JP4088459B2 - 新規糖質およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規糖質アルキルα−２−デオキシグルコシド及びD-グルカールとアルコールを原料として用い、α−グルコシダーゼを作用させることを特徴とするその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルキルグリコシドは界面活性剤や酵素阻害剤などとして広く利用されている素材である。これらのアルキルグリコシドは、単糖類とアルコールを強酸などの触媒存在下で加熱するなどの方法や、グリコシダーゼの糖転移反応を利用して製造することができる。
また、アルキル２−デオキシグリコシドについては、β型のグルコシドとガラクトシドがそれぞれβ-グルコシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼを用いての合成が報告されている（J. M. Petitら，Tetrahedron Letters：32, 6125-6128 (1991)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記方法の前者ではα型とβ型の混合物として得られ、後者では酵素の有機溶媒に対する安定性による制約があるなどの問題点を有していた。また、プティ(Petit)らの報告においても糖転移反応のアクセプターとなるアルコールの他に７０から７５％のアセトンもしくはアセトニトリルを添加しているものの、その生成率は最大で６４％であった。プティ（Petit）らの方法では、β型の２−デオキシグリコシドしか得ることができず、α型の２−デオキシグリコシドに関しては効率的に得る方法が開発されておらず、アルキルグリコシドよりも高い消化酵素系の阻害効果などが期待されながらも解明できずにいた。
【０００４】
そこで本発明の目的は、新規糖質であるアルキルα−２−デオキシグルコシド、およびその効率的な製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、アルキル α−２−デオキシグルコシドについて鋭意研究し、グルカールを供与体、アルコールを受容体として用い、α-グルコシダーゼを反応させることによりアルキルα−２−デオキシグルコシドを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
（１）下記化学式で示される新規糖質であるアルキルα−２−デオキシグルコシド
を提供する。
【化３】
(式中、Rは−CH3 、−(CH2)nCH3 (但し、nは1〜７の整数である)、−CH(CH3)CH3 、−CH2CH(CH3)CH3 、−CH(CH3)CH2CH3 、
【化４】
または−CH2CH＝CH2である）
【０００７】
更に、本発明は、
（２）D-グルカールと式ＲＯＨで示されるアルコール（但し、Ｒは、（１）における定義と同義である）との混合物に、α−グルコシダーゼを作用させることを特徴とする（１）に記載のアルキル α−２−デオキシグルコシドの製造方法を提供する。
【０００８】
上記本発明の製造方法の好ましい態様を以下に示す。
（３）有機溶媒を含む反応系で行う（２）に記載の製造方法。
（４）前記有機溶媒が式ＲＯＨで示されるアルコールである（３）に記載の製造方法。
（５）式ＲＯＨで示されるアルコールが、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール、１-ペンタノール、１-ヘキサノール、１-ヘプタノール、１-オクタノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、またはアリルアルコールである（２）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）前記α-グルコシダーゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）前記α-グルコシダーゼが、ブタ起源のα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（８）前記α-グルコシダーゼが、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）起源のα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（９）前記α-グルコシダーゼが、水解活性が天然型の１００００分の１以下となるように活性に関与するアミノ酸を改変されたα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１０）前記アミノ酸を改変されたα-グルコシダーゼが、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomayces pombe）起源のα-グルコシダーゼの４８１番目のアスパラギン酸がアラニンまたはグリシンに改変された改変酵素である（９）に記載の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明によって新規に提供される
【化５】
で示されるアルキルα−２−デオキシグルコシドは、D-グルカールとアルコールとを混合し、その混合物にα−グルコシダーゼを作用させることにより得ることができる。
本発明において、アルキルα−２−グルコシダーゼを製造するために用いるα-グルコシダーゼは、その起源など特に限定されるものではない。但し、アルキル α−２−デオキシグルコシドを製造する際に受容体としてアルコールを用いるので、アルコールや有機溶媒に対して安定性の高いα-グルコシダーゼ、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼなどを用いることが好ましい。用いるα-グルコシダーゼは精製された標品でも、市販されている粗精製標品でも構わない。
【００１０】
α−グルコシダーゼとしては、天然型α−グルコシダーゼを用いることもでき、α-グルコシダーゼの特定のアミノ酸を置換した改変α-グルコシダーゼを用いることもできる。本発明では、水解活性が天然型の１００００分の１以下となるように活性に関与するアミノ酸を改変されたα−グルコシダーゼを用いることが好ましい。ここで、「水解活性が天然型の１００００分の１以下」とは、改変前の酵素をマルトースやｐ−フェニルα−グルコシド等を基質として生成するグルコース量と比較して、生成するグルコース量が１００００分の１以下であることを意味する。水解活性が低減された改変α−グルコシダーゼは、アルキルα−２−デオキシグルコシドをほとんど加水分解しないため、本発明のアルキルα−２−デオキシグルコシドの製造に用いると、その収率を向上させることができる。
