JP2000300287A - トランスグルタミナーゼを用いた糖鎖導入方法 - Google Patents
トランスグルタミナーゼを用いた糖鎖導入方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖鎖のないポリペプチドに安全かつ容易に糖
鎖を導入する新規な方法を提供する。 【解決手段】 トランスグルタミナーゼの転移作用を利
用して、アミノアルキルグリコシドを糖鎖ドナー基質と
し、これをグルタミン含有ポリペプチドに作用させるこ
とによってポリペプチドに糖鎖を導入する。
鎖を導入する新規な方法を提供する。 【解決手段】 トランスグルタミナーゼの転移作用を利
用して、アミノアルキルグリコシドを糖鎖ドナー基質と
し、これをグルタミン含有ポリペプチドに作用させるこ
とによってポリペプチドに糖鎖を導入する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トランスグルタミ
ナーゼの転移触媒作用を利用してポリペプチドに糖鎖を
導入する方法に関する。さらに、詳しくは、トランスグ
ルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ポリペプチドに
アミノアルキルグリコシドを作用させてポリペプチドに
糖鎖を導入する新規な糖鎖導入方法を提供するものであ
り、医療上有用な複合糖質とくに糖タンパク質の合成に
有用である。
ナーゼの転移触媒作用を利用してポリペプチドに糖鎖を
導入する方法に関する。さらに、詳しくは、トランスグ
ルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ポリペプチドに
アミノアルキルグリコシドを作用させてポリペプチドに
糖鎖を導入する新規な糖鎖導入方法を提供するものであ
り、医療上有用な複合糖質とくに糖タンパク質の合成に
有用である。
【０００２】
【従来の技術】生体内にある糖タンパク質には、通常、
特定の糖鎖が含まれており、この糖鎖はタンパク質の血
中安定性の保持に関与したり、細胞表面のレセプターに
対するリガンドとして働くなど、生体内で重要な役割を
果たしていることが知られている。最近、組換え技術の
発達に伴い、大腸菌やライン化細胞を利用して種々の組
換えタンパク質の製造が試みられているが、これら大腸
菌等の細胞を用いて発現されるリコンビナントタンパク
質では本来の糖鎖を欠落している場合が多く、かかる糖
鎖を有さないリコンビナントタンパク質への糖鎖の導入
が重要な課題になっている。このような糖タンパク質等
の複合糖質の製造には、(１)糖転移酵素を用いる方法、
(２)脱水縮合剤を用いる方法、(３)活性エステルを用い
る方法、(４)還元アミノ化法などが挙げられるが糖転移
酵素を用いる方法(１)では、糖鎖が導入されるペプチド
と糖との間にスペーサーを設けることが出来ないため、
複合糖質の設計の自由度が狭いほか、原料となる糖ヌク
レオチドや、酵素が高価である欠点がある。脱水縮合剤
を用いる方法(２)は化学的な方法であるため、種々のス
ペーサーを導入することが可能であるが、用いられる脱
水縮合剤が猛毒性であることや、多くの副反応を伴う欠
点がある。また活性エステルを用いる方法(３)は比較的
温和な反応ではあるが、反応の位置選択性、立体選択性
がないため、所望の生成物を高純度で得られ難い。さら
に、還元アミノ化法(４)は最も簡単な糖鎖導入法の一つ
であるが、この方法を用いた場合、反応後に還元末端側
の糖残基の構造が壊れ、還元糖のかたちになるため、糖
とペプチドのあいだに余分なポリビニルアルコール残基
が含まれてしまう。
特定の糖鎖が含まれており、この糖鎖はタンパク質の血
中安定性の保持に関与したり、細胞表面のレセプターに
対するリガンドとして働くなど、生体内で重要な役割を
果たしていることが知られている。最近、組換え技術の
発達に伴い、大腸菌やライン化細胞を利用して種々の組
換えタンパク質の製造が試みられているが、これら大腸
菌等の細胞を用いて発現されるリコンビナントタンパク
質では本来の糖鎖を欠落している場合が多く、かかる糖
鎖を有さないリコンビナントタンパク質への糖鎖の導入
が重要な課題になっている。このような糖タンパク質等
の複合糖質の製造には、(１)糖転移酵素を用いる方法、
(２)脱水縮合剤を用いる方法、(３)活性エステルを用い
る方法、(４)還元アミノ化法などが挙げられるが糖転移
酵素を用いる方法(１)では、糖鎖が導入されるペプチド
と糖との間にスペーサーを設けることが出来ないため、
複合糖質の設計の自由度が狭いほか、原料となる糖ヌク
