3135649B2 (ja) | 1991-12-03 | 1991-12-03 | ジアデノシンポリリン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3135649B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08224227A (ja) * | 1995-02-22 | 1996-09-03 | Internatl Reagents Corp | 血液採血管 |
-
1991
- 1991-12-03 JP JP03348127A patent/JP3135649B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05153993A (ja) | 1993-06-22 |
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