以下に、この改変α-グルコシダーゼについて、更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明において、アルキルα−２−グルコシドの製造のために用いることのできる改変α−グルコシダーゼは、例えば、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼであって、前記アミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸を、水解活性が配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するように他のアミノ酸に置換した改変α−グルコシダーゼであることができる。
【００１２】
アミノ酸が改変されていない配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼは、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼである。そして、配列番号１に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換する。アミノ酸の置換は、水解活性が配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するように行うことが好ましい。具体的には、４８１番目のアスパラギン酸を側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換する。そして、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸は、例えば、アラニンまたはグリシンであることができる。
【００１３】
本発明では、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであって、該α−グルコシダーゼの活性解離基のうち解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を、水解活性が野生型の酵素に比較して１００００分の１以下に低下するように側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換した改変α−グルコシダーゼを用いることもできる。
【００１４】
上記改変α−グルコシダーゼでは、基礎とするα−グルコシダーゼは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに限らず、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであればよい。そして、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼの活性解離基のうち解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を側鎖にカルボキシル基を含まない他のアミノ酸で置換する。他のアミノ酸で置換するアミノ酸は、例えば、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸である。配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼも、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであることから、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ以外のシズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼも、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列と高い相同性を有し、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸は容易に見出すことができる。
【００１５】
アミノ酸の置換は、水解活性が野生型の酵素、即ち、野生型のシズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するように行うことが好ましい。また、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸は、例えば、アラニンまたはグリシンであることができる。
【００１６】
本発明において、改変α−グルコシダーゼは常法により調製することができる。例えば、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ遺伝子、または、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼ遺伝子に、目標とする解離型カルボキシル基を有するアミノ酸残基をポイントミュテーションにより他のアミノ酸に置換することにより調製できる。改変α−グルコシダーゼは、これらの改変酵素を、微生物を培養することにより調製し、その上清もしくは菌体破砕物としても利用可能であるが、必要に応じて各種クロマトグラフィーにて精製して用いることもできる。
【００１７】
シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼは、すでにその精製方法や酵素化学的諸性質、糖転移反応について千葉らにより報告されている（Chiba et al., Agric. Biol. Chem. : 29, 540-547 (1965)、Chiba et al., Agric. Biol. Chem. : 30, 536-540 (1966)）。また、その遺伝子も取得されており、活性解離基の同定も行われている（日本農芸化学会誌７２巻、１９９８年度大会講演要旨集p.134）。
【００１８】
本発明の製造方法において、アルコールは、酵素反応の受容体として働く。長鎖のアルキル鎖を有するアルコールは酵素の受容体となり難いため、本発明では、式ROH(式中、Rは−CH3 、−(CH2)nCH3 (但し、nは1〜７の整数である)、−CH(CH3)CH3 、−CH2CH(CH3)CH3 、−CH(CH3)CH2CH3 、
【化６】
または−CH2CH＝CH2である）で示されるアルコールを使用する。例えば、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール、１-ペンタノール、１-ヘキサノール、１-ヘプタノール、１-オクタノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、またはアリルアルコールなどを用いることができる。また、反応系にこれら受容体となるアルコール以外のアセトンやアセトニトリルなどの有機溶媒を添加することもできる。これらのアルコールの濃度は、特に限定されるものではないが、３０％以上であることが望ましく、これらアルコール濃度が１００％での反応を行うことも可能である。
【００１９】