レオチドや、酵素が高価である欠点がある。脱水縮合剤
を用いる方法(２)は化学的な方法であるため、種々のス
ペーサーを導入することが可能であるが、用いられる脱
水縮合剤が猛毒性であることや、多くの副反応を伴う欠
点がある。また活性エステルを用いる方法(３)は比較的
温和な反応ではあるが、反応の位置選択性、立体選択性
がないため、所望の生成物を高純度で得られ難い。さら
に、還元アミノ化法(４)は最も簡単な糖鎖導入法の一つ
であるが、この方法を用いた場合、反応後に還元末端側
の糖残基の構造が壊れ、還元糖のかたちになるため、糖
とペプチドのあいだに余分なポリビニルアルコール残基
が含まれてしまう。
【０００３】一方、モルモットの肝臓や微生物等から得
られたトランスグルタミナーゼは生体内でタンパク質同
士の架橋反応を触媒する酵素であって、リジン残基とグ
ルタミン残基が基質となり、リジンの側鎖アミノ基とグ
ルタミンの側鎖アミド基間で脱アンモニア縮合を触媒し
架橋を行なうことが知られている。トランスグルタミナ
ーゼに関する研究報告によれば、単純なアミノアルキル
アルコールがトランスグルタミナーゼの基質となりうる
ことが示されている。また、糖を含むアミンをドナーと
して用いた例もＹａｎらにより報告されている(Sauchi
Betty Yan and Finn Wold, Biochemistry, 23, 3759-37
65)。しかしながら、該Ｙａｎらの報告では、糖を還元
して得られるアミノアルキルポリオールや天然の糖タン
パク質から切り出した様々な構造の糖鎖の混合物をドナ
ーとして用い、これをトランスグルタミナーゼの存在下
に、β−カゼインに作用させており、その反応によって
何らかの生成物が得られることが電気泳動と発色反応に
より示唆されてはいるが、生成物の構造解析にまでは至
っていない。
られたトランスグルタミナーゼは生体内でタンパク質同
士の架橋反応を触媒する酵素であって、リジン残基とグ
ルタミン残基が基質となり、リジンの側鎖アミノ基とグ
ルタミンの側鎖アミド基間で脱アンモニア縮合を触媒し
架橋を行なうことが知られている。トランスグルタミナ
ーゼに関する研究報告によれば、単純なアミノアルキル
アルコールがトランスグルタミナーゼの基質となりうる
ことが示されている。また、糖を含むアミンをドナーと
して用いた例もＹａｎらにより報告されている(Sauchi
Betty Yan and Finn Wold, Biochemistry, 23, 3759-37
65)。しかしながら、該Ｙａｎらの報告では、糖を還元
して得られるアミノアルキルポリオールや天然の糖タン
パク質から切り出した様々な構造の糖鎖の混合物をドナ
ーとして用い、これをトランスグルタミナーゼの存在下
に、β−カゼインに作用させており、その反応によって
何らかの生成物が得られることが電気泳動と発色反応に
より示唆されてはいるが、生成物の構造解析にまでは至
っていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】医療上有用な各種複合
糖質ことに糖タンパク質を安全で容易に製造する方法の
開発が望まれており、本発明はかかる目的に適した新し
い糖鎖導入方法を提供することを目的とする。
糖質ことに糖タンパク質を安全で容易に製造する方法の
開発が望まれており、本発明はかかる目的に適した新し
い糖鎖導入方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者の研究によれ
ば、生体内でタンパク質を架橋する機能を有することが
知られているトランスグルタミナーゼを用い、その転移
触媒活性を利用することによって、アミノアルキルグリ
コシドをドナーとしてグルタミン含有ポリペプチドに糖
鎖を導入し得ることを見出した。すなわち、本発明はト
ランスグルタミナーゼを用いた糖鎖の新しい導入方法を
提供するものである。
ば、生体内でタンパク質を架橋する機能を有することが
知られているトランスグルタミナーゼを用い、その転移
触媒活性を利用することによって、アミノアルキルグリ
コシドをドナーとしてグルタミン含有ポリペプチドに糖
鎖を導入し得ることを見出した。すなわち、本発明はト
ランスグルタミナーゼを用いた糖鎖の新しい導入方法を
提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明方法によれば、トランスグ
ルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ポリペプチドに