本発明で用いるD-グルカールは、W. Roth, W. Pigman; 'D-Glucal and the Glycals', METHODS IN Carbohydrate Chemistry VOLUME II Reactions of Carbohydrates, p405-408, Academic Press Inc. New York and London (1963)に記載の方法により調製することができ、また、試薬として東京化成株式会社からも販売されている。D-グルカールは、例えば０．５〜５００ｍＭの濃度で用いることができる。
【００２０】
本発明では、上記アルコールとD-グルカールとを混合し、その混合物にα−グルコシダーゼを添加して酵素反応を行うことにより、アルキルα―２−デオキシグルコシドを生成する。
アルキルα−２−デオキシグルコシドを生成させるための酵素反応条件は、用いるα-グルコシダーゼの酵素化学的諸性質を考慮して、酵素反応の最適条件を用いれば良く、反応時間や酵素量などは特に限定されるものではない。例えば、α−グルコシダーゼを０．１〜１０００ユニットの量で添加し、反応温度１５〜６０℃、反応時間０．５〜１００時間、ｐＨ３．０〜６．０の反応条件において行うことができる。
また、生成したアルキルα−２−デオキシグルコシドは、ゲル濾過、イオン交換樹脂、吸着樹脂などを用いたクロマトグラフィーや濃縮、蒸留、結晶化などの従来より知られている糖質の精製方法や有機溶媒の除去方法などを単独もしくは組み合わせることにより精製することができる。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
α - グルコシダーゼの耐有機溶媒性の確認
アルキル α−２−デオキシグルコシドの生成反応では、アルコール存在下において反応を行うため、各種α-グルコシダーゼの有機溶媒による耐性について調査した。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ブタ血清、ソバ起源のα-グルコシダーゼを、３５℃において５０％（v/v）メタノール中で処理した場合の残存酵素活性を測定した。その結果を図１に示す。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼは４時間の処理でも９０％以上の残存活性を示している。これに対して、ブタ血清起源のα-グルコシダーゼは経時的に残存活性が低下し、４時間処理において約２０％、ソバ起源のα-グルコシダーゼは処理開始直後から残存活性が急激に低下し、３０分処理においてほとんど残存活性は失われた。
【００２３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼについて、各種メタノール濃度における耐性について調査した。３５℃において０〜７０％（v/v）メタノール中でアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを処理した場合の残存酵素活性を測定した。その結果を図２に示す。７０％（v/v）メタノール中においても、４時間の処理で７０％以上の残存活性を示し、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼが高い耐有機溶媒特性を有することが判明した。
【００２４】
実施例２
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において反応を行った際の結果を図３に示す。反応開始直後からD-グルカールが減少し、それに伴ってメチルα−２−デオキシグルコシドが生成した。２４時間反応を行った結果、メチルα−２−デオキシグルコシドは８３％、２−デオキシグルコシドが１６％の生成率であった。
【００２５】
実施例３
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応の最適温度、最適ｐ H の測定
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、各種温度において２４時間反応を行った際の結果を図４に、また各種ｐHの２０ｍM酢酸緩衝液、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、２４時間反応を行った際の結果を図５に示す。その結果、メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応の最適温度は３５〜４５℃、最適ｐHは４.５であった。
【００２６】
実施例４
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応のグルカール濃度の影響
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、各種濃度のD-グルカール、７０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った際の結果を図６に示す。その結果、グルカール濃度の上昇に伴ってメチルα−２−デオキシグルコシドの生成量は増大した。
【００２７】
実施例５
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応のメタノール濃度の影響
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のメタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った際の結果が図７に示されている。その結果、７０％（v/v）メタノールにおいてメチルα−２−デオキシグルコシドの生成量最大となり、その生成率は９３％であった。しかしながら８０％（v/v）メタノール以上の濃度ではメチルα−２−デオキシグルコシドの生成量は減少した。
【００２８】
実施例６
プロピル α−２−デオキシグルコシドの生成反応
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のプロパノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った際の結果を図８に示されている。その結果、９０％（v/v）プロパノールにおいてプロピル α−２−デオキシグルコシドの生成量最大となり、その生成率は８８％であった。しかしながら１００％（v/v）プロパノールの濃度ではプロピル α−２−デオキシグルコシドの生成量は減少した。
【００２９】
実施例７
各種アルコールを用いたアルキル α−２−デオキシグルコシドの生成反応
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度の各種アルコール、０.１ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において３６時間反応を行った際の結果が表１及び図９に示す。水と混和しない１-ペンタノールや１-ヘプタノールにおいても、ペンチルα−２−デオキシグルコシド、ヘプチルα−２−デオキシグルコシドが８３．４５％の生成率で得られた。また、その他のアルコールを用いてもアルキルα−２−デオキシグルコシドの生成が認められた。
【００３０】
【表１】
【００３１】