アミノアルキルグリコシドを作用させることにより、ポ
リペプチドのグルタミン残基にアミノアルキルスペーサ
ーを介して糖鎖が容易に導入れる。糖鎖のドナーとして
用いられるアミノアルキルグリコシドは、導入れるべき
糖鎖に対応する糖とアグリコンであるアミノアルキル部
分からなり、アミノアルカノールと糖とを常法にしたが
って反応させれば容易に得られる。糖としては、グルコ
ース、マンノース等の単糖類、ラクトース、マルトー
ス、ショ糖類のオリゴ糖およびデンプン等の多糖類が含
まれる。アミノアルカノールとしては、２−アミノエタ
ノール、３−アミノプロパノール、４−アミノ−ｎ−ブ
タノール等が含まれる。
ルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ポリペプチドに
アミノアルキルグリコシドを作用させることにより、ポ
リペプチドのグルタミン残基にアミノアルキルスペーサ
ーを介して糖鎖が容易に導入れる。糖鎖のドナーとして
用いられるアミノアルキルグリコシドは、導入れるべき
糖鎖に対応する糖とアグリコンであるアミノアルキル部
分からなり、アミノアルカノールと糖とを常法にしたが
って反応させれば容易に得られる。糖としては、グルコ
ース、マンノース等の単糖類、ラクトース、マルトー
ス、ショ糖類のオリゴ糖およびデンプン等の多糖類が含
まれる。アミノアルカノールとしては、２−アミノエタ
ノール、３−アミノプロパノール、４−アミノ−ｎ−ブ
タノール等が含まれる。
【０００７】糖鎖を導入する受容体としてのポリペプチ
ドもグルタミン残基を含む以外は特に制限はなく、Ｌ−
グルタミル−グリシン等のジペプチド、Ｌ−グルタミル
−グリシル−セリン等のトリペプチド等のほかより長鎖
のポリペプチドを含む。さらに、糖鎖を欠く天然または
合成タンパク質も含み、とくに糖鎖を含まない組換えタ
ンパク質も好ましい対象となり得る。
ドもグルタミン残基を含む以外は特に制限はなく、Ｌ−
グルタミル−グリシン等のジペプチド、Ｌ−グルタミル
−グリシル−セリン等のトリペプチド等のほかより長鎖
のポリペプチドを含む。さらに、糖鎖を欠く天然または
合成タンパク質も含み、とくに糖鎖を含まない組換えタ
ンパク質も好ましい対象となり得る。
【０００８】本発明による糖鎖導入方法を実施するに
は、糖鎖ドナーとしてのアミノアルキルグリコシドと受
容体であるグルタミン含有ポリペプチドを適当な緩衝液
に溶解させ、これに触媒となるトランスグルタミナーゼ
を添加して反応させる。反応はトランスグルタミナーゼ
の至適ｐＨであるｐＨ４〜ｐＨ９の領域で、室温ないし
加温下、例えば、２０℃〜４０℃において数十分〜数十
時間、好ましくは攪拌下に行なわれる。
は、糖鎖ドナーとしてのアミノアルキルグリコシドと受
容体であるグルタミン含有ポリペプチドを適当な緩衝液
に溶解させ、これに触媒となるトランスグルタミナーゼ
を添加して反応させる。反応はトランスグルタミナーゼ
の至適ｐＨであるｐＨ４〜ｐＨ９の領域で、室温ないし
加温下、例えば、２０℃〜４０℃において数十分〜数十
時間、好ましくは攪拌下に行なわれる。
【０００９】用いられる緩衝液としてはｐＨ４〜ｐＨ９
のものであればいずれの種類の緩衝液でもよく、例えば
トリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、リン酸緩衝液(ｐＨ
６．４〜７．４)等が挙げられる。また、動物由来のト
ランスグルタミナーゼはカルシウム依存性のタンパク質
であるため、酵素活性を発現させるために、塩化カルシ
ウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を反応系に添加
するのが好ましく、その添加量は通常０．１〜１００ミ
リモル濃度が好ましい。なお、微生物由来のトランスグ
ルタミナーゼはカルシウム依存性ではないため、カルシ
ウム塩の添加は必要でない。トランスグルタミナーゼと
しては、ストレプトベルティシリウム属（例えば、Ｓtr
eptoverticillium sp. Ｓtrain s-８１１２）等の微生
物の産生するもの、モルモット、ヒト等の動物由来のも
の、さらに魚類由来のものなどいずれも用い得る。また
汎用食品の増貼剤として市販もされており、本発明では
かかる市販のトランスグルタミナーゼでも用いられる。
のものであればいずれの種類の緩衝液でもよく、例えば
トリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)、リン酸緩衝液(ｐＨ
６．４〜７．４)等が挙げられる。また、動物由来のト