これらのアルキル α−２−デオキシグルコシドの構造に関しては、質量分析およびNMR分析を行い、アルキル α−２−デオキシグルコシドであることを確認した。結果を表２〜１６に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
【表７】
【００３８】
【表８】
【００３９】
【表９】
【００４０】
【表１０】
【００４１】
【表１１】
【００４２】
【表１２】
【００４３】
【表１３】
【００４４】
【表１４】
【００４５】
【表１５】
【００４６】
【表１６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ブタ血清、ソバ起源のα-グルコシダーゼを、３５℃において５０％（v/v）メタノール中で処理した場合の残存酵素活性の測定結果を示す。
【図２】３５℃において０〜７０％（v/v）メタノール中でアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを処理した場合の残存酵素活性の測定結果を示す。
【図３】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において反応を行った結果を示す。
【図４】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、各種温度において２４時間反応を行った結果を示す。
【図５】各種ｐHの２０ｍM酢酸緩衝液、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、２４時間反応を行った結果を示す。
【図６】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、各種濃度のD-グルカール、７０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った結果を示す。
【図７】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のメタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った結果を示す。
【図８】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のプロパノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った結果を示す。
【図９】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度の各種アルコール、０.１ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において３６時間反応を行った結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規糖質アルキルα−２−デオキシグルコシド及びD-グルカールとアルコールを原料として用い、α−グルコシダーゼを作用させることを特徴とするその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルキルグリコシドは界面活性剤や酵素阻害剤などとして広く利用されている素材である。これらのアルキルグリコシドは、単糖類とアルコールを強酸などの触媒存在下で加熱するなどの方法や、グリコシダーゼの糖転移反応を利用して製造することができる。
また、アルキル２−デオキシグリコシドについては、β型のグルコシドとガラクトシドがそれぞれβ-グルコシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼを用いての合成が報告されている（J. M. Petitら，Tetrahedron Letters：32, 6125-6128 (1991)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記方法の前者ではα型とβ型の混合物として得られ、後者では酵素の有機溶媒に対する安定性による制約があるなどの問題点を有していた。また、プティ(Petit)らの報告においても糖転移反応のアクセプターとなるアルコールの他に７０から７５％のアセトンもしくはアセトニトリルを添加しているものの、その生成率は最大で６４％であった。プティ（Petit）らの方法では、β型の２−デオキシグリコシドしか得ることができず、α型の２−デオキシグリコシドに関しては効率的に得る方法が開発されておらず、アルキルグリコシドよりも高い消化酵素系の阻害効果などが期待されながらも解明できずにいた。
【０００４】
そこで本発明の目的は、新規糖質であるアルキルα−２−デオキシグルコシド、およびその効率的な製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、アルキル α−２−デオキシグルコシドについて鋭意研究し、グルカールを供与体、アルコールを受容体として用い、α-グルコシダーゼを反応させることによりアルキルα−２−デオキシグルコシドを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
（１）下記化学式で示される新規糖質であるアルキルα−２−デオキシグルコシド
を提供する。
【化３】
【化４】
【０００７】
更に、本発明は、
（２）D-グルカールと式ＲＯＨで示されるアルコール（但し、Ｒは、（１）における定義と同義である）との混合物に、α−グルコシダーゼを作用させることを特徴とする（１）に記載のアルキル α−２−デオキシグルコシドの製造方法を提供する。
【０００８】
上記本発明の製造方法の好ましい態様を以下に示す。
（３）有機溶媒を含む反応系で行う（２）に記載の製造方法。
（４）前記有機溶媒が式ＲＯＨで示されるアルコールである（３）に記載の製造方法。
（５）式ＲＯＨで示されるアルコールが、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール、１-ペンタノール、１-ヘキサノール、１-ヘプタノール、１-オクタノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、またはアリルアルコールである（２）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）前記α-グルコシダーゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）前記α-グルコシダーゼが、ブタ起源のα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（８）前記α-グルコシダーゼが、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）起源のα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（９）前記α-グルコシダーゼが、水解活性が天然型の１００００分の１以下となるように活性に関与するアミノ酸を改変されたα-グルコシダーゼである（２）〜（５）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１０）前記アミノ酸を改変されたα-グルコシダーゼが、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomayces pombe）起源のα-グルコシダーゼの４８１番目のアスパラギン酸がアラニンまたはグリシンに改変された改変酵素である（９）に記載の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明によって新規に提供される
【化５】
本発明において、アルキルα−２−グルコシダーゼを製造するために用いるα-グルコシダーゼは、その起源など特に限定されるものではない。但し、アルキル α−２−デオキシグルコシドを製造する際に受容体としてアルコールを用いるので、アルコールや有機溶媒に対して安定性の高いα-グルコシダーゼ、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼなどを用いることが好ましい。用いるα-グルコシダーゼは精製された標品でも、市販されている粗精製標品でも構わない。
【００１０】
α−グルコシダーゼとしては、天然型α−グルコシダーゼを用いることもでき、α-グルコシダーゼの特定のアミノ酸を置換した改変α-グルコシダーゼを用いることもできる。本発明では、水解活性が天然型の１００００分の１以下となるように活性に関与するアミノ酸を改変されたα−グルコシダーゼを用いることが好ましい。ここで、「水解活性が天然型の１００００分の１以下」とは、改変前の酵素をマルトースやｐ−フェニルα−グルコシド等を基質として生成するグルコース量と比較して、生成するグルコース量が１００００分の１以下であることを意味する。水解活性が低減された改変α−グルコシダーゼは、アルキルα−２−デオキシグルコシドをほとんど加水分解しないため、本発明のアルキルα−２−デオキシグルコシドの製造に用いると、その収率を向上させることができる。
以下に、この改変α-グルコシダーゼについて、更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明において、アルキルα−２−グルコシドの製造のために用いることのできる改変α−グルコシダーゼは、例えば、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼであって、前記アミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸を、水解活性が配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するように他のアミノ酸に置換した改変α−グルコシダーゼであることができる。
【００１２】
アミノ酸が改変されていない配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼは、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼである。そして、配列番号１に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換する。アミノ酸の置換は、水解活性が配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するように行うことが好ましい。具体的には、４８１番目のアスパラギン酸を側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換する。そして、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸は、例えば、アラニンまたはグリシンであることができる。
【００１３】
本発明では、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであって、該α−グルコシダーゼの活性解離基のうち解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を、水解活性が野生型の酵素に比較して１００００分の１以下に低下するように側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換した改変α−グルコシダーゼを用いることもできる。
【００１４】
上記改変α−グルコシダーゼでは、基礎とするα−グルコシダーゼは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼに限らず、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであればよい。そして、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼの活性解離基のうち解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を側鎖にカルボキシル基を含まない他のアミノ酸で置換する。他のアミノ酸で置換するアミノ酸は、例えば、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸である。配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼも、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼであることから、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ以外のシズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼも、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列と高い相同性を有し、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列の４８１番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸は容易に見出すことができる。
【００１５】
アミノ酸の置換は、水解活性が野生型の酵素、即ち、野生型のシズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼに比較して１００００分の１以下に低下するように行うことが好ましい。また、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸は、例えば、アラニンまたはグリシンであることができる。
【００１６】