ランスグルタミナーゼはカルシウム依存性のタンパク質
であるため、酵素活性を発現させるために、塩化カルシ
ウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を反応系に添加
するのが好ましく、その添加量は通常０．１〜１００ミ
リモル濃度が好ましい。なお、微生物由来のトランスグ
ルタミナーゼはカルシウム依存性ではないため、カルシ
ウム塩の添加は必要でない。トランスグルタミナーゼと
しては、ストレプトベルティシリウム属（例えば、Ｓtr
eptoverticillium sp. Ｓtrain s-８１１２）等の微生
物の産生するもの、モルモット、ヒト等の動物由来のも
の、さらに魚類由来のものなどいずれも用い得る。また
汎用食品の増貼剤として市販もされており、本発明では
かかる市販のトランスグルタミナーゼでも用いられる。
【００１０】反応生成物は、遠心分離法、クロマトグラ
フィ等の常法により反応混合物から単離精製することが
出来る。なお、該反応生成物の分析は、高速液体クロマ
トグラフィ、核磁気共鳴スペクトル、質量分析などの各
種分光分析法により行なうことができる。
フィ等の常法により反応混合物から単離精製することが
出来る。なお、該反応生成物の分析は、高速液体クロマ
トグラフィ、核磁気共鳴スペクトル、質量分析などの各
種分光分析法により行なうことができる。
【００１１】
【実施例】つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するがこれらに限定されない。なお、実施例中の
記号は下記の意味を有する。 ＴＧase：トランスグルタミナーゼ ＢＯＣ：ｔ−ブトキシカルボニル(アミノ基の保護基) Ｇln：グルタミン Ｇly：グリシン Ｓer：セリン
に説明するがこれらに限定されない。なお、実施例中の
記号は下記の意味を有する。 ＴＧase：トランスグルタミナーゼ ＢＯＣ：ｔ−ブトキシカルボニル(アミノ基の保護基) Ｇln：グルタミン Ｇly：グリシン Ｓer：セリン
【００１２】実施例１ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−ラクトシドのＢoc-Ｇln-
Ｇly(ＯＨ)への転移反応
Ｇly(ＯＨ)への転移反応
【化１】
【００１３】３−アミノプロピル−β−Ｄ−ラクトシド
(５ｍＭ)およびＢoc-Ｇln-Ｇly(ＯＨ)(１．６７ｍＭ)の
トリス−塩酸バッファー(ｐＨ８．０)混合溶液０．４９
ｍｌにＴＧase(モルモット由来)０．１Ｕ／１５０μｌ
を加え、さらにＣａＣｌ2を１０ｍＭ濃度で加え、２５
℃で３０時間攪拌した。反応系に２０％トリクロロ酢酸
水溶液を０．５ｍｌ加え、遠心分離し、上清液を採取し
た。反応生成物をマトリックスアシステッドレーザーデ
ソープションイオン化−飛行時間型質量分析計(ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦＭＳ)によって分析し、反応生成物の絶対
分子量を測定した。目的とする生成物Boc-δＮ−(３−
プロピルラクトシド)−Ｇln−Ｇly(ＯＨ)＋カリウムイ
オンのシグナル［Ｍ＋Ｋ］+＝７６２を得た。
(５ｍＭ)およびＢoc-Ｇln-Ｇly(ＯＨ)(１．６７ｍＭ)の
トリス−塩酸バッファー(ｐＨ８．０)混合溶液０．４９
ｍｌにＴＧase(モルモット由来)０．１Ｕ／１５０μｌ
を加え、さらにＣａＣｌ2を１０ｍＭ濃度で加え、２５
℃で３０時間攪拌した。反応系に２０％トリクロロ酢酸
水溶液を０．５ｍｌ加え、遠心分離し、上清液を採取し
た。反応生成物をマトリックスアシステッドレーザーデ
ソープションイオン化−飛行時間型質量分析計(ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦＭＳ)によって分析し、反応生成物の絶対
分子量を測定した。目的とする生成物Boc-δＮ−(３−
プロピルラクトシド)−Ｇln−Ｇly(ＯＨ)＋カリウムイ
オンのシグナル［Ｍ＋Ｋ］+＝７６２を得た。
【００１４】実施例２ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコサミンのＢoc−Ｇ
ln−Ｇly(ＯＨ)への移転反応
ln−Ｇly(ＯＨ)への移転反応
【化２】
【００１５】３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミン(１ｍＭ)およびＢoc−Ｇln−Ｇly(Ｏ
Ｈ)(１ｍＭ)のトリス−塩酸バッファー(ｐＨ８．０)混
合液７．３５ｍｌにＴＧase(モルモット由来)０．５Ｕ
／１５０μｌを加え、さらにＣａＣｌ2を１０ｍＭの濃
度で加え、２５℃で３０時間攪拌した。その反応系に２
０％トリクロロ酢酸水溶液０．５ｍｌを加えたのち、遠
心分離し、その上清液を採取した。その上清液を逆相型
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィおよびＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析して、目的物Ｂｏｃ−δ
Ｎ−(３−プロピルグルコサミン)−Ｇln−Ｇly(ＯＨ)の
生成を確認した。
Ｄ−グルコサミン(１ｍＭ)およびＢoc−Ｇln−Ｇly(Ｏ
Ｈ)(１ｍＭ)のトリス−塩酸バッファー(ｐＨ８．０)混
合液７．３５ｍｌにＴＧase(モルモット由来)０．５Ｕ
／１５０μｌを加え、さらにＣａＣｌ2を１０ｍＭの濃
度で加え、２５℃で３０時間攪拌した。その反応系に２
０％トリクロロ酢酸水溶液０．５ｍｌを加えたのち、遠
心分離し、その上清液を採取した。その上清液を逆相型
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィおよびＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析して、目的物Ｂｏｃ−δ
Ｎ−(３−プロピルグルコサミン)−Ｇln−Ｇly(ＯＨ)の
生成を確認した。
【００１６】実施例３ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコサミンの天然ポリ
ペプチドへの移転反応 ３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン(０．３ｍｇ)およびカルシトニンのトリス−塩酸バ
ッファー溶液(０．０１μｍｏｌ／１００μｌ)ＣａＣｌ
2２Ｈ2Ｏ０．４ｍｇをトリス−塩酸バッファー(ｐＨ＝
８．０)５０μｌに溶解し、２５℃でＴＧase(モルモッ
ト由来)０．１Ｕ／１５０μｌを４回に分けて加え、３
０時間攪拌した。反応系にトリクロロ酢酸を加え、遠心
分離し、上清液を採取した。反応生成物をＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳによって分析し、反応生成物の絶対分子量を
測定した。スペクトル上にカルシトニンに３−アミノプ
ロピル−β−Ｄ−ラクトシドが一残基導入された化合物
＋カリウムイオンのシグナル［Ｍ＋Ｋ］+＝３７０７．
３を得た。
ペプチドへの移転反応 ３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン(０．３ｍｇ)およびカルシトニンのトリス−塩酸バ
ッファー溶液(０．０１μｍｏｌ／１００μｌ)ＣａＣｌ
2２Ｈ2Ｏ０．４ｍｇをトリス−塩酸バッファー(ｐＨ＝
８．０)５０μｌに溶解し、２５℃でＴＧase(モルモッ
ト由来)０．１Ｕ／１５０μｌを４回に分けて加え、３
０時間攪拌した。反応系にトリクロロ酢酸を加え、遠心
分離し、上清液を採取した。反応生成物をＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳによって分析し、反応生成物の絶対分子量を
測定した。スペクトル上にカルシトニンに３−アミノプ
ロピル−β−Ｄ−ラクトシドが一残基導入された化合物
＋カリウムイオンのシグナル［Ｍ＋Ｋ］+＝３７０７．
３を得た。
【００１７】実施例４ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコサミンの合成ポリ
ペプチドへの転移反応 繰返し配列からなるポリペプチドＨ−(Ｇly−Ｓer−Ｇl
n−Ｓer−Ｓer−Ｇly) 3 -ＯＨ(５ｍｇ，３．２５μＭ)お
よび３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン(７２．５ｍｇ，２９３μＭ)を１０％ＣａＣｌ
2トリス−塩酸バッファー溶液(ｐＨ７．５)に溶解し、
微生物由来トランスグルタミナーゼを加え、４０℃に
て、終夜攪拌した。５０％トリクロロ酢酸を加え、反応
を止めた。反応生成物をＯＤＳカラムにて分析し、反応
生成物を確認した。反応生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクト
ルより、グルタミン残基のγ−プロトンが高磁場シフト
しており、また、３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコ
サミンのプロピル基のプロトンの低磁場シフトが確認さ