本発明において、改変α−グルコシダーゼは常法により調製することができる。例えば、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ遺伝子、または、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼ遺伝子に、目標とする解離型カルボキシル基を有するアミノ酸残基をポイントミュテーションにより他のアミノ酸に置換することにより調製できる。改変α−グルコシダーゼは、これらの改変酵素を、微生物を培養することにより調製し、その上清もしくは菌体破砕物としても利用可能であるが、必要に応じて各種クロマトグラフィーにて精製して用いることもできる。
【００１７】
シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のα−グルコシダーゼは、すでにその精製方法や酵素化学的諸性質、糖転移反応について千葉らにより報告されている（Chiba et al., Agric. Biol. Chem. : 29, 540-547 (1965)、Chiba et al., Agric. Biol. Chem. : 30, 536-540 (1966)）。また、その遺伝子も取得されており、活性解離基の同定も行われている（日本農芸化学会誌７２巻、１９９８年度大会講演要旨集p.134）。
【００１８】
本発明の製造方法において、アルコールは、酵素反応の受容体として働く。長鎖のアルキル鎖を有するアルコールは酵素の受容体となり難いため、本発明では、式ROH(式中、Rは−CH3 、−(CH2)nCH3 (但し、nは1〜７の整数である)、−CH(CH3)CH3 、−CH2CH(CH3)CH3 、−CH(CH3)CH2CH3 、
【化６】
【００１９】
本発明で用いるD-グルカールは、W. Roth, W. Pigman; 'D-Glucal and the Glycals', METHODS IN Carbohydrate Chemistry VOLUME II Reactions of Carbohydrates, p405-408, Academic Press Inc. New York and London (1963)に記載の方法により調製することができ、また、試薬として東京化成株式会社からも販売されている。D-グルカールは、例えば０．５〜５００ｍＭの濃度で用いることができる。
【００２０】
本発明では、上記アルコールとD-グルカールとを混合し、その混合物にα−グルコシダーゼを添加して酵素反応を行うことにより、アルキルα―２−デオキシグルコシドを生成する。
アルキルα−２−デオキシグルコシドを生成させるための酵素反応条件は、用いるα-グルコシダーゼの酵素化学的諸性質を考慮して、酵素反応の最適条件を用いれば良く、反応時間や酵素量などは特に限定されるものではない。例えば、α−グルコシダーゼを０．１〜１０００ユニットの量で添加し、反応温度１５〜６０℃、反応時間０．５〜１００時間、ｐＨ３．０〜６．０の反応条件において行うことができる。
また、生成したアルキルα−２−デオキシグルコシドは、ゲル濾過、イオン交換樹脂、吸着樹脂などを用いたクロマトグラフィーや濃縮、蒸留、結晶化などの従来より知られている糖質の精製方法や有機溶媒の除去方法などを単独もしくは組み合わせることにより精製することができる。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
α - グルコシダーゼの耐有機溶媒性の確認
アルキル α−２−デオキシグルコシドの生成反応では、アルコール存在下において反応を行うため、各種α-グルコシダーゼの有機溶媒による耐性について調査した。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ブタ血清、ソバ起源のα-グルコシダーゼを、３５℃において５０％（v/v）メタノール中で処理した場合の残存酵素活性を測定した。その結果を図１に示す。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼは４時間の処理でも９０％以上の残存活性を示している。これに対して、ブタ血清起源のα-グルコシダーゼは経時的に残存活性が低下し、４時間処理において約２０％、ソバ起源のα-グルコシダーゼは処理開始直後から残存活性が急激に低下し、３０分処理においてほとんど残存活性は失われた。
【００２３】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼについて、各種メタノール濃度における耐性について調査した。３５℃において０〜７０％（v/v）メタノール中でアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを処理した場合の残存酵素活性を測定した。その結果を図２に示す。７０％（v/v）メタノール中においても、４時間の処理で７０％以上の残存活性を示し、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼが高い耐有機溶媒特性を有することが判明した。
【００２４】
実施例２
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において反応を行った際の結果を図３に示す。反応開始直後からD-グルカールが減少し、それに伴ってメチルα−２−デオキシグルコシドが生成した。２４時間反応を行った結果、メチルα−２−デオキシグルコシドは８３％、２−デオキシグルコシドが１６％の生成率であった。
【００２５】
実施例３
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応の最適温度、最適ｐ H の測定
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、各種温度において２４時間反応を行った際の結果を図４に、また各種ｐHの２０ｍM酢酸緩衝液、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、２４時間反応を行った際の結果を図５に示す。その結果、メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応の最適温度は３５〜４５℃、最適ｐHは４.５であった。
【００２６】
実施例４
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応のグルカール濃度の影響
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、各種濃度のD-グルカール、７０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った際の結果を図６に示す。その結果、グルカール濃度の上昇に伴ってメチルα−２−デオキシグルコシドの生成量は増大した。
【００２７】
実施例５
メチルα−２−デオキシグルコシドの生成反応のメタノール濃度の影響
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のメタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った際の結果が図７に示されている。その結果、７０％（v/v）メタノールにおいてメチルα−２−デオキシグルコシドの生成量最大となり、その生成率は９３％であった。しかしながら８０％（v/v）メタノール以上の濃度ではメチルα−２−デオキシグルコシドの生成量は減少した。
【００２８】
実施例６
プロピル α−２−デオキシグルコシドの生成反応
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のプロパノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った際の結果を図８に示されている。その結果、９０％（v/v）プロパノールにおいてプロピル α−２−デオキシグルコシドの生成量最大となり、その生成率は８８％であった。しかしながら１００％（v/v）プロパノールの濃度ではプロピル α−２−デオキシグルコシドの生成量は減少した。
【００２９】
実施例７
各種アルコールを用いたアルキル α−２−デオキシグルコシドの生成反応
２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度の各種アルコール、０.１ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において３６時間反応を行った際の結果が表１及び図９に示す。水と混和しない１-ペンタノールや１-ヘプタノールにおいても、ペンチルα−２−デオキシグルコシド、ヘプチルα−２−デオキシグルコシドが８３．４５％の生成率で得られた。また、その他のアルコールを用いてもアルキルα−２−デオキシグルコシドの生成が認められた。
【００３０】
【表１】
これらのアルキル α−２−デオキシグルコシドの構造に関しては、質量分析およびNMR分析を行い、アルキル α−２−デオキシグルコシドであることを確認した。結果を表２〜１６に示す。
【００３２】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ブタ血清、ソバ起源のα-グルコシダーゼを、３５℃において５０％（v/v）メタノール中で処理した場合の残存酵素活性の測定結果を示す。
【図２】３５℃において０〜７０％（v/v）メタノール中でアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを処理した場合の残存酵素活性の測定結果を示す。
【図３】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において反応を行った結果を示す。
【図４】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、各種温度において２４時間反応を行った結果を示す。
【図５】各種ｐHの２０ｍM酢酸緩衝液、２０mM D-グルカール、５０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、２４時間反応を行った結果を示す。
【図６】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、各種濃度のD-グルカール、７０％（v/v）メタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った結果を示す。
【図７】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のメタノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った結果を示す。
【図８】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度のプロパノール、０.１５ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において２４時間反応を行った結果を示す。
【図９】２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH ４.３）、２０mMのD-グルカール、各種濃度の各種アルコール、０.１ｍｇ／ｍｌのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼを用いて、３５℃において３６時間反応を行った結果を示す。
Claims (9)
- D-グルカールと式ＲＯＨで示されるアルコール（但し、Ｒは、請求項１における定義と同義である）との混合物に、α−グルコシダーゼを作用させることを特徴とする、下記化学式で示されるアルキルα−２−デオキシグルコシドの製造方法。
- 有機溶媒を含む反応系で行う請求項１に記載の製造方法。
- 前記有機溶媒が式ＲＯＨで示されるアルコールである請求項２に記載の製造方法。
- 式ＲＯＨで示されるアルコールが、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール、１-ペンタノール、１-ヘキサノール、１-ヘプタノール、１-オクタノール、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、またはアリルアルコールである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記α-グルコシダーゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-グルコシダーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記α-グルコシダーゼが、ブタ起源のα-グルコシダーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記α-グルコシダーゼが、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）起源のα-グルコシダーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記α-グルコシダーゼが、α−グルコシダーゼの活性解離基の解離型カルボキシル基を含むアミノ酸を、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸に置換して、水解活性が野生型の酵素に比較して１００００分の１以下に低下させた改変α−グルコシダーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記改変α - グルコシダーゼが、シズサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomayces pombe）起源のα-グルコシダーゼの４８１番目のアスパラギン酸がアラニンまたはグリシンに改変された改変酵素である請求項８に記載の製造方法。
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