れた。これらのプロトンシグナルの積分比から、Ｈ−
(Ｇly−Ｓer−Ｇln−Ｓer−Ｓer−Ｇly)3−ＯＨに糖残
基が１つ導入された化合物が生成していることが確認さ
れた。
ペプチドへの転移反応 繰返し配列からなるポリペプチドＨ−(Ｇly−Ｓer−Ｇl
n−Ｓer−Ｓer−Ｇly) 3 -ＯＨ(５ｍｇ，３．２５μＭ)お
よび３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン(７２．５ｍｇ，２９３μＭ)を１０％ＣａＣｌ
2トリス−塩酸バッファー溶液(ｐＨ７．５)に溶解し、
微生物由来トランスグルタミナーゼを加え、４０℃に
て、終夜攪拌した。５０％トリクロロ酢酸を加え、反応
を止めた。反応生成物をＯＤＳカラムにて分析し、反応
生成物を確認した。反応生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクト
ルより、グルタミン残基のγ−プロトンが高磁場シフト
しており、また、３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコ
サミンのプロピル基のプロトンの低磁場シフトが確認さ
れた。これらのプロトンシグナルの積分比から、Ｈ−
(Ｇly−Ｓer−Ｇln−Ｓer−Ｓer−Ｇly)3−ＯＨに糖残
基が１つ導入された化合物が生成していることが確認さ
れた。
【００１８】
【発明の効果】本発明方法によれば、糖の構造を壊すこ
となく設計されたアミノアルキルグリコシドをトランス
グルタミナーゼのドナー基質と使用することができ、し
かも受容体のポリペプチドに対する基質特異性はグルタ
ミン残基に限定されるため、ポリペプチドに対し位置選
択的糖鎖導入が可能であって、各種複合糖類、とくに糖
タンパク質の製造に好適に用いられる。なかんずく、大
腸菌やライン化細胞を用いて発現された糖鎖を持たない
組換えタンパク質に所望の糖鎖を導入するのに極めて有
用である。しかも、本発明では天然の酵素をそのまま用
いることができるため、毒作用の心配がなく、安全な糖
鎖導入方法として工業的に利用価値のきわめて高いもの
である。
となく設計されたアミノアルキルグリコシドをトランス
グルタミナーゼのドナー基質と使用することができ、し
かも受容体のポリペプチドに対する基質特異性はグルタ
ミン残基に限定されるため、ポリペプチドに対し位置選
択的糖鎖導入が可能であって、各種複合糖類、とくに糖
タンパク質の製造に好適に用いられる。なかんずく、大
腸菌やライン化細胞を用いて発現された糖鎖を持たない
組換えタンパク質に所望の糖鎖を導入するのに極めて有
用である。しかも、本発明では天然の酵素をそのまま用
いることができるため、毒作用の心配がなく、安全な糖
鎖導入方法として工業的に利用価値のきわめて高いもの
である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年６月３０日（２０００．６．３
０）
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】実施例３ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコサミンの天然ポリ
ペプチドへの移転反応 ３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン(０．３ｍｇ)およびカルシトニンのトリス−塩酸バ
ッファー溶液(０．０１μｍｏｌ／１００μｌ)ＣａＣｌ
2２Ｈ2Ｏ０．４ｍｇをトリス−塩酸バッファー(ｐＨ＝
８．０)５０μｌに溶解し、２５℃でＴＧase(モルモッ
ト由来)０．１Ｕ／１５０μｌを４回に分けて加え、３
０時間攪拌した。反応系にトリクロロ酢酸を加え、遠心
分離し、上清液を採取した。反応生成物をＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳによって分析し、反応生成物の絶対分子量を
測定した。スペクトル上にカルシトニンに３−アミノプ
ロピル−β−Ｄ−ラクトシドが一残基導入された化合物
＋カリウムイオンのシグナル［Ｍ＋Ｋ］+＝３７０７．
３を得た。 実施例４ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコサミンの合成ポリ
ペプチドへの転移反応 繰返し配列からなるポリペプチドＨ−(Ｇly−Ｓer−Ｇl
n−Ｓer−Ｓer−Ｇly) 3 -ＯＨ(５ｍｇ，３．２５μＭ)お
よび３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン(７２．５ｍｇ，２９３μＭ)を１０％ＣａＣｌ
2トリス−塩酸バッファー溶液(ｐＨ７．５)に溶解し、
微生物由来トランスグルタミナーゼを加え、４０℃に
て、終夜攪拌した。５０％トリクロロ酢酸を加え、反応
を止めた。反応生成物をＯＤＳカラムにて分析し、反応
生成物を確認した。反応生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクト
ルより、グルタミン残基のγ−プロトンが高磁場シフト
しており、また、３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコ
サミンのプロピル基のプロトンの低磁場シフトが確認さ
れた。これらのプロトンシグナルの積分比から、Ｈ−
(Ｇly−Ｓer−Ｇln−Ｓer−Ｓer−Ｇly)3−ＯＨに糖残
基が１つ導入された化合物が生成していることが確認さ
れた。
ペプチドへの移転反応 ３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン(０．３ｍｇ)およびカルシトニンのトリス−塩酸バ
ッファー溶液(０．０１μｍｏｌ／１００μｌ)ＣａＣｌ
2２Ｈ2Ｏ０．４ｍｇをトリス−塩酸バッファー(ｐＨ＝
８．０)５０μｌに溶解し、２５℃でＴＧase(モルモッ
ト由来)０．１Ｕ／１５０μｌを４回に分けて加え、３
０時間攪拌した。反応系にトリクロロ酢酸を加え、遠心
分離し、上清液を採取した。反応生成物をＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦＭＳによって分析し、反応生成物の絶対分子量を
測定した。スペクトル上にカルシトニンに３−アミノプ
ロピル−β−Ｄ−ラクトシドが一残基導入された化合物
＋カリウムイオンのシグナル［Ｍ＋Ｋ］+＝３７０７．
３を得た。 実施例４ ３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコサミンの合成ポリ
ペプチドへの転移反応 繰返し配列からなるポリペプチドＨ−(Ｇly−Ｓer−Ｇl
n−Ｓer−Ｓer−Ｇly) 3 -ＯＨ(５ｍｇ，３．２５μＭ)お
よび３−アミノプロピル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン(７２．５ｍｇ，２９３μＭ)を１０％ＣａＣｌ
2トリス−塩酸バッファー溶液(ｐＨ７．５)に溶解し、
微生物由来トランスグルタミナーゼを加え、４０℃に
て、終夜攪拌した。５０％トリクロロ酢酸を加え、反応
を止めた。反応生成物をＯＤＳカラムにて分析し、反応
生成物を確認した。反応生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクト
ルより、グルタミン残基のγ−プロトンが高磁場シフト
しており、また、３−アミノプロピル−β−Ｄ−グルコ
サミンのプロピル基のプロトンの低磁場シフトが確認さ
れた。これらのプロトンシグナルの積分比から、Ｈ−
(Ｇly−Ｓer−Ｇln−Ｓer−Ｓer−Ｇly)3−ＯＨに糖残
基が１つ導入された化合物が生成していることが確認さ
れた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】
【発明の効果】本発明方法によれば、糖の構造を壊すこ
となく設計されたアミノアルキルグリコシドをトランス
グルタミナーゼのドナー基質と使用することができ、し
かも受容体のポリペプチドに対する基質特異性はグルタ
ミン残基に限定されるため、ポリペプチドに対し位置選
択的糖鎖導入が可能であって、各種複合糖類、とくに糖
タンパク質の製造に好適に用いられる。なかんずく、大
腸菌やライン化細胞を用いて発現された糖鎖を持たない
組換えタンパク質に所望の糖鎖を導入するのに極めて有
用である。しかも、本発明では天然の酵素をそのまま用
いることができるため、毒作用の心配がなく、安全な糖
鎖導入方法として工業的に利用価値のきわめて高いもの
である。
となく設計されたアミノアルキルグリコシドをトランス
グルタミナーゼのドナー基質と使用することができ、し
かも受容体のポリペプチドに対する基質特異性はグルタ
ミン残基に限定されるため、ポリペプチドに対し位置選
択的糖鎖導入が可能であって、各種複合糖類、とくに糖
タンパク質の製造に好適に用いられる。なかんずく、大
腸菌やライン化細胞を用いて発現された糖鎖を持たない
組換えタンパク質に所望の糖鎖を導入するのに極めて有
用である。しかも、本発明では天然の酵素をそのまま用
いることができるため、毒作用の心配がなく、安全な糖
鎖導入方法として工業的に利用価値のきわめて高いもの
である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <210> 1 <211> 18 <212> Amino Acid <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 1 Gly Ser Gln Ser Ser Gly Gly Ser Gln Ser Ser Gly Gly Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ser Gly
フロントページの続き (72)発明者 菅野 憲一 北海道江別市対雁２−１ 北海道電力株式 会社総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AG01 CA21 CB30 CD12 CD20 DA01 4H045 AA20 BA53 EA20 FA70
Claims (1)
- 【請求項１】 トランスグルタミナーゼの存在下、グル
タミン含有ポリペプチドにアミノアルキルグリコシドを
作用させることを特徴とするポリペプチドに糖鎖を導入
する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6849399A JP2000300287A (ja) | 1999-03-15 | 1999-03-15 | トランスグルタミナーゼを用いた糖鎖導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6849399A JP2000300287A (ja) | 1999-03-15 | 1999-03-15 | トランスグルタミナーゼを用いた糖鎖導入方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300287A true JP2000300287A (ja) | 2000-10-31 |
Family
ID=13375285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6849399A Pending JP2000300287A (ja) | 1999-03-15 | 1999-03-15 | トランスグルタミナーゼを用いた糖鎖導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000300287A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054658A (ja) * | 2006-08-02 | 2008-03-13 | Kyushu Univ | タンパク質への外来分子の部位特異的な連結及びその利用 |
| JP2011169878A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-09-01 | Kyushu Univ | 核酸検出用キット |
| JP2014506239A (ja) * | 2010-12-08 | 2014-03-13 | エヴォニク ゴールドシュミット ゲーエムベーハー | 疎水性化タンパク質加水分解物 |
-
1999
- 1999-03-15 JP JP6849399A patent/JP2000300287A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054658A (ja) * | 2006-08-02 | 2008-03-13 | Kyushu Univ | タンパク質への外来分子の部位特異的な連結及びその利用 |
| JP4604201B2 (ja) * | 2006-08-02 | 2011-01-05 | 国立大学法人九州大学 | タンパク質への外来分子の部位特異的な連結及びその利用 |
| JP2011169878A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-09-01 | Kyushu Univ | 核酸検出用キット |
| JP2014506239A (ja) * | 2010-12-08 | 2014-03-13 | エヴォニク ゴールドシュミット ゲーエムベーハー | 疎水性化タンパク質加水分解物 |